KR101808916B1 - 보툴리눔 신경독소 ｃ형 단백질에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

보툴리눔 신경독소 ｃ형 단백질에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 신경독소 C형 단백질(Botulinum neurotoxin type C1, BoNT/C1)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 보툴리즘 C형 보유 샘플에서 BoNT/C1 단백질을 검출함으로써, 보툴리즘 C형의 조기 진단 및 예후 판단 용도로 사용될 수 있다.

Description

보툴리눔 신경독소 Ｃ형 단백질에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 이의 용도{DNA aptamer specifically binding to Botulinum neurotoxin type C1}
본 발명은 보툴리눔 신경독소 C형 단백질(Botulinum neurotoxin type C1, BoNT/C1)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
보툴리즘은 클로스트리움 보툴리눔(Clostridium botulinum)이라는 세균이 만든 독소에 의한 중독증으로 우리가 흔히 알고 있는 세균, 바이러스에 의한 감염증과는 많은 차이가 있다. 클로스트리움 보툴리눔은 발육 여건이 좋지 않으면 아포(spore)라고 하는 외투를 입고 땅 속에서 수 십 년간 동면한다. 아포를 입은 균은 열, 건조, 햇빛에도 죽지 않으며, 끓는 물에 수 시간 삶아도 살아남는 아주 생명력이 질긴 세균으로 알려져 있으며, 주변 여건상태가 이로울 경우 동면에서 깨어나 아포를 벗고 살면서 주변에 독소를 뿌리는 특징을 보인다.
보툴리눔 독소는 평균 치사량이 0.0003 ug/kg으로 지구상에 알려진 독소 중 가장 강한 독소이다. 우리가 일반적으로 강한 독으로 알고 있는 청산가리, 코브라 독, 복어 독은 각각 평균 치사량이 10,000 ug/kg, 500 ug/kg, 10 ug/kg으로 보툴리눔 독소에 비하면 상대적으로 독력이 아주 낮다. 즉, 보툴리눔 독소는 청산가리보다 수백만 배 강하다. 전문가들의 시뮬레이션에 따르면 보툴리눔 독소 1 g을 공기 중에 살포하면 약 150만 명이 사망한다는 보고가 있을 만큼 보툴리눔 독소는 조기진단과 예방이 이루어지지 않으면 인간사회 뿐 아니라 축산산업에도 큰 피해를 줄 수 있어 조기진단 및 예방기술이 필요한 실정이다.
보툼리눔 균이 분비하는 독소는 A~G까지 7 종류가 있는데, 비록 독소의 종류가 다르더라도 모두 동일한 이완성 마비를 유발한다. 보툴리눔 신경 독소는 세 개의 작용 도메인을 가지고 있는데, N-말단 촉매 도메인(Light chain: Enzyme)과 내부 전위 도메인(Heavy chain: Translocation domain), C-말단 수용체 결합 도메인(Heavy chain: Binding domain)으로 이루어진 복합체(약 150 kDa)로 비활성 상태의 폴리펩타이드 형태로 발현된 후, 단백질 분해효소에 의해서 분리된 heavy vhain과 light chain이 이황화결합을 이루는 활성상태가 되어야 한다. 활성 독소는 NTNHA(Nontoxic-nonhemagglutinin) 및 HA(Hemagglutinin)와 복합체를 이루어 존재하며, 인체 내로 투입된 복합체 형태의 독소는 혈류로 흡수된 후에 순환기계를 통해 최종 목적지인 근신경 접합부에 이동하여 비가역적으로 결합한다. 독소는 HA 및 NTNHA와의 복합체를 이룸으로써 구조적으로 안정성이 높아지기 때문에 식품 매개 보툴리즘과 같이 독소가 위를 통과하는 경우에도 위산이나 펩신에 의해 분해되지 않고 위장을 통과하면서 체내에 흡수되는 것으로 알려져 있다. 독소가 신경세포의 수용체에 부착한 후, light chain이 세포질로 이동하여 zinc-dependent endoprotease로 작용하고 신경전달 물질의 분비에 관련된 단백질을 분해함으로써 아세틸콜린의 분비를 방해하고 이로 인해 근수축이 차단되므로 마비증상이 나타난다.
보툴리눔 독소형 중 C형은 주로 농경지 및 가축의 축사 부근 토양에 분포되어 축산 산업에 관련된 소, 양, 조류 등의 가축들에게 보툴리즘을 유발하는 독소형으로 매년 발생건수가 보고될 만큼 축산 산업에 피해를 주고 있다. 국내의 경우 1999년 환경보호 측면과 사료가격의 상승으로 인하여 일부 잔반을 재활용하여 축산농가에 공급을 하였는데 이러한 발효사료를 섭취한 소에서 집단적으로 보툴리즘(C형)이 발생하였다.
소의 보툴리즘의 증상은 먼저 뒷다리에 마비가 나타난 후 점차 앞다리로 진행하며, 그 후에는 머리와 목에 마비가 나타난다. 독소를 많이 섭취한 경우에는 급성으로 기립불능, 폐사되기도 하며 독소를 적게 섭취한 경우에는 간혹 회복되기도 한다. 조류에서도 간헐적으로 2005년 서울대공원에서 흑고니, 2007년 성남 탄천에서 야생 오리, 2009년 시화호 야생 철새가 조류 폐사체에 생긴 구더기를 먹고 보툴리즘이 발생하였고, 2012년에는 전북 익산과 충남 부여의 토종닭 사육농가에 보툴리즘이 발생하는 등 모두 독소형 C형에 의한 보툴리즘이 발생하였다.
소의 보툴리즘은 특별한 증상이나 부검 시 병변이 없을 뿐 만 아니라 정상 소들도 장내에 노툴리눔 균이 있어, 원인체 검출에 의한 보툴리즘 진단은 매우 제한적으로 이루어져야 한다. 또한, 보툴리즘은 대부분 항체 형성 이전에 폐사하므로 항체 검사로 보툴리즘에 걸린 소들은 골라낼 수 없으며, 집단 폐사가 아니면 초기 진단이나 오염원을 밝히기가 매우 어려운 중독증이다.
한편, 현재 보툴리즘 C형 진단에는 실험용 쥐를 이용하여 환자의 혈청을 쥐의 복강에 주사한 후 독소를 검출하는 방법이 주로 활용되고 있다. 표준 진단법인 실험용 쥐를 이용한 방법은 PCR, ELISA 등 다른 진단법에 비해 민감도가 높고 모든 보툴리눔 독소를 검출할 수 있는 장점을 가지지만, 생명체를 이용한다는 단점과 함께 약 70 ~ 80%는 보툴리즘임에도 불구하고 실험용 쥐에서 독소가 검출되지 않아 보툴리즘의 진단이 매우 어려운 실정이다. 따라서 현재의 실험용 쥐를 이용한 방법보다 보툴리즘 C형을 특이적이고 효과적으로 진단 할 수 있는 마커를 발굴하고 이를 이용하여 보툴리즘 C형을 조기 진단 할 수 있는 진단 기법 개발이 요구되고 있다. 뿐만 아니라, 기존 PCR을 이용한 진단이나, ELISA를 이용한 고가 장비와 전문성을 요구하는 기법이 아닌 현장에서 간단하게 진단을 할 수 있는 새로운 형태의 진단 기법 개발이 필요하다.
대한민국 공개특허 제2015-0087321호
이에, 본 발명에서는 기존 실험용 쥐를 기반으로 하는 표적물질 검출 기법의 문제점들을 보완하여 보툴리즘 C형을 조기 진단하기 위하여, 보툴리즘 C형의 진단 및 예후 확인에 활용될 수 있는 보툴리눔 신경독소 C1 경쇄 사슬 단백질(Botulinum neurotoxin C1 Light chain protein)을 바이오마커로 활용하였으며, 보툴리즘 C형에 노출 시 보툴리눔 C형 독소 단백질에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 활용하여 BoNT/C1 단백질을 탐지하는 방법으로 보툴리즘 C형을 진단하는 새로운 기법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 BoNT/C1 단백질 특이적 DNA 앱타머 및 이의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 키트(kit), 바이오칩 또는 마이크로어레이를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 보툴리즘 C형 진단 또는 BoNT/C1 단백질 검출에 필요한 정보를 제공하기 위해 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 BoNT/C1 단백질과의 결합반응을 이용하여 BoNT/C1 단백질을 검출 또는 보툴리즘 C형을 진단하는 방법을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 BoNT/C1 단백질 특이적 DNA 앱타머를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 사람 BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 조성물을 제공한다.
또한, BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 키트를 제공한다.
또한, BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 것을 특징으로 하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머가 웰(well)에 집적되어 BoNT/C1 단백질을 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 바이오칩을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 웰(well)은 종이, 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 보유 가축의 예후 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 생물학적 시료로부터 상기 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머와 BoNT/C1 단백질과의 결합 반응을 통해 BoNT/C1 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) PCR 기법을 이용한 랜덤 DNA 앱타머 풀 증폭 단계; (b) 가열-냉각 기법과 스트렙트아비딘을 이용한 ssDNA 제작 단계; (c) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 앱타머 풀을 혼합하는 단계; (d) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 앱타머 풀 혼합액을 기활성화된 Ni-NTA 아가로스와 반응시키는 단계; (e) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하지 못한 DNA 앱타머를 제거하는 단계; 및 (f) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 회수하는 단계를 포함하는 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 보툴리즘 C형 보유 샘플에서 BoNT/C1 단백질을 검출함으로써, 보툴리즘 C형의 조기 진단 및 예후 판단 용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 기존의 실험용 쥐를 이용한 진단법이나 ELISA를 통한 진단을 대체할 수 있으며, 나아가 보툴리즘 C형 앱타머 제작 기술은 C형 뿐만 아니라 다양한 타입의 보툴리즘을 보다 신속하고 경제적으로 진단하는데 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과와 PCR 기법을 통하여 제작한 dsDNA를 열-냉각기법 및 스트랩타비딘 (streptavidin)을 이용하여 회수한 ssDNA을 10% 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교하여 확인한 결과이다.
레인 M: 100 bp DNA 마커
레인 1: DNA 앱타머로부터 PCR 기법을 통하여 증폭된 dsDNA 결과
레인 2, 3: PCR 기법으로 확보한 dsDNA를 열-냉각기법과 스트랩타비딘을 이용하여 제작한 ssDNA 결과
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 SELEX 라운드에서 회수된 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 또는 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 ssDNA 농도를 Nanodrop spectrophotometer를 이용하여 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위한 SELEX 과정에서 선별된 15개의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 BoNT/C1-1 내지 BoNT/C1-15의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 카르복실기를 가지고 있는 CM5 센서 칩 표면에 BoNT/C1을 고정하는 단계를 나타낸 도면이다.
도 6은 BoNT/C1 결합 DNA 앱타머를 이용하여 ELISA 기법을 기반으로 BoNT/C1을 탐지하는 방법에 대한 모식도로서, 패널 [1]은 BoNT/C1 탐지를 위해 BoNT/C1 결합 DNA 앱타머를 이용한 ELISA 법의 모식도를 나타내며, 패널 [2]는 기존 항체를 이용하여 BoNT/C1을 탐지하는 ELISA 법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용한 조툴리즘 C형 표적인자인 BoNT/C1 검출 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. 보툴리즘 C형으로 의심되는 가축의 시료를 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머가 고정되어 있는 진단 키트에 처리하였을 때, 샘플 내 BoNT/C1 단백질과 BoNT/C1 단백질 결합 앱타머의 결합에 의해 BoNT/C1을 진단하는 시스템을 모식도로 나타낸 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 보툴리눔 신경독소 C형 단백질(Botulinum neurotoxin type C1, BoNT/C1)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 보툴리즘 C형의 진단 및 예후 확인에 활용될 수 있는 보툴리눔 신경독소 C1 경쇄 사슬 단백질(Botulinum neurotoxin C1 Light chain protein)을 바이오마커로 활용하였으며, 보툴리즘 C형에 노출 시 보툴리눔 C형 독소 단백질에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 활용하여 BoNT/C1 단백질을 탐지하는 방법으로 보툴리즘 C형을 조기에 진단하는 새로운 기법을 제시하였다는 점에 특징이 있다.
BoNT/C1 단백질은 이완성 마비를 유발하는 단백질로써, 보툴리눔 균이 분비하는 독소는 A~G까지 7 종류가 있다. 특히 C형은 소, 말, 양과 같은 가축과 조류에 보툴리즘을 유발하는 독소로 축산사업에 매년 산발적으로 피해를 주고 있으며, 이를 조기에 예방 진단하기 위해 본 발명에서는 보툴리눔 독소에서 직접적으로 마비증상을 유발하는 light chain 부분을 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 개발하여 보툴리즘 C형을 진단하였다.
앱타머(aptamer)는 짧은 길이의 올리고머로 안정된 삼차구조를 형성하여 표적물질과 특이적인 결합력을 가지는 특징을 가지고 있다. 또한, 앱타머는 DNA나 RNA인 핵산으로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체보다 안정적이며, 다양한 표적 물질(단백질, 펩타이드, 금속, 화학물질 등)과 특이적으로 결합이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 화학적 합성 기법을 이용해 제작이 가능하기 때문에 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며, 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다.
이와 더불어 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 각종 환경 및 산업분야에서 높은 잠재성을 보이는 앱타머를 보툴리즘 C형을 진단하는데 사용하였다는 점에 특징이 있다.
본 발명에서는 기존의 보툴리즘 진단을 위해 독소의 검출 이외에 증상(마비 진행양상, 혀 운동성 관찰 등), 질병발생 과정(전염성, 추정 오염원 유무 등), 유사한 다른 질병의 검사(초기 조치사항, 기립 불능을 유발하는 여러 가지 질병 검사 결과)등을 통하여 보툴리즘을 확인, 진단 시 발생하는 문제뿐만 아니라 기존 진단 기법의 문제점인 고가의 장비 사용 및 확진까지의 시간 및 검출 정확도 따라 발생하는 다양한 문제점을 해결, 보안 및 대체할 수 있는 새로운 진단법을 개발하고자 하였다. 문제점을 해결하기 위해 보툴리즘 C형 진단 및 검출에 활용할 수 있는 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 제작, 선별하여 본 발명에서 제시하고자 하는 새로운 형태의 보툴리즘 C형 진단 기법에 적극 활용하고자 하였다.
BoNT / C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머
본 발명은 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별과정은 히스티딘 융합 단백질 정제 (His tagged protein purification) 기법을 활용하는 방법으로 먼저 히스티딘 잔기를 융합한 BoNT/C1 단백질과 DNA 앱타머 풀의 복합체를 반응시킨 후, Ni-NTA 아가로스와 결합시켜, 히스티딘 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 회수하는 과정이다.
상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖거나, 이러한 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 사람 BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성될 수도 있는데, 상기 표지물질은 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 “DNA 앱타머”는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 “DNA 앱타머”는 “DNA 올리고뉴클레오타이드”와 혼용하여 사용한다.
본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 표적 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 표적 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체 내 또는 시험관 내 선택 기술을 이용할 수 있다 (Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 DNA 앱타머는 본 명세서 도 3 및 도 4에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.
또한, 본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 BoNT/C1 단백질과 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) Needleman and Wunsch, J.Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
한편, 본 발명은 (a) PCR 기법을 이용한 랜덤 DNA 앱타머 풀 증폭 단계; (b) 가열-냉각 기법과 스트렙트아비딘을 이용한 ssDNA 제작 단계; (c) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 앱타머 풀을 혼합하는 단계; (d) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 앱타머 풀 혼합액을 기활성화된 Ni-NTA 아가로스와 반응시키는 단계; (e) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하지 못한 DNA 앱타머를 제거하는 단계; 및 (f) BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 회수하는 단계를 포함하는 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다.
BoNT / C1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 활용한 보툴리즘 C형 진단 및 BoNT / C1 단백질 검출
본 발명은 BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 기반으로 하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 조성물 및 이의 방법을 제공한다.
본 발명의 BoNT/C1 단백질 검출은 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 BoNT/C1 단백질의 복합체를 검출하는 방법에 기초한다. 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 형광물질, 예를 들어 플루오레세인 (fulorescein) Cy3 또는 Cy5, 방사성물질 또는 화학물질, 예를 들어 비오틴 (biotin)으로 표지되거나 1차 아민(primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 보유 가축의 예후 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 생물학적 시료로부터 상기 DNA 앱타머와 BoNT/C1 단백질과의 결합 반응을 통해 BoNT/C1 단백질을 검출하거나, 보툴리즘 C형을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 것을 특징으로 하는 BoNT/C1 단백질 검출, 보툴리즘 C형의 진단 또는 예후 판단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 예를 들어, DNA 앱타머가 고정화된 기판(Substrate)을 포함하는 마이크로어레이(microarray)를 사용하여 BoNT/C1을 검출할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “마이크로 어레이”는 기판의 특정의 영역에 유전 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 마이크로어레이의 “기판”은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 가기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 막(membrane), 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데하이드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민을 통해 기판에 결합될 수 있다.
본 발명에서 BoNT/C1 단백질 검출용 조성물은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열 또는 이러한 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서의 키트는 시료 중의 BoNT/C1 단백질 검출 키트를 사용하기 위한 설명서 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다.
즉, 상기 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 그리고, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 BoNT/C1 단백질 검출용 조성물은 바이오칩의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명에서 바이오칩은 서열번호 1 내지 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열 또는 이러한 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 DNA 앱타머가 웰(well)에 집적되어 BoNT/C1 단백질을 포함하는 시료에 특이적으로 반응하여 BoNT/C1 단백질을 검출하거나 보툴리즘 C형을 진단할 수 있다. 여기서, 상기 웰(well)은 종이, 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
BoNT / C1 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 활용한 BoNT / C1 검출
시료내 BoNT/C1 단백질의 검출 및 분석은 보툴리즘 C형 가능성을 제시할 수 있으며 추후 부툴리즘 모니터링을 위한 검출에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로, BoNT/C1 단백질은 이완성 마비를 유발하는 단백질로써 체내로 투입된 복합체 형태의 독소는 혈류로 흡수된 후에 순환기계를 통해 최종 목적지인 근신경 접합부에 이동하여 독소가 신경세포의 수용체에 부착한 후, light chain이 세포질로 이동하여 zinc-dependent endoprotease로 작용하고 신경전달 물질의 분비에 관련된 단백질을 분해함으로써 아세틸콜린의 분비를 방해하고 이로 인해 근수축이 차단되므로 마비증상이 나타난다. 이에 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 시료로부터 BoNT/C1 단백질의 유무 및 정량 확인함으로써, 보툴리눔 C형 진단 또는 예후 BoNT/C1 검출에 활용할 수 있다.
또한, 본 발명은 보툴리즘 C형 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 가축의 생물학적 시료로부터 본 발명의 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머와 BoNT/C1 단백질과의 결합반응을 통해 BoNT/C1 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 용어 “생물학적 시료”는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1>
BoNT / C1 단백질 선정 및 His 융합 재조합 BoNT / C1 단백질 준비
<1-1> BoNT / C1 단백질의 선정
BoNT/C1 단백질은 주로 농경지 및 가축의 축사 부근 토양에 분포되어 축산 산업에 관련된 소, 양, 조류 등의 가축들에게 보툴리즘을 유발하는 독소형으로 매년 발생건수가 보고될 만큼 축산 산업에 피해를 주고 있다. 특히 BoNT/C1 단백질 복합체 중 경쇄 사슬(light chain)은 세포질로 이동하여 zinc-dependent endoprotease로 작용하고 신경전달 물질의 분비에 관련된 단백질을 분해함으로써 아세틸콜린의 분비를 방해를 하여 마비증상을 직접적으로 일으키는 부분 (Dorner MB, 2013)으로 보툴리즘 C형 진단의 성공률을 높일 것으로 기대되는 물질이다. 이에 본 연구에서는 보툴리즘 C형 조기진단을 위하여 보툴리즘 C형의 진단 및 예후확인에 활용될 수 있는 BoNT/C1 light chain 단백질을 선정하였다.
보툴리즘 C형에 노출된 가축에게 발현되는 BoNT/C1 단백질에 대한 앱타머를 제작하기 위하여 R&D SYSTEMS 사의 His 융합된 재조합 BoNT/C1 단백질 (BoNT-C1 Light Chain)을 구매하여 BoNT/C1에 특이적인 앱타머 제작에 사용하였다.
< 실시예 2>
DNA 앱타머의 제작
<2-1> PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭
BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위해 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100 bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTA AGTGCAATCT-3'; 서열목록 제 16 서열)와 이를 100 bp로 증폭할 수 있는 세 개의 프라이머를 바이오니어로부터 주문하여 제작하였다 [정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3' (서열번호 17의 염기서열), 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 18의 염기서열), 비오티닐화된 (biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-비오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 19의 염기서열)]. 임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 100 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 주형 DNA 1㎕, 10X PCR 완충용액 5㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4㎕, 25μM 정방향 프라이머 2㎕, 25μM 비오티닐화된 역방향 프라이머 2㎕, Ex Taq 중합효소(Takara, Japan) 0.3㎕ (1 unit/㎕)와 35.7㎕의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔 전기영동을 통하여 100 bp에서 밴드가 나타나는지 증폭 산물을 확인하였다. PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50㎕를 이용하여 회수하였다.
<2-2> 가열-냉각( heating - cooling ) 기법을 활용한 ssDNA 제작
PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50㎕를 첨가하여 부피를 100㎕로 조정한 후, 가열-냉각(heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성(Denaturation)하였다. 실험 방법을 구체적으로 표현하자면 PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 획득한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각시켜 ssDNA를 확보하였다.
<2-3> ssDNA 의 선별 및 회수
가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴(Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA와 프라이머를 제거하고 정방향의 ssDNA만을 순수하게 확보하기 위하여, 상기 실시 예에서 획득한 100㎕의 반응액에 스트렙트아비딘 아가로즈 레진(streptavidin agarose resin, Thermo scientific, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA(sigma aldrich, USA), 3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 1 참고).
< 실시예 3>
SELEX 기법을 이용한 재조합 BoNT / C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별
<3-1> SELEX 에 이용되는 각 용액의 조성
SELEX에 이용한 각 용액은 Ni-NTA Agarose(Qiagen, USA)를 이용하였으며, 조성은 다음과 같았다. 즉, 1X 앱타머 선별 용액(pH 7.9): 500mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 5mM 이미다졸, 2X 앱타머 선별 용액(pH 7.9): 300mM NaCl, 40mM Tris-HCl, 10mM 이미다졸, 2mM MgCl2, 세척 용액(pH 7.9): 500mM NaCl, 60mM 이미다졸, 20mM Tris-HCl, DNA 앱타머 용출 용액(pH 7.9): 300mM NaCl, 20mM Tris-HCl, 250mM 이미다졸.
<3-2> SELEX 에 이용될 DNA 앱타머 구조 제작
상기 실시예 <2-3>을 통하여 제작 확보한 ssDNA 50 ㎕에 2X DNA 앱타머 선별 용액 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성 시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.
<3-3> Ni - NTA agarose 정제 키트를 이용한 BoNT / C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 선별
상기 실시예 1에서 구매한 His 융합 BoNT/C1 단백질 3㎕ (21.54 pmol)를 1X 앱타머 선별용액으로 전체 반응 부피를 100㎕로 조정한 후, 상기 실시예 <3-2>에서 획득한 ssDNA 앱타머 풀(323.1.8 pmol)과 1:15 비율로 혼합하여 4℃에서 24시간동안 반응시켰다. Ni-NTA 아가로스 정제 키트의 보존용액을 제거하기 위해 Ni-NTA 아가로스 200㎕을 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 그 후 Ni-NTA 아가로스 정제 키트를 활성화하기 위하여 1X 앱타머 선별용액 500 ㎕을 넣고 4℃에서 10분 동안 교반하며 반응시켜 활성화시킨 후, 4℃에서 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 상기 과정을 2회 반복한 후 His 융합 BoNT/C1 단백질과 ssDNA 앱타머 풀을 반응시킨 반응액을 활성화된 Ni-NTA 아가로스와 4℃에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 세척용액 1 ㎖을 넣어 세척하는 과정을 3회 반복하여 His 융합 BoNT/C1 단백질과 결합하지 못한 ssDNA 앱타머를 제거하였다. Ni-NTA 아가로스로부터 His 융합 BoNT/C1 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 용출하기 위하여 DNA 앱타머 용출 용액 200㎕를 넣어 4℃에서 20분 동안 교반하며 반응시켰으며, 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층의 용출 용액을 얻었다. 상기 과정을 2회 반복하여 상층의 용출 용액을 획득하였다. His 융합 BoNT/C1 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머간의 결합물에서 His 융합 BoNT/C1 단백질을 제거하기 위하여, 용출 용액에 동일 부피의 PCI 용액을 처리한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 이후, His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 만을 회수하기 위하여 PCI 법을 통하여 회수된 상층액에 1/100 부피의 tRNA와 3배부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 이상 반응시켰고, 반응액을 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 이를 통하여 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수할 수 있었으며, 회수된 DNA 앱타머는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다.
<3-4> 비특이적 DNA 앱타머 제거를 위한 네가티브 선별
BoNT/C1 단백질이 아닌 히스티딘 잔기와 아가로스(agarose)에 결합하여 선별된 비특이적인 DNA 앱타머를 제거하기 위하여 SELEX 6회와 7회 사이에 BoNT/C1 단백질 없이 히스티딘 아미노산만 고정되어 있는 Ni-NTA 아가로스에 DNA 앱타머 용액을 결합하는 네가티브 선별(negative selection)을 진행하였다. 이후 3-3과 같은 방법으로 SELEX를 총 12회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적물질인 BoNT/C1 단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻고자 하였다.
< 실시예 4>
His 융합 BoNT / C1 단백질과 특이적으로 결합하는 최적 DNA 앱타머 선별을 위한 SELEX 라운드 선별
<4-1> 나노 드롭( Nano Drop )을 이용한 각 라운드의 친화성 확인
SELEX를 12회 까지 마친 후 SELEX 계속 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노 드롭(Nano drop Micro spectrophotometer)을 이용하여 측정하였다. 나노 드롭을 활용하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머 농도를 측정한 결과, 네가티브 선별 이후에 10 라운드의 농도가 248.1 ng/㎕로 가장 높았으며, 11 라운드와 12 라운드의 농도는 각각 182.8 ng/㎕와 168.9 ng/㎕로 10 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 네가티브 선별 이후, His 융합 BoNT/C1 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 최적 앱타머 풀은 10 라운드 풀임을 확인할 수 있었다(도 2 참고).
<4-2> 실시간 PCR 기법을 이용한 최적 라운드 확인
SELEX를 12회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간(Real time) PCR을 수행하였다.
우선 초기 DNA 라이브러리와 네가티브 선별 이후인 9 라운드, 10 라운드, 11 라운드, 12 라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR 기법을 이용하여 증폭하고, 가열- 냉각 기법을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 9, 10, 11, 12 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비하여 동일한 농도의 His 융합 BoNT/C1 단백질과 4℃에서 24시간 이상 반응시켰다. 반응액은 반응액은 활성화된 Ni-NTA 아가로스와 1시간 동안 반응시킨 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거했다. 이후, 세척 용액으로 3회 세척하여 His 융합 BoNT/C1 단백질과 결합하지 못한 ssDNA를 제거한 후 앱타머 용출 용액과 반응시켜 His 융합 BoNT/C1 단백질과 결합한 DNA 앱타머를 회수하였다. 회수한 His 융합 BoNT/C1 단백질과 결합한 DNA 앱타머에 동일 부피의 PCI를 처리하여 His 융합 BoNT/C1 단백질을 제거한 후, 회수 용액의 1/100 부피의 tRNA와 3배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 이상 반응시켰다. 회수된 DNA는 85℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 이를 통하여 획득된 각 ssDNA들은 각각 100와 10-1, 10-2로 희석하여 실시간 PCR 기법의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 우선, 95℃에서 5분 변성 이후, 95℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10-1로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다. 실시간 PCR Ct값은 9, 10, 11, 12 라운드에서 각각 16.20, 12.16, 14.55, 17.09로 10 라운드 Ct값이 가장 낮게 나왔다. 10 라운드의 ssDNA 앱타머들이 9, 11, 12 라운드와 비교하여 높은 앱타머 농도의 풀임을 확인할 수 있었으며 더 이상 SELEX를 진행이 필요 없음을 확인하였다(표 1 참고). 이는 나노 드롭을 이용하여 확인한 각 라운드에서 회수된 앱타머 농도 측정 결과와도 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 나노 드롭 결과 및 실시간 PCR 결과를 통하여 10 라운드의 앱타머 풀이 His 융합 BoNT/C1 단백질과 결합 효율이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
9R (1 X 10 -1 ) 10R (1 X 10 -1 ) 11R (1 X 10 -1 ) 12R (1 X 10 -1 )
C(t) 16.20 12.16 14.55 17.09
Efficiency (%) 67.9 78.3 71.8 62.1
< 실시예 5>
BoNT / C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군 확보
나노 드롭과 실시간 PCR을 통하여 His 융합 BoNT/C1 단백질과 친화력이 가장 높은 것으로 판단된 10 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 아래와 같은 프라이머를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다.
정방향 프라이머:
5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3' (서열번호 17의 염기서열)
역방향 프라이머:
5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 18의 염기서열)
이렇게 획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트(SolGent, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (10ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 (20ng/㎕) 4㎕, 6 X T-블런트 버퍼 1㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6㎕는 100㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열충격(heat shock)을 가한 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 여기에 900㎕의 SOC(2% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 글루코오스) 배지를 첨가한 후, 37℃에서 50분 동안 배양하였다. 이후, 200㎕의 배양액을 취하여 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/ml), 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/ml), X-gal (50 ㎍/ml), IPTG (5 ㎍/ml)가 포함되어 있는 LB 배양 플레이트에 스프레딩하고, 37℃에서 20시간 동안 배양시킨 후, 42개의 흰색 콜로니만을 선별하여 각 콜로니의 염기서열을 결정하였으며(Solgent, Korea), 서열 분석을 통하여 중복되지 않고 BoNT/C1 단백질과 친화력이 높은 BoNT/C1 단백질 결합 DNA 앱타머 15개를 확보할 수 있었다. 하기 표 2는 Ni-NTA 아가로스를 활용한 BoNT/C1 단백질 결합 DNA 앱타머 선별 SELEX 기법을 이용하여 획득한 BoNT/C1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 15개에 대한 서열을 구체적으로 나타낸 것이다.
클론명칭 서열
번호 		선별된 서열 서열크기
( bp )
BoNT/C1-1 1 GGGTGGTGGTACCTACCTTGAGCGAGTCGAGATCACGCTG 40
BoNT/C1-2 2 GCGGGGTTTGTGCCATCCTGTGCCATTGAATGTTGGGGCG 40
BoNT/C1-3 3 GCCGCGTCGGTGGCGATTGTGTATGCGGTTGTCCCCGGGG 40
BoNT/C1-4 4 TGGTGAGTATAACCCTAGAGGCTTCGGCTTTGAGTCGGGG 40
BoNT/C1-5 5 GGTAAGCTGTCTCGTGGGTCGTGTTAGGGGCGCGTCTCGG 40
BoNT/C1-6 6 GCGTGGTGGCGAAGTTTAGTATATCGTATCTTGCCTAGGG 40
BoNT/C1-7 7 CAGCGGCCCTACAGTGCGTATTGATGGCCTTTCTGCTGGG 40
BoNT/C1-8 8 CCTTAGTGCGGTACGTGACTATTGTTGAATATGCGCTGGG 40
BoNT/C1-9 9 CCGGTATCACACTGTTGGAAGGGGCGTATTTACTCTCGGCA 41
BoNT/C1-10 10 GCAAAGGTTTTGAATAACCGCTGAGCTCTCCCGTTCTGCG 40
BoNT/C1-11 11 GGCGTATCTCCTCACCTATGTCAGTCGTGTTGCCGGTTCG 40
BoNT/C1-12 12 TGGTGGTCAGTGAGTGGTCGGGTCTCTGCATCTCTGTGTG 40
BoNT/C1-13 13 CGGATGCGGGTAATTGAATTAGTACGGTCTGCCCCTTGTG 40
BoNT/C1-14 14 GGATCTGCTGTGTACCTCGCTGCTCGACTGGACTAGTCCG 40
BoNT/C1-15 15 CGGATGCGGGTAATTGAATTAGTACGGTTTGCCCCTTGTG 40
< 실시예 6>
BoNT / C1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정
BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다 (도 3 및 도 4 참고).
< 실시예 7>
SPR 을 이용한 BoNT / C1 단백질과 BoNT / C1 결합 앱타머 후보군 간의 친화도 테스트
<7-1> BoNT / C1 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들 간의 각 친화도를 정량하기 위한 BoNT / C1 단백질 코팅 센서 칩 제작 실험
BoNT/C1 단백질과 상기 <실시예 5>에서 획득한 앱타머 후보군들간의 친화도를 정량하기 위하여, SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000 (BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. BoNT/C1 단백질과 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5(GE Healthcare, UK)을 이용하였다. 우선 센서 칩 CM5에 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropy l) carbodiimide (EDC) 혼합액을 5㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려 센서칩 표면의 카르복실기를 반응성이 더 좋은 N-히드록시석신이미드 에스테르(N-Hydroxy- succinimide ester; NHS-에스테르)로 활성화시켰다. NHS-에스테르로 활성화된 센서칩 CM5의 표면에 BoNT/C1 단백질을 고정하기 위하여 10mM 소듐 아세테이트(pH 4.5) 완충액에 60㎍/㎖의 농도로 녹아 있는 BoNT/C1 단백질 용액을 5㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하여 칩 표면을 BoNT/C1 단백질로 코팅하였다. 이후 His 융합 BoNT/C1 단백질이 고정된 센서 칩에 1M 에탄올아민 하이드로클로라이드 (pH 8.5)를 5㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려줌으로써 센서 칩 표면에 남아 있는 카르복실 반응기를 불활성시켰다. 이를 통하여 다른 시약 및 DNA 앱타머가 칩 표면에 직접 결합하는 것을 방지하였으며, 각 실험 후 센서칩은 1 M NaCl, 50 mM NaOH로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)으로 수득, 정량하였다.
<7-2> BoNT / C1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화력 측정
BoNT/C1 단백질과 가장 높은 친화력을 가지는 앱타머를 선별하기 위하여 확보된 BoNT/C1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군을 HBS-EP 버퍼(GE Healthcare, UK)에 각 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1,000nM의 농도로 녹여 준비하였다. 기 제작 준비된 BoNT/C1 결합 DNA 앱타머는 아무것도 결합시키지 않은 센서 칩 (채널 1)과 BoNT/C1 단백질이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 다양한 농도 (각 300 nM, 500 nM, 700 nM, 1,000nM)의 BoNT/C1 결합 DNA 앱타머 후보군을 주입함으로써 BoNT/C1 단백질과 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군간의 친화도를 정량화하였다. 각 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 해리상수 (K D , dissociation) 수득 결과 His 융합 BoNT/C1 단백질 결합 DNA 앱타머 후보군 중 BoNT/C1_14 앱타머의 해리상수 (K D )가 9.91 X 10-14 M으로 표적하는 BoNT/C1 단백질에 대해 가장 높은 친화도 값을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다(표 3 참고).
클론 명칭 K D (M) 클론 명칭 K D (M)
BoNT/C1-1 1.04 x 10-12 BoNT/C1-2 8.2 x 10-13
BoNT/C1-3 2.39 x 10-12 BoNT/C1-4 5.74 x 10-11
BoNT/C1-5 8.99 x 10-12 BoNT/C1-6 6.53 x 10-13
BoNT/C1-7 3.48 x 10-11 BoNT/C1-8 2.08 x 10-11
BoNT/C1-9 2.71 x 10-12 BoNT/C1-10 6.09 x 10-13
BoNT/C1-11 2.53 x 10-11 BoNT/C1-12 6.18 x 10-13
BoNT/C1-13 1.07 x 10-13 BoNT/C1-14 9.91 x 10-14
BoNT/C1-15 2.51 x 10-12
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA aptamer specifically binding to Botulinum neurotoxin type C1 <130> pn1510-301 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 1 gggtggtggt acctaccttg agcgagtcga gatcacgctg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 2 gcggggtttg tgccatcctg tgccattgaa tgttggggcg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 3 gccgcgtcgg tggcgattgt gtatgcggtt gtccccgggg 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 4 tggtgagtat aaccctagag gcttcggctt tgagtcgggg 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 5 ggtaagctgt ctcgtgggtc gtgttagggg cgcgtctcgg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 6 gcgtggtggc gaagtttagt atatcgtatc ttgcctaggg 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 7 cagcggccct acagtgcgta ttgatggcct ttctgctggg 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 8 ccttagtgcg gtacgtgact attgttgaat atgcgctggg 40 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 9 ccggtatcac actgttggaa ggggcgtatt tactctcggc a 41 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 10 gcaaaggttt tgaataaccg ctgagctctc ccgttctgcg 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 11 ggcgtatctc ctcacctatg tcagtcgtgt tgccggttcg 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 12 tggtggtcag tgagtggtcg ggtctctgca tctctgtgtg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 13 cggatgcggg taattgaatt agtacggtct gccccttgtg 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 14 ggatctgctg tgtacctcgc tgctcgactg gactagtccg 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 15 cggatgcggg taattgaatt agtacggttt gccccttgtg 40 <210> 16 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template DNA <400> 16 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagatagta agtgcaatct 100 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 17 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 18 agattgcact tactatct 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer_biotin <400> 19 agattgcact tactatct 18

Claims (14)

  1. BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)인 BoNT/C1 단백질 특이적 DNA 앱타머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 사람 BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 표지물질은 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  8. BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 조성물.
  9. BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 키트.
  10. BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머가 기판상에 고정된 것을 특징으로 하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 마이크로어레이.
  11. BoNT/C1 단백질 또는 His 융합 BoNT/C1 단백질에 특이적으로 결합하는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 DNA 앱타머가 웰(well)에 집적되어 BoNT/C1 단백질을 포함하는 시료에 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 바이오칩.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 웰(well)은 종이, 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 BoNT/C1 검출 또는 보툴리즘 C형 진단용 바이오칩.
  13. BoNT/C1 단백질 검출 또는 보툴리즘 C형 보유 가축의 예후 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 생물학적 시료로부터 상기 제1항 및 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머와 BoNT/C1 단백질과의 결합 반응을 통해 BoNT/C1 단백질을 검출하는 방법.
  14. 삭제
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