KR102016664B1

KR102016664B1 - 미숙과 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102016664B1
Application number: KR1020190021990A
Authority: KR
Inventors: 김현주; 김현덕
Original assignee: 인삼열매유통공사 주식회사
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2019-08-30

Abstract

본 발명은 미숙과 인삼열매의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 미숙과 인삼열매의 아임계 추출물을 유효성분으로 포함하고, 항산화, 미백, 피부 염증 완화, 피부보습, 가려움증 개선, 피부장벽강화용 피부 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

미숙과 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition Comprising Immature Ginseng Fruit Extract As Active Ingredient}

인간의 피부는 최외부에 있는 신체기관으로, 외부의 자극으로부터 신체를 보호하는 역할을 하며, 항상성(Homeostasis)을 유지하는 역할을 한다. 인간의 노화 현상 중 하나인 피부 노화는 그 원인으로 내적 및 외적 요인으로 나누어지는데, 그 중 외적 요인으로 태양광에 의한 UV 조사에 따른 피부의 생리학적 및 형태학적 변화의 주된 원인으로 알려져 있다. 피부에 직접적인 영향을 주는 자외선은 피부의 표피 및 진피층에 투과하여 몇 가지 효소반응을 포함한 다양한 과정을 거쳐 활성산소(oxygen free radical)를 생성시키는데, 활성산소의 생성이 체내에서 과잉 발생되면 돌연변이, 염증, 세포 살상, 발암 및 피부 노화를 일으킨다. 따라서 피부에서 활성산소의 발생을 저해함으로써 피부 노화 및 염증을 저해할 수 있다.

또한, 피부는 외부의 자극으로부터 보호하기 위해 멜라닌 색소를 만들어 낸다. 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 등 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인으로 피부색이 결정되어 진다. 피부가 자외선에 노출되면 티로시나아제가 활성화되고, 피부조직에 존재하는 아미노산의 일종인 티로신에 작용하여 도파(DOPA)를 생성시키고, 다시 도파퀴논을 생성시키는 산화과정을 통해 피부 색소세포인 멜라노사이트 내의 멜라노좀에서 멜라닌이라는 중합체가 합성된다. 생성된 멜라닌은 각질형성세포인 케라티노사이트로 전달되며, 각질화 과정에 의해 피부 표면에 도달하여 자외선으로부터 피부를 보호하게 된다. 멜라닌은 인체에 없어서는 안 되는 자외선 방어제이나, 멜라닌이 국소적으로 과도하게 합성되거나 피부병변 및 노화에 따른 피부의 생리기능이 떨어지게 되면, 멜라닌이 피부 표면에 침착되어 기미, 주근깨 및 다양한 색소 침착이 유발되게 된다.

한편, 현대 사회는 식생활, 환경변화, 환경오염, 화학물질 노출 등에 의해 아토피 피부염에 노출될 가능성이 증가하고 있으며, 아토피 피부염 환자들의 수가 증가하고 있다. 아토피 피부염의 증상으로 건조함, 염증, 가려움 및 피부장벽 약화의 증상이 대표적이다. 피부의 구성성분 중 30~80%(각질층 30%, 표피층 65~70%, 진피층 80%)가 수분으로 이루어져 있어, 피부 건조함을 개선하기 위해서는 피부 보습을 강화하는 것이 매우중요하다. 특히 피부세포 내 막관통 단백질로 수분의 이동을 조절하는 aquaporin 3(AQP-3)의 발현을 조절함으로 피부의 보습력을 유지하는데 효과가 있으며, AQP-3와 피부 보습에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있다.

피부 가려움증(itching)은 피부를 긁거나 문지르고 싶은 충동을 일으키는 불유쾌한 감각으로, 매우 주관적인 감각으로 개인에 따라 매우 다양하게 나타난다. 가려움증을 일으키는 피부 질환에는 두드러기, 습진성 피부질환(아토피 피부염, 접촉성 피부염 등), 건선, 피부 건조증, 노인 가려움증 등이 있다. 가려움증을 없애기 위해 심하게 긁거나 문지르는 경우, 긁은 흔적, 홍반, 상처, 염증 및 색소침착 등의 증상을 동반할 수 있다. 가려움증은 자극원, 수용체, 척수, 대뇌의 순서대로 신호가 전달되는 것으로 알려져 있으며, 각 기전에 따른 가려움증 개선 연구가 수행되고 있다. 그중 수용체는 감각수용체를 일컫는 것으로 TRPV 수용체를 통해 감각이 전달됨으로, TRPV 수용체를 조절함으로 가려움증을 개선할 수 있다.

피부 각질층은 외부인자로부터 피부를 보호하는 역할을 하지만, 피부 내부 수분을 보유 및 유지하는 역할도 수행한다. 피부 각질층을 피부장벽이라고도 하는데, 피부장벽이 약화되었을 경우 피부 건조감 뿐 아니라 민감해지고, 피부의 수분을 보유하지 못하게 된다. 피부장벽은 각질세포 및 세포간 지질에 의해서 구성되는데, 세포간지질에는 콜라겐, 엘라스틴, 세라마이드, 히알루론산 등의 구성성분을 보유하고 있다. 이 중 세라마이드는 양친매성 성분으로 피부의 수분을 빠져나가지 않게 유지하며, 피부를 지탱해주는 지지체 역할을 한다. 세라마이드를 화장품으로 제공함으로 피부의 보습 및 피부장벽을 개선하는데 효과가 있으나, 최근에는 피부 내 세라마이딘 생합성을 유도하는데 연구가 활발히 진행되고 있다.

인삼(Panax ginseng)은 오갈피나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생 초본류로서, 한방에서는 그 뿌리를 인삼(Ginseng Radix)이라 하며, 강장(强壯), 강정(强精), 조혈(造血), 보온(保溫), 건위(健胃), 피로회복, 정신안정, 진정작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 인삼의 주요 유효성분으로는 사포닌, 사포게닌, 폴리아세틸렌, 피라진 유도체, 말톨 등이 있으며, 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 사포닌을 일컫는 말로, 그 종류는 Rg1, Rg2, Rg3, Rg5, Re, Rb, Rb1, Rb2, Rb3, Rh1, Rh2, Rh4, Rk1, F1 등 약 100여종의 진세노사이드가 있는 것으로 알려져 있으나, 각각의 생리활성에 대한 연구는 확립되어있지 않다. 인삼은 그 사용 부위에 따라서 진세노사이드의 함유량이 다르며, 포제 방법, 횟수, 재배지, 재배 시기 등에 따라 천차만별이다. 그 중 Rh4은 항염 및 항암, Rg3은 항암 및 종양 억제, Rk1은 항염 및 항암에 효능이 있다고 알려져 있다.

인삼 열매는 예로부터 인삼보다도 귀하게 여겨지는 것으로서 종자 획득을 목적으로 선별되어 수확되어 왔다. 또한, 인삼열매는 인삼의 재배기간 중 4년생에 한해서 채종되며, 열매의 채종 후 인삼근에 영양분을 집중하기 위하여 줄기를 잘라버리기 때문에 인삼열매는 4년생에서만 수확을 할 수 있다. 인삼은 5월 중순에 꽃이 만개하여 7월 중·하순이면 성숙단계에 접어드는데, 붉은색으로 성숙되기 전인 상태의 열매가 미숙과 인삼열매이다.

인삼열매는 화장품의 원료로써 사용이 많이 되어 왔으나, 인삼열매의 완숙과를 이용한 화장품이 주를 이루고 있다.

인삼열매를 이용한 선행기술로서, 한국등록특허 제10-0887631호는 감압농축하여 추출된 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물을 개시하고 있다. 또한, 한국등록특허 제10-1415997호는 감압농축하여 추출된 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

상기 특허들은 인삼열매의 완숙과를 이용한 것으로서, 인삼열매의 미숙과의 경우에는 그 사용이 전무하고, 피부효능에 대한 연구는 미비한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 미숙과 인삼열매의 성분 및 피부과학적 효능을 연구 노력한 결과, 미숙과 인삼열매를 아임계 추출방법으로 추출하여 얻어진 미숙과 인삼열매 아임계 추출물이 진세노사이드 Rh4, Rg3 및 Rk1의 함량이 높으며, 항산화, 미백, 피부 염증 완화, 피부보습, 가려움증 개선, 피부장벽강화 등의 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 미숙과 인삼열매 아임계 추출물을 유효성분으로 포함하여, 항산화, 미백, 피부 염증 완화, 피부보습, 가려움증 개선, 피부장벽강화 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미숙과 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 미숙과 인삼열매 추출물은 아임계추출법, 초고압추출법 및 용매추출법으로 이루어진 군에서 선택된 추출방법으로 추출될 수 있다.

또한, 바람직하게는 상기 화장료 조성물은 항산화용, 피부 미백용, 피부 염증 완화용, 피부 보습용, 가려움 개선용 또는 피부장벽강화용일 수 있다.

본 발명은 미숙과 인삼열매 추출물을 화장료 조성물 총 중량 대비 0.001~30중량%로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 미숙과 인삼열매 아임계추출물은 아임계 조건에서 추출한 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하며, 미숙과 인삼열매 아임계추출물은 완숙과 인삼열매 추출물보다 진세노사이드 Rg3 함량이 6.7배, Rh4 함량이 6.3배, Rk1 함량이 6.4배 높은 것을 특징으로 한다.

또한, 미숙과 인삼열매 아임계추출물은 자유라디칼활성 및 멜라닌생성을 억제하여 항산화 및 미백효과를 나타내며, LPS에 의해 유도된 염증 반응을 저해하여 항염 효과를 나타내고, AQP-3의 발현을 촉진함으로 피부 보습에 효과를 갖으며, TRPV1의 발현억제 및 SPT 발현활성을 통해 가려움증 개선 및 피부장벽강화 효과를 나타낸다.

도 1은 미숙과(실시예 1) 및 완숙과(비교예 1) 인삼열매 추출물의 진세노사이드 총 함량 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 미숙과 및 완숙과 인삼열매 추출물의 Rh4의 함량을 분석 비교한 도면이다.
도 3은 미숙과 및 완숙과 인삼열매 추출물의 Rg3의 함량을 분석 비교한 도면이다.
도 4는 미숙과 및 완숙과 인삼열매 추출물의 Rk1의 함량을 분석 비교한 도면이다.
도 5는 미숙과 및 완숙과 인삼열매 추출물의 TRPV1 발현 억제율을 비교한 도면이다.
도 6은 미숙과 및 완숙과 인삼열매 추출물의 SPT 발현율을 비교한 도면이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 미숙과 인삼열매의 아임계 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 “미숙과 인삼열매”란, 인삼열매가 붉은색으로 성숙되기 전인 6월 중순경에 채취한 인삼열매를 가리킨다. 본 발명에서 "미숙과 인삼열매"는 종자를 제거하거나, 종자를 제거하지 않은 것 모두를 의미한다. 보다 바림직하게는 종자를 제거한 미숙과 인삼열매일 수 있다.

본 발명의 미숙과 인삼열매 추출물은 아임계추출법(Subcritical extraction), 초고압추출법 및 용매추출법으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 추출 방법으로 추출된 것일 수 있다. 바람직하게는 미숙과 인삼열매를 40~200℃, 1기압(14.69psi) 내지 122기압(1792psi)의 아임계추출법 조건에서 추출하는 아임계 추출물일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 아임계추출법은 80~150℃ 및 1기압(14.69psi)~10기압(146.96psi)의 추출 조건일 수 있다. 특히, 본 발명의 아임계 추출법은 적은 양의 소재와 용매로 짧은 시간 안에 높은 추출효율을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 미숙과 인삼열매 아임계추출물의 진세노사이드 함량 확인을 위하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 이를 통해 본 발명의 미숙과 인삼열매 아임계 추출물이 완숙과 인삼열매 아임계추출물과 비교하여 더 많은 Rh4, Rg3 및 Rk1을 함유하는 것을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 초고압 추출법은 100 내지 3000Mpa의 압력에 40 내지 90℃의 온도로 1 내지 24시간 동안 처리하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 500 내지 1,000Mpa의 압력에서 40 내지 60℃의 온도로 12 내지 24시간 처리할 수 있고, 보다 바람직하게는 1,000Mpa의 압력 및 50℃의 온도에서 24시간 동안 처리할 수 있다.

본 발명에 따른 용매 추출법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 통상의 용매를 이용할 수 있다. 통상의 용매로는, 물, 탄소수 1 내지 4의 무소 또는 함수 저급 알코올(예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콘, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 용매일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 미숙과 인삼열매 추출물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.001~30%로 포함하는 것이 바람직하다.

상기 미숙과 인삼열매 추출물을 함유하는 화장료는 화장품 제품으로 피부컨디셔닝제, 스킨, 로션, 크림, 에센스, 클렌징 제품, 마사지크림, 파우더, 마스크팩, 영양크림, 영양에센스, 선크림, 바디크림, 바디로션, 핸드크림 등 어느 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 어느 하나에 제한되지 않는다.

이하에서는 실시예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 이들 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 미숙과 인삼열매 아임계 추출물 제조

미숙과 인삼열매를 정제수로 세척하고, 건조하여 모두 분쇄하였다. 미숙과 인삼열매 분쇄물에 100 g/L가 되도록 정제수를 첨가하여 100℃, 5기압의 조건으로 추출하여, 냉각하고 여과지(Whatman No.2 filter paper, Maidstone, UK)로 여과한 다음 감압농축 및 동결건조하여 미숙과 인삼 열매 아임계 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 미숙과 인삼열매 초고압 추출물 제조

미숙과 인삼열매를 정제수로 세척하고, 건조하여 모두 분쇄하였다. 미숙과 인삼열매 분쇄물 100 g을 초고압처리기를 이용하여 압력 1000 MPa에서 온도를 50℃로 승온시킨 후 24시간 동안 처리한 다음 실온으로 냉각시켰다. 냉각물을 냉각하고 여과지(Whatman No.2 filter paper, Maidstone, UK)로 여과한 다음 감압농축 및 동결건조하여 미숙과 인삼열매 초고압 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 미숙과인삼열매 용매추출물 제조

미숙과 인삼열매를 정제수로 세척하고, 건조한 다음 모두 분쇄하였다. 미숙과 인삼열매 분쇄물에 100 g/L가 되도록 70%(v/v) 에탄올을 첨가하여 5시간 환류추출 후 냉침하고, 여과지(Whatman No.2 filter paper, Maidstone, UK)로 여과한 후 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하여 미숙과 인삼열매 용매추출물을 제조하였다.

비교예 1: 완숙과 인삼열매 아임계추출물 제조

완숙과 인삼열매를 정제수로 세척하고 종자를 제거하고, 건조한 다음 모두 분쇄하였다. 완숙과 인삼열매 분쇄물에 100 g/L가 되도록 정제수를 첨가하여 100℃, 5기압의 조건으로 추출하여, 냉각하고 여과지(Whatman No.2 filter paper, Maidstone, UK)로 여과한 다음 감압농축 및 동결건조하여 완숙과 인삼열매 아임계추출물을 제조하였다.

실험예 1: 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC )를 활용한 진세노사이드 총 함량 분석

본 실험에서는 실시예 1과 비교예 1의 추출물에 함유된 진세노사이드의 총 함량을 HPLC를 사용하여 분석하였다.

실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 1 mg씩 채취하여 정제수 1 ml에 용해하여 1000 ppm 시료를 제조하였다. 분석조건은 하기 표 1과 같다. 실험결과는 도 1에 나타내었다.

No	시간	Flow	% Acetonitrile	% 0.1 Formic acid	조작조건
1	0	1.0	10	90	검출기 : 자외부흡광광도계 (203 nm)
2	10	1.0	10	90
3	60	1.0	60	40
4	61	1.0	90	10
5	75	1.0	90	10
6	76	1.0	10	90
7	90	1.0	10	90

도 1을 보면, 진세노사이드 함량에 있어서, 실시예 1 및 비교예 1의 물질 함량 스펙트럼의 차이가 있음을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 1에 함유된 성분의 총 함량이 비교예 1의 함량 보다 높게 측정되었으며, 실시예 1에서만 높게 측정된 진세노사이드가 있음을 확인하였다.

실험예 2: 고속액체크로마토그래피( HPLC )를 활용한 진세노사이드 Rh4 함량 분석

본 실험에서는 실시예 1과 비교예 1의 진세노사이드 Rh4 성분의 함량을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 표준품으로는 진세노사이드 Rh4를 사용하였고, 실시예 1과 비교예 1의 진세노사이드 Rh4의 함량과 비교하였다.

실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 1 mg씩 채취하여 정제수 1 ml에 용해하여 1000 ppm시료를 제조하였다. 분석조건은 상기 표 1과 같다.

실험결과는 도 2에 나타내었다. 도 2를 보면, Rh4의 함량은 실시예 1에서 8892.536 ppm으로 나타났고, 비교예 1에서 1412.471 ppm으로 나타났다. 실시예 1이 비교예 1 보다 진세노사이드 Rh4의 함량이 약 6.3배 높다는 것을 확인하였다.

실험예 3: 고속액체크로마토그래피( HPLC )를 활용한 진세노사이드 Rg3 함량 분석

본 실험에서는 상기 실시예 1과 비교예 1의 진세노사이드 Rg3 성분의 함량 을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 표준품으로는 진세노사이드 Rg3을 사용하였고, 실시예 1과 비교예 1의 진세노사이드 Rg3의 함량과 비교하였다.

실험결과는 도 3에 나타내었다. 도 3을 보면, Rg3의 함량은 실시예 1에서 12622.993 ppm으로 나타났고, 비교예 1에서 1870.211 ppm으로 나타났다. 실시예 1이 비교예 1 보다 진세노사이드 Rg3의 함량이 약 6.7배 높다는 것을 확인하였다.

실험예 4: 고속액체크로마토그래피( HPLC )를 활용한 진세노사이드 Rk1 함량 분석

본 실험에서는 상기 실시예 1과 비교예 1의 진세노사이드 Rk1 성분의 함량을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 표준품으로는 진세노사이드 Rk1을 사용하였고, 실시예 1과 비교예 1의 진세노사이드 Rk1의 함량과 비교하였다.

실시예 1 및 비교예 1의 추출물을 각각 1 mg씩 채취하여 정제수 1 ml에 용해하여 1000 ppm 시료를 제조하였다. 분석조건은 상기 표 1과 같다.

실험결과는 도 4에 나타내었다. 도 4를 보면, Rk1의 함량은 실시예 1에서 84.000 ppm으로 나타났고, 비교예 1에서 13.034 ppm으로 나타났다. 실시예 1이 비교예 1 보다 진세노사이드 Rk1 함량이 약 6.4배 높다는 것을 확인하였다.

실험예 5: DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

DPPH법을 이용하여 항산화 효과(자유라디칼 소거율)를 측정하였다.

항산화 측정법 중에 대표적인 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma) 라디칼은 유기 용매에 녹은 상태에서 540nm에서 최대 흡광도를 가지게 되는데, 이때 항산화 물질은 DPPH 라디칼을 소거하여 고유의 색을 잃고 황색으로 변화시킨다. 사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 자유라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 메탄올에 용해하여 100 ml로 한다. 측정방법으로서, 96-웰 플레이트에 0.1 mM DPPH 용액 0.15 ml에 시료 용액 0.15 ml를 가하여 빨리 교반하고, 25℃에서 10 분간의 배양을 개시한 후, 560 nm에서의 흡광도 A를 측정하였다. 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 0.1 mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 A를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 C를 측정하였다. 공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 A를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 B를 측정하였다. 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1 mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 A를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 D를 측정하였다.

자유라디칼 소거율(%)의 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기의 표 2와 같다.

[수학식 1]

A : 시료의 자유라디칼 소거 후의 540 nm에서의 흡광도

B : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 540 nm에서의 흡광도

C : 시료의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 540 nm에서의 흡광도

D : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 540 nm에서의 흡광도

구분	시료처리농도(μg/ml)	DPPH 저해율(%)
대조군1	0	-
대조군2 (Ascorbic acid)	10 μM	83.8
실시예1	100 ug/ml	86.1
실시예2	100 ug/ml	78.5
실시예3	100 ug/ml	56.7
비교예1	100 ug/ml	53.9

실험결과, 실시예 1의 DPPH 라디컬 저해율이 86.1%로 비교예 1의 53.9% 보다 우수한 것을 확인할 수 있었다. 실시예 2 및 3의 DPPH 라디컬 저해율도 비교예 1보다는 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 멜라닌 생성 억제 평가

피부 미백효능을 확인하기 위해 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였다.

본 실험예에서 사용한 B16F10 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포로 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다. B16F10(멜라닌 형성 세포)를 96웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴ cells/well의 농도로 접종하여 세포를 부착시킨 후 100 nM α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)를 처리하여 멜라닌 생합성을 유도한 후, 실험군으로 상기 실시예 1~3 및 비교예 1에서 수득된 인삼열매 추출물을 독성을 유발하지 않는 하기 표 3의 농도로 각각 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 멜라닌 생성량을 측정하기 위해 마이크로플레이트 판독기로 405 nm의 흡광도에서 멜라닌 생성량을 측정한 후, 세포 생존율을 확인하기 위해 MTT를 처리하여 540 nm의 흡광도를 측정하여 세포생존율을 동시에 확인하였다.

α-MSH는 멜라노사이트에서 멜라닌 생합성을 유도하는 물질로, 멜라닌 생성 저해 실험에서 멜라닌 생합성을 유도하기 위해 사용되는 물질이다.

[수학식 2]

A: 100 nM α-MSH를 처리한 웰의 멜라닌양

B: 시료를 처리한 웰의 멜라닌양

[수학식 3]

C: 시료를 처리하지 않은 웰의 흡광도

D: 시료를 처리한 웰의 흡광도

구분	100 nM α-MSH	시료처리농도 (μg/ml)	멜라닌 합성율(%)	세포생존율(%)
대조군 1	-	-	13.2	99.6
대조군 2	100 nM	-	100.0	100.0
실시예 1	100 nM	100 ug/ml	32.2	102.6
실시예 2	100 nM	100 ug/ml	44.7	101.5
실시예 3	100 nM	100 ug/ml	58.4	100.7
비교예 1	100 nM	100 ug/ml	73.5	99.7

표 3을 보면, 멜라닌 생합성 저해 확인 실험 결과, α-MSH로 유도된 멜라닌 생성량(대조군 2)과 비교하여, 실시예 1은 32.2%, 비교예 1은 73.5%의 멜라닌 합성율을 확인하였다. 결과적으로 실시예 1과 비교예 1의 멜라닌 생성 저해율은 각각 67.8%, 26.5%임을 확인하였다.

실험예 7: NO(Nitric Oxide) 생성 저해 확인

NO 생성 저해 시험을 통한 항염 효능을 확인하였다.

마우스대식세포인 RAW 264.7 세포는 ACTT (American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였다. 배양된 RAW264.7 세포는 5x10⁴ cells/well의 농도로 96웰플레이트에 접종하여 안정화시킨 다음, LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 NO 생성을 유도시킨다. 4시간 후 실시예 1~3 및 비교예 1을 하기 표 4의 농도로 각 웰에 처리하고, 24시간 배양 후 배양액을 이용하여 NO assay kit(Promega)를 이용하여 발생시켜, 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 NO 생성량을 측정하여 생성 저해율을 측정하였다.

구분	LPS	시료처리농도	NO 생성량(μM)
대조군1	-	-	2.1
대조군2	1 μg/ml	-	10.3
실시예1	1 μg/ml	100 μg/ml	3.8
실시예2	1 μg/ml	100 μg/ml	6.2
실시예3	1 μg/ml	100 μg/ml	8.9
비교예1	1 μg/ml	100 μg/ml	7.6

LPS는 대식세포에서 염증을 유도하는 물질로, LPS 처리 후 NO 생성량이 증가한다. LPS로 염증반응을 유도하여 실험을 진행한 결과, NO 생성량이 대조군 2는 10.3 μM, 실시예 1 및 비교예 1은 각각 3.8 μM, 7.6 μM로 나타났다. 결론적으로 NO 생성저해율은 실시예 1, 비교예 1은 각각 63.1%, 26.2% 저해율을 나타내었다.

실험예 8: AQP -3 생성량 비교

보습 효과를 확인하기 위해 피부 수분채널인 AQP-3의 생성량 비교 확인을 하였다. 사람각질생성세포인 케라티노사이드(keratinocytes)를 24웰 플레이트에 1x10⁴ cells/well 의 농도로 접종한 후 안정화시킨 후, 실시예 1~3 및 비교예 1을 각 웰에 처리하고 48시간 동안 무혈청 배지에서 배양시켰다. 배양된 배양액을 이용하여 아쿠아포린(Aquaporin)-3의 생성량을 확인하기 위해 ELISA kit를 사용하여 분석을 진행하였고, 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타냈다.

구분	시료처리농도(μg/ml)	AQP-3 생성율(%)
대조군 1	-	100
실시예 1	100 μg/ml	179.4
실시예 2	100 μg/ml	138.2
실시예 3	100 μg/ml	126.8
비교예 1	100 μg/ml	142.1

실험 결과, 대조군 1에 비교하여 실시예 1과 비교예1은 각각 179.4%, 142.1%의 AQP-3의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 비교예 1과 비교하여 실시예1이 AQP-3발현율이 약 37.3% 우수한 것을 확인하였다.

실험예 9: TRPV1 발현 억제율 확인

피부 가려움 개선 효능을 확인하기 위해 TRPV1 발현량을 확인하였다.

사람유래 각질형성세포(HaCaT, Human keratinocyte)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였다. HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 1x10⁵ cells/well의 농도로 세포를 접종하여 안정화시킨 후, TRPV1의 발현을 위하여 캡사이신 처리와 동시에 실험 시료를 처리하였다. 이후, 24시간 배양 후, 용균 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 단백질을 용균(lysis)하였다. 이후 단백질 BCA 방법으로 단백질을 정량하여 20 ㎍의 단백질을 취하여 SDS-PAGE를 진행하였다. 그 후, PVDF membrane으로 트랜스퍼(transfer) 후 anti-TRPV1을 1:1000으로 냉장에서 4℃에서 24시간 처리한 다음 검출하였다. 각 밴드는 베타-액틴(β-actin)으로 정량하고 imageJ 1.47 소프트웨어를 이용하여 수치화하여 그래프로 나타내었다. 그 결과를 표 6 및 도 5에 에 나타냈다.

구분	캡사이신 처리농도	시료처리농도(μg/ml)	TRPV1 발현 억제율(%)
대조군1	-	-	-
대조군2	100 nM	-	-
실시예1	100 nM	100 μg/ml	79.6
실시예2	100 nM	100 μg/ml	64.7
실시예3	100 nM	100 μg/ml	32.1
비교예1	100 nM	100 μg/ml	59.2

캡사이신은 각질형성세포의 TRPV1의 단백질 발현을 유도하는 물질로, TRPV1이 발현되는 정도로 자극 정도를 확인할 수 있다. 실험 결과, 표6에서 나타낸 것과 같이 실시예 1 및 비교예 1의 TRPV1 발현 억제율이 각각 79.6%, 59.2%로 나타났으며, 실시예 1이 TRPV1의 발현을 가장 많이 억제함을 확인하였다. 이로써, 자극 완화에 있어서 실시예 1의 추출물이 비교예 1의 추출물보다 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 10: SPT ( Serine - palmitoyltransferase ) 발현 증가율 확인

피부 장벽 강화 효과를 확인하기 위하여 실시예 1~3 및 비교예 1의 SPT 발현율을 확인하였다. SPT는 세라마이드의 전구제인 Serine Palmitoly CoA를 세라마이드로 합성하는데 중요한 역할을 하는 인자이다.

각질형성세포(HaCaT)세포를 배양하여 1x10⁵ cells/well의 농도로 6 웰플레이트에 접종하여 24시간동안 안정화시켰다. 시험 시료 처리 후 24시간 동안 배양하고, 용균 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 단백질을 용균(lysis)하였다. 이후 단백질 BCA 방법으로 단백질을 정량하여 20 ㎍의 단백질을 취하여 SDS-PAGE를 진행하였다. 그 후, PVDF membrane으로 트랜스퍼(transfer) 후 Anti-serine-palmitoyltransferase(Abcam, USA)을 1:1000으로 냉장에서 4℃에서 24시간 처리 한 다음 검출하였다. 각 밴드는 베타-액틴(β-actin)으로 정량하고 imageJ 1.47 소프트웨어를 이용하여 수치화하여 그래프로 나타내었다. 그 결과를 표 7 및 도 6에 나타냈다.

구분	시료처리농도(μg/ml)	SPT 발현율(%)
대조군1	-	100
실시예1	100 μg/ml	183.4
실시예2	100 μg/ml	167.8
실시예3	100 μg/ml	134.7
비교예1	100 μg/ml	150.6

SPT는 피부장벽을 구성하는 물질 중 중요한 역할을 하는 세라마이드 생합성에 관여한다. 실험 결과, 표 7에 나타낸 것과 같이 실시예 1 및 비교예 1에서 SPT 발현율이 각각 183.4%, 150.6%로 확인되었다. 실시예 1~3 중, 실시예 1이 비교예 1보다 SPT 발현율이 약 30% 이상 높게 나타났으며 이를 통해 실시예 1의 우수한 피부 장벽 강화 효과가 확인되었다.

Claims

아임계추출법으로 추출된 미숙과 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항산화용 또는 피부 미백용 화장료 조성물.
아임계추출법으로 추출된 미숙과 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부 보습용 또는 피부장벽강화용 화장료 조성물.
아임계추출법으로 추출된 미숙과 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부 가려움 개선용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미숙과 인삼열매 추출물은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.001~30 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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