KR102001137B1 - 시료채취장치, 그 제조방법, 및 이를 이용한 시료채취방법 - Google Patents

시료채취장치, 그 제조방법, 및 이를 이용한 시료채취방법 Download PDF

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Abstract

시료채취장치는 반응용기, 온도조절부재, 및 PNA 어셈블리를 포함한다. 상기 온도조절부재는 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절한다. 상기 PNA 어셈블리는 생화학적으로 안정된 물질로 구성되는 다공성매질을 포함하는 기저층 및 상기 기저층의 표면에 부착되고 아미노기를 포함하는 결합부를 포함하는 다공성기판과, 상기 다공성기판의 상기 결합부에 연결되고 3 mer 내지 20 mer 정도의 길이를 갖는 연결소자와, 상기 연결소자의 단부에 연결되며 DNA의 인산-리보스당이 아마이드로 치환된 DNA 유사물질인 PNA를 포함하고 온도가 용융온도보다 낮으면 단일결합(Single Strand) 상태의 타깃유전자를 강하게 결합하며 온도가 상기 용융온도보다 높은 경우 상기 결합된 타깃유전자를 분리하여 배출하는 포획 PNA 프로브를 포함하며, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시킨다.

Description

시료채취장치, 그 제조방법, 및 이를 이용한 시료채취방법{SAMPLE PREPARATION DEVICE, METHOD OF MANUFACTURING THE SAME, AND METHOD OF PREPARING SAMPLE USING THE SAME}
본 발명은 시료채취장치, 그 제조방법, 및 이를 이용한 선택적 시료채취방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, PNA를 이용하여 유전물질을 포함하는 시료를 선택적으로 채취하는 장치, 그 제조방법, 및 이를 이용한 시료채취방법에 관한 것이다.
유전자기술의 발달로 인하여 생물체의 고유한 표지인 유전자를 분석하는 다양한 기술들이 개발되어 왔다. 최근에는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 시료 내에 존재하는 소량의 유전자를 증폭하여 분석하는 기술이 널리 사용되고 있다.
그런데 시료 내의 전체 유전자를 분석하는 것은 많은 시간이 소요된다. 또한 관심의 대상이 되는 유전물질 외에 다른 유전물질이 일종의 노이즈로 작용하여 검사결과의 신뢰성이 저하된다.
한편 유전자를 검사하기 위해서는 생물체의 세포, 바이러스, 세균, 등으로부터 유전자를 분리하여 채취하는 단계가 필요하다.
유전자를 채취하기 위해서는 세표벽과 핵막을 파괴한 후에 유전자만을 분리하여야 하는데, 종래의 유전자를 채취하는 방법은 여러 차례 원심분리, 세정, 등의 과정을 거쳐야 하기 때문에 유전자 채취 자체에 적지 않은 시간이 소요된다.
또한 각 단계의 중간에 피펫 등을 이용하여 유전자를 뽑아내거나 용액을 혼합하는 과정을 거치는데, 고도로 숙련된 작업자가 요구되어 비용이 증가한다.
또한 시료채취과정에서 외부의 오염물질 또는 인접하는 시료들 사이의 혼합에 의해 오류가 발생할 수 있다.
대한민국공개특허 제10-2008-0081750호, 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 PNA 프로브, 키트 및 방법 (2008. 9. 10.)
본 발명의 목적은 PNA를 이용하여 유전물질을 포함하는 시료를 선택적으로 채취하는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 시료채취장치의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 시료채취장치를 이용한 시료채취방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 시료채취장치는 반응용기, 온도조절부재, 및 PNA 어셈블리를 포함한다. 상기 반응용기는 타깃유전자 및 잔류유전자를 포함하는 시료가 주입되는 반응공간, 상기 반응공간의 하부에 배치되며 상기 잔류유전자가 배출되는 배출공간, 및 상기 배출공간의 하부에 배치되어 상기 배출공간을 통해 저류된 물질이 배출되는 배출구를 포함하였다. 상기 온도조절부재는 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절한다. 상기 PNA 어셈블리는 생화학적으로 안정된 물질로 구성되는 다공성매질을 포함하는 기저층 및 상기 기저층의 표면에 부착되고 아미노기를 포함하는 결합부를 포함하는 다공성기판과, 상기 다공성기판의 상기 결합부에 연결되고 3 mer 내지 20 mer 정도의 길이를 갖는 연결소자와, 상기 연결소자의 단부에 연결되며 DNA의 인산-리보스당이 아마이드로 치환된 DNA 유사물질인 PNA를 포함하고 온도가 용융온도보다 낮으면 단일결합(Single Strand) 상태의 타깃유전자를 강하게 결합하며 온도가 상기 용융온도보다 높은 경우 상기 결합된 타깃유전자를 분리하여 배출하는 포획 PNA 프로브를 포함하며, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시킨다. 상기 용융온도는 포획 PNA 프로브와 타깃유전자의 결합정도가 50%인 온도로서, 54℃ 내지 78℃일 수 있다.
일 실시예에서, PNA 어셈블리는 상기 반응공간과 상기 배출공간의 사이에 배치될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 연결소자는 3 mer 내지 20 mer의 길이를 가질 수 있다.
일 실시예에서, 상기 PNA 어셈블리는 온도가 80℃보다 높은 경우 상기 결합된 타깃유전자를 분리할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 시료채취장치는 반응용기, 온도조절부재, 및 LNA 어셈블리를 포함한다. 상기 반응용기는 타깃유전자 및 잔류유전자를 포함하는 시료가 주입되는 반응공간, 상기 반응공간의 하부에 배치되며 상기 잔류유전자가 배출되는 배출공간, 및 상기 배출공간의 하부에 배치되어 상기 배출공간을 통해 저류된 물질이 배출되는 배출구를 포함한다. 상기 온도조절부재는 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절한다. 상기 PNA 어셈블리는 생화학적으로 안정된 물질로 구성되는 다공성매질을 포함하는 기저층 및 상기 기저층의 표면에 부착되고 아미노기를 포함하는 결합부를 포함하는 다공성기판과, 상기 다공성기판의 상기 결합부에 연결되고 3 mer 내지 20 mer 정도의 길이를 갖는 연결소자와, 상기 연결소자의 단부에 연결되며 타깃유전자에 대한 상보적 염기서열 중에서 하나 이상의 유전자가 인공유전자인 LNA로 치환되어 용융온도보다 낮으면 단일결합(Single Strand) 상태의 타깃유전자를 강하게 결합하며 온도가 상기 용융온도보다 높은 경우 상기 결합된 타깃유전자를 분리하여 배출하는 포획 LNA 프로브를 포함하며, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시킨다. 상기 용융온도는 포획 PNA 프로브와 타깃유전자의 결합정도가 50%인 온도로서, 54℃ 내지 78℃일 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 시료채취장치의 제조방법에 있어서, 시료채취장치는 타깃유전자 및 잔류유전자를 포함하는 시료가 주입되는 반응공간을 포함하는 반응용기와, 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절하는 온도조절부재와, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시키는 PNA 어셈블리를 포함한다. 상기 PNA 어셈블리를 형성하는 방법은, 유리, 실리카, 폴리스티렌, 및 자성체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 물질을 다공성으로 성형하여 상부의 유체가 하부로 흐를 수 있는 기저층을 형성하는 단계; 상기 기저층에 카르복실산을 처리하여 상기 기저층의 표면에 카르복실기 단말을 형성하는 단계; 상기 카르복실기 단말이 형성된 기저층 상에 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드(EDC)를 투입하는 단계; 상기 기저층 상의 카르복실기와 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS)를 결합하는 단계; 연결소자와 타깃유전자에 대응되는 포획 PNA 프로브를 연결하는 단계; 및 상기 카르복실기와 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS)가 결합된 기저층 상에 상기 포획 PNA 프로브에 연결된 연결소자를 결합하는 단계를 포함한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 시료채취장치의 제조방법에 있어서, 시료채취장치는 타깃유전자 및 잔류유전자를 포함하는 시료가 주입되는 반응공간을 포함하는 반응용기와, 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절하는 온도조절부재와, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시키는 LNA 어셈블리를 포함한다. 상기 LNA 어셈블리를 형성하는 방법은, 유리, 실리카, 폴리스티렌, 및 자성체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 물질을 다공성으로 성형하여 상부의 유체가 하부로 흐를 수 있는 기저층을 형성하는 단계; 상기 기저층에 카르복실산을 처리하여 상기 기저층의 표면에 카르복실기 단말을 형성하는 단계; 상기 카르복실기 단말이 형성된 기저층 상에 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드(EDC)를 투입하는 단계; 상기 기저층 상의 카르복실기와 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS)를 결합하는 단계; 연결소자와 타깃유전자에 대응되는 포획 LNA 프로브를 연결하는 단계; 및 상기 카르복실기와 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS)가 결합된 기저층 상에 상기 포획 LNA 프로브에 연결된 연결소자를 결합하는 단계를 포함한다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 시료채취장치를 이용한 시료채취방법에 있어서, 상기 시료채취장치는 타깃유전자 및 잔류유전자를 포함하는 시료가 주입되는 반응공간을 포함하는 반응용기와, 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절하는 온도조절부재와, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시키는 PNA 어셈블리를 포함한다. 상기 시료채취방법에 있어서, 먼저 상기 시료 내의 상기 타깃유전자와 상기 잔류유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한다. 이어서, 상기 타깃유전자를 상기 PNA 어셈블리의 포획 PNA 프로브에 선택적으로 결합시킨다. 이후에, 상기 반응공간으로부터 상기 잔류유전자를 제거한다. 계속해서, 상기 PNA 어셈블리의 상기 포획 PNA 프로브로부터 상기 타깃유전자를 분리한다. 이어서, 상기 포획 PNA 프로브로부터 분리된 상기 타깃유전자를 추출한다.
일 실시예에서, 상기 이중가닥 유전자를 상기 단일가닥 유전자로 분리하는 단계는, 상기 온도조절부재를 이용하여 상기 반응공간의 온도를 90℃ 내지 98℃로 상승시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 타깃유전자를 상기 포획 PNA 프로브에 선택적으로 결합시키는 단계는 상기 반응공간을 50℃ 내지 70℃로 냉각하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 포획 PNA 프로브로부터 상기 타깃유전자를 분리하는 단계는 상기 온도조절부재를 이용하여 상기 PNA 어셈블리의 온도를 80℃ 내지 90℃로 상승시킬 수 있다.
일 실시예에서, 상기 포획 PNA 프로브로부터 상기 타깃유전자를 분리하는 단계는 상기 PNA어셈블리를 90℃의 온도로 2분 이상 가열하고, 상기 타깃유전자를 추출하는 단계는 pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 상기 타깃유전자를 추출할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 타깃유전자를 추출하는 단계는 pH가 9인 80mM 농도의 NaOAc 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 상기 타깃유전자를 추출할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 시료채취장치를 이용한 시료채취방법에 있어서, 상기 시료채취장치는 타깃유전자 및 잔류유전자를 포함하는 시료가 주입되는 반응공간을 포함하는 반응용기와, 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절하는 온도조절부재와, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시키는 LNA 어셈블리를 포함한다. 상기 시료채취방법에 있어서, 먼저 상기 시료 내의 상기 타깃유전자와 상기 잔류유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한다. 이어서, 상기 타깃유전자를 상기 LNA 어셈블리의 포획 LNA 프로브에 선택적으로 결합시킨다. 이후에, 상기 반응공간으로부터 상기 잔류유전자를 제거한다. 계속해서, 상기 LNA 어셈블리의 상기 포획 LNA 프로브로부터 상기 타깃유전자를 분리한다. 이어서, 상기 포획 LNA 프로브로부터 분리된 상기 타깃유전자를 추출한다.
상기와 같은 본 발명의 실시예에 따르면, 인공핵산(Peptide Nucleic Acid, 이하, 'PNA'라고 함)를 이용하여 특정 유전자만을 선별적으로 추출할 수 있다.
또한 PNA가 DNA 또는 RNA와 결합하는 경우, DNA 또는 RNA 상호간에 결합하는 경우에 비해 강한 결합력을 가져서, PNA가 DNA 또는 RNA로부터 이탈하는 온도범위에 비해 DNA 또는 RNA 상호간에 이탈하는 온도범위가 보다 정밀하다. 또한 PNA는 DNA 또는 RNA 용액의 염 농도와 관계없이 결합특성이 일정하게 유지된다.
또한 PNA는 핵산 또는 산백질 분해효소에 대해 보다 강한 저항성을 가지며, 일종의 완충용액 역할을 하기 때문에 pH의 변화에도 안정적이다.
또한 포획 PNA 프로브가 다공성기판의 표면 뿐만 아니라 내부에도 배치되는 3차원 구조로 배열되어 타깃유전자를 효과적으로 포획할 수 있다.
따라서 유전물질을 분리하여 시료를 채취하는데 소요되는 시간 및 비용이 절약된다.
또한 관심의 대상이 되는 유전물질만을 정확하게 추출할 수 있어서 검사결과의 신뢰성이 향상된다.
또한 숙련기술 없이 누구라도 손쉽게 유전물질을 채취할 수 있으며, 시료의 오염이 방지된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료채취장치를 나타내는 단면도이다.
도 2는 도 1의 PNA 어셈블리의 일부분을 확대한 단면도이다.
도 3 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 어셈블리를 나타내는 개념도들이다.
도 8은 도 1에 도시된 시료채취장비를 이용한 시료채취방법을 나타내는 흐름도이다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 시료채취장치를 나타내는 단면도이다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 LNA 어셈블리의 일부를 나타내는 확대단면도이다.
본문에 개시되어 있는 본 발명의 실시예들에 대해서, 특정한 구조적 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본문에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 구성요소에 대해 사용하였다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위로부터 이탈되지 않은 채 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 구성요소들 간의 관계를 설명하는 다른 표현들, 즉 "~사이에"와 "바로 ~사이에" 또는 "~에 이웃하는"과 "~에 직접 이웃하는" 등도 마찬가지로 해석되어야 한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시(說示)된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 설명하고자 한다. 도면상의 동일한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 사용하고 동일한 구성요소에 대해서 중복된 설명은 생략한다.
시료채취장비
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료채취장치를 나타내는 단면도이다.
도 1을 참조하면, 시료채취장치는 반응용기(50), 온도조절부재(30), 및 PNA 어셈블리(100)를 포함한다.
반응용기(50)는 내부에 공동이 형성되어 있으며, 반응공간(52), 배출공간(54), 및 배출구(45)를 포함한다. 반응용기(50)는 원형 실린더 형상을 가질 수 있다. 다른 실시예에서, 반응용기(50)가 직사각형 형상, 육각 실린더 형상 등 다양한 형상을 가질 수도 있다.
반응공간(52)은 반응용기(50)의 상부쪽에 배치되어 분리되기 전 유전자를 포함하는 원시시료가 배치된다.
배출공간(54)는 반응용기(50)의 하부쪽에 배치되어 세정액, 유전자 이외의 세포성분, 잔류 유전자, 등이 배출된다. 잔류 유전자는 PNA 어셈블리(100)에 포획되지 않은 나머지 유전자를 포함한다.
배출구(45)는 배출공간(54)의 하부에 배치되어, 배출공간(54)을 통해 저류된 물질이 배출된다.
본 실시예에서, 반응공간(52), 배출공간(54), 및 배출구(45)는 수직방향으로 배열된다. 다른 실시예에서, 반응용기(50)가 커버(도시되지 않음)에 의해 밀폐되고, 반응공간(52), 배출공간(54), 및 배출구(45)가 수평방향으로 배열될 수도 있다.
온도조절부재(30)는 반응용기(50)의 외면 상에 배치되어 반응공간(52)의 온도를 조절한다. 본 실시예에서, 온도조절부재(30)는 반응용기(50)의 외측면 상에 배치된다. 다른 실시예에서, 온도조절부재가 반응용기(50)의 아래쪽에 배치될 수도 있다.
예를 들어, 온도조절부재(30)는 금속, 도전성 금속산화물 등을 패터닝하여 온도조절회로(도시되지 않음)로부터 인가받은 전류를 흘려줌으로써 열을 발생시킬 수 있다. 다른 실시예에서, 온도조절부재(30)는 펠티어소자와 같은 열전소자에 전류를 인가하여 온도를 조절할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 온도조절부재(30)는 팬, 냉각핀, 등과 같은 외부냉각장치(도시되지 않음)를 더 포함할 수 있다.
PNA 어셈블리(100)는 반응용기(50) 내에 배치된다. 본 실시예에서, PNA 어셈블리(100)는 반응공간(52)와 배출공간(54)의 사이에 배치된다.
PNA 어셈블리(100)는 온도조절부재(30)의 제어에 의해, 관심의 대상이 되는 타깃 유전자만을 포획하거나 배출하고 잔류 유전자 및 시료의 나머지 부분은 그대로 통과시킨다.
도 2는 도 1의 PNA 어셈블리를 확대한 단면도이고, 도 6은 도 2에 도시된 PNA 어셈블리의 일 실시예를 나타내는 단면도이다.
도 1, 도 2, 및 도 6을 참조하면, PNA 어셈블리(100)는 다공성기판(110), 포획 PNA 프로브(120), 및 연결소자(130)를 포함한다.
다공성기판(110)은 기저층(111) 및 결합부(113)를 포함한다.
기저층(111)은 유리, 실리카, 폴리스티렌, 자성체, 등 생화학적으로 안정된 물질로 구성되는 다공성 매질(porous media)을 포함한다. 본 실시예에서, 기저층(111)은 생화학적으로 안정된 물질을 다공성으로 성형하여 다공성기판(110) 상부의 유체가 하부로 흐를 수 있다. 예를 들어, 유리, 실리카, 폴리스티렌 등의 비드들(bead)을 원판형상으로 압축·가열하여 입자들 사이에 다수의 공극이 형성된 다공성 매질을 형성할 수 있다.
다른 실시예에서, 유리, 실리카, 폴리스티렌 등의 입자들과 B2O3, ZnO, CaO, FeO, Na2O, NaCl, Al2O3, AgPO3, BaCO3, BaCrO4, Ba(IO3)2, AgNO3, CaF2, CaCO3, CaC2O4, Cr2O3, CuO, KBr, 등과 같이 물, 알코올, 유기용매, 식각액 등의 용매에 반응하여 용해되는 물질로 분말을 혼합한 후에 이들을 압축·가열하고, 용매를 이용하여 용해되는 물질을 제거하여 유리, 실리카, 폴리스티렌 등의 입자들을 골격으로 하는 다공성 매질을 형성할 수도 있다.
결합부(113)는 기저층(111)의 표면에 부착되어 연결소자(130)의 일 단부와 부착된다. 본 실시예에서, 결합부(113)는 연결소자(130)와 결합될 수 있는 아미노기를 포함한다. 예를 들어, 결합부(113)의 일 단부는 기저층(111)과 결합되는 카르복실기를 포함하고 타 단부는 연결소자(130)에 결합되는 아미노기를 포함할 수 있다. 결합부(113)의 구조에 대해서는 도 3 내지 도 7을 참조하여 후술한다.
연결소자(130)는 포획 PNA 프로브(120)와 다공성기판(110)의 사이에 배치되고 포획 PNA 프로브(120)를 다공성기판(110)에 연결한다.
포획 PNA 프로브(120)가 다공성기판(110)에 직접 부착되는 경우, 길이 방향으로 연장된 형상의 타깃유전자가 다공성기판(110)의 표면에 부딪혀서 L-자 형태로 꺾어지는 형상이 발생한다.
타깃유전자가 다공성기판(110)의 표면에 부딪혀서 L-자 형태로 꺾어지는 경우, 타깃유전자가 포획 PNA 프로브(120)에 제대로 부착되지 않는다. 본 실시예에서, 연결소자(130)가 포획 PNA 프로브(120)와 다공성기판(110)의 사이에 배치되어 포획 PNA 프로브(120)를 다공성기판(110)으로부터 이격시킨다. 포획 PNA 프로브(120)가 다공성기판(110)으로부터 이격되면, 타깃유전자가 다공성기판(110)의 표면에 부딪히지 않고 포획 PNA 프로브(120)에 원활하게 결합된다.
연결소자(130)의 길이가 너무 짧으면 타깃유전자의 일부가 다공성기판(110)의 표면에 부딪히는 현상이 발생한다. 반면에, 연결소자(130)의 길이가 너무 길면 연결소자(130)가 늘어져서 다공성기판(110)의 표면쪽을 휘어진다. 연결소자(130)가 다공성기판(110)의 표면쪽으로 휘어지면 타깃유전자의 일부가 다공성기판(110)의 표면에 부딪히는 현상이 발생한다.
본 실시예에서, 연결소자(130)는 3 mer 내지 20 mer정도의 길이를 갖는다. 연결소자(130)의 길이가 3 mer 보다 짧거나 20 mer 보다 길어지면, 포획 PNA 프로브(120)가 다공성기판(110)의 표면에 인접하게 배치되어 타깃유전자가 포획 PNA 프로브(120)와 제대로 결합하지 않는다. 예를 들어, 연결소자(130)는 7 mer 내지 14 mer의 길이를 가질 수 있다.
연결소자(130)는 다공성기판(110)과 포획 PNA 프로브(120)를 연결할 수 있기만 하면 다양한 물질을 포함할 수 있다. 본 실시예에서, 연결소자(130)는 DNA링커를 포함한다.
본 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 1]에 도시된 E-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112017072995318-pat00001
다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 2]에 도시된 X-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112017072995318-pat00002
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 3]에 도시된 O-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112017072995318-pat00003
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 4]에 도시된 AEEEA-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112017072995318-pat00004
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 5]에 도시된 C3A-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 5]
Figure 112017072995318-pat00005
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 6]에 도시된 C4A-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 6]
Figure 112017072995318-pat00006
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 7]에 도시된 C6A-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 7]
Figure 112017072995318-pat00007
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 8]에 도시된 C12A-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 8]
Figure 112017072995318-pat00008
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 9]에 도시된 C6M-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 9]
Figure 112017072995318-pat00009
또 다른 실시예에서, 연결소자(130)는 [화학식 10]에 도시된 C11M-링커를 포함할 수 있다.
[화학식 10]
Figure 112017072995318-pat00010
연결소자(130)는 전술한 링커들 외에 다양한 종류의 링커들을 포함할 수 있다.
예를 들어, 연결소자(130)가 아크릴 포스포아미다이트(acrylic phosphoramidite), 아데닐화된 올리고뉴클레오티드(adenylated oligonucleotide), 아자이드화물(azide moity), 디곡시게닌(digoxigenin), 콜레스테롤-TEG (cholesteryl-TEG), 미국 IDT사의 I-linker, 미국 IDT사의 아미노 변경유전자 C6, C12, 또는 Uni-Link, 등을 포함할 수도 있다.
상기 링커들은 단독으로 또는 한 종류의 링커가 복수회 반복 연결되어 사용되거나, 두 종류 이상의 링커들이 연결되어 사용될 수도 있다.
본 실시예에서, 연결소자(130)는 링커들 외에 리신(lysine), 시스테인(cysteine) 등의 아미노산과 혼합하여 사용될 수 있다.
포획 PNA 프로브(120)는 일종의 인공 DNA로서, DNA의 인산-리보스당이 아마이드로 치환된 DNA 유사물질이다. PNA는 DNA와 유사한 형태를 가지고 있으나, 인산-리보스당이 아마이드로 치환됨으로 인하여 다양한 물리적인 특징을 갖는다. 예를 들어, PNA-DNA의 결합력은 DNA-DNA의 결합력보다 강한 특징이 있다.
이로 인하여, DNA 프로브의 경우 DNA의 경우 염기서열에 일부 오류가 있더라도 이를 명확히 구분하지 못하는데 PNA 프로브는 이를 명확히 구분해낼 수 있다. 즉, DNA의 염기서열에 일부 오류가 있더라도 DNA 프로브는 오류에 상관없이 결합되는 경우가 있는데, PNA 프로브는 오류가 있는 경우에는 결합이 일어나지 않는다.
또한 PNA 자체가 일종의 완충용액의 특성이 있기 때문에, 온도나 산도(pH)에 대한 저항성이 높고 화학적으로 안정된다. 또한 핵산 분해효소, 단백질 분해효소 등에 대해서도 DNA에 비해 강한 저항성을 가져서 쉽게 분해되지 않는다.
또한 상보적인 DNA 또는 RNA 단편을 검출하기 위한 잡종형성(hybridization) 과정에서 실험결과가 염의 농도에 의존하지 않는다.
특히 PNA에 결합된 DNA는 특정온도에서 민감하게 반응하여 분리되기 때문에 DNA 시료의 채취 및 분리에 적합하다.
포획 PNA 프로브(120)는 온도가 용융온도(Melting Temperature; Tm)보다 낮으며 시료 내에 단일결합(Single Strand) 상태의 타깃유전자(도 7의 140)가 존재하는 경우, 이를 강하게 결합한다. 또한 포획 PNA프로브(120)의 온도가 용융온도보다 높은 경우 결합된 타깃유전자(도 7의 140)와 분리되어 배출한다. 용융온도는 포획 PNA 프로브(120)와 타깃유전자(도 7의 140)의 결합정도가 50%인 온도로서, 용융온도보다 높은 온도에서는 포획 PNA 프로브(120)와 타깃유전자(도 7의 140)의 결합이 끊어지지 쉽고, 용융온도보다 낮은 온도에서는 포획 PNA 프로브(120)와 타깃유전자(도 7의 140)가 결합되기 쉽다. 본 실시예에서, 포획 PNA 프로브(120)와 타깃유전자(도 7의 140)의 용융온도는 54℃ 내지 78℃일 수 있다. 바람직하게는 용융온도가 66℃일 수 있다.
본 실시예에서, PNA 어셈블리(100)가 다공성기판(110)을 포함하고 결합부(113), 포획 PNA 프로브(120), 및 연결소자(130)가 다공성기판(110)의 표면 뿐만 아니라 내부에 배치된 공극의 표면에도 형성되어 3차원 구조를 이루기 때문에, 포획 PNA 프로브(120)가 평면 상에만 2차원 구조로 배열된 경우보다 효과적으로 타깃유전자(140)를 포획할 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 지식과 경험을 가진 사람이라면, 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 않는 범위내에서 PNA 어셈블리가 2차원 구조로 변형될 수 있음을 이해할 것이다.
다른 실시예에서, PNA 어셈블리(100) 대신에 LNA와 같은 다른 종류의 인공유전자를 포함하는 유전자포획 어셈블리(도시되지 않음)가 사용될 수도 있다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 시료채취장치를 나타내는 단면도이다. 본 실시예에서 온도조절부재를 제외한 나머지 구성요소들은 도 1 및 도 2에 도시된 실시예와 동일하므로, 동일한 구성요소들에 대한 중복되는 설명은 생략한다.
도 9를 참조하면, 시료채취장치는 반응용기(50), 온도조절부재(32), 및 PNA 어셈블리(100)를 포함한다.
온도조절부재(30)는 반응용기(50)의 외면 상에 배치되어 반응공간(52)의 온도를 조절한다. 본 실시예에서, 온도조절부재(30)는 반응용기(50)의 아래쪽에 배치된다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 LNA 어셈블리의 일부를 나타내는 확대단면도이다. 본 실시예에서, PNA 어셈블리 대신에 LNA 어셈블리를 사용한 것을 제외한 나머지 구성요소들은 도 1 및 도 2에 도시된 실시예와 동일하므로, 동일한 구성요소들에 대한 중복되는 설명은 생략한다.
도 1 및 도 10을 참조하면, PNA 외에 다른 인공유전자인 LNA가 활용된다. LNA 어셈블리는 기저층(111) 및 결합부(113)를 포함하는 다공성기판과, 포획 LNA 프로브(220)와, 연결소자(130)를 포함한다.
포획 LNA 프로브(220)는 인공유전자인 타깃유전자의 상보적 염기서열에 해당하는 DNA와 상기 상보적 염기서열 중 어느 하나 이상의 유전자가 인공유전자인 LNA로 치환된 유전자복합체를 포함한다.
LNA는 Locked Nucleic Acid란 리보 핵산의 2의 산소 원자와 4의 탄소 원자에 메틸렌(methylen)을 개입시켜 2개의 환상 구조를 가지는 인공 유전자이다. 가교결합에 의해 화학 구조상의 형태의 자유도가 구속되는 것으로 천연 유전자인 DNA에 비해, 표적이 되는 DNA나 RNA와의 결합 친화성과 핵산분해효소(nuclease)에 대한 내성이 강해서, 생체 독성이 저하된다.
본 실시예에서, 포획 LNA 프로브(220)의 염기서열 중에서 하나 또는 둘 이상의 염기를 LNA로 치환하여 사용한다.
상기와 같은 본 실시예에 따르면, DNA만으로 이루어진 포획 프로브에 비해 LNA를 포함하는 포획 LNA 프로브가 강한 결합력 및 정밀한 분석이 가능하다.
PNA 어셈블리의 제조
본 실험예는 시료채취장비를 제조함에 있어서, PNA 어셈블리를 제조하는 일 실시예이다. 시료채취장비의 나머지 구성요소들은 전술한 바와 같이 도 1 및 도 2를 참조하여 제조가 가능하다. 다만 PNA 어셈블리의 제조에 관하여, 후술하는 바와 같이 다공성기판의 결합부를 형성하기 위하여 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide; EDC)와 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(N-hydroxyl succinimide ester; NHS)를 이용하였다.
도 3 내지 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 어셈블리를 나타내는 개념도들이다.
다공성기판(110)의 결합부(113)는 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide; EDC)와 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(N-hydroxyl succinimide ester; NHS)를 이용한 공유결합방법으로 생성되었다.
도 1 및 도 3을 참조하면, 기저층(111)에 카르복실산(carboxylic acid)을 처리하여 기저층(111)의 표면에 카르복실기 단말을 형성하였다.
이어서 카르복실기 단말이 형성된 기저층(111) 상에 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필)카보디이미드(EDC)를 투입하였다. 이후 기저층(111) 상의 카르복실기와 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS)가 결합하였다.
도 1, 도 4, 및 도 5를 참조하면, 연결소자(130)로서 E링커를 사용하여 포획 PNA 프로브를 결합시켰다. 이어서 E링커와 결합된 포획 PNA 프로브를 기저층(111) 상에 투입하였다.
예를 들어, E링커의 길이는 DNA길이단위(mer)로 비교하면 7개의 염기가 결합된 길이인 7 mer정도이다.
이어서, E링커와 포획 PNA 프로브를 결합한다.
도 1 및 도 6을 참조하면, 이후에 카르복실기와 결합되어 엔-하이드록실 숙신이미드 에스터(NHS)가 포획 PNA 프로브와 결합된 E링커와 교체되면서 포획 PNA 프로브와 결합된 E링커가 결합부(113)를 통해서 기저층(111)에 연결되었다.
따라서 PNA 어셈블리(110)가 완성되었다.
도 1 및 도 7을 참조하면, 이후에 타깃유전자(140) 및 잔류유전자(142)를 포함하는 시료를 투입하였다. 시료 내의 타깃유전자(140)만이 PNA 어셈블리(110)의 포획 PNA 프로브(120)에 결합되었고, 잔류유전자(142)는 결합되지 않은 상태로 시료 내에 존재하였다.
당해 기술분야에서 통상의 지식과 경험을 가진 자라면, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 실시예에 개시된 이외에 다양한 형태의 PNA 어셈블리가 가능함을 이해할 수 있을 것이다.
다른 실시예에서, 기저층(111) 상에 카르복실기 단말 대신에 하기의 [화학식 12]의 아민기(amine) 단말(NH3+)을 이용하여 결합부(113)를 형성하였다.
[화학식 12]
Figure 112017072995318-pat00011
다른 실시예에서, 기저층(111) 상에 카르복실기 단말 대신에 하기의 [화학식 13]의 알데히드기(aldehyde) 단말(CH=O)을 이용하여 결합부(113)를 형성하였다. 결합부(113)에 결합되는 연결소자(130)의 단부에 NH2가 있어야 하며 H2O가 증발되면서 결합된다.
[화학식 13]
Figure 112017072995318-pat00012
다른 실시예에서, 기저층(111) 상에 카르복실기 단말 대신에 하기의 [화학식 14]의 에폭시기(epoxy) 단말(O-CH2-CH)을 이용하여 결합부(113)를 형성하였다. 결합부(113)에 결합되는 연결소자(130)의 단부에 NH2가 있어야 한다.
[화학식 14]
Figure 112017072995318-pat00013
다른 실시예에서, 수순한 산화실리콘의 표면(Si-OH0), 소수성 단백질막(hydrophobic adsorption), 니트로실기 다당류막(nitrosylated polysaccharide), 알데히드기(CH=O), 순수한 금의 표면(Au) 등을 이용하여 결합부(113)를 형성할 수도 있다.
시료채취방법
본 발명의 실시예에 따른 시료채취장비를 이용하여 시료 내의 타깃유전자만을 선별적으로 채취하였다.
도 8은 도 1에 도시된 시료채취장비를 이용한 시료채취방법을 나타내는 흐름도이다.
도 1 내지 도 8을 참조하면, 이어서 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한다(단계 S110). 다른 실시예에서, 유전자 시료를 주입하는 것이 아니라 그 이전단계인 세포가 파괴된 상태의 시료를 반응공간(52)에 투입하고, 세정하여 유전자 성분만을 잔류시킬 수도 있다. 구체적으로, 세포가 파괴된 상태의 시료를 반응공간(52)에 투입하면, 포스포다이에스테르 본드에 의해 네거티브 포텐셜을 갖는 유전자 성분이 기저층(111)의 표면에 부착된다. 유전자 성분이 기저층(111)의 표면에 부착된 상태에서 에탄올을 주입하여 세포벽, 등의 찌꺼기를 배출공간(54) 쪽으로 제거한다. 이후에 반응공간(52)에 일루션 버퍼(elution buffer) 용액, 증류수 등을 주입하여 유전자 성분을 기저층(111)으로부터 이탈시킨다.
본 실시예에서, 반응공간(52) 내에 유전자가 포함된 시료를 투입한다. 이어서, 온도조절부재(30)를 이용하여 반응공간(52)의 온도를 90℃ 내지 98℃로 상승시키면, 시료 내의 유전자가 변성되어 단일가닥 유전자로 분리된다. 예를 들어, 반응공간(52)의 온도를 95℃로 상승시킬 수 있다. 반응공간(52)의 온도가 90℃보다 작으면 유전자분리가 잘 이루어지지 않으며, 반응공간(52)의 온도가 98℃를 넘어가면 유전자가 변형될 수 있다.
분리된 단일가닥 유전자는 선택적 채취의 대상이 되는 타깃유전자(도 7의 140)와 채취의 대상이 되지 않는 잔류유전자(142)를 포함한다.
이어서 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시킨다(단계 S120).
본 실시예에서, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 50℃ 내지 70℃로 냉각하여, 타깃유전자(도 7의 140)가 PNA어셈블리(100)의 포획 PNA 프로브(120)에 결합된다. 예를 들어, 반응공간(52)을 55℃로 냉각할 수 있다.
반응공간(52)을 50℃보다 낮은 온도로 냉각하면 타깃유전자(도 7의 140) 뿐만 아니라 정상유전자까지도 포획 PNA 프로브(120)에 결합되어 타깃유전자(도 7의 140)만 검출할 수 없다. 반응공간(52)을 70℃보다 높은 온도로 냉각하면 타깃유전자(도 7의 140)와 포획 PNA 프로브(120) 사이의 결합이 완전하게 이루어지지 않을 수 있다.
PNA와 DNA(또는 RNA) 사이의 결합력은 DNA(또는 RNA)와 상보적 DNA(또는 상보적 RNA) 사이의 결합력보다 높아서, 타깃유전자(도 7의 140)는 상보적 타깃유전자와 결합하지 않고 포획 PNA 프로브(120)에 쉽게 결합한다.
계속해서 PNA 어셈블리(100)에 결합되지 못하고 반응공간(52) 내에 잔류하는 잔류유전자(142)를 제거한다(단계 S130).
본 실시예에서, 배출구(45)에 음압을 걸어주면 반응공간(52) 내에 잔류하는 시료가 다공성기판(110)의 공극들을 통하여 배출공간(54)으로 이동한다. 계속하여 증류수, 에탄올, EDTA, NaOAc, 알코올, 오일, 등의 물질을 반응공간(52) 쪽으로 공급하여 잔류유전자(142)를 반응용기(50)로부터 완전히 제거한다.
이어서, 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리한다(단계 S140).
본 실시예에서, PNA 어셈블리(100)를 65℃ 내지 98℃의 온도로 가열하여 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)의 포획 PNA 프로브(120)로부터 분리한다. 바람직하게는, PNA 어셈블리(100)를 75℃ 내지 95℃로 가열한다. 더욱 바람직하게는, PNA 어셈블리(100)를 80℃ 내지 90℃로 가열한다.
본 실시예에서, 온도조절부재(30)가 반응용기(50)를 가열하여, 반응용기(50) 내의 PNA 어셈블리(100)를 가열한다.
PNA 어셈블리(100)를 65℃보다 낮은 온도로 가열하면 타깃유전자(도 7의 140)와 포획 PNA 프로브(120) 사이의 결합이 잘 끊어지지 않는다. PNA 어셈블리(100)를 98℃보다 높은 온도로 가열하면 타깃유전자(도 7의 140)가 변형될 수 있다.
이후에, PNA 어셈블리(100)가 가열된 상태를 유지하면서 포획 PNA 프로브(120)로부터 분리된 타깃유전자(도 7의 140)를 추출한다(단계 S150).
본 실시예에서, 반응공간(52)으로 포름아미드(formamide), 증류수, EDTA, NaOAc, 등을 주입하여 포획 PNA 프로브(120)로부터 분리된 타깃유전자(도 7의 140)를 배출공간(54)쪽으로 추출한다. 배출공간(54)으로 추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 배출구(45)를 통하여 외부로 배출되어 수집된다.
실시예 1
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 타깃유전자는 인간 파필로마 바이러스(Human Papiloma Virus; HPV)로 약 8kb 정도의 크기를 가지는 DNA 바이러스의 유전자(이하, 'HPV 바이러스'라고 함)를 선택적으로 채취하기 위하여 포획 PNA 프로브를 준비하였다. 알려준 HPV 바이러스는 90여가지 종류가 있으며 이중 암을 유발하는 고위험군 HPV 바이러스와 암 발생과 관련이 적은 저위험군 HPV 바이러스로 구분된다. HPV 바이러스의 유전자 중에서 L1 유전자는 약 1.5 kb 정도의 크기를 가지며 HPV 바이러스의 종류를 구분하는데 중요하다.
HPV 바이러스의 L1 유전자의 MY11 염기서열(sequence)은 대부분의 HPV 바이러스가 공통으로 가지고 있는 염기서열이다. 본 실시예에서, MY11 프라이머 서열을 가지는 포획 프로브를 사용하였다.
본 실시예에서, HPV 바이러스를 검출하기 위한 프라이머의 염기서열은 GC M CAGGG W CATAA Y AATGG이었다(이때, M=(A+C), W=(A+T), Y=(C+T)이다). 포획 PNA 프로브의 염기 서열(Sequence)은 NH2-E링커-E링커-GC M CAGGG W CATAA Y AATGG이었다. 본 실시예에서, 연결소자로 E링커가 2개 연결된 링커를 사용하였다.
시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리하기 위하여, 온도조절부재(30)를 이용하여 반응공간(52)의 온도를 95℃로 5분간 가열하였다.
이어서, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
계속해서, 배출구(45)에 음압을 걸어서 반응공간(52)에 잔류하는 시료를 배출하면서, pH가 8.2인 10mM EDTA용액과 95 중량%의 포름아미드를 이용하여 잔류유전자(142)를 배출하였다.
이어서, 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 10분간 가열하였다.
이후에, pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 96.80 중량%의 수율을 보였다.
실시예 2
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
이어서, 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 5분간 가열하였다.
이후에, pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 96.40 중량%의 수율을 보였다.
실시예 3
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 2분간 가열하였다.
이후에, pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 96.80 중량%의 수율을 보였다.
실시예 1 내지 3에서는, 추출온도 및 추출을 위한 용액이 동일하고 추출시간을 변화시켰는데, 수율에 별다른 변동이 없었다.
실시예 4
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 65℃의 온도로 5분간 가열하였다.
이후에, pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 36.40 중량%를 넘지 않았다.
실시예 5
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 65℃의 온도로 2분간 가열하였다.
이후에, pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 32.70 중량%의 수율을 넘지 않았다.
실시예 4 및 5를 참조하면, 타깃유전자를 추출하는 온도를 65℃로 낮추자 수율이 급격히 저하되었다.
실시예 6
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 37℃의 온도로 10분간 유지하였다.
이후에, pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 데이터로 검출되는 수율이 거의 0%에 가까웠다.
실시예 6에서, 타깃유전자를 추출하는 온도를 PNA와 타깃유전자의 결합온도인 55℃보다 낮추자 수득되는 타깃유전자가 검출되지 않았다.
실시예 7
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 10분간 가열하였다.
이후에, 포름아미드 없이 증류수만을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 7.3 중량%의 수율을 보였다.
실시예 7에서, 증류수를 이용하는 경우 수율이 매우 저조하였다.
실시예 8
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 10분간 가열하였다.
이후에, 포름아미드 없이 pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액만을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 52.00 중량%의 수율을 보였다.
실시예 8에서, pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액만을 이용하는 경우 수율이 낮았다.
실시예 9
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 10분간 가열하였다.
이후에, 95 중량%의 포름아미드 용액만을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 35.90 중량%의 수율을 보였다.
실시예 9에서, 95 중량%의 포름아미드 용액만을 이용하는 경우 수율이 낮았다.
실시예 10
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 10분간 가열하였다.
이후에, pH가 9인 30 mM 농도의 NaOAc 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 95.50 중량%의 수율을 보였다.
실시예 11
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 10분간 가열하였다.
이후에, pH가 9인 80 mM 농도의 NaOAc 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 97.30 중량%의 수율을 보였다.
실시예 12
도 1에 도시된 시료채취장치를 이용하여 타깃유전자를 추출하였다. 본 실시예에서, 타깃유전자를 추출하는 단계를 제외한 나머지 단계들은 실시예 1과 동일하였으므로, 동일한 실험단계들에 대한 중복되는 설명은 생략하였다.
본 실시예에서, 먼저 시료 내의 유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리한 후에, 반응공간(52) 내의 타깃유전자(도 7의 140)를 PNA어셈블리(100)에 선택적으로 결합시키기 위하여, 단일가닥 유전자의 시료가 포함된 반응공간(52)을 55℃로 냉각하여 10분간 방치하였다.
타깃유전자(도 7의 140)를 PNA 어셈블리(100)로부터 분리하기 위하여, PNA 어셈블리(100)를 90℃의 온도로 10분간 가열하였다.
이후에, pH가 9인 140 mM 농도의 NaOAc 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 타깃유전자(도 7의 140)를 추출하였다.
추출된 타깃유전자(도 7의 140)는 전체 타깃유전자 중에서 95.40 중량%의 수율을 보였다.
실시예 10 내지 12에서, pH가 9인 140 mM 농도의 NaOAc 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하는 경우 수율이 우수했다.
상기와 같은 본 실시예에 따르면, 온도조절부재(30)가 반응용기(50)의 아래쪽에 배치되어, 배출공간(54) 및 반응공간(52) 내의 대류현상을 이용하여 열을 효율적으로 전달할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 실시예에 따르면, 인공핵산(Peptide Nucleic Acid, 이하, 'PNA'라고 함)를 이용하여 특정 유전자만을 선별적으로 추출할 수 있다.
또한 PNA가 DNA 또는 RNA와 결합하는 경우, DNA 또는 RNA 상호간에 결합하는 경우에 비해 강한 결합력을 가져서, PNA가 DNA 또는 RNA로부터 이탈하는 온도범위에 비해 DNA 또는 RNA 상호간에 이탈하는 온도범위가 보다 정밀하다. 또한 PNA는 DNA 또는 RNA 용액의 염 농도와 관계없이 결합특성이 일정하게 유지된다.
또한 PNA는 핵산 또는 산백질 분해효소에 대해 보다 강한 저항성을 가지며, 일종의 완충용액 역할을 하기 때문에 pH의 변화에도 안정적이다.
또한 포획 PNA 프로브가 다공성기판의 표면 뿐만 아니라 내부에도 배치되는 3차원 구조로 배열되어 타깃유전자를 효과적으로 포획할 수 있다.
따라서 유전물질을 분리하여 시료를 채취하는데 소요되는 시간 및 비용이 절약된다.
또한 관심의 대상이 되는 유전물질만을 정확하게 추출할 수 있어서 검사결과의 신뢰성이 향상된다.
또한 숙련기술 없이 누구라도 손쉽게 유전물질을 채취할 수 있으며, 시료의 오염이 방지된다.
본 발명은 유전물질을 증폭하여 검사를 수행하는 장치, 혈액검사장치, 질병검사장치 등으로 연구용, 재난방지용, 의료용, 축산용, 애완동물치료용 등으로 사용될 수 있는 산업상 이용가능성을 갖는다.
30, 32 : 온도조절부재 45 : 배출구
50 : 반응용기 52 : 반응공간
54 : 배출공간 100 : PNA 어셈블리
110, 112 : 다공성기판 111 : 기저입자
113 : 결합부 112a : 보이드
120 : 포획 PNA 프로브(배출) 130 : 연결소자
140 : 타깃 유전자 142 : 잔류 유전자
220 : 포획 LNA 프로브

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  8. 타깃유전자 및 잔류유전자를 포함하는 시료가 주입되는 반응공간을 포함하는 반응용기와, 상기 반응용기의 외면 상에 배치되어 상기 반응공간의 온도를 조절하는 온도조절부재와, 상기 온도조절부재의 제어에 의해 상기 타깃유전자를 포획하거나 배출하고 상기 잔류유전자는 그대로 통과시키는 PNA 어셈블리를 포함하는 시료채취장치를 이용한 시료채취방법에 있어서,
    상기 시료 내의 상기 타깃유전자와 상기 잔류유전자를 변성(denaturation)하여 이중가닥(double strand) 유전자를 단일가닥(single strand) 유전자로 분리하는 단계;
    상기 타깃유전자를 상기 PNA 어셈블리의 포획 PNA 프로브에 선택적으로 결합시키는 단계;
    상기 반응공간으로부터 상기 잔류유전자를 제거하는 단계;
    상기 PNA 어셈블리의 상기 포획 PNA 프로브로부터 상기 타깃유전자를 분리하는 단계; 및
    상기 포획 PNA 프로브로부터 분리된 상기 타깃유전자를 추출하는 단계를 포함하되,
    상기 포획 PNA 프로브로부터 상기 타깃유전자를 분리하는 단계는 상기 PNA어셈블리를 90℃의 온도로 2분 이상 가열하고,
    상기 타깃유전자를 추출하는 단계는 pH가 8.2인 10mM 농도의 EDTA 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 상기 타깃유전자를 추출하는 것을 특징으로 하고,
    상기 타깃유전자를 추출하는 단계는 pH가 9인 80mM 농도의 NaOAc 용액과 95 중량%의 포름아미드를 혼합한 용액을 이용하여 상기 타깃유전자를 추출하는 것을 특징으로 하는 시료채취방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이중가닥 유전자를 상기 단일가닥 유전자로 분리하는 단계는, 상기 온도조절부재를 이용하여 상기 반응공간의 온도를 90℃ 내지 98℃로 상승시키는 것을 특징으로 하는 시료채취방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 타깃유전자를 상기 포획 PNA 프로브에 선택적으로 결합시키는 단계는 상기 반응공간을 50℃ 내지 70℃로 냉각하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시료채취방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 포획 PNA 프로브로부터 상기 타깃유전자를 분리하는 단계는 상기 온도조절부재를 이용하여 상기 PNA 어셈블리의 온도를 80℃ 내지 90℃로 상승시키는 것을 특징으로 하는 시료채취방법.
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