KR101997018B1 - 글리코겐-기반 양이온 폴리머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글리코겐-기반 양이온 폴리머, 음이온 화합물과 양이온 폴리머의 복합체, 이 복합체를 포함하는 약학적 조성물 및 기관, 조직 또는 세포와 같은 특정 약학적 표적 속에 음이온 화합물을 전달하거나 형질감염시키기 위한 복합체의 의 용도에 관한 것이다.

Description

글리코겐-기반 양이온 폴리머{Glycogen-Based Cationic Polymers}
본 발명은 글리코겐-기반 양이온 폴리머, 이 폴리머 및 적어도 하나의 음이온 화합물을 포함하는 복합체 및 음이온 화합물을 전달하기 위한 복합체의 용도에 관한 것이다.
특히, 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 핵산의 형질감염을 위한 비-바이러스 벡터로서 유용하다.
활성 성분의 부작용을 감소시키고 이들의 치료 효과를 최대화하기 위해서, 제형이 활성 성분의 방출 단계를 제어하는 제어 방출 시스템과 활성 성분을 특정 약리학적 표적에 전달하고 작용하게 할 수 있는 시스템이 개발되었다.
특히, 전달 및 작용 시스템은 얻은 복합체가 저장과 투여 동안 안정하나, 옳은 약리학적 표적으로 활성 성분을 방출하는 방식으로 활성 성분과 상호작용해야 한다.
통상적으로, 전달 시스템과 활성 성분 사이에 형성된 상호작용은, 비-공유이며, 예를 들어, 정전기, 이온 또는 반데르 바알스 상호작용, 수소 결합 등이다.
전달 및 작용 시스템의 문제는 부분적으로 저 분자량의 활성 성분에 대해 제기되었고, 부분적으로 고 분자량의 폴리머 및 분자, 예를 들어, 핵산에 대해 제기되었다.
특히, 표적 세포들 속에 핵산 서열 및/또는 유전자 구조체의 삽입의 자발적 과정은, 유전자의 부존재를 보상하거나, 유전자를 과다발현하거나, 유전자의 발현을 침묵시키거나 또는 세포 속에 새로운 기능을 주입하기 위한 목적으로, 유전자 치료 분야에서, 용어 "형질감염(transfection)"으로 표현된다.
이 과정은 유전 질환의 치료 및 만성 질환의 치료 및 예방을 위한 전략의 개발 모두에서 전도유망한 것으로 보인다.
그러나, 자연 형태로 인비보 투여될 때, 다른 폴리음이온 물질과 매우 유사하게, 핵산은 양이온 효소(예를 들어, 뉴클레아제 및 프로테아제)에 의해 빠르게 분해되고 세포에 의해 빈약하게 흡수된다.
본 발명에서 연구되고 개발된 유전자 벡터는 바이러스 시스템(레트로바이러스, 아데노바이러스 등) 및 비-바이러스 시스템(리포솜, 폴리머, 펩타이드 등)을 포함한다.
바이러스 벡터는 비-바이러스 시스템보다 더 높은 형질감염 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 그러나, 바이러스 벡터의 인비보의 사용은 여러 단점, 예를 들어, 복제 위험, 면역 반응 유발 가능성, 단지 추가분할될 세포들만 표적들로 사용가능하다는 사실, 대형 유전자의 낮은 전하 용량 또는 DNA 단편의 무작위 삽입에 의해 제한된다.
비-바이러스 벡터를 기반으로 한 유전자 치료의 사용은 여러 이점, 예를 들어, 상대적 안전성 및 낮은 제조 비용을 포함한다.
비-바이러스 유전자 벡터, 예를 들어, 양이온 폴리머, 리포좀 및 합성 벡터는 바이러스 벡터의 용도에 대한 대안으로 널리 연구되고 있다.
N,N-다이에틸아미노에틸-덱스트란(DEAE-덱스트란)은 활성 성분의 제어 방출(예를 들어 WO 90/09780에 기술된 대로 점막 속에 제어 방출)에 사용되고, 뒤이어 형질감염제(예를 들어 EP 1 738 769에 기술)로 사용될 천연 폴리머의 제 1 화학적 유도체 중 하나이었다.
DEAE-덱스트란은 N,N-다이에틸아미노에틸 클로라이드와 덱스트란을 반응시켜 얻은 폴리양이온 폴리머이며, 이는 글루코오스 단위들이 α-1,6 결합을 통해 결합되고, 글루코오스 모노머들이 α-1,4 결합을 통해 결합되는 적은 분지를 가지는 선형 폴리머이다(넘버링은 아래 화학식에 도시된다).
다음 화학식으로 나타내어지는 DEAE-덱스트란은 질소 원자들이 서로 다른 물리화학적 특징을 갖는 질소 잔기를 포함하는 2개의 치환기를 가진다:
Figure 112014071313611-pct00001
제 1 치환기는 생리적 pH에서, 이온화 형태인 약 9.5의 pKa를 가진 3차 아민 작용기(N'로 표시)를 포함한다. "탠덤(tandem)"으로 알려진 제 2 치환기는 영구적인 양전하를 가지며 약 5.7의 pKa를 갖고, 생리적 pH에서, 비-이온화 형태인 제 2의 3차 아민 작용기(N"로 표시)의 산도에 영향을 미치는 4차 암모늄기(N+)를 포함한다(F. Gubensek, Journal of Macromolecular Science: Part A - Chemistry - 2 (5) 1968, 1045 -1054).
그러나, DEAE-덱스트란의 양전하는 인비보에서 핵산 이외의 음이온 생물학적 구조와 상호작용하여, 독성 현상을 초래한다는 것이 알려져 있다.
일반적으로, 양이온 폴리머와 핵산 사이의 복합체의 형성 메커니즘 및 이후 전달은 다음과 같이 요약될 수 있다.
유전 물질은 약한 상호작용, 예를 들어, 정전기 상호작용을 통해 양이온 폴리머에 의해 복합체를 형성한다. 이런 복합체의 형성이 핵산을 뉴클레아제 분해로부터 보호하고 핵산이 세포 속에 전달되게 할 수 있는데 이는 복합체의 표면상에 존재하는 양전하들이 세포막과 상호작용하여, 엔도솜의 형성을 통해, 복합체의 세포내식작용을 자극하기 때문이다.
엔도솜의 내부는 약 7.3인 세포질 매질의 pH보다 훨씬 더 산성인 약 4.5-5의 pH를 가진다. 이런 pH 차이는 시토솔로부터 엔도솜 속으로 H+ 이온을 밀어내는, 엔도솜 막 상에 존재하는 ATP-의존성 프로톤 펌프에 의해 유지된다. 산성 pH는 뉴클레오티드 서브유닛 사이의 포스포다이에스터 결합의 가수분해에 의한 핵산의 분해에 원인이 되는 효소인 리소좀 뉴클레아제의 활성을 촉진한다.
버퍼 능력을 가진 폴리머는 리소좀 뉴클레아제의 활성을 억제하는 동시에 엔도솜의 삼투질 농도를 변형시킨다.
사실은, 폴리머는 H+ 이온을 결합하는 반면, 다른 H+ 이온은 엔도솜의 전기 중성을 유지하는 Cl- 이온과 동시에 시토솔이 필요로 한다. 그러나, H+ 및 Cl-에 대한 요구는 엔도솜 내부에서 이온 농도의 증가를 초래하며, 시토솔에 비해 엔도솜의 삼투질 농도의 결과적 증가를 동반한다. 삼투질 농도의 증가는 시토솔로부터의 물을 요구한다. 결과적으로, 엔도솜은 파열될 때까지 팽창하여, 폴리머-핵산 복합체를 세포질 속에 방출한다.
"프로톤 스폰지 메커니즘"으로 알려진 이런 메커니즘은, 특히 J-P. Behr in "The proton sponge : a trick to enter cells the viruses did not exploit" (Chimia, 1997, 51, 34-36) in relation to polyethyleneimine (PEI) polymers 및 더욱 일반적으로 H. Eliyahu et al. in "Polymers for DNA delivery"(Molecules, 2005, 10, 34-64)에 기술되었다.
폴리에틸렌이민(PEI)은, 예를 들어, O. Boussif et al. in "A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine"(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, Vol. 92, 7297-7301) 및 국제특허출원 WO 02/100435에 기술된 대로, 인비트로로, 세포 속의 올리고뉴클레오티드 및 플라스미드의 매우 효과적인 방출을 특징으로 하는 선형 또는 가지형 양이온 폴리머이다. PEI는 뉴클레아제에 의한 분해에 대항하여 핵산을 보호하는 높은 전하 밀도를 가진 폴리머로 기술된다. PEI의 높은 버퍼 능력은 벡터-핵산 복합체의 세포질 속으로의 방출을 가능하게 하는 엔도솜의 삼투성 팽창("프로톤 스폰지" 메커니즘)을 유도함으로써, 세포 흡수 단계 동안 엔도솜에서 분해에 대항하여 핵산을 보호한다.
형질감염제로서 널리 연구되는 다른 폴리머는 폴리(L-리신)(PLL)이며, 예를 들어, 국제특허출원 WO 03/063827에 기술되며, 음으로 하전된 핵산의 포스페이트기와 상호작용하는 생리적 pH에서 이온화되는 1차 아민기를 특징으로 한다. 그러나, PLL의 독성 및 형질감염 효과는 이들의 분자량에 정비례한다: 폴리머의 분자량이 증가하면, 한편으론, 증가된 형질감염 효과가 관찰되며, 다른 한편으론, 증가된 세포독성이 관찰된다. 또한, PLL의 주쇄는 생리적 조건하에서 거의 분해되지 않으며, 이의 축적은 결국은 독성 결과를 유도할 수 있다.
대다수의 양이온 폴리머의 경우, 핵산과 PLL의 복합체는 또한 물리화학적 단점을 가진다. 예를 들어, 제조 방법은 크기 제어에 적은 능력을 제공하며 이것이 제한된 확산 능력을 가진 대형 입자들의 존재 및/또는 제제화 또는 투여 동안 침전의 가능성을 유도할 수 있다. 또한, PLL의 산-염기 특징은 높은 형질감염 효과를 얻는 것을 가능하게 하지 못하는데, 이는 아마도 세포질 매질 속으로 핵산의 방출에 대한 제한된 능력 때문일 것이다.
천연 및 합성인 다른 양이온 폴리머는 핵산에 대한 형질감염제로서 종래기술에 기술되었다.
예를 들어, 국제특허출원 WO 03/078576은 핵산에 대한 형질감염제로서 키토산을 기술한다.
키토산은 β-1,4 결합을 통해 연결된 폴리머에 무작위로 분배된 D-글루코사민 및 N-아세틸-D-글루코사민 유닛으로 구성되고 약 6.5의 pKa를 가진 아민기를 포함하는 천연 선형 폴리머이다.
핵산을 위한 형질감염제로서, 예를 들어, 폴리(아미도아민)(PAMAM) 구조, 선형 구조의 거대분자; 메타크릴 폴리머(N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, DMAEMA), 폴리(에틸렌이민)(PEI) 및 가용성, 기능성 또는 지향성 그룹을 가진 이런 폴리머의 유도체, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 포함하는 폴리머 구조의 양으로 이온화가능한 그룹을 포함하는 덴드리머에 대한 집중적인 연구가 실행되었다.
예를 들어, 국제특허출원 WO 97/25067에 기술된 선형 폴리(아미도아민)(PAMAM)은 안정한 및/또는 분산가능한 복합체의 형성을 가능하게 하는 수용성 폴리머이다. 바람직하게는, 이런 폴리머의 양이온 그룹의 pKa 값은 7 내지 8로 유지되어야 하는데, 이는 낮은 pKa 값이 핵산으로 충전하는 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문이다. 또한, PAMAM을 기반으로 한 덴드리머 및 핵산으로부터 형성된 복합체의 엔도솜에 의한 방출은 "프로톤-스폰지" 효과를 필요로 한다. 구체적으로, C.L. Waite et al. in "Acetylation of PAMAM dendrimers for cellular delivery of siRNA"(BMC Biotechnology, 2009, 9:38)은 1차 아민 잔기의 부분 아세틸화는 PAMAM-기반 덴드리머의 버퍼 능력 및 siRNA의 방출 모두를 감소시킨다는 것을 기술하였다.
핵산을 위한 형질감염제 이외의 다른 용도를 위한 양이온 폴리머가 개발되었다.
예를 들어, Pal S et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289, 2006, pages 193-199)의 논문 2.2 장에서, 양이온 모노머 N-(3-클로로-2-하이드록시프로필)-트라이메틸 암모늄 클로라이드를 폴리사카라이드 글리코겐의 주쇄 속에 포함시킴으로써 어떻게 글리코겐이 양이온화되었는지가 기술된다. 상기 양이온 폴리머는 철광석 현탁액에 응집제로서 효과적인 것으로 발견되었다.
이상적인 형질감염제는, 생리적 표적을 조작하는 것이 필수적일 필요 없이, 높은 형질감염 능력을 보장해야하며; 유효량에서 독성이지 않아야 하며 임의의 장기간 부작용을 피하기 위해서 생분해성이어야 한다는 것이 알려져 있다.
또한, 형질감염제가 폴리머이기 위해서, 형질감염제는 마이크로미터보다 작은 입자(즉 10-6m 미만)를 형성해야 하며 바람직하게는 나노입자를 형성해야 하는데, 이는 크기는 세포외 매질에서 복합체의 분산 능력 및 세포에서 세포내식작용/식세포작용 효과 모두를 제한하는 것으로 알려져 있기 때문이다.
마지막으로, 폴리머 구조는 다양한 pKa 값을 특징으로 하는 아민기 및/또는 질소 원자를 포함해야 한다. 사실, 생리적 pH보다 높은 pKa 값을 가진 아민기는 생리적 pH에서 핵산의 복합화를 촉진하며; 약 엔도솜 pH 값의 pKa 값을 가진 아민기는 "프로톤-스폰지" 메커니즘을 활성화하고 세포질 속으로 폴리머-핵산 복합체의 방출을 보장하며; 마지막으로, 4차 암모늄기는 pH 값과 관계없이 복합화 및 엔도솜으로부터 방출을 보장한다.
본 출원인은 저 분자량 활성 물질을 전달하고 핵산을 위한 비-바이러스 벡터로서 사용될 수 있고, 종래기술에 공지된 재료들의 단점을 극복할 수 있는 신규한 폴리머를 개발하는 문제를 다뤘다.
놀랍게도, 본 출원인은 신규한 양이온 유도체를 얻도록 변형될 수 있는 글리코겐을 발견하였다.
유리하게는, 상기 글리코겐의 신규한 양이온 유도체는 낮은 세포독성을 특징으로 한다.
본 출원인은 이것은 주로 두 가지 이유 때문인 것으로 생각한다. 먼저, 글리코겐은 생체적합성 폴리머이며, 모든 동물 신체에서 당의 신진대사 및 저장의 생산물이며, 동물 신체에서 글리코겐은 연속적으로 생산되고 분해된다. 또한, 본 출원인은 글리코겐에서 여러 가지가 구조에 양이온 전하에 대한 접근을 선택적으로 감소시킬 수 있는 안정한 구형 형태를 제공하며: 가용성 분자들이 폴리머 구조 내부에서 확산될 수 있으며 양이온 부위에 의해 복합체를 형성하는 반면, 더 많은 복합체 구조와의 상호작용은 입체장애 이유로 더 이상 허용하지 않을 것이라고 생각한다. 이런 구형 형태는 통상적으로 세포막을 손상시키는 양이온 전하의 독성을 감소시킬 수 있다.
본 출원인은 글리코겐의 신규한 양이온 유도체는 유도체가 이로부터 유도될 수 있는 천연 폴리머의 생체적합성 특성을 보유한다는 것을 발견하였다.
본 출원인은 또한 글리코겐의 이런 신규한 양이온 유도체는 넓은 범위 내의 크기와 분자량을 가진 음이온 화합물과 복합체를 형성할 수 있다는 것을 발견하였다.
유리하게는, 상기 복합체는 나노미터 크기이며 심지어 높은 농도로 용액에 있을 때 어떠한 응집도 나타내지 않는다.
본 출원인은 글리코겐의 신규한 양이온 유도체는 음이온 화합물을 특정 생리적 표적(예를 들어, 기관, 조직 및 세포)에 전달할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 출원인은 또한 본 발명에 따른 글리코겐의 양이온 유도체는 세포 속으로 침투할 수 있다는 것을 발견하였다.
결과적으로, 글리코겐의 상기 신규한 양이온 유도체는 음이온 화합물을 세포 속으로 전달하기 위해 사용될 수 있다.
마지막으로, 본 출원인은 본 발명에 따른 글리코겐의 양이온 유도체는 단백질 및 효소의 보존에서 안정제로서 사용될 수 있고 백신의 보호에서 보조항원보강제로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
유리하게는, 글리코겐의 신규한 양이온 유도체는 음이온 화합물의 복합체화 및 엔도솜으로부터 세포질로 폴리머-음이온 화합물 복합체의 방출 모두를 촉진하기 위해서, 서로 다른 pKa 값을 특징으로 하는 아민기를 포함하는 치환기를 포함한다.
유리하게는, 본 발명에 따른 글리코겐의 신규한 양이온 유도체는 낮은 점성을 가지며, 결과적으로, 주사용 약학적 조성물로 제제화될 수 있다.
제 1 양태에서, 본 발명은 변형 글리코겐을 기반으로 한 신규한 양이온 폴리머에 관한 것이며, 특히 본 발명은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 반복 단위를 포함하는 글리코겐을 기반으로 한 양이온 폴리머에 관한 것이다:
(a)
Figure 112014071313611-pct00002
(a)
여기서
동일하거나 다를 수 있는 그룹 R은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬, 아조사이클일-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 동일하거나 다를 수 있는 사슬 (C1-C6)알킬은 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다; 및
n은 1보다 크거나 동일한 정수이다; 및
(b)
Figure 112014071313611-pct00003
(b)
여기서
R1은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 동일하거나 다를 수 있는 사슬 (C1-C6)알킬은 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다;
동일하거나 다를 수 있는 X1 및 X2는 그룹 -OH 또는 R2가 수소 원자, (C1-C6)알킬 및 p가 1보다 크거나 동일한 H-[NH-(C1-C6)알킬]p-로부터 선택되는 질소를 포함하는 그룹 -NHR2이며 그룹 (C1-C6)알킬은 동일하거나 다를 수 있고;
m은 1보다 크거나 동일한 정수이다;
R, R1, X1 및 X2 중 적어도 하나는 R, R1, X1 및 X2의 각각에 대해 정의한 대로 질소를 포함하는 그룹인 것을 조건으로 하며
상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 글리코겐과 N-(3-클로로-2-하이드록시프로필)-트라이메틸 암모늄 클로라이드와 반응에 의해 얻은 생성물과 다르다는 것을 조건으로 한다.
상기 표현 "R, R1, X1 및 X2 중 적어도 하나는 R, R1, X1 및 X2의 각각에 대해 정의한 대로 질소를 포함하는 그룹인 것을 조건으로"는 R이 질소를 포함하는 그룹인 경우에, 이 그룹은 R1에 정의된 것이며, X1이 질소를 포함하는 그룹인 경우에, 이 그룹은 X1에 정의된 것이며 X2가 질소를 포함하는 그룹인 경우에, 이 그룹은 X2에 정의된 것이라는 것을 의미한다.
제 2 양태에서, 본 발명은 글리코겐-기반 양이온 폴리머와 음이온 화합물 사이의 복합체에 관한 것이다.
한 바람직한 실시태양에 따라, 상기 음이온 화합물은 활성 물질이다. 유리하게는, 상기 음이온 화합물은 핵산이다.
제 3 양태에서, 본 발명은 글리코겐-기반 양이온 폴리머와 음이온 화합물 사이의 복합체 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제 4 양태에서, 본 발명은 음이온 화합물을 특정 약학적 표적, 예를 들어, 기관, 조직 또는 세포 속에 전달하거나 형질감염하기 위한 글리코겐-기반 양이온 폴리머와 음이온 화합물 사이의 복합체의 용도에 관한 것이다.
한 바람직한 실시태양에서, 상기 음이온 화합물은 활성 물질이다. 유리하게는, 상기 음이온 화합물은 핵산이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1 내지 8은 실시예 5에 기술된 대로, 겔 전기영동 후에 얻은 8개 아가로스 겔을 나타낸다. 도 1 내지 8 전부에서, siRNA(*) 및 DNA(*) 마커는 비교 목적에 사용된 상응하는 밴드를 얻고 전기영동법의 작용을 확인하기 위해 씨드되었다.
도 1은 다양한 농도(0.5중량% 내지 8중량%)에서 본 발명에 따른 폴리머 3 및 siRNA 사이에서 얻은 복합체가 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다. 핵산이 없는 폴리머 3(0%)는 본 발명에 따른 양이온 폴리머가 siRNA에 대한 지점의 탐지를 방해하지 않는지를 확인하기 위한 비교예로서 사용되었다.
도 2는 다음이 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다:
- 10중량% 내지 20중량%의 농도로 본 발명에 따른 폴리머 3 및 siRNA 사이에서 얻은 복합체
- 본 발명에 따른 양이온 폴리머가 siRNA에 대한 지점의 탐지를 방해하지 않는지를 확인하기 위한 비교예로서 핵산이 없는 폴리머 3(0%); 및
- 본 발명에 따라 변형되지 않은 글리코겐이 핵산과 복합체화할 수 없는지를 확인하기 위한 비교예로서 폴리머 50(변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐).
도 3은 다양한 농도(30중량% 내지 800중량%)에서 본 발명에 따른 폴리머 3 및 siRNA 사이에서 얻은 복합체가 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다.
도 4는 각 폴리머의 전체 중량에 대해 5중량% 내지 20중량%의 농도로 본 발명에 따른 폴리머 1, 2 및 6 및 siRNA 사이에 얻은 복합체가 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다.
도 5는 각 폴리머의 전체 중량에 대해 5중량% 내지 20중량%의 농도로 본 발명에 따른 폴리머 10, 14 및 15 및 siRNA 사이에 얻은 복합체가 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다.
도 6은 각 폴리머의 전체 중량에 대해 5중량% 내지 20중량%의 농도로 본 발명에 따른 폴리머 8, 12 및 16 및 siRNA 사이에 얻은 복합체가 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다.
도 7은 각 폴리머의 전체 중량에 대해 5중량% 내지 20중량%의 농도로 본 발명에 따른 폴리머 21, 24 및 25 및 siRNA 사이에 얻은 복합체가 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다.
도 8은 각 폴리머의 전체 중량에 대해 5중량% 내지 20중량%의 농도로 본 발명에 따른 폴리머 20, 23 및 28 및 siRNA 사이에 얻은 복합체가 위에 씨드된 아가로스 겔을 나타낸다.
도 9는 실시예 8에 기술된 대로 얻은, 본 발명에 따른 폴리머 2, 3 및 4에 대한 적정 곡선을 나타낸다.
도 10은 실시예 8에 기술된 대로 얻은 (본 발명에 따른) 폴리머 4 및 18(비교예)에 대한 적정 곡선을 나타낸다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항에서, 표현 "양이온 폴리머"는 생리적 pH에서 전체 양전하를 가진 폴리머를 나타낸다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항에서, 용어 "글리코겐"은 일반적으로, 높은 정도의 가지화를 특징으로 하는 글루코오스 호모폴리머를 나타내며, 글루코오스 모노머들은 선형 사슬에서 α-(1,4) 결합에 의해 결합되며, 가지들은 α-(1,6) 결합에 의해 그라프트되며, 일반적으로 각각의 7-11개 글루코오스 모노머는 다음 화학식으로 나타내어지나 이에 제한되지 않는다:
Figure 112014071313611-pct00004
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 표현 "글리코겐-기반"은 폴리머가 본 발명에 따른 양이온 폴리머를 얻기 위해 부분적으로 변형된 상기한 글리코겐 구조를 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 표현 "반복 단위"는 본 발명에 따른 양이온 폴리머에 적어도 한 번 존재하는 모노머를 나타낸다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 표현 "(C1-C6)알킬"은 1개 내지 6개 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 가지형 알킬기, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, n-부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, sec-펜틸, 3-펜틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, sec-헥실 또는 네오헥실을 나타낸다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 용어 "아조사이클일"은 예를 들어, 아지리딘, 피롤, 피롤린, 피롤리딘, 피리딘 또는 피페리딘과 같이 적어도 하나의 N 원자를 포함하는 3- 내지 7-원 방향족 또는 지방족 헤테로사이클릭 고리를 나타내다. 선택적으로, 상기한 헤테로사이클릭 고리는, 예를 들어, 티아졸, 옥사진 또는 티아진과 같이 N, O 및 S로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 이형원자를 포함한다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 용어 "복합체"는 비-공유 상호작용(예를 들어 정전기, 이온 또는 반데르 바알스 상호작용, 수소 결합 등)을 통해 본 발명에 따른 글리코겐-기반 양이온 폴리머와 적어도 하나의 음이온 화합물의 상호작용에 의해 얻은 생성물을 나타낸다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 표현 "활성 물질"은 투여 이후, 세포 또는 살아있는 유기체의 생물학적 기능과 상호작용할 수 있고 가능하게는 상기 생물학적 기능을 변형시킬 수 있는 천연, 반-합성 또는 합성 분자를 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 활성 물질은 전체 음전하를 가진 분자, 즉 음이온 분자이며, 병적 상태의 치료, 예방 또는 진단을 위해 사용될 수 있다. 상기 음이온 분자는 유기 또는 무기일 수 있다. 예를 들어, 이들은 유기 음이온 분자일 수 있고 저 분자량(예를 들어, 아미노산, 설파미드 또는 비타민) 또는 고 분자량(예를 들어, 백신 또는 헤파린과 같은 글루코사미노글리칸)을 가질 수 있다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 용어 "핵산"은 이중 가닥 또는 단일 가닥이며 전체 음전하를 가진 천연 또는 합성 기원의 뉴클레오티드 거대분자를 나타낸다. 특히, 이 용어는 올리고뉴클레오티드, RNA (siRNA, dsRNA, ssRNA, shRNA, miRNA, rRNA, hnRNA, mRNA, tRNA, snRNA, pre-mRNA, 촉매 RNA, 안티센스 RNA), DNA (cDNA, mtDNA, ssDNA, dsDNA, 안티센스 DNA, 플라스미드 DNA)를 포함한다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 표현 "활성 물질의 전달" 및 "활성 물질을 전달"은 본 발명에 따른 양이온 폴리머에 복합체화된 활성 물질의 특정 생리적 표적, 예를 들어, 조직 또는 기관으로의 운송을 나타낸다.
다음의 본 발명의 상세한 설명 및 청구항을 위해, 용어 "형질감염" 및 "형질감염하는"은 세포, 특히 세포질 및/또는 핵 속으로 핵산 서열의 주입을 나타낸다.
특히, 본 발명은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 반복 단위를 포함하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머에 관한 것이다:
(a)
Figure 112014071313611-pct00005
(a)
여기서
동일하거나 다를 수 있는 그룹 R은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬, 아조사이클일-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 동일하거나 다를 수 있는 사슬 (C1-C6)알킬은 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다; 및
n은 1보다 크거나 동일한 정수이다; 및
(b)
Figure 112014071313611-pct00006
(b)
여기서
R1은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 동일하거나 다를 수 있는 사슬 (C1-C6)알킬은 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다;
동일하거나 다를 수 있는 X1 및 X2는 그룹 -OH 또는 R2가 수소 원자, (C1-C6)알킬 및 p가 1보다 크거나 동일한 H-[NH-(C1-C6)알킬]p-로부터 선택되는 질소를 포함하는 그룹 -NHR2이며 그룹 (C1-C6)알킬은 동일하거나 다를 수 있고;
m은 1보다 크거나 동일한 정수이다;
R, R1, X1 및 X2 중 적어도 하나는 R, R1, X1 및 X2의 각각에 대해 정의한 대로 질소를 포함하는 그룹인 것을 조건으로 하며
상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머는, 특히, Pal S et al. (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 289, 2006, pages 193-199)의 논문 2.2 장에 개시된 대로, 글리코겐과 N-(3-클로로-2-하이드록시프로필)-트라이메틸 암모늄 클로라이드와 반응에 의해 얻은 생성물과 다르다는 것을 조건으로 한다.
바람직하게는, 동일하거나 다를 수 있는 그룹 R은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 [N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬-다이(C1-C3)알킬암모니오}-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬아미노}-(C1-C3)알킬, 또는 [트라이(C1-C3)알킬암모니오]-(C1-C3)알킬, 아조사이클일-(C1-C3)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 동일하거나 다를 수 있는 사슬 (C1-C3)알킬은 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다
바람직하게는, 용어 "아조사이클일"로 나타내어진 적어도 하나의 N 원자를 포함하는 헤테로사이클릭 고리는, 예를 들어, 피롤, 피롤린, 피롤리딘, 피리딘 또는 피페리딘과 같은 5- 또는 6-원 방향족 또는 지방족 헤테로사이클릭 고리이다. 유리하게는, 상기 5- 또는 6-원 헤테로사이클릭 고리는 N, O 및 S로부터 선택된 적어도 하나의 제 2 이형원자를 포함하며, 예를 들어, 다이아졸, 옥사진 및 티아진으로 나타내어진다. 바람직하게는, 상기 헤테로사이클릭 고리는 지방족이다. 더욱더 바람직하게는, 상기 헤테로사이클릭 고리는 모르폴린 또는 피페리딘이다.
더욱 바람직하게는, 동일하거나 다를 수 있는 그룹 R은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 N,N-다이메틸아미노에틸, N,N-다이메틸아미노프로필, N,N-다이에틸아미노에틸, [(N,N-다이메틸아미노-에틸)다이메틸암모니오]에틸, [(N,N-다이메틸아미노프로필)-다이메틸암모니오]프로필, [(N,N-다이에틸아미노-에틸)다이에틸암모니오]-에틸, [트라이메틸암모니오]-2-하이드록시프로필, 피페리딜-N-에틸 또는 모르폴리닐-N-에틸로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이다.
바람직하게는, R1은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 [N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬-다이(C1-C3)알킬암모니오}-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬아미노}-(C1-C3)알킬 또는 [트라이(C1-C3)알킬암모니오]-(C1-C3)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 동일하거나 다를 수 있는 사슬 (C1-C3)알킬은 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다.
더욱 바람직하게는, R1은 수소 원자 또는 카복시메틸기이다.
바람직하게는, 동일하거나 다를 수 있는 X1 및 X2는 R2가 수소 원자 또는 p가 1보다 크거나 동일한 H-[NH-(C1-C4)알킬]p-로부터 선택되는 질소를 포함하는 그룹 -NHR2이며 그룹 (C1-C4)알킬은 동일하거나 다를 수 있다.
바람직하게는, 상기 H-[NH-(C1-C4)알킬]p-는 50 내지 3,000 달톤의 분자량 및 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,300 달톤의 분자량을 가진 폴리에틸렌이민, 스퍼민 (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2) 또는 스퍼미딘 (H2N(CH2)4NH(CH2)4NH2)이다.
약학적으로 허용가능한 유기 염기의 예들은 트로메타민, 리신, 아르기닌, 글리신, 알라닌, 메틸아민, 다이메틸아민, 트라이메틸아민, 에틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 프로필아민, 다이프로필아민, 트라이프로필아민, 에틸렌다이아민, 모노에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 구아니딘, 모르폴린, 피페리딘, 피롤리딘, 피페라진, 1-부틸피페리딘, 1-에틸-2-메틸피페리딘, N-메틸피페라진, 1,4-다이-메틸피페라진, N-벤질펜에틸아민, N-메틸글루코사민 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인이다.
약학적으로 허용가능한 무기 염의 예들은, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨, 탄산칼륨 및 탄산칼슘과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리-토금속 수산화물 또는 탄산염이다.
유리하게는, 상기 반복 단위 (a) 및 (b)는 글리코겐 사슬에서 무작위로 배열된다.
반복 단위 (a) 및 (b)의 예들은 아래 표 A 및 B에 각각 나타내어진다.
표 A - 반복 단위(a)의 예
Figure 112014071313611-pct00007
Figure 112014071313611-pct00008
Figure 112014071313611-pct00009
Figure 112014071313611-pct00010
Figure 112014071313611-pct00011
Figure 112014071313611-pct00012
Figure 112014071313611-pct00013
표 B - 반복 단위(b)의 예
Figure 112014071313611-pct00014
Figure 112014071313611-pct00015
Figure 112014071313611-pct00016
한 바람직한 실시태양에 따라, 상기 반복 단위(a) 및 (b)는 생리적 pH에서 이온화가능하며 상기 음이온 화합물의 복합체화를 촉진하는 적어도 하나의 질소를 포함하는 그룹 및 생리적 pH 아래의 pH에서 이온화가능하며 엔도솜으로부터 복합체의 방출을 촉진하는 적어도 하나의 질소를 포함하는 그룹을 포함한다.
바람직하게는, 생리적 pH에서 이온화가능한 질소를 포함하는 상기 그룹은 본 발명에 따른 양이온 폴리머를 제조하기 위해 사용된 글리코겐에서 수산기의 전체 수에 대해 1% 내지 30%의 수 백분율로 존재한다.
바람직하게는, 생리적 pH 아래의 pH에서 이온화가능한 질소를 포함하는 상기 그룹은 본 발명에 따른 양이온 폴리머를 제조하기 위해 사용된 글리코겐에서 수산기의 전체 수에 대해 0.1% 내지 10%의 수 백분율로 존재한다.
본 발명을 위해서, 생리적 pH에서 이온화가능한 질소를 포함하는 상기 그룹은 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬 및 아조사이클일-(C1-C6)알킬이다.
유리하게는, 생리적 pH 아래의 pH에서 이온화가능한 질소를 포함하는 상기 그룹은 NH2-{[(C1-C3)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬 및 {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C3)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 글리코겐의 신규한 양이온 유도체는 낮은 점도를 가지며 결과적으로 주사용 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 글리코겐의 신규한 양이온 유도체는 회전 유량계로 PBS에서 1%의 농도로 측정한 10mPa*s 미만 및 바람직하게는 5mPa*s 미만의 점도를 가진다.
본 발명에 따른 양이온 폴리머를 제조하는데 사용된 글리코겐은 당업계에 공지된 방법들 중 하나에 따라 얻을 수 있다.
바람직하게는, 글리코겐은 국제특허출원 WO 94/03502에 기술된 대로 제조된다.
바람직하게는, 상기 글리코겐은 진주담치(Mytilus edulis) 및 지중해담치 (Mytilus galloprovincialis) 종으로부터 얻는다.
본 발명을 위해 사용될 수 있는 글리코겐의 다른 원료는 굴과 크레피둘라 포르니카타(Crepidula fornicata)와 같은 조개 및 간과 근육과 같은 척추동물의 글리코겐-풍부 기관을 포함한다.
바람직하게는, 상기 글리코겐은 질소를 포함하는 화합물 및 환원당이 실질적으로 없다. 다음 상세한 설명 및 청구항에 사용된 대로, 표현 "질소를 포함하는 화합물 및 환원당이 실질적으로 없다"는 질소 함량이 킬달 방법(kieldahl method)에 의해 측정된 60ppm 미만이며, 환원당의 함량은 F.D. 스넬 및 스넬("Colorimetric Methods of Analysis", New York, 1954, vol. III, p. 204)의 방법에 의해 측정된 0.25% 미만이다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용된 글리코겐은 약 44% 내지 약 45%의 탄소 함량, 약 (2.5±0.1)x106 달톤의 분자량 및 197±2.0의 광회전(α)D 20(물에서, c=1)을 특징으로 한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용된 글리코겐은 아지엔드 키미쉐 리유나이트 안젤리니 프란체스코 에이.씨.알.에이.에프.에스.피.에이에 의해 생산된 PolglumytTM 글리코겐이다.
당업자는 본 발명은 본질적으로 치료 효과를 가진 화합물들의 신규한 종류에 대한 것은 아니라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 오히려, 본 발명은 적어도 하나의 음이온 화합물과 복합체를 형성하기 위한 상기한 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 용도에 관한 것이다.
제 2 양태에서, 본 발명은 글리코겐-기반 양이온 폴리머 및 음이온 화합물 사이의 복합체에 관한 것이며, 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 상기한 (a) 및 (b)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 반복 단위를 포함한다.
바람직하게는, 상기 음이온 화합물은 저 분자량 또는 고 분자량을 가진 유기 또는 무기이다.
더욱 바람직하게는, 상기 음이온 화합물은, 예를 들어, 다음 종류의 하나에 속하는 활성 물질이다: 항감염제, 예를 들어, 항균제 및 항바이러스제; 진통제; 식욕감퇴제; 구충제; 항천식제; 항경련제; 기분안정제; 항당뇨제; 지사제; 항히스타민제; 항염증제; 항편두통제; 항구토제; 항신생물제; 항파킨슨제; 항소양제; 항우울제; 해열제; 항진경제; 항콜린제; 교감신경작용제; 잔틴 유도체; 심혈관계용 약물, 예를 들어, 칼륨, 칼슘-채널 차단제, 베타 차단제, 알파 차단제 및 항부정맥제; 항고혈압제; 이뇨제 및 항이뇨제; 중심 및 말초 혈관확장제; 중추 신경 자극제; 혈관수축제; 진해제; 충혈완화제; 호르몬; 최면제; 면역억제제; 근육 완화제; 부교감신경억제제; 정신자극제; 안정제; 정신안정제.
한 바람직한 실시태양에 따라, 상기 음이온 화합물은 핵산이다.
바람직하게는, 상기 핵산은 올리고뉴클레오티드, RNA (siRNA, dsRNA, ssRNA, shRNA, miRNA, rRNA, hnRNA, mRNA, tRNA, snRNA, pre-mRNA, 촉매 RNA, 안티센스 RNA) 및 DNA (cDNA, mtDNA, ssDNA, dsDNA, 안티센스 DNA, 플라스미드 DNA)로부터 선택된다.
본 출원인은 1 내지 200nm, 바람직하게는 20 내지 100nm 및 더욱 바람직하게는 30 내지 50nm의 평균 지름(Z)을 가진 나노미터 입자를 형성할 수 있다.
한 바람직한 실시태양에 따라, 상기 복합체는 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 중량에 대해 5중량% 내지 60중량%의 상기 음이온 화합물의 양을 포함한다.
바람직하게는, 상기 복합체는 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 중량에 대해 10중량% 내지 50중량%의 상기 음이온 화합물의 양을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 복합체는 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 중량에 대해 10중량% 내지 30중량%의 상기 음이온 화합물의 양을 포함한다.
글리코겐-기반 양이온 폴리머 및 음이온 화합물 사이의 복합체는 약학적 조성물로서 제조되는 것이 유리할 수 있다.
제 3 양태에서, 본 발명은 글리코겐-기반 양이온 폴리머 및 음이온 화합물 사이의 복합체 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 상기한 (a) 및 (b)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 반복 단위를 포함한다.
한 바람직한 실시태양에서, 상기 음이온 화합물은 핵산이다.
용어 "부형제"는 제형을 제조하는데 적합한 당업계에 공지된 임의의 물질을 의미한다.
본 발명에 따라 적합한 부형제의 예들은 방부제, 안정제, 계면활성제, 삼투압 조절제, 유화제, 감미료, 향미제, 염료 등이다.
상기 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 단위 제형으로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 수용액, 현탁액 또는 유탁액과 같은 주사용이며 또는 정맥내, 근육내, 피하, 경피 또는 복강 투여를 위한 수용액, 현탁액 또는 유탁액의 제조를 위해 재구성될 분말 형태일 수 있다.
선택적으로, 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 경구 투여용 정제, 캡슐, 코팅 정제, 과립, 용액 및 시럽; 경피 투여용 약품첨가 플라스터, 용액, 페이스트, 크림 또는 포마드; 직장 투여용 좌약; 에어로졸 투여용 살균 용액; 즉시 및 지연 방출의 형태일 수 있다.
제 4 양태에서, 제 4 양태에서, 본 발명은 음이온 화합물을 특정 약학적 표적, 예를 들어, 기관, 조직 또는 세포 속에 전달하거나 형질감염하기 위한 글리코겐-기반 양이온 폴리머와 음이온 화합물 사이의 복합체의 용도에 관한 것이며, 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 상기한 (a) 및 (b)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 반복 단위를 포함한다.
한 바람직한 실시태양에 따라, 상기 음이온 화합물은 활성 물질이다. 유리하게는, 상기 음이온 화합물은 핵산이다. 유리하게는, 상기 약학적 표적은 세포이다.
한 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 매우 특이적인 방식으로 세포 표면상에 존재하는 표적과 결합하고 특정 세포(예를 들어 종양 세포, 간 세포, 조혈 세포 등) 속으로 복합체의 흡수를 촉진할 수 있는 지향성 그룹에 직접 또는 스페이서를 통해 컨쥬게이트될 수 있다.
지향성 그룹은 또한 양이온 폴리머가 세포 구획(예를 들어 핵, 미토콘드리아 등)으로 지향하게 하는데 사용될 수 있다.
지향성 그룹은, 예를 들어, 폴산, 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 펩티드, 단백질 및 히알루론산 올리고머로부터 선택될 수 있다.
다음 실시예들은 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않고 설명한다.
실시예
실시예 1
단위(a)를 포함하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 제조
(i) 질소를 포함하는 그룹을 포함하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 합성
10g의 PolglumytTM 글리코겐(61.73mmol의 글루코오스)을 자석 교반기와 환류 응축기가 장착된 2구 둥근 바닥 플라스크에서 124mL의 1N NaOH(생성물 1-7, 9-11 및 13-15의 합성을 위함) 또는 2N NaOH(생성물 8, 12 및 16의 합성을 위함)에 용해하였다. 일단 용해가 완료되면, 혼합물을 70℃로 가열하고 2시간 동안 교반하였다.
원하는 생성물에 따라, 다음 시약(I) 내지 (VI) 중 하나를 표 1에 보고된 양(시약의 mmol로 표현)으로 첨가하였다:
(I) 2-클로로-N,N-다이에틸에틸아민 하이드로클로라이드;
(II) 3-클로로-N,N-다이메틸프로필아민 하이드로클로라이드;
(III) 2-클로로-N,N-다이메틸에틸아민 하이드로클로라이드;
(IV) H2O에서 60중량%의 3-클로로-2-하이드록시프로필트라이메틸암모늄 클로라이드의 용액;
(V) 1-(2-클로로에틸)피페리딘; 및
(VI) 4-(2-클로로에틸)모르폴린.
혼합물을 70℃에서 밤새 교반하였다.
다음날, 가열을 멈추고 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 그런 후에 미정제 반응 생성물을 400mL의 아세톤 속에 천천히 부었다. 첨가가 완료된 후, 얻은 현탁액을 약 30분 동안 교반하였다. 교반을 멈춘 후, 상청액과 침전물의 분리를 얻을 때까지 혼합물을 침전시켰다.
상청액을 버리고 얻은 침전물을 아세톤(200mL)으로 2회 세척하였다. 이렇게 얻은 고체를 여과하고, 200mL의 증류수에 용해하고, 1N HCl 용액으로 중성 pH를 만들고 마지막으로 전도성이 일정할 때까지(약 2-3μS와 동일) 증류수에 대하여 재생 셀룰로오스 튜브(컷-오프 15,000)에서 투석하였다. 얻은 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고, 진공하에서 농축하고 마지막으로 동결건조하였다.
합성 수율은 아래 표 1에서 대조된다.
종류 폴리머 No. 시약 시약의 mmol 수율
% (W/W)
다이에틸아미노에틸
(DEAE)
글리코겐		 1 (I) 2.65 82
2 (I) 15.43 80
3 (I) 30.87 80
4 (I) 61.73 82
다이메틸-아미노프로필
(DMAP)
글리코겐		 5 (II) 15.43 82
6 (II) 30.87 83
7 (II) 61.73 80
8 (II) 123.46 82
다이메틸-아미노에틸
(DMAE)
글리코겐		 9 (III) 15.43 81
10 (III) 30.87 80
11 (III) 61.73 83
12 (III) 123.46 80
2-하이드록시프로필-
트라이메틸암모늄
(2-OH-PTMA) 글리코겐		 13 (IV) 15.43 83
14 (IV) 30.87 84
15 (IV) 61.73 82
16 (IV) 123.46 84
글리코겐
이형고리 유도체		 40 (V) 30.87 83
41 (VI) 30.87 80
기술된 방법을 통해, 아래 표 2에 도시된 구조를 가진 양이온 폴리머 1-16 및 40-41을 제조하였다.
도시된 구조에서, 약어 "Glu"는 폴리머 사슬이 변형되지 않은 글루코오스의 반복 단위 또는 본 발명에 따른 반복 단위로 이어질 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 보기에 편하도록, 가지는 도시되지 않고 치환기는 단지 위치 6에서만 그리고 다른 반복 단위 상에 도시된다.
당업자는 동일한 반복 단위는 동일하거나 다를 수 있는 1개 내지 3개 치환기를 포함하며 이런 치환기는 위치 2, 3 및/또는 6에 독립적으로 존재한다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
종류 구조식 폴리머
No.		 1H-NMR




(DEAE)
글리코겐
Figure 112014071313611-pct00017
 1 δppm: 1.45-1.75 (CH3 멀티플렛), 3.2-4.6
(멀티플렛), 5.2-6.1 (멀티플렛)
2 δppm: 1.25-1.75 (CH3 멀티플렛), 2.8-4.6 (멀티플렛), 5.2-6.1 (멀티플렛)
3
4




(DMAP)
글리코겐
Figure 112014071313611-pct00018
 5 δppm: 2.2-4.5(멀티플렛), 5.2-6.1 (멀티플렛 H anomeric)
7
6 δppm: 2.2-4.4(멀티플렛), 5.2-6.1 (멀티플렛 H 애노머릭)
8



(DMAE)
글리코겐
Figure 112014071313611-pct00019
 9

δppm: 2.5-4.6(멀티플렛), 5.2-6.2 (멀티플렛 H 애노머릭
10
11
12


(2-OH-PTMA)
글리코겐
Figure 112014071313611-pct00020
 13

δppm: 3.45-4.5(멀티플렛), 5.25-6.1 (멀티플렛 H 애노머릭)
14
15
16


글리코겐
이형고리
유도체
Figure 112014071313611-pct00021
 40 δppm 1.65-2.35(멀티플렛), 2.6-3.15(멀티플렛), 3.55-4.45(멀티플렛), 5.2-6.15(멀티플렛 H 애노머릭)
Figure 112014071313611-pct00022
 δppm 2.8-3.1 (멀티플렛), 3.6-4.45 (멀티플렛), 5.2-6.1 (멀티플렛 H 애노머릭)
(ii) 질소를 포함하는 그룹 및 카복시메틸기를 포함하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 합성
적어도 하나의 카복시메틸기를 포함하는 PolglumytTM 글리코겐(글리코겐-CM)을 아래 기술된 대로 합성하였다.
진공하에서 60℃의 오븐에서 일정한 중량으로 미리 건조한 9.57g(59.07mmol의 글루코오스)의 무수 PolglumytTM 글리코겐을 자석 교반기가 장착되고 질소 흐름하에 있는 2구 둥근 바닥 플라스크에 놓고 200mL의 무수 다이메틸 설폭사이드에 용해하였다. 용해가 완료된 후, 수소화나트륨을 표 3에 나타낸 양으로 첨가하였고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 다음으로, 클로로아세트산 나트륨을 표 3에 나타낸 양으로 첨가하였고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다.
다음날, 혼합물을 아세톤(800mL) 속에 천천히 부었고 얻은 현탁액을 약 30분 동안 교반하였다. 얻은 고체를 여과하고, 아세톤(400mL)으로 2회 세척하고, 다시 여과하고 증류수(200mL)에 용해시켰다. 얻은 용액을 전도성이 일정할 때까지(약 2-3μS와 동일) 증류수에 대하여 재생 셀룰로오스 튜브(컷-오프 15,000)에서 투석하였다. 얻은 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고, 진공하에서 농축하고 마지막으로 동결건조하였다.
100개 글루코오스 모노머당 카복시메틸기로 유도화된 글루코오스 분자의 수로 이해되는 유도화도(DD)는 알려진 역가의 PolglumytTM 글리코겐 및 아세트산나트륨을 포함하는 혼합물로 교정 곡선을 만듦으로써 IR 분광학에 의해 측정하였다.
글리코겐-
CM		 mmol
NaH		 mmol
ClCH2COONa		 수율
% (W/W)		 DD
100 5.91 6.50 83 1
101 11.82 13.00 80 14
102 17.72 19.49 78 22
103 23.63 25.99 75 32
104 29.54 32.49 74 39
이렇게 얻은 글리코겐-CM을 다음 합성에서 사용하여, 질소 그룹을 포함하는 양이온 폴리머를 얻었다.
다이에틸아미노에틸(DEAE-글리코겐-CM) 및 2-하이드록시프로필트라이메틸암모늄(2-OH-PTMA-글리코겐-CM) 그룹을 포함하는 글리코겐-CM을 특히 합성하였다.
DEAE -글리코겐- CM
1g의 생성물 103을 자석 교반기와 환류 응축기가 장착된 2구 둥근 바닥 플라스크에서 10.8mL의 1N NaOH에 용해하고 2시간 동안 70℃에서 가열하였다.
0.929g의 2-클로로-N,N-다이에틸에틸아민 하이드로클로라이드(5.4mmol)를 첨가하고 혼합물을 70℃에서 밤새 교반하였다.
다음날, 가열을 멈추고 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 그런 후에 미정제 반응 생성물을 100mL의 아세톤 속에 천천히 부었다. 첨가의 종료시에, 얻은 현탁액을 30분 동안 교반하였다.
얻은 고체를 여과하고, 아세톤(100mL)으로 2회 세척하고, 50mL의 증류수에 용해하고, 1N HCl로 6.5-7의 pH를 만들고 마지막으로 전도성이 일정할 때까지(약 2-3μS와 동일) 증류수에 대하여 재생 셀룰로오스 튜브(컷-오프 15,000)에서 투석하였다. 얻은 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고, 진공하에서 농축하고 마지막으로 동결건조하였다.
2- OH - PTMA -글리코겐- CM
2.5g의 생성물 103을 자석 교반기와 환류 응축기가 장착된 2구 둥근 바닥 플라스크에서 27mL의 1N NaOH에 용해하고 2시간 동안 70℃에서 가열하였다.
3-클로로-2-하이드록시프로필트라이메틸암모늄 클로라이드(H2O에서 60중량%, = 8.1mmol)를 첨가하고 혼합물을 70℃에서 밤새 교반하였다.
다음날, 가열을 멈추고 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 그런 후에 미정제 반응 생성물을 80mL의 아세톤 속에 천천히 부었다.
얻은 고체를 여과하고, 아세톤(80mL)으로 2회 세척하고, 50mL의 증류수에 용해하고, 전도성이 일정할 때까지(약 2-3μS와 동일) 증류수에 대하여 재생 셀룰로오스 튜브(컷-오프 15,000)에서 투석하였다. 얻은 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고, 진공하에서 농축하고 마지막으로 동결건조하였다.
기술된 방법을 통해 얻은 양이온 폴리머 17 및 19는 아래 표 4에 도시된다.
보기에 편하도록, 가지는 도시되지 않고 치환기는 단지 위치 6에서만 그리고 다른 반복 단위 상에 도시된다. 도시된 구조에서, 약어 "Glu"는 폴리머 사슬이 변형되지 않은 글루코오스의 반복 단위 또는 본 발명에 따른 반복 단위로 이어질 수 있다는 것을 나타낸다.
당업자는 동일한 반복 단위는 동일하거나 다를 수 있는 1개 내지 3개 치환기를 포함하며 이런 치환기는 동일한 반복 단위의 위치 2, 3 및/또는 6에 독립적으로 존재한다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
종류 구조식 폴리머
No.		 1H-NMR



DEAE-
글리코겐-
CM
Figure 112014071313611-pct00023


17		 δppm: 1.25-1.75 (멀티플렛), 3-4.65 (멀티플렛), 5.5-6.15 (멀티플렛 H 애노머릭)


2-OH-
PTMA-
글리코겐-CM
Figure 112014071313611-pct00024


19		 δppm:
3.4-4.65 (멀티플렛), 5.25-6.20 (멀티플렛 H 애노머릭)
실시예 2
단위(b)를 포함하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 제조
PolglumytTM 글리코겐을 다음 방법에 따라 과요오드산염칼륨으로 산화시켰다.
20g의 PolglumytTM 글리코겐(123.46mmol의 글루코오스)을 어두운 유리병에서 400mL의 증류수에 용해하였다. 과요오드산염칼륨을 표 5에 제공된 양(시약의 mmol로 표현)으로 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다.
실온에서 2시간 동안 교반을 지속하면서 과량의 에틸렌 글리콜(26mL)을 첨가하여 반응을 멈췄다.
혼합물을 전도성이 일정할 때까지(약 2-3μS와 동일) 증류수에 대하여 재생 셀룰로오스 튜브(컷-오프 15,000)에서 투석하였다. 혼합물을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고 동결건조하였다.
다음으로, 산화도(산화된 글루코오스 모노머의 %)를 하이드록실아민 하이드로클로라이드 및 다양한 탄수화물에 존재하는 유리 알데하이드기 사이의 반응에 의해 방출된 0.1N NaOH의 염산에 의한 적정에 의해 측정하였다. 반응은 아래에 제공된다:
글리코겐-(CH=O)Z + z·H2N-OH*HCl = 글리코겐-(CH=N-OH)Z + z·H2O + z·HCl
산화된 모노머의 백분율을 다음 식을 통해 측정하였다:
Figure 112014071313611-pct00025
V = NaOH의 mL;
N = NaOH의 노르말농도;
W = 무수 샘플의 mg;
162 = 글루코오스 반복 단위의 분자량
산화된
글리코겐		 mmol KIO4 % 수율(W/W) DD
200 6.17 88 5
201 12.35 87 10
202 24.69 88 18
이렇게 얻은 산화된 PolglumytTM 글리코겐을 표 6에 제공된 양(시약의 mmol로 표현)으로 아래 시약(VII) 내지 (X) 중 하나와 반응시켰다:
(VII) 스퍼민(플루카, 참조번호 No. 85590);
(VIII) 테트라에틸렌펜타민(플루카, 참조번호 No. 15652843);
(IX) 물에서 50중량%의 폴리에틸렌이민 MW 1300의 용액(알드리치, 참조번호 No. 482595);
(X) 물에서 50중량%의 폴리에틸렌이민 MW 2000의 용액(알드리치, 408700).
유도체를 다음 일반적인 방법에 따라 합성하였다.
2g의 PolglumytTM 글리코겐을 기계적 교반기(IKA 라보테크닉 모델)가 장착된 3구 둥근 바닥 플라스크에서 pH 8.5의 200mL의 붕산염 버퍼에 용해하였다. 아민을 40mL의 붕산염 버퍼에 용해하고, 반응 플라스크에 천천히 첨가하고, 혼합물을 실온에서 기계적으로 교반하였다.
4시간 후, 수소화붕소나트륨(473mg; 12.5mmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 기계적으로 교반하였다.
다음날, 미정제 반응 생성물을 400mL의 아세톤 속에 천천히 부었고 얻은 현탁액을 약 30분 동안 교반하였다. 얻은 고체를 여과하고, 아세톤(400mL)으로 2회 세척하고, 다시 여과하고 증류수(100mL)에 용해시켰다. 용액을 전도성이 일정할 때까지(약 2-3μS와 동일) 증류수에 대하여 재생 셀룰로오스 튜브(컷-오프 15,000)에서 투석하였다. 얻은 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고, 진공하에서 농축하고 마지막으로 동결건조하였다.
No. 출발
산화
글리코겐		 시약 mmol 시약 % 수율(W/W)
20 200 VII 0.60 69
21 200 IX 0.48 84
22 200 X 0.31 70
23 201 VII 0.60 65
24 201 VIII 0.41 70
25 201 VIII 0.83 44
26 201 IX 0.48 83
27 201 X 0.31 87
28 202 VII 1.20 24
29 202 IX 0.48 95
30 202 IX 0.96 98
기술된 방법을 통해 얻은 양이온 폴리머 20-30은 아래 표 7에 도시된다. 도시된 구조에서, 약어 "Glu"는 폴리머 사슬이 변형되지 않은 글루코오스의 반복 단위 또는 본 발명에 따른 반복 단위로 이어질 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 보기에 편하도록, 가지는 도시되지 않고 치환기는 다른 반복 단위 상에 도시된다.
종류 구조식 폴리머
No.		 IR
산화
글리코겐
Figure 112014071313611-pct00026
 24 3293(M), 2926(W), 1638(W), 1409(W), 1359(W), 1240(W), 1148(M), 1078(M), 1016(VS), 999(VS), 930(M), 848(M), 759(M)
25 3308(M), 2924(W), 1639(W), 1411(W), 1358(W), 1243(W), 1149(M), 1078(S), 1016(VS), 999(VS), 930(M), 848(M), 759(M)
산화
글리코겐

Figure 112014071313611-pct00027
 20 3306(M), 2925(W), 1639(W), 1411(W), 1361(W), 1241(W), 1148(M), 1078(S), 995(VS), 927(M), 847(M), 757(M)
23 3293(M), 2926(W), 1638(W), 1412(W), 1359(W), 1241(W), 1148(M), 1078(S), 1015(VS), 929(M), 848(M), 759(M)
28 3292(M), 2928(W), 1639(W), 1415(W), 1355(W), 1243(W), 1148(M), 1078(S), 1015(VS), 929(M), 848(M), 758(M)



산화
글리코겐






Figure 112014071313611-pct00028
 21 3228(M), 2924(W), 1640(M), 1412(W), 1361(W), 1148(M), 1079(S), 1015(VS), 999(VS), 930(M), 848(M), 759(M)
26 3298(M), 2925(W), 1638(W), 1411(W), 1359(W), 1148(M), 1079(S), 1016(VS), 999(VS), 930(M), 848(M), 759(M)
22 3292(M), 2921(W), 1643(W), 1411(W), 1360(W), 1148(M), 1078(S), 1015(VS), 998(VS), 930(M), 848(M), 759(M)
27 3299(M), 2924(W), 1635(W), 1412(W), 1358(W), 1148(M), 1079(S), 1016(VS), 1000(VS), 930(M), 847(M), 759(M)
29 3289(W), 2924(W), 2840(W), 1635(W), 1411(W), 1336(W), 1147(M), 1079(S), 1016(VS), 1000(VS), 930(M), 848(M), 758(M)
30 3276(M), 2924(W), 2843(W), 1634(W), 1453(W), 1333(M), 1146(M), 1079(S), 1019(VS), 1000(VS), 930(M), 848(M), 758(M)
실시예 3
형태(a)의 반복 단위를 포함하는 양이온 폴리머의 유도화도(DD)의 측정
반복 단위(a)를 포함하는 폴리머에 존재하는 질소를 포함하는 그룹의 수에 대한 유도화도는 아민기의 상응하는 하이드로클로라이드로의 변형 및 아민기 상에 또는 4차 암모늄기 상에 존재하는 할로겐 원자의 양을 측정함으로써 계산하였다.
동일한 절차가 비교 생성물로 사용된, DEAE-덱스트란 하이드로클로라이드(상업용 제품 DEAE-덱스트란 하이드로클로라이드, 시그마, 참조번호 No. D9885).
할로게 이온의 양은 칼 피셔 방법을 통해 측정된 물 함량을 빼서 얻은 폴리머의 건중량에 대해 측정하였다.
1g의 아민 유도체를 10mL의 증류수에 용해하였다. 용해가 완료된 후, 10mL의 1N 염산을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 교반이 완료된 후, 혼합물을 아세톤(100mL) 속에 부었다. 얻은 고체를 여과하고, 아세톤(100mL)으로 2회 세척하고 진공하에서 60℃로 오븐에서 건조하였다.
할로겐 이온의 양은 중량%, 즉 100g의 양이온 폴리머당 할로겐 이온의 중량으로 표현된다.
측정을 위해서, 각 질소는 독립적으로 치환된 것으로 생각하였다.
유도화도는 아래 제공된 식에 따라 계산하였다.
Figure 112014071313611-pct00029
DD = 유도화도
H.I.= 100g의 수화된 샘플당 할로겐 이온의 그램
MW = 단일 알칼아민 하이드로클로라이드 그룹으로 치환된 모노머의 분자량
35.45 = 염소의 분자량
얻은 결과는 아래 표 8에 제공된다.
폴리머 No. DD
1 1
2 6
3 12
4 22
5 5
6 6
7 12
8 19
9 4
10 7
11 12
12 14
13 3
14 5
15 13
16 15
18(*) 20
(*) 비교예: DEAE-덱스트란
유도화도 및 작용기의 영향은 2개의 작동 변수, (i) 최소화돼야하는 응집에 대한 경향; 및 (ii) 최대화돼야하는 전하 용량의 함수로서 연구하였다.
실시예 4
동적 광 산란( DLS ) 측정
동적 광 산란 연구를 사용하여 양이온 폴리머의 응집 경향을 연구하였다.
동적 광 산란 연구를 실시예 1에 기술된 대로 제조한 PolglumytTM 글리코겐을 기반으로 한 양이온 폴리머 및 다양한 siRNA/폴리머 중량% 비로 제조한 siRNA과의 개별 복합체(인비트로겐, 공급자 참조번호 No. 1299001)에 대해 아래 보고된 대로 실행하였다.
광 산란 연구를 위해, 다음 용액을 제조하였다:
- 용액 1: RNase-제거 PBS 속 siRNA 0.1 mg/mL의 원료 용액;
- 용액 2: 살균 0.22㎛ 필터를 통해 여과된, RNase-제거 PBS 속 0.2mg/mL 농도의 다양한 양이온 폴리머의 원료 용액;
- 용액 3: 살균 0.22㎛ 필터를 통해 여과된 RNase-제거 PBS의 용액.
약어 PBS(포스페이트-버퍼 식염수)는 염화나트륨 8g/l, 인산나트륨 1.78g/l, 염화칼륨 0.2g/l 및 인산칼륨 0.27g/l의 수용액을 포함하는 pH 7.4의 표준 인산염-버퍼 식염수를 나타낸다.
분석한 샘플들을 표 9에 제공된 비에 따라 용액 1, 2 및 3을 혼합하여 얻었다. 그런 후에 샘플들을 2회 30초 동안 교반하고 30분 동안 방치하여 처리하였다. 30분 동안 교반하고 1시간 동안 방치하는 후속 처리 후, 샘플을 DLS 제타사이저 나노 맬번으로 분석하였고, 분석 전 5분 교반함으로써 용액을 처리하는 것에 유의해야 한다.
측정은 25℃ 및 173°의 산란 각도로 헬륨-네온 레이저(λ=632.8nm)를 사용하여 실행하였다. 결과는 제타사이저 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
siRNA mg/mL 폴리머 mg/mL 조성물
용액 1의 mL 용액 2의 mL 용액 3의 mL
- 0.1 - 0.5 0.5
0.050 0.1 0.5 0.5 -
0.03 0.1 0.3 0.5 0.2
0.02 0.1 0.2 0.5 0.3
0.015 0.1 0.15 0.5 0.35
0.010 0.1 0.10 0.5 0.4
0.005 0.1 0.05 0.5 0.45
연구는 다음 변수를 측정하는 것을 가능하게 한다:
1. siRNA 제거 PolglumytTM 글리코겐의 양이온 유도체의 평균 지름(Z)(결과는 표 10에서 대조된다);
2. 나노입자의 종횡비(결과는 표 10에서 대조된다); 및
3. 응집 현상이 관찰되지 않는 폴리머의 중량에 대한 siRNA의 최대 중량% 비(결과는 표 10에서 대조된다).
폴리머 No. (1) 평균 지름 (Z) (nm) (2) 종횡비 (3) 응집체의 형성 없는 siRNA/폴리머(w/w) % 비
1 37 1.2 10
2 37 0.8 50
3 38 0.9 15
4 41 0.8 20
5 35 0.9 50
6 36 0.8 10
7 38 0.9 10
8 38 0.9 15
9 35 1.1 50
10 36 0.8 50
11 37 0.8 50
12 40 0.9 15
13 36 0.8 50
14 37 0.9 50
15 41 0.8 10
16 41 0.9 15
17 35 1.0 50
18(*) 76 4.5 20
(*) 비교예: DEAE-덱스트란
(1) 평균 지름(Z)
표 10으로부터 볼 수 있듯이, 모든 유도체는 100nm 미만의 평균 지름(Z)을 가진다.
유리하게는, DEAE-덱스트란과 반대로, 본 발명에 따른 양이온 유도체는 70nm 미만의 평균 지름(Z)을 가진 나노입자를 형성한다.
(2) 종횡비
종횡비는 평균 지름에 의해 정규화된 입자 크기의 분포 피크의 중간 높이에서 폭이며 따라서 크기 분포 피크의 형태를 설명한다.
볼 수 있듯이, 본 발명에 따른 모든 양이온 폴리머는 DEAE-덱스트란과 반대로, 0.8 내지 1.1의 종횡비를 가진 크기 분포를 가졌고, 이는 4.5와 동일한 종횡비를 가진 크기 분포를 나타내었다.
이것은, 동일한 합성 방법을 사용함으로써, 본 발명에 다른 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 평균값에 근접한 크기 범위 내에서 제어된 크기의 나노입자를 얻는 것을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
(3) 응집이 관찰되지 않는 siRNA/폴리머의 최대 중량% 비
결과는 본 발명에 따른 모든 치환기를 포함하는 양이온 폴리머는 유도화도의 함수로서, 50중량%의 siRNA까지 응집체-제거 복합체를 형성하는 것을 나타내었다.
폴리머 18(DEAE-덱스트란)은 단지 20중량%의 siRNA까지 응집체-제거 복합체를 형성하였다.
실시예 5
전하 용량의 측정
전하 용량은 겔 전기영동을 통해 반복 단위(a) 및 (b)를 포함하는 일련의 유도체에 대해 측정하였다.
복합체를 다음 방법에 따라 제조하였다.
siRNA 및 다양한 폴리머 유도체 사이의 복합체를 다양한 siRNA/폴리머 비(중량%)를 사용하여 제조하였다.
표 11 및 12에 기술된 다양한 농도의 폴리머 용액을 0.2㎛ 필터를 통해 여과된 RNase-제거 PBS에서, RNase-제거 수에서 0.340mg/mL의 siRNA(인비트로겐, 참조번호 No. 1299001)의 용액과 혼합하였다. 다음으로, 혼합물을 약 30초 동안 교반하여 처리하고, 실온에서 15분 동안 방치하였고, 30초 동안 교반하여 다시 처리하고, 약 30분 동안 방지한 후, 겔 전기영동을 실시하였다.
MOPS-EDTA-아세트산나트륨 버퍼에서 제조된 Green Gel PlusTM Nucleic Acid Stain 20000X의 1:200 000 비를 포함하는 4% 아가로스 겔 상에 각 복합체의 10㎕의 용액을 충전하여 겔을 전개하였다.
80V의 일정한 전압에서 1시간 동안 아가로스 겔을 전개하였다. 이미지는 ImageQuant LAS 4000 시스템(GE Healthcare)에 의해 얻었다.
얻은 겔은 도 1 내지 8에 도시된다.
아래 표 11에 제공된 양으로, 폴리머 용액 및 siRNA를 사용하여 폴리머 3(DEAE-글리코겐) 및 siRNA 사이의 복합체를 제조하였다.
폴리머 3 및 siRNA 사이의 복합체를 위에 씨드하고 이후 전기영동에 의해 전개한 겔이 표 11에 나열된 도면에 도시된다.
mg/mL 폴리머 mg/mL siRNA % siRNA (w/w) 도면
20 0.1 0.5 1
10 0.1 1 1
5 0.1 2 1
2.5 0.1 4 1
1.25 0.1 8 1
1 0.1 10 2
0.66 0.1 15 2
0.5 0.1 20 2
0.333 0.1 30 3
0.2 0.1 50 3
0.1 0.1 100 3
0.05 0.1 200 3
0.025 0.1 400 3
0.0125 0.1 800 3
변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐(50*)을 비교예로서 사용하였다:
Figure 112014071313611-pct00030
도 1에서, 0.5중량% 내지 8중량%의 백분율로 siRNA와 복합체화된 폴리머 3의 컬럼에서, siRNA 단독에 상응하는 흰색 밴드는 존재하지 않았다. 밴드의 부존재는 폴리머 3가 폴리머의 중량에 대해 0.5중량% 내지 8중량%로 siRNA와 완전히 복합체화될 수 있다는 것을 나타내었다.
도 2에서, siRNA와 복합체화된 폴리머 3의 컬럼에서 siRNA에 상응하는 밴드의 부존재는 폴리머 3가 폴리머의 중량에 대해 10중량% 내지 20중량%의 백분율로 siRNA와 완전히 복합체화될 수 있다는 것을 나타내었다. 폴리머 50(변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐)의 컬럼에서 siRNA에 상응하는 밴드의 존재는 변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐이 폴리머의 중량에 대해 10중량%와 동일한 백분율에서도 siRNA와 복합체화될 수 없다는 것을 나타내었다.
도 3에서, 30%의 siRNA와 복합체화된 폴리머 3의 컬럼에서 siRNA에 상응하는 밴드의 부존재는 폴리머 3가 폴리머의 전체 중량에 대해 30중량%의 siRNA와 완전히 복합체화될 수 있다는 것을 나타내었다. 반대로, 50% 내지 800%의 백분율에서 siRNA에 상응하는 밴드의 존재는 폴리머 3가 폴리머의 전체 중량에 대해 50중량%의 siRNA와 복합체화될 수 없다는 것을 나타내었다.
따라서 이런 연구는 폴리머 3의 최대 전하 용량은 30중량%의 siRNA이었다. 반대로, PolglumytTM 글리코겐(폴리머 50)은 siRNA와 복합체화될 수 없었다.
또한, 폴리머-siRNA 복합체를 다음 폴리머를 사용하여 제조하였다:
- 반복 단위(a)를 포함하는 No. 1, 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16;
- 반복 단위(b)를 포함하는 No. 20, 21, 23, 24, 25, 28;
2개 siRNA 충전 백분율을 사용하였다: 폴리머의 중량에 대해 5% 및 20%. 사용된 용액은 아래 표 12에서 대조된다.
폴리머 mg/mL
폴리머		 mg/mL siRNA 도면
1 2 0.1 4
0.5 0.1 4
2 2 0.1 4
0.5 0.1 4
6 2 0.1 4
0.5 0.1 4
8 2 0.1 6
0.5 0.1 6
10 2 0.1 5
0.5 0.1 5
12 2 0.1 6
0.5 0.1 6
14 2 0.1 5
0.5 0.1 5
16 2 0.1 6
0.5 0.1 6
20 2 0.1 8
0.5 0.1 8
21 2 0.1 7
0.5 0.1 7
23 2 0.1 8
0.5 0.1 8
24 2 0.1 7
0.5 0.1 7
25 2 0.1 7
0.5 0.1 7
28 2 0.1 8
0.5 0.1 8
도 4에서, 각각 5중량% 및 20중량%의 siRNA와 복합체화된 폴리머 1의 컬럼에서 siRNA에 상응하는 밴드의 존재는 폴리머 1(낮은 유도화도를 가진 DEAE-Polgumyt)이 siRNA와 복합체화될 수 없다는 것을 나타내었다. 폴리머 2는 폴리머의 전체 중량에 대해 5중량%의 백분율로 siRNA와 복합체화될 수 있었고, 폴리머 6은 폴리머의 전체 중량에 대해 20중량%의 siRNA와 복합체화될 수 있었다.
도 5에서, 20중량%의 siRNA와 복합체화된 폴리머 10 및 14의 컬럼에서 siRNA에 상응하는 밴드의 존재는 이런 폴리머들이 5중량%의 siRNA와 복합체화될 수 있다는 것을 나타내었다. 반대로, 폴리머 15는 20중량%의 siRNA와 복합체화될 수 있었다.
도 6에서, siRNA에 상응하는 밴드의 부존재는 폴리머 8, 12 및 16이 20중량%의 siRNA와 복합체화될 수 있다는 것을 나타내었다.
도 7에서, 폴리머 24 및 25의 컬럼에서 siRNA에 상응하는 밴드의 존재는 이런 폴리머들이 5중량%의 siRNA와 복합체화될 수 있다는 것을 나타내었다. 반대로, 폴리머 21은 20중량%의 siRNA와 복합체화되었다.
도 8에서, 20%의 siRNA와 복합체화된 폴리머 23 및 20의 컬럼에서 siRNA에 상응하는 밴드의 존재는 이런 폴리머들이 5%의 siRNA와 복합체화될 수 있다는 것을 나타내었다. 반대로, 폴리머 28은 20%의 siRNA와 복합체화되었다.
따라서, 일반적으로, 연구는 단지 폴리머 1(최저 유도화도를 가진 DEAE-글리코겐), 24 및 25는 5중량% 미만의 siRNA와 복합체화될 수 있다는 것을 입증하는 것을 가능하게 한다.
모든 다른 유도체들은 비교예 폴리머 18(DEAE-덱스트란)과 같이, 20%의 siRNA와 복합체화될 수 있었다. 반대로, 폴리머 50(변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐)은 siRNA와 복합체를 형성할 수 없었다.
실시예 6
Polglumyt TM 글리코겐의 양이온 유도체에 의한 세포독성 연구
(DEAE)-글리코겐(폴리머 1-4), (DMAP)-글리코겐(폴리머 5-8), (DMAE)-글리코겐(폴리머 9-12), (2-OH-PTMA)-글리코겐(폴리머 13-16), 변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐(폴리머 50), DEAE-덱스트란 하이드로클로라이드(폴리머 18) 및 핵산의 전달에 대해 광범위하게 연구된 다른 참조 폴리머, 가지형 폴리에틸렌이민(PEI)(알드리치, 참조번호 No. 40872-7)(폴리머 60)에 대해 세포독성 연구를 실행하였다.
(a) 본 발명에 따른 양이온 폴리머에 대한 연구
● 양이온 폴리머의 제조
양이온 폴리머를 물에 용해하고 세포 배지에 적절하게 희석하여 10 내지 10-5 mg/ml의 최종 농도를 얻어, 24, 48 및 72 시간 후 두 세포주: MonoMac-6 및 HT29에 대한 세포독성을 평가하였다.
● MonoMac-6 세포주
인간 단핵구/대식구 세포주 MonoMac-6을 만토바니 교수(Humanitas, Italy)로부터 친절하게 기증받았다.
세포들을 10% 태아 소 혈청(FCS), 2% L-글루타민, 1%의 페니실린/스트렙토마이신 용액, 1%의 비-필수 아미노산, 1%의 100mM 피루브산 나트륨 및 1%의 옥살로아세트산으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 5% CO2로 37℃에서 배양기에 놓았다.
현탁액에서 성장한 세포들을 새로운 신선한 완전 배지에서 세포 배양액의 1:4 희석을 통해, 주 1회 정도로 실행된 병원균 배양에 의해 배양액에 유지하였다.
● HT-29 세포주
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC 메릴랜드, USA)으로부터 얻은 인간 결장 샘암종 세포 HT-29를 10% 태아 소 혈청(FCS), 2% L-글루타민, 1%의 페니실린/스트렙토마이신 용액, 1%의 비-필수 아미노산, 1%의 100mM 피루브산 나트륨 및 2%의 1M HEPES 용액으로 보충한 듈베코 변형 이글 배지(DMEM 고 글루코오스 pH 7.4)에 유지하였다.
부착에 의해 성장된 세포들을 주 1회 정도로 실행된 병원균 배양에 의해 배양액에 유지하였고, 단층으로부터 세포들을 분리하기 위한 트립신/EDTA에 의한 처리 이전, 플라스크 당 300 000 세포를 씨딩하였다.
● 세포독성 분석법
실험 24 시간 이전 96웰 플레이트(10 000 cells/well)에서 배양액으로 배양한 Mono Mac-6 및 HT-29 세포들을 24, 48 및 72시간 동안 다양한 농도에서 양이온 유도체로 배양하였다.
테스트 화합물에 의한 치료의 종료시에, 세포 생존가능성을 키트 ATPlite(Perkin-Elmer)를 사용하여 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 생산의 함수로서 측정하였다.
ATPlite 분석법은 세포들에 존재하는 ATP의 반응 이후 생산된 냉광의 발생을 기초로 하며, 루시페라제 및 d-루시페린은 리딩 전에 웰에 첨가된다. 발생된 냉광의 강도는 샘플에 존재하는 ATP의 농도에 정비례하고 루미노미터(VICTOR-3 Wallac)를 사용하여 측정한다.
루미노미터 측정을 실행하기 이전, 100㎕의 세포 배지에서 50㎕의 세포용해용액(0.2N NaOH에서 트리톤 X-100 0.5%)을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 5분 배양하고 700rpm에서 교반하면서, 50㎕의 ATPlite 키트를 각 웰에 첨가하고, 5분 동안 교반한 후, 냉광 측정을 실행하기 이전, 판을 암실에서 추가로 10분 동안 배양하였다.
각 유도체의 경우, 실험을 2중으로 실행하였다.
세포 생존가능성의 백분율을 처리된 세포 및 미처리된 제어 세포에 대한 냉광 값의 평균을 고려하여 측정하였다.
각 유도체에 대한 세포 생존가능성의 백분율(% CV)을 다음 식에 따라, 대조군에 대한 평균 백분율로 표현하였다.
Figure 112014071313611-pct00031
화합물은 생존가능성의 백분율이 50% 미만일 때 세포독성인 것으로 생각된다.
양이온 폴리머 0.01mg/ml의 농도
폴리머
No.		 MonoMac-6 세포주(현탁액) HT29 세포주 (점착성)
CV (%) CV (%)
24
시간		 48
시간		 72
시간		 24
시간		 48
시간		 72
시간
1 111 97 114 115 78 143
2 112 61 136 136 107 136
3 115 208 65 96 131 160
4 108 217 60 86 118 140
5 100 176 56 113 107 165
6 109 132 124 111 138 158
7 104 80 105 317 92 95
8 - - - 103 61 92
9 111 143 129 101 120 156
10 110 144 80 103 143 162
11 125 110 129 323 101 97
12 - - - 127 72 86
13 135 121 136 301 95 90
14 108 71 81 305 92 91
15 126 115 161 227 92 68
16 - - - 131 83 79
17 107 137 134 106 123 131
18(*) 97 74 109 97 73 105
50(*) 105 105 120 97 128 158
60(*) - - - 93 114 52
(*) 비교에 사용된 폴리머:
18 = DEAE 덱스트란;
50 = 변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐;
60 = 폴리에틸렌이민(PEI)
표 13의 결과는 본 발명에 따른 양이온 폴리머가 0.01mg/mL의 농도에서 세포독성이 아니라는 것을 입증하는 것을 가능하게 한다.
양이온 폴리머 0.1mg/mL의 농도
폴리머
No.		 MonoMac-6 세포주(현탁액) HT29 세포주 (점착성)
CV (%) CV (%)
24
시간		 48
시간		 72
시간		 24
시간		 48
시간		 72
시간
1 108 86 61 101 96 132
2 105 152 167 116 110 169
3 107 182 100 102 127 140
4 105 165 66 104 122 131
5 107 182 87 85 147 152
6 102 151 107 102 110 147
7 99 54 95 342 81 102
8 - - - 114 149 92
9 109 182 128 106 118 168
10 111 152 82 95 156 150
11 107 82 142 367 105 110
12 - - - 131 91 92
13 121 123 121 346 92 104
14 106 81 123 381 114 114
15 125 109 149 326 113 98
16 - - - 131 159 150
17 110 124 138 109 120 152
18(*) 10 24 16 60 41 45
50(*) 105 167 108 97 125 158
60(*) - - - 7 6 3
(*) 비교에 사용된 폴리머:
18 = DEAE 덱스트란;
50 = 변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐;
60 = PEI.
표 14의 결과는 DEAE-덱스트란 및 PEI와 달리, 본 발명에 따른 양이온 폴리머가 0.1mg/mL의 농도에서 세포독성이 아니라는 것을 입증하는 것을 가능하게 한다.
양이온 폴리머 1.0mg/mL의 농도
폴리머
No.		 MonoMac-6 세포주(현탁액) HT29 세포주 (점착성)
CV (%) CV (%)
24
시간		 48
시간		 72
시간		 24
시간		 48
시간		 72
시간
1 91 70 76 89 133 109
2 117 118 153 95 121 145
3 88 115 32 112 126 133
4 55 81 50 84 115 108
5 88 175 45 79 127 159
6 102 132 89 103 130 149
7 41 16 12 280 82 84
8 - - - 74 113 86
9 115 132 103 99 127 163
10 99 136 55 131 143 155
11 113 78 136 371 110 111
12 - - - 108 169 135
13 97 169 63 329 111 99
14 107 75 131 373 104 112
15 140 101 105 333 110 100
16 - - - 107 165 125
17 98 138 138 95 134 128
18(*) 13 14 12 49 29 18
50(*) 98 158 69 98 115 157
60(*) - - - 3 6 2
(*) 비교에 사용된 폴리머:
18 = DEAE 덱스트란;
50 = 변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐;
60 = PEI.
표 15의 결과는 DEAE-덱스트란 및 PEI와 달리, 폴리머 7을 제외하고, 본 발명에 따른 양이온 폴리머가 현탁액에서 1mg/mL의 농도에서 세포 배지에만 세포독성이 아니라는 것을 입증하는 것을 가능하게 한다. 유도체 7은 현탁액에서 세포 배지에만 세포독성을 제공하는 것으로 입증되었다.
양이온 폴리머 10.0mg/mL의 농도
폴리머
No.		 HT29 세포주 (부착)
CV (%)
24
시간		 48
시간		 72
시간
1 112 156 164
2 97 130 177
3 78 104 128
4 63 82 71
5 106 130 174
6 101 132 170
7 277 76 83
8 43 77 56
9 104 135 165
10 52 120 172
11 362 116 108
12 93 166 115
13 379 116 113
14 361 123 108
15 308 110 92
16 79 146 95
17 97 129 176
18(*) 49 27 28
50(*) 89 135 151
60(*) 2 2 1
(*) 비교에 사용된 폴리머:
18 = DEAE 덱스트란;
50 = 변형되지 않은 PolglumytTM 글리코겐;
60 = PEI.
표 16의 결과는 DEAE-덱스트란 및 PEI와 달리, 본 발명에 따른 양이온 폴리머가 10mg/mL의 농도에서 세포독성이 아니라는 것을 입증하는 것을 가능하게 한다.
(b) 본 발명에 따른 양이온 폴리머의 형광 유도체에 대한 연구
세포 흡수 연구를 실행할 최고 비-세포독성 농도를 측정하기 위해서, 본 발명에 따른 양이온 폴리머의 형광 유도체를 사용하여 세포독성 연구를 실행하였다.
본 발명에 따른 양이온 폴리머의 형광 유도체들을 다음과 같이 합성하였다.
500mg의 본 발명에 따른 양이온 폴리머들 중 하나를 자석 교반기가 장착된 2구 둥근 바닥 플라스크에서 10mL의 증류수에 암실에서 용해하였다. 2mL의 1N NaOH를 첨가하고 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 다음으로, 36mg의 0.3mL의 DMSO에 용해된 36mg의 형광조영제 아이소티오시아네이트(FITC)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다.
다음날, 20mL의 아세톤을 반응 플라스크 속에 붓고, 약 30분 동안 교반한 후, 폴리머를 침전시켰다. 상청액을 버리고 침전물을 약 20mL의 아세톤으로 2회 세척하였다.
그런 후에 침전물을 약 10mL의 증류수에 용해하고 용액을 암실에서, 증류수에 대하여 재생 셀룰로오스 튜브(컷-오프 15,000)에서 투석하였다. 투석을 완료한 후, 용액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과하고 동결건조하였다.
이런 연구를 상기한 대로 기술하여, HT29 부착 세포에 대해 연구를 실행하였다.
결과는 아래 표 17에 대조되고, 본 발명에 따른 양이온 폴리머의 형광 유도체는 "f"를 첨가하여 표 2에서와 동일한 넘버링으로 나타내었다.
Conc.
0.01 mg/mL		 Conc.
0.1 mg/mL		 Conc.
1 mg/mL		 Conc.
10 mg/mL
No. 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24 h 48 h 72h 24h 48h 72h
1f 119 142 115 111 116 125 106 108 131 97 116 125
2f 102 159 133 101 112 83 100 115 119 77 100 89
3f 92 123 102 71 84 107 75 90 105 53 74 61
4f 69 86 94 79 59 78 56 31 71 36 32 34
5f 114 100 133 98 94 134 107 106 116 105 78 106
6f 105 90 118 101 154 91 98 92 116 98 72 75
7f 94 128 114 102 120 112 73 72 88 59 52 40
8f 103 61 92 114 149 92 74 113 86 43 77 56
9f 92 67 69 89 83 37 72 71 36 77 57 33
10f 95 151 114 93 119 82 94 120 75 56 79 35
11f 111 105 147 100 90 144 75 75 123 81 50 94
12f 127 72 86 131 91 92 108 169 135 93 166 115
13f 93 100 96 97 122 75 110 90 104 63 70 47
14f 102 94 103 102 119 137 103 78 156 74 65 101
15f 93 81 137 81 105 150 77 87 122 69 59 88
16f 131 83 79 131 159 150 107 165 125 79 146 95
18f(*) 15 10 11 20 7 13 17 12 6 20 8 10
(*) 비교예:
18f = DEAE-덱스트란의 형광 유도체
얻은 결과로부터, 본 발명에 따른 양이온 폴리머의 모든 형광 유도체가 24시간 동안 비 독성이었던 최고 농도는 1mg/ml이었다. 반대로, DEAE-덱스트란의 형광 유도체는 분석된 모든 농도에서 높은 세포독성이었다.
실시예 7
세포 흡수 연구
세포 흡수 연구를 1mg/mL의 농도, 즉 형광 유도체 1f-16f가 24시간 동안 비 독성인 것으로 증명된 세포독성 연구에서 분석된 최고 농도에서, 본 발명의 양이온 폴리머(1f-16f) 및 DEAE-덱스트란 하이드로클로라이드의 형광 유도체를 사용하여 2, 6 및 24시간 실행하였다.
연구는 다음 절차에 따라 처리된 HT29 부착 세포들을 사용하여 실행하였다.
20,000 cells/well의 밀도에서 실험 이전 날에 배양액으로 배양한 HT-29 세포들을 2, 6 및 24시간 동안 1mg/ml의 농도에서 개별 형광 유도체로 배양하였다. 각 배양기간의 종료시에, 배지를 웰들로부터 제거하고 세포들을 표준 pH 7.4 포스페이트-버퍼 식염수(PBS)로 3회 세척하였다.
다음으로, 세포들을 200㎕의 세포용해 용액(0.2N NaOH에서 트리톤 X-100 0.5%)으로 처리하고 형광을 형광분석기(λexc.485nm; λem.535nm)로 측정하였다.
각 화합물 및 각 시간에 대해, 2개의 복제물의 평균 형광을 계산하였고, 이의 값은 표 18에 제공된다.
폴리머 No. 형광 강도
2 시간 6 시간 24 시간
1f 1696 1372 744
2f 5567 6327 7217
3f 17531 24101 30573
4f 70210 63668 120662
5f 4845 4365 3274
6f 6842 8306 7651
7f 26268 36314 52612
8f 19638 34463 58024
9f 2386 2991 2487
10f 3122 4318 3177
11f 10866 12491 8906
12f 14020 21569 37090
13f 937 1736 1008
14f 4599 7724 4190
15f 13319 22623 30889
16f 23560 48650 56919
18f(*) 15227 13689 12626
대조군 833 1152 349
형광 유도체에 대한 세포 흡수의 유효량을 세포 용해 용매(0.2N NaOH에서 트리톤 X-100 0.5%)에서 각 형광 유도체에 대한 교정 곡선을 만듦으로써 계산하였다.
관찰된 교정 곡선 및 형광 강도로부터, 세포 흡수의 mg/mL의 양을 표 19에 기술된 대로 계산하였다.
농도 mg/mL
폴리머 No. 2 h 6 h 24 h
2f 0.006 0.006 0.007
3f 0.008 0.014 0.021
4f 0.019 0.017 0.036
5f 0.002 0.001 0.000
6f 0.002 0.003 0.002
7f 0.026 0.036 0.053
8f 0.005 0.012 0.024
11f 0.002 0.003 0.001
12f 0.004 0.008 0.016
14f 0.006 0.009 0.005
15f 0.004 0.014 0.022
16f 0.008 0.020 0.025
18f(*) 0.002 0.002 0.001
(*) 형광 DEAE-덱스트란
얻은 결과는 DEAE-덱스트란에 대해 본 발명에 따른 양이온 폴리머의 세포 흡수의 정도를 나타내었다.
또한, 유도화도는 세포 흡수에 대해 정비례 영향을 미쳤다는 것을 나타내었다.
실시예 8
버퍼 용량의 평가
버퍼 용량을 평가하여 본 발명에 따른 양이온 폴리머들이 엔도솜으로부터 폴리머-핵산 복합체의 방출, 뒤이어 세포 부착을 가능하게 하는데 필수라고 생각되는 "프로톤-스펀지" 효과를 유도할 수 있는 특성을 가질 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 양이온 폴리머(DEAE-글리코겐) 및 DEAE-덱스트란을 NaOH에 의해 하이드로클로라이드(실시예 2에 기술된 대로)으로 변형되자마자 적정하였고, 적정은 pH 변화로 관찰하였다.
100mg의 폴리머 하이드로클로라이드를 100mL의 증류수에 용해하였고, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 용액을 0.01N NaOH로 적절하였고, 적정제의 첨가를 선량계로 실행하였고 적정은 pH-미터로 관찰하였다.
본 발명에 따른 양이온 유도체에 대해 실행한 적정 연구는 본 발명의 양이온 폴리머에 높은 버퍼 용량을 제공하는 약 4.5-8 사이의 범위에서 약 생리적 pH 및 그보다 낮은 pKa 분포를 확인하는 것을 가능하게 할 수 있다.
약 생리적 pH인 pKa 값은 핵산의 복합체화에 필수적인 양전하를 본 발명의 양이온 폴리머에 제공하는데 유용하였다.
생리적 pH보다 낮은 pKa 값은 ("프로톤 스펀지" 효과를 통해) 엔도솜으로부터 세포질 속으로 복합체의 방출을 보장하는데 유용하였다.
도 9는 비교를 위해서 양이온 폴리머 2, 3 및 4(본 발명에 따른, DEAE-글리코겐)에 대한 적정 곡선을 나타낸다. 동일한 종류의 유도체 내에서, 버퍼 용량은 유도화의 정도가 증가함에 따라 증가하였다.
또한, 폴리머 4(DEAE-글리코겐) 및 생성물 18(DEAE-덱스트란)은 도 10에 도시된 대로, 유사한 유도화도 및 필적가능한 버퍼 용량을 가졌다는 것을 관찰하였다.
실시예 9
유동학적 측정
유동학 연구를 본 발명에 따른 양이온 유도체 1-16(DEAE-, DMAP-, DMAE-, 2-OH-PTMA-글리코겐) 및 DEAE-덱스트란 하이드로클로라이드에 대해, PBS에서 1%의 농도에서, 실행하였다.
측정을 펠티어 보힐린 장치에 의해 자동온도조절로 유지된 콘-플레이트 기하학 2°/55mm가 장착된, 보힐린 R6 40.5.32 소프트웨어에 의해 조정된 보힐린 제미니 150 회전 유량계를 사용하여 실행하였고 1-5Pa의 전단 응력 범위에서 "제어된 응력" 모드로 실행하였다.
분석된 모든 샘플들은 mPa*s 크기의 매우 낮은 점도 값을 나타내었다. 이런 특징은 주입에 의해 본 발명에 따른 양이온 유도체를 사용하는 것을 가능하게 하였다.
예를 들어, 표 20은 단일 응력 값(2.5Pa)에서 다양한 유도체의 점도 값을 나타낸다.
폴리머 No. 2.5 Pa에서 점도 (Pa.s)
1 1.97x10-3
2 1.91x10-3
3 1.91x10-3
4 1.95x10-3
5 1.97x10-3
6 1.95x10-3
7 1.91x10-3
8 1.96x10-3
9 1.87x10-3
10 1.96x10-3
11 1.92x10-3
12 1.91x10-3
13 1.93x10-3
14 1.94x10-3
15 1.93x10-3
16 1.98x10-3
18(*) 2.36x10-3
(*) 비교예: DEAE-덱스트란
실시예 10
음이온 분자와 복합체화된 글리코겐의 양이온 유도체에 의한 세포독성 연구
10% 혈청을 포함하는 100㎕의 DMEM 배지의 부피에서 10,000 cells/well의 밀도로 실험 전날 HT-29 세포를 배양액에서 배양하였다.
실험 날, 배지를 웰들로부터 제거하고 2.5% 혈청을 포함하는 150㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다. 그런 후에 본 발명에 따른 양이온 폴리머로 형성된 50㎕의 복합체 및 형광 siRNA를 첨가하였다. 본 발명에 따른 양이온 폴리머로 형성된 복합체 및 형광 siRNA를 다음 절차에 따라 제조하였다.
40ml의 RNase-제거 PBS에서 6.283mg의 양이온 폴리머 3, 7, 11 및 15를 각각 포함하는 4개 용액을 제조하였다. 142.86㎕의 각 용액에 6.6㎕의 RNase-제거 PBS(20μM) 속 siRNA의 용액을 첨가하였고, 수분 후, 각각을 350.54㎕의 RNase-제거 PBS로 희석하였다. 용액 속 siRNA의 최종 농도는 폴리머의 중량에 대해 siRNA의 10중량%와 동일한 264nM이었다.
따라서 얻은 용액을 약 30초 동안 교반하고, 10분 동안 실온에서 교반하였고, 30초 동안 다시 교반하고 5분 동안 방치하였다. 실험을 실행하기 전에, 용액을 30초 동안 다시 교반하였다.
siRNA가 첨가되지 않은 RNase-제거 PBS의 양이온 폴리머 3, 7, 11 및 15의 용액(50㎕)을 제 1 비교예로 사용하였다.
siRNA 및 siRNA의 형질감염을 위해 제조사 라이프-테크놀러지TM에 의해 기술된 절차에 따라 제조되고 폴리머의 복합체에 사용된 siRNA의 동일한 양을 포함하는 형질감염 시약 리포펙타민®2000을 제 2 비교예로서 사용하였다.
siRNA가 첨가되지 않은 형질감염 시약 리포펙타민®2000을 제 3 비교예로서 사용하였다.
상기한 대로 제조한 복합체 및 모든 비교 재료를 세포와 접촉시켜 놓았다.
세포들을 37℃에서 4 및 24시간 동안 배양하였고, 그 후 상청액을 제거하고 2.5% 혈청을 포함하는 100㎕을 첨가하였다.
테스트 화합물에 의한 처리의 종료시에, 세포 생존가능성을 상기 실시예 6에 기술된 바와 같이 키트 ATPlite(Perkin-Elmer)를 사용하여 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 생산의 함수로서 측정하였다.
실시예 6에서 기술된 대로 결과는 아래 표 21에 생존 세포의 백분율로 표현된다.
폴리머
No.		 세포 생존 CV (%)
4 h 24 h
3 + siRNA 58 100
7 + siRNA 89 85
11 + siRNA 91 70
15 + siRNA 101 59
첫 번째 비교
3 92 105
7 90 99
11 85 85
15 86 72
두 번째 비교
리포펙타민®2000 + siRNA 130 110
세 번째 비교
리포펙타민®2000 110 108
얻은 결과는 본 발명에 따른 양이온 폴리머 및 siRNA 사이에서 얻은 복합체가 세포독성이 아니라는 것을 입증하였다.
결과적으로, 양이온 폴리머 3, 7, 11 및 15를 다음 세포 흡수 연구에 사용하였다.
실시예 11
형광 음이온 분자와 복합체화된 글리코겐의 양이온 유도체에 의한 세포 흡수 연구
연구는 HT29 부착 세포를 사용하여, 실시예 7에 기술된 것과 유사한 방식으로 실행하였다.
HT-29 세포를 10% 혈청을 포함하는 100㎕의 DMEM 배지의 부피에서 20,000 cells/well의 밀도로 실험 전날 HT-29 세포를 배양액에서 배양하였다.
실험 날, 배지를 웰들로부터 제거하고 2.5% 혈청을 포함하는 150㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다. 그런 후에 본 발명에 따른 양이온 폴리머로 형성된 50㎕의 복합체 및 형광 siRNA를 첨가하였다.
본 발명에 따른 양이온 폴리머로 형성된 복합체 및 형광 siRNA를 다음 절차에 따라 제조하였다.
40ml의 RNase-제거 PBS에서 6.2832mg의 양이온 폴리머 3, 7, 11 및 15를 각각 포함하는 4개 용액을 제조하였다. 142.86㎕의 각 용액에 6.6㎕의 RNase-제거 PBS(20μM) 속 siRNA의 용액을 첨가하였고, 수분 후, 각각을 350.54㎕의 RNase-제거 PBS로 희석하였다. siRNA를 형광 화합물 Alexa-488로 표지화하였다. siRNA의 최종 농도는 폴리머의 중량에 대해 siRNA의 10중량%와 동일한 264nM이었다.
따라서 얻은 용액을 약 30초 동안 교반하고, 10분 동안 실온에서 교반하였고, 추가 30초 동안 다시 교반하고 5분 동안 방치하였다. 실험을 실행하기 전에, 용액을 추가 30초 동안 다시 교반하였다.
siRNA 및 siRNA의 형질감염을 위해 제조사 라이프-테크놀러지TM에 의해 기술된 절차에 따라 제조되고 폴리머의 복합체에 사용된 siRNA의 동일한 양을 포함하는 형질감염 시약 리포펙타민®2000을 제 1 비교예로서 사용하였다.
siRNA 단독의 형광을 후속 비교로서 측정하였다.
상기한 대로 제조한 복합체 및 모든 비교 재료를 세포와 접촉시켜 놓았다.
세포들을 37℃에서 4 및 24시간 동안 배양하였고, 그 후 상청액을 제거하고, 세포들을 200㎕의 PBS로 2회 세척하였다.
다음, 세포들을 200㎕의 세포용해 용액(0.2N NaOH에서 트리톤 X-100 0.5%)으로 5분 동안, 실온에서 교반하면서 처리하였다.
폴리머 및 siRNA 사이의 복합체를 4시간 동안 세포와 접촉시켜 유지한 후, 흡수된, Alexa-488로 표지화된 siRNA에 의해 방출된 형광을 형광분석기(λexc.485nm; λem.535nm)로 측정하였다.
각 폴리머에 대해, 실험을 3중으로 실행하였고 그런 후에 평균 형광 강도를 계산하였다. 이런 값은 1366과 동일한, 배지 단독에 대해 계산된 형광 강도의 평균값으로부터 빼서, 최종 형광 강도를 제공한다.
제 1 비교(리포펙타민® 2000 + siRNA)에 대해 동일한 절차를 따랐고 배지 단독에 대한 평균 형광 강도 값이 1328과 동일하였다.
결과는 표 22에서 대조된다.
폴리머
No.		 형광 강도
기록 평균 최종
3 2533 2504 2642 2560 1194
7 2721 2973 3066 2920 1554
11 1906 1801 1856 1854 489
15 2493 2927 2851 2757 1391
리포펙타민®2000 + siRNA 1811 1820 1845 1825 498
siRNA 1334 1351 1267 1317 -
얻은 결과는 본 발명에 따른 양이온 폴리머들은 세포막 속으로 siRNA의 흡수를 유도할 수 있다는 것을 입증하였다. 또한, 본 발명에 따른 양이온 폴리머는 리포펙타민®2000을 포함하는 비교로서 사용된 복합체보다 많은 양의 siRNA를 흡수하는 것을 가능하게 하였다.

Claims (15)

  1. 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 반복 단위를 포함하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머로서:
    (a)
    Figure 112019027564806-pct00032
    (a)
    여기서
    그룹 R은, 동일하거나 다를 수 있고, 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬, 아조사이클일-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 여기서 사슬 (C1-C6)알킬은 동일하거나 다를 수 있고, 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다; 및
    n은 1보다 크거나 동일한 정수이다; 및
    (b)
    Figure 112019027564806-pct00033
    (b)
    여기서
    R1은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 여기서 사슬 (C1-C6)알킬은, 동일하거나 다를 수 있고, 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다;
    X1 및 X2는, 동일하거나 다를 수 있고, 그룹 -OH 또는 질소를 포함하는 그룹 -NHR2이며, 여기서 R2는 수소 원자, (C1-C6)알킬 및 H-[NH-(C1-C6)알킬]p-로부터 선택되고, 여기서 p는 1보다 크거나 동일하고, 그룹 (C1-C6)알킬은 동일하거나 다를 수 있다;
    m은 1보다 크거나 동일한 정수이다;
    이때, 선택된 반복 단위에 존재하는, R, R1, X1 및 X2 중 적어도 하나는 R, R1, X1 및 X2의 각각에 대해 정의한 대로 질소를 포함하는 기인 것을 조건으로 하며,
    상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머는 글리코겐과 N-(3-클로로-2-하이드록시프로필)-트라이메틸 암모늄 클로라이드와 반응에 의해 얻은 생성물과 다르다는 것을 조건으로 하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 그룹 R은, 동일하거나 다를 수 있고, 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 [N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬-다이(C1-C3)알킬암모니오}-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬아미노}-(C1-C3)알킬, [트라이(C1-C3)알킬암모니오]-(C1-C3)알킬, 아조사이클일-(C1-C3)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 여기서 사슬 (C1-C3)알킬은, 동일하거나 다를 수 있고, 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환되는 것인 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 그룹 R은 동일하거나 다를 수 있고, 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 N,N-다이메틸아미노에틸, N,N-다이메틸아미노프로필, N,N-다이에틸아미노에틸, [(N,N-다이메틸아미노-에틸)다이메틸암모니오]에틸, [(N,N-다이메틸아미노프로필)-다이메틸암모니오]프로필, [(N,N-다이에틸아미노-에틸)다이에틸암모니오]-에틸, [트라이메틸암모니오]-2-하이드록시프로필, 피페리딜-N-에틸 또는 모르폴리닐-N-에틸로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹인 것인 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  4. 제 1 항에 있어서,
    R1은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 [N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬-다이(C1-C3)알킬암모니오}-(C1-C3)알킬, {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C3)알킬아미노}-(C1-C3)알킬 또는 [트라이(C1-C3)알킬암모니오]-(C1-C3)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 여기서 사슬 (C1-C3)알킬은, 동일하거나 다를 수 있고, 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환되는 것인 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  5. 제 4 항에 있어서,
    R1은 수소 원자 또는 카복시메틸기인 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  6. 제 1 항에 있어서,
    X1 및 X2는, 동일하거나 다를 수 있고, 질소를 포함하는 그룹 -NHR2이며, 여기서 R2는 수소 원자 또는 H-[NH-(C1-C4)알킬]p-로부터 선택되고, 여기서 p는 1보다 크거나 동일하고, 그룹 (C1-C4)알킬은 동일하거나 다를 수 있는 것인 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 그룹 H-[NH-(C1-C4)알킬]p-는 50 내지 3,000 달톤의 분자량을 가진 폴리에틸렌이민, 스퍼민 (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2), 또는 스퍼미딘 (H2N(CH2)4NH(CH2)4NH2)인 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 반복 단위(a) 및 (b)는
    - NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬 및 아조사이클일-(C1-C6)알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 생리적 pH에서 이온화가능한 질소를 포함하는 그룹인 X, R1, X1 및 X2로부터 적어도 하나; 및
    - NH2-{[(C1-C3)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬 및 {[N,N-다이(C1-C3)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 생리적 pH 아래의 pH에서 이온화가능한 질소를 포함하는 그룹인 X, R1, X1 및 X2로부터 적어도 하나
    를 포함하는 것인 글리코겐-기반 양이온 폴리머.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 글리코겐-기반 양이온 폴리머 및 음이온 화합물 사이의 복합체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 복합체는 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 중량에 대해 5중량% 내지 60중량%의 상기 음이온 화합물의 양을 포함하는 것인 복합체.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 복합체는 상기 글리코겐-기반 양이온 폴리머의 중량에 대해 10중량% 내지 50중량%의 상기 음이온 화합물의 양을 포함하는 것인 복합체.
  12. 음이온 화합물의 비-바이러스 전달을 위한 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은,
    (A) 하기 (1)과 (2) 사이의 복합체:
    (1) 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 반복 단위를 포함하는 글리코겐-기반 양이온 폴리머:
    (a)
    Figure 112019027564806-pct00034
    (a)
    여기서
    그룹 R은, 동일하거나 다를 수 있고, 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬, 아조사이클일-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 여기서 사슬 (C1-C6)알킬은, 동일하거나 다를 수 있고, 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환된다; 및
    n은 1보다 크거나 동일한 정수이다; 및
    (b)
    Figure 112019027564806-pct00035
    (b)
    여기서
    R1은 수소 원자; 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 염기와 선택적으로 염 형태인 카복시메틸기; 또는 NH2-(C1-C6)알킬, [N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, NH2-{[(C1-C6)알킬]-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬-다이(C1-C6)알킬암모니오}-(C1-C6)알킬, NH2-[(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬, {[N,N-다이(C1-C6)알킬아미노]-(C1-C6)알킬아미노}-(C1-C6)알킬, [트라이(C1-C6)알킬암모니오]-(C1-C6)알킬로부터 선택된 질소를 포함하는 그룹이며, 여기서 사슬 (C1-C6)알킬은, 동일하거나 다를 수 있고, 하나 이상의 수산기로 선택적으로 치환되고;
    X1 및 X2는, 동일하거나 다를 수 있고, 그룹 -OH 또는 질소를 포함하는 그룹 -NHR2이며, 여기서 R2는 수소 원자, (C1-C6)알킬 및 H-[NH-(C1-C6)알킬]p-로부터 선택되고, 여기서 p는 1보다 크거나 동일하고, 그룹 (C1-C6)알킬은 동일하거나 다를 수 있고;
    m은 1보다 크거나 동일한 정수이다;
    이때, 선택된 반복 단위에 존재하는, R, R1, X1 및 X2 중의 적어도 하나는 그룹 R, R1, X1 및 X2의 각각에 대해 정의한 대로 질소를 포함하는 그룹인 것을 조건으로 하는 것인
    글리코겐-기반 양이온 폴리머, 및
    (2) 음이온 화합물; 및
    (B) 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제
    를 포함하는 것인 약학적인 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 음이온 화합물은 핵산인 약학적 조성물.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    주사용인 약학적 조성물.
  15. 삭제
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