KR20150137349A - 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것으로 본 발명을 통하여 인삼열매 추출물이 염증 반응을 주도하는 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 억제하는 결과를 획득함으로써 인삼열매 추출물이 보이는 염증억제 효능을 보이는 것을 확인하였다.

Description

인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물{A COMPOSITION FOR ANTI-INFLAMMATION COMPRISING GINSENG BERRY EXTRACT}

본 발명은 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

인삼열매 (진생베리, ginseng berry)는 종자, 종피, 과육, 과피로 구분된다. 5월말에는 녹색의 인삼열매가 달리고 7월말에는 빨간색으로 익게 된다. 인삼은 뿌리가 널리 사용되어 왔는데 주성분의 일종인 진세노사이드의 생물학적 효능 때문이다. 인삼열매도 인삼근과 마찬가지로 진세노사이드를 포함하고 있어서 다양한 생물학적 효능을 보이는 것으로 알려져 있다.

염증이 만성적으로 진행되면 당뇨, 동맥경화를 포함한 심혈관계 질환, 대사질환, 치매 등 뇌 퇴행성 질환을 유발하며, 암과 같은 악성 질환과 알러지, 천식 등 과민성 질환이 야기되는 인체질환 중 가장 도전하기 어려운 질병이다. 항염증제 시장 규모의 증가는 노인인구의 증가와 식생활의 서구화 등 국내 환경의 변화로 만성 염증성 질환 환자가 급증하고 있음을 시사하고 있다. 염증은 상처 등과 같은 물리적 자극이나 외부의 독성물질, 미생물 감염에 대한 일련의 생체 방어 기능이다.

염증반응은 침입한 미생물을 제거하고 손상된 조직의 재생을 촉진시켜 생체의 정상적 생리 기능을 회복시킨다. 정상적인 염증반응은 매우 성공적인 생체 방어기작이지만 염증과정이 종결되지 않고 지속으로 진행되면 질병상태가 된다. 염증반응에 의한 조직 손상은 주로 염증 주변 조직에 임파구나 백혈구 등의 면역세포들이 과다하게 침입됐거나, 염증 조직 부위에 콜라겐이 과다하게 축적된 경우, 활성 산소 생성에 의한 DNA 손상 등에 의하여 유발된다고 알려져 있다. 만성적 염증은 신경염증질환, 동맥경화, 염증성 장질환, 관절염, 위염, 간염, 알레르기성 천식 및 비염, 당뇨병, 그리고 악성 종양 등 많은 질병에 수반되는 증상이다. 고령 인구의 증가로 인한 염증성 질환의 증가는 세계적인 추세이며, 산업의 변화에 따라 염증성 질환의 양상도 변화되고 있다. 따라서, 다양한 염증 반응을 적절히 제어하기 위한 방법이 필요하다.

NF-kB(Nuclear Factor-kappa B) 단백질은 염증반응과 면역기능, 노화, 종양 등에 관계하는 다양한 신호전달 합성을 조절하는 전사인자 단백질이다. NF-kB는 p50(NFκB1), p52(NFκB2), p65(Rel-A), c-Rel과 Rel-B와 같은 Rel 계 동종이량체 (homodimer)나 이종이량체 (heterodimer)로 이루어져 있으며, inhibitory κB (IκB)라 불리는 저해성 분자와 결합하여 불활성화된 상태로 세포질에 존재한다. 염증신호가 세포내로 전달되면 IKK(IκB kinase)에 의해 IκB가 인산화되어 일련의 분해과정을 통해 단백분해 됨으로써 NFkB는 활성형태로 되어 핵으로 이동하여 표적 유전자의 전사(transcription)를 야기시킨다. NFkB 활성에 관여하는 인자들은 TNF-α, lymphotoxin과 IL-1β, mitogens, LPS(lipopolysaccharide) 등이 있다.

현재까지 알려진 NF-kB의 표적 유전자는 60여개 이상이 보고되었으며, 다양한 염증반응에서 중추적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 NF-kB의 활성을 적절하게 제어할 수 있다면, 만성관절염, 퇴행성관절염, 위염과 간염등과 같은 다양한 만성 염증 질병뿐만 아니라 치매, 우울증, 파킨슨씨병 등과 같은 퇴행성 뇌질환의 예방과 치료제의 새로운 선도 물질로 개발할 수 있다.

[선행 기술문헌]

J Ginseng Res. 2013 Mar; 37(1): 54-63. doi: 10.5142/jgr.2013.37.54.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 항염증용 소재물질을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 추출물은 인삼 열매 유기 용매 추출물이 바람직하고, 알코올 추출물인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 추출물은 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 억제하는 것이 바람직하고, TNFα에 의한 매트릭스-메탈로프로티나제(MMP)-9 mRNA 발현을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 완화 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼클링징, 립스틱, 메이크업베이스 또는 비누 형태인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 인삼 열매 추출물 유래 진세노사이드 Rd 및 진세노사이드 Rh1 중 하나 이상의 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보에이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제,내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 인삼 열매 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태,질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 염증 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.

상기 염증질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 본 발명의 추출물을 함유하는 화장품 이외에도 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 여고, 스프레이 또는 콘실 스틱(Conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다.또한, 포말(Foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 인삼 열매 추출물에 추가로 지방 물질,유기 용매, 용해제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(Foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제,습윤화제, 필수오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩,비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 인삼열매 추출물의 항염증 효과를 검증하기 위하여 대표적 염증성 싸이토카인인 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 염증 모델 신호로 이용하였다. 본 발명을 통하여, 인삼열매 추출물이 염증 반응을 주도하는 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 억제하는 결과를 획득함으로써 인삼열매 추출물이 보이는 염증억제 효능을 확보하였다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 인삼열매 추출물이 염증 반응을 주도하는 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 억제하는 결과를 획득함으로써 인삼열매 추출물이 보이는 염증억제 효능을 보이는 것을 확인하였다.

도 1은 인삼열매 건조물 사진
도 2는 진세노사이드 Rd (빨간색)와 인삼열매 추출물 (파란색)의 크로마토그램을 중첩시킨 결과
도 3은 진세노사이드 Rh1 (빨간색)와 인삼열매 추출물 (파란색)의 크로마토그램을 중첩시킨 결과
도 4는 염증성 싸이토카인인 TNFα 자극에 의해 증가되는 NF-kB 인산화를 인삼열매 추출물에 의해 억제시키는 효과를 면역블롯법을 이용하여 조사한 것
도 5는 인삼열매 추출물이 염증성 싸이토카인인 TNFα 자극에 의해 증가되는 MMP-9 유전자 발현을 억제시키는 효과를 Real-time PCR법을 이용하여 조사한 것

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1. 인삼열매 추출물의 확보

우리나라 인삼 재배지에서 5월에 수확하는 인삼열매 미숙과 (녹색열매) 또는 7월부터 10월까지 수확하는 인삼열매 성숙과 (빨간색열매)를 확보하였다. 이 인삼열매를 건조하여 도 1과 같은 건조물을 얻었다.

상기 건조물에 에탄올을 같은 양으로 3일간 침지한 후, 추출하였고 이 과정을 3회 반복하여 에탄올 추출물을 확보하였다. 추출물을 동결건조하였다.

실시예 2. 인삼열매 추출물이 함유한 진세노사이드의 분석

진세노사이드를 분석하기 위한 장비는 고성능액체크로마토그라피 (HPLC : Agilent 1100 series)를 사용하였다. 분석에 사용한 컬럼은 역상 C18 컬럼 (Symmetry C18 4.6 X 250mm 5)을 사용하였다. 분석을 위한 이동상은 물에 아세토니트릴 (acetonitrile)을 그래디언트(gradient)로 20%에서 70%까지 변화시키면서 사용하였다. 분석온도는 35℃였고, 분석을 위한 유속 (flow rate)은 1.0 mL/min 으로 하였고, 시료의 주입부피 (injection volume)은 10내지 20 uL로 하였다. 검출은 자외선분광기 203 nm로 하였다. 인삼열매 추출물은 10 mg/mL의 농도로 메탄올에 녹여서 고성능액체크로마토그라피 분석을 위한 시료로 준비하였다. 진세노사이드의 표준품은 1 mg/mL의 농도로 메탄올에 녹여서 준비하였다.

위의 분석 조건에서 진세노사이드 Rd는 38분의 머무름 시간 (retention time)에서 검출되었고 두가지 크로마토그램을 겹쳐서 보면 도 2와 같이 동일한 머무름 시간에서 피크 (peak)가 관찰되어서 인삼열매 추출물에 진세노사이드 Rd가 함유된 결과를 얻었다. 빨간색의 크로마토그램은 진세노사이드 Rd이고 파란색은 인삼열매 추출물을 나타내는데 38분의 머무름 시간에서 Rd의 peak이 일치하였기 때문에 인삼열매 추출물에는 Rd가 함유된 것을 확인할 수 있었다.

위의 분석 조건에서 진세노사이드 Rh1은 11분의 머무름 시간 (retention time)에서 검출되었고 이 때 얻은 두가지 크로마토그램을 겹쳐서 보면 아래 도 3과 같이 동일한 머무름 시간에서 피크 (peak)가 관찰되어서 인삼열매 추출물에 진세노사이드 Rh1이 함유된 결과를 얻었다. 빨간색의 크로마토그램은 진세노사이드 Rh1이고 파란색은 인삼열매 추출물을 나타내는데 11분의 머무름 시간에서 Rh1의 peak이 일치하였기 때문에 인삼열매 추출물에는 Rh1이 함유된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 면역블롯법을 이용한 인삼열매 추출물의 NF - kB ( nuclear factor - kappa B) 활성억제 효과

MDA-MB-231세포를 ATTC(American Type Culture Collection)로부터 구입하여 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies) 포함한 DMEM/F12(Invitrogen Life Technologies) 배양액을 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에 1 x 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

인삼열매 추출물에 의한 NF-kB 활성 억제 효과를 분석하기 위하여, MDA-MB-231 세포에 대표적 염증성 싸이토카인인 TNFα (sigma에서 구입)를 10 ng/ml 농도로 단독 처리하거나, TNFα 처리 30분전에 20μM 농도의 인삼열매 추출물을 처리하였다. TNFα 처리하고 60분 경과 후에 세포를 수확하여, 20mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 10㎍/㎕ Leupeptin, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 완충용액으로 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 세포 용해액만을 수확하였다. 동량의 단백질이 포함되도록 제조된 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포에 존재하는 단백질들을 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 폴리스틸렌 막(polystyrene membrane)으로 옮긴 후 인산화 형태의 NF-kB (Ser 536)만을 인지하는 일차 항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)와 대조군으로서 단백질 발현이 변화되지 않는 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 인지하는 일차항체(Santa Cruz technology 회사에서 구입)를 각각 5시간 반응 시킨 후, 일차항체를 인지하는 이차항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)를 1시간 동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템(chemiluminescence)(Amersham Pharmacia Biotechnology에서 구입)을 이용하여 단백질 변화량을 분석하였다.

그 결과 도 4에 나타난바와 같이 TNFα를 MDA-MB-231 세포에 처리하면 대조단백질인 GAPDH의 양은 변하지 않았지만, p65/NFkB 단백질의 serine 536 잔기에서 각각 인산화 형태가 증가하였다. 이와 같은 결과는 TNFα가 NF-kB 활성형의 인산화 형태가 증가된 것을 의미한다. 총 15종의 진세노사이들을 TNFα와 병행 처리해 주었고, 그 결과 진세노사이드 Rg1, Rd, Rh1, CK, Rh2, F2, F11, RT5, R1은 TNFα에 의한 NF-kB의 인산화 증가가 나타나지 않았다. 이들 진세노사이드 중 Rd, Rh1은 인삼열매 추출물에서 검출되었기 때문에 인삼열매 추출물은 진세노사이드 Rd, Rh1을 통하여 염증반응에 의해 활성되는 NF-kB를 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 실시간 중합효소반응( Real - Time Polymerase Chain Reaction ; Real - time PCR)법을 이용한 인삼열매 추출물의 MMP -9 유전자 발현 억제 효과

상기의 MDA-MB-231 세포에 TNFα 단독 또는 TNFα와 인삼열매 추출물을 병행처리한 후 24 시간 후에 세포를 수확하여 Trizol RNA extraction kit (QIAGEN 회사에서 구입)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA 0.5 ㎍을 역전사반응으로 1차 가닥(first strand) cDNA를 합성하고 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-RAD회사에서 구입)를 이용하여 이중나선 cDNA를 합성하였다. 이중나선 cDNA 0.0125㎍ 으로 PCR을 이용하여RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 후 TaqMan-iQ supermix kit (Bio-Rad 회사에서 구입)를 이용하여 PCR을 수행하였다. MMP-9 mRNA 측정을 위한 TaqMan probe 염기서열은 5′-FAM-cctccaaccaccaccacaccgcagc-BHQ-1-3′ 이었으며, normalize용 대조군으로써 사용한 GAPDH mRNA 측정을 위하여 사용한 TaqMan probe 염기서열은 5′-Yakima Yellowcgtcgccagcccagccacgc-BHQ-1-3′ 이었다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 TNFα를 MDA-MB-231 세포에 처리하면 MMP-9 mRNA는 약 20배 증가하였다. 총 15종의 진세노사이들을 TNFα와 병행 처리해 주었고, 그 결과 진세노사이드 Rb1, Rg1, Rd, Rh1, Rc, Rg3, F2, Re은 TNFα에 의한 NF-kB의 인산화 증가가 나타나지 않았다. 이때 인삼열매 추출물 성분 중 Rd, Rh1은 TNFα에 의한 MMP-9 mRNA 발현을 현저하게 감소시켰다. 이상의 결과를 통하여, 본 발명의 인삼열매 추출물은 포함된 Rd, Rh1을 통하여 염증환경에서 NF-kB 활성을 억제시켜 염증 반응을 억제시킨 다는 사실을 확인하였다.

Claims (9)

1. 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 인삼 열매 유기용매 추출물인 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 유기 용매는 알코올인 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 TNFα에 의한 매트릭스-메탈로프로티나제(MMP)-9 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 약학 조성물.
6. 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 완화 및 개선용 화장료 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼클링징, 립스틱, 메이크업베이스 또는 비누 형태의 화장료 조성물.
8. 인삼 열매 추출물 유래 진세노사이드 Rd 및 진세노사이드 Rh1 중 하나 이상의 진세노사이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 진세노사이드는 TNFα에 의한 NF-kB 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염증용 조성물.
   
   

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