EA032479B1 - Катионные полимеры на основе гликогена - Google Patents

Катионные полимеры на основе гликогена Download PDF

Info

Publication number
EA032479B1
EA032479B1 EA201491613A EA201491613A EA032479B1 EA 032479 B1 EA032479 B1 EA 032479B1 EA 201491613 A EA201491613 A EA 201491613A EA 201491613 A EA201491613 A EA 201491613A EA 032479 B1 EA032479 B1 EA 032479B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
alkyl
alkylamino
glycogen
group
cationic
Prior art date
Application number
EA201491613A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491613A1 (ru
Inventor
Винченцо Руссо
Элиза Либерати
Никола Каццолла
Original Assignee
Ацьенде Кимике Рьюните Анджелини Франческо А.К.Р.А.Ф. С.П.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ацьенде Кимике Рьюните Анджелини Франческо А.К.Р.А.Ф. С.П.А. filed Critical Ацьенде Кимике Рьюните Анджелини Франческо А.К.Р.А.Ф. С.П.А.
Publication of EA201491613A1 publication Critical patent/EA201491613A1/ru
Publication of EA032479B1 publication Critical patent/EA032479B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/18—Reserve carbohydrates, e.g. glycogen, inulin, laminarin; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

Изобретение относится к катионным полимерам на основе гликогена, комплексам указанных катионных полимеров с анионными соединениями, фармацевтическим композициям, содержащим указанные комплексы, и применению указанных комплексов для доставки или трансфекции указанных анионных соединений к определенной фармакологической мишени, такой как, например, орган, ткань или клетка.

Description

Изобретение относится к катионным полимерам на основе гликогена, комплексам указанных катионных полимеров с анионными соединениями, фармацевтическим композициям, содержащим указанные комплексы, и применению указанных комплексов для доставки или трансфекции указанных анионных соединений к определенной фармакологической мишени, такой как, например, орган, ткань или клетка.
032479 Β1
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к катионным полимерам на основе гликогена, комплексам, содержащим указанные полимеры и по меньшей мере одно анионное соединение, и применению указанных комплексов для доставки анионных соединений.
В частности, катионные полимеры на основе гликогена являются применимыми в качестве невирусных векторов для трансфекции нуклеиновых кислот.
Описание предшествующего уровня техники
Для уменьшения побочных действий активных ингредиентов и максимизации их терапевтической эффективности были разработаны системы с регулируемым высвобождением, в которых лекарственная форма регулирует фазу высвобождения активного ингредиента, а также системы, способные доставлять и направлять активный ингредиент к определенной фармакологической мишени.
В частности, доставляющие и направляющие системы должны взаимодействовать с активными ингредиентами таким образом, чтобы полученный комплекс был стабильным при хранении и введении, но высвобождал активный ингредиент в заданной фармакологической мишени.
Обычно связи, которые образуются между системой доставки и активным ингредиентом являются нековалентными, например, электростатическими, ионными или ван-дер-ваальсовыми связями, водородными связями и тому подобными связями.
Проблема разработки доставляющих и направляющих систем относится частично к активным ингредиентам с низкой молекулярной массой и частично к полимерам и молекулам с высокой молекулярной массой, например нуклеиновым кислотам.
В частности, указывается способ сознательной инсерции последовательностей нуклеиновых кислот и/или генетических конструкций в клетки-мишени с целью компенсации отсутствия гена, сверхэкспрессии гена, заглушения экспрессии гена или введения новых функций в указанную клетку в области генной терапии, обозначаемый термином трансфекция.
Этот способ, как представляется, является перспективным как при лечении генетических заболеваний, так и при разработке стратегий для лечения и предотвращения хронических заболеваний.
Однако, при введении ίη νίνο в нативной форме нуклеиновые кислоты, подобно другим полианионным веществам, быстро разлагаются катионными ферментами (например, нуклеазами и протеазами) и слабо поглощаются клетками.
Генные векторы, которые изучены и разработаны до настоящего времени, включают в себя вирусные системы (ретровирусы, аденовирусы и т.д.) и невирусные системы (липосомы, полимеры, пептиды и т.д.).
Известно, что вирусные векторы имеют более высокую эффективность трансфекции по сравнению с невирусными системами. Однако применение вирусных векторов ίη νίνο ограничено многими недостатками, например риском репликации, возможностью индуцирования иммунных реакций, тем фактором, что только субреплицированные клетки являются применимыми в качестве мишеней, низкой емкостью заряда генов больших размеров или произвольной инсерцией фрагментов ДНК.
В настоящей области известно, что применение генных терапий на основе невирусных векторов имеет многочисленные преимущества, среди которых имеются относительная безопасность и низкие стоимости препаратов.
Невирусные генные векторы, например катионные полимеры, липосомы и синтетические векторы, были широко исследованы в качестве альтернативы применению вирусных векторов.
Ν,Ν-Диэтиламиноэтилдекстран (ΌΕΛΕ-декстран) был одним из первых химических производных природного полимера, который применяли для регулируемого высвобождения активных ингредиентов (например, для регулируемого высвобождения в слизистой оболочке, как описано, например, в \УО 90/09780) и затем в качестве агента трансфекции (как описано, например, в ЕР 1738769).
ΌΕΛΕ-декстран представляет собой поликатионный полимер, полученный взаимодействием Ν,Νдиэтиламиноэтилхлорида и декстрана, который представляет собой линейный полимер, у которого звенья глюкозы связываются посредством а-1,6-связей, и который имеет небольшое число разветвлений, у которых мономеры глюкозы связаны посредством а-1,4-связей (нумерация показана в приведенной ниже формуле).
ΌΕΛΕ-декстран, представленный следующей структурной формулой, имеет два заместителя, содержащие азотистые остатки, у которых атомы азота имеют отличные друг от друга физико-химические характеристики:
- 1 032479
Первый заместитель содержит третичную функциональную аминогруппу (обозначается как Ν') с рКа приблизительно 9,5, которая при физиологическом значении рН имеет ионизированную форму. Второй заместитель, известный как тандем, содержит четвертичную аммониевую группу (Ν ), которая имеет постоянный положительный заряд и влияет на кислотность второй третичной функциональной аминогруппы (обозначенной как Ν), которая имеет рКа приблизительно 5,7 и затем, при физиологическом значении рН, находится в неионизированной форме (Г. ОиЬепзек, ,1онгпа1 о£ Масгото1еси1аг 8с1епсе: Раг! А - СГет1з!гу - 2 (5) 1968, 1045-1054).
Известно, однако, что положительные заряды ИЕАЕ-декстрана ιη у1уо взаимодействуют с анионными биологическими структурами, другими, чем нуклеиновые кислоты, что приводит к появлению токсичности.
В общем, механизм образования комплексов между катионными полимерами и нуклеиновыми кислотами и последующей доставки можно суммировать следующим образом.
Генетический материал образует комплекс с катионными полимерами посредством слабых связей, например электростатических связей. Образование этого комплекса защищает нуклеиновую кислоту от деградации под воздействием нуклеазы и позволяет нуклеиновой кислоте доставляться в клетку, поскольку положительные заряды, присутствующие на поверхности комплекса, взаимодействуют с клеточной мембраной, стимулируя эндоцитоз комплекса посредством образования цитоплазматических телец.
Внутренняя часть цитоплазматических телец имеет значение рН приблизительно 4,5-5, которое является значительно более кислотным, чем значение рН цитоплазматической среды, которое равно приблизительно 7,3. Это различие в рН поддерживается посредством АТФ-зависимого протонного насоса, присутствующего на эндосомальной мембране, которая выталкивает ионы Н из цитозоля в цитоплазматическое тельце. Кислотное значение рН промотирует активность лизосомальных нуклеаз, которые являются ферментами, ответственными за деградацию нуклеиновых кислот гидролизом фосфодиэфирных связей между нуклеотидными субъединицами.
Полимеры с буферной способностью ингибируют активность лизосомальных нуклеаз и в то же время изменяют осмолярность цитоплазматических телец.
Фактически, хотя полимеры секвестрируют ионы Н , другие ионы Н требуются цитозолю, в то время как ионы С1- должны поддерживать электрическую нейтральность цитоплазматического тельца. Однако, потребность в ионах Н и С1- приводит к увеличению концентрации ионов внутри цитоплазматического тельца с последующим увеличением осмолярности цитоплазматического тельца относительно цитозоля. Увеличению осмолярности требуется вода из цитозоля. В результате цитоплазматическое тельце набухает до тех пор, пока оно не разорвется, высвобождая при этом комплекс полимернуклеиновая кислота в цитоплазму.
Этот механизм, известный как механизм протонной губки, был описан, среди прочего, в публикации Ι-Р. ВеЬг ТГе рго!оп зропде: а !пск !о еп!ег се11з 1Ге упизез б1б по! ехр1ой (СЫт1а, 1997, 51, 34-36) в отношении к полиэтилениминовым полимерам (РЕ1) и более широко описан в публикации Н. ЕНуаГи е! а1. Ро1утегз £ог ΏΝΑ беНуегу (Мо1еси1ез, 2005, 10, 34-64).
Полиэтиленимины (РЕ1) являются линейными или разветвленными катионными полимерами, характеризующимися высокой эффективностью высвобождения олигонуклеотидов и плазмид в клетки, ιη уйго, как описано, например, в публикации О. ВоиззИ е! а1. А уегзаШе уес!ог £ог депе апб о11допис1ео!1бе !гапз£ег т!о се11з т си1!иге апб т у1уо: Ро1уе!йу1еттте (Ргос. Νού. Асаб. 8с£ ϋ8Α, 1995, Уо1. 92, 72977301) и в международной патентной заявке УО 02/100435. РЕ1 описываются как полимеры с высокой плотностью заряда, которая защищают нуклеиновые кислоты от деградации нуклеазами. Считается, что высокая буферная способность РЕ1 защищает нуклеиновую кислоту от деградации в цитоплазматических тельцах во время фазы включения клетками индуцированием осмотического набухания (механизм протонной губки) цитоплазматического тельца, что делает возможным высвобождение комплекса вектор
- 2 032479 нуклеиновая кислота в цитоплазму.
Другим полимером, который был широко изучен в качестве агента трансфекции, является поли(Ьлизин) (РЕБ), который был описан, например, в международной патентной заявке \¥О 03/063827 и который характеризуется первичными аминогруппами, которые ионизируются при физиологическом значении рН и которые взаимодействуют с фосфатными группами нуклеиновых кислот, которые являются отрицательно заряженными. Однако, токсичность и эффективность трансфекции РББ прямо пропорциональны его молекулярной массе: когда молекулярная масса полимера увеличивается, наблюдается увеличенная эффективность трансфекции, с одной стороны, и увеличенная цитотоксичность, с другой стороны. Кроме того, основная цепь РЬЬ слабо деградирует в физиологических условиях, и ее накопление может привести в конце концов к токсичным последствиям.
Что касается большинства катионных полимеров, комплексы РЬЬ с нуклеиновыми кислотами также имеют физико-химические недостатки. Например, способы получения предоставляют небольшую возможность для регулирования размера, и это может привести к присутствию крупных частиц с ограниченной диффузионной способностью и/или возможностью осаждения на этапе изготовления или введения. Кроме того, оказывается, что кислотно-основные характеристики РЬЬ не обеспечивают возможность достижение высокой эффективности трансфекции, вероятно вследствие ограниченной возможности высвобождения нуклеиновой кислоты в цитоплазматическую среду.
Другие катионные полимеры, как природные, так и синтетические, были описаны в предшествующем уровне техники в качестве агентов для трансфекции нуклеиновых кислот.
Например, в международной патентной заявке \¥О 03/078576 описывается хитозан в качестве агента трансфекции для нуклеиновых кислот.
Хитозан является природным линейным полимером, состоящим из звеньев Ό-глюкозамина и Νацетил-Э-глюкозамина, произвольно распределенных в полимере, связанных посредством в-1,4-связей и содержащих аминогруппу с рКа приблизительно 6,5.
Для применения в качестве агентов трансфекции для нуклеиновых кислот были проведены также обширные исследования дендримеров, содержащих положительно ионизируемые группы, например структуры поли(амидоамина) (РАМАМ), макромолекул линейной структуры; метакриловых полимеров (таких как Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилат, ΌΜΑΕΜΑ), поли(этиленимин) (РЕ1) и производные этих полимеров с солюбилизирующими, функциональными или направляющими группами, например, полимерных структур, содержащих поли(этиленгликоль) (ПЭГ).
Линейные поли(амидоамины) (РАМАМ), описанные, например, в международной патентной заявке \УО 97/25067, являются водорастворимыми полимерами, которые позволяют получать растворимые и/или диспергируемые комплексы. Величину рКа катионных групп этих полимеров предпочтительно следует сохранять между 7 и 8, поскольку известно, что более низкие величины рКа приводят к снижению их способности загружаться нуклеиновыми кислотами. Кроме того, высвобождение комплексов, образованных из дендримеров на основе РАМАМ и нуклеиновых кислот, цитоплазматическими тельцами, включает в себя эффект протонной губки. В частности, С.Ь. ^айс с1 а1. в публикации Асс1у1аОоп оГ РАМАМ бспбптсгз Гог се11и1аг бсйусгу оГ δίΡΝΑ (ВМС Вю1сс11по1оду, 2009, 9:38) описывают, что частичное ацетилирование остатков первичных аминов снижает как буферную способность дендримеров на основе РАМАМ, так и высвобождение 81РНК.
Катионные полимеры были разработаны также для других применений, отличных от применений в качестве агентов трансфекции для нуклеиновых кислот.
Например, в параграфе 2.2 статьи Ра1 8 с! а1. (СоИоИз апб ЗнгГассз Α: Рйузюосйст. Епд. ЛхрссБ 289, 2006, радсз 183-199) описывается, как катионизировали гликоген включением катионного мономера хлорида №(3-хлор-2-гидроксипропил)триметиламмония в главную цепь полисахарида гликогена. Было обнаружено, что указанный катионный полимер является эффективным в качестве агента флокуляции в суспензиях железной руды.
Известно, что идеальный агент трансфекции должен обеспечивать высокую эффективность трансфекции без необходимости проведения манипуляции с физиологической мишенью; он не должен быть токсичным при эффективной дозе и должен быть биоразрушаемым, чтобы избежать каких-либо продолжительных побочных действий.
Кроме того, агент трансфекции должен быть полимером, должен образовывать частицы размером меньше микрона (т.е. меньше 10-6 м) и предпочтительно должен образовывать наночастицы, так как известно, что размер может ограничить как диффузионную способность комплекса во внеклеточной среде, так и эффективность эндоцитоза/фагоцитоза в клетках.
Наконец, полимерная структура должна содержать аминогруппы и/или атомы азота, характеризующиеся различными величинами рКа. Фактически, аминогруппы с величинами рКа выше, чем величина физиологического рН, облегчают комплексообразование нуклеиновой кислоты при физиологическом значении рН; аминогруппы с величинами рКа около величины эндосомального рН активируют механизм протонной губки и обеспечивают высвобождение комплекса полимер-нуклеиновая кислота в цитоплазму; наконец, четвертичные аммониевые группы обеспечивают комплексообразование и высвобождение из цитоплазматического тельца независимо от величины рН.
- 3 032479
Сущность изобретения
Заявитель обратился к разрешению проблемы разработки новых полимеров, которые можно применять как для доставки активных ингредиентов с низкой молекулярной массой, так и в качестве невирусных векторов для нуклеиновых кислот, и которые могут преодолеть недостатки материалов, известных в предшествующем уровне техники.
Неожиданно заявителем теперь было обнаружено, что гликоген можно модифицировать так, чтобы получить новые катионные производные.
Указанные новые катионные производные гликогена преимущественно характеризуются низкой цитотоксичностью.
Заявитель полагает, что это обусловлено главным образом двумя причинами. Во-первых, гликоген является биосовместимый полимером, который представляет собой продукт метаболизма и хранения Сахаров во всех животных организмах, где он непрерывно продуцируется и разрушается. Кроме того, заявитель полагает, что многочисленные разветвления в гликогене создают структуру стабильной сферической конформации, которая способна селективно уменьшать доступ к катионным зарядам: растворимые молекулы могут диффундировать внутрь полимерной структуры и образовывать комплексные соединения посредством катионных центров, тогда как в противоположность этому, взаимодействия с более сложными структурами не будут больше допускаться по стерическим причинам. Эта сферическая конформация может сделать возможным уменьшение токсичности катионных зарядов, которые обычно повреждают клеточные мембраны.
Заявителем было обнаружено, что новые катионные производные гликогена сохраняют характеристики биосовместимости природного полимера, из которого они получены.
Заявителем также обнаружено, что эти новые катионные производные гликогена способны образовывать комплексы с анионными соединениями, которые имеют размеры и молекулярные массы в широком диапазоне.
Указанные комплексы преимущественно имеют нанометровый размер и не проявляют никакую агрегацию, когда они находятся в растворе, даже при высоких концентрациях.
Заявителем обнаружено, что новые катионные производные гликогена могут доставлять анионные соединения к определенным физиологическим мишеням (например, органам, тканям и клеткам).
Заявителем также обнаружено, что катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению способны проникать в клетки.
Следовательно, указанные новые катионные производные гликогена можно применять для доставки анионных соединений в клетки.
Наконец, заявителем обнаружено, что катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению можно применять в качестве стабилизаторов при хранении белков и ферментов и в качестве соадъювантов при получении вакцин.
Новые катионные производные гликогена предпочтительно содержат заместители, имеющие аминогруппы, характеризующиеся величинами рКа, которые отличаются друг от друга, что способствует как комплексообразованию анионных соединений, так и высвобождению комплексов полимер-анионное соединение из цитоплазматического тельца в цитоплазму.
Новые катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют низкую вязкость и, следовательно, их можно применять в фармацевтических композициях для введения в виде инъекций.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к новым катионным полимерам на основе модифицированного гликогена, в частности настоящее изобретение относится к катионным полимерам на основе гликогена, которые содержат по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а)
в которой группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием или азотсодержащую группу, выбранную из ИН2-(С1-С6)алкила, [Н,Н-ди(С1-Сб)алкиламино]-(С1-Сб)алкила, НН2-{[(С1-С6)алкил]ди(С1-С6)алкиламмонио}-С1-С6)алкила, {[Н,Н-ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио}-(С1-С6)алкила, НН2-[(С1-С6) алкиламино]-(С1-С6)алкила, {[НН-ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкиламино}-(С1-С6)алкила, [три(С1-С6) алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, азоциклил(С1-С6)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (СрС^алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и η равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ъ)
- 4 032479
в которой Κ1 выбран из атома водорода; карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащей группы, выбранной из КН2-(СгС6)алкила, ^^-ди(СгС6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, КН2-[(СгС6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, {|\,\-ди(САС\0алкилам1ино|-(САС’6)алки.1ди(С’|-С’6)алки.1аммонио}-(С1-С6)алкила, КН2-[(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, {|\,\-ди(С/-С’(,)алки.1ам1ино|-(СгС’6) алкиламино}-(С1-С6)алкила, [три (С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидро ксильными группами;
Х1 и Х2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -ΝΗΚ2, у которой Κ2 выбран из атома водорода, (С1-С6)алкила и Н-[ХН-(С1-С6)алкил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и т равно целому числу, которое больше или равно 1;
при условии, что по меньшей мере один из Κ, Κ1, Х1 и Х2 представляет собой азотсодержащую группу, указываемую соответственно, для каждого из Κ, Κ1, Х1 и Х2, и при условии, что указанный катионный полимер на основе гликогена отличается от продукта, полученного реакцией гликогена с хлоридом №(3-хлор-2-гидроксипропил)триметиламмония.
Вышеуказанное выражение при условии, что по меньшей мере один из Κ, Κ1, Х1 и Х2 представляет собой азотсодержащую группу, указываемую соответственно для каждого из Κ, Κ1, Х1 и Х2, означает, что в случае, когда Κ представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для Κ, в случае, когда Κ1 представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для Κ1, в случае, когда Х1 представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для Х1, и в случае, когда Х2 представляет собой азотсодержащую группу, эта группа имеет значения, указанные для Х2.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к комплексу гликогена на основе катионного полимера и анионного соединения.
Согласно предпочтительному варианту, указанное анионное соединение является активным ингредиентом. Указанное анионное соединение преимущественно представляет собой нуклеиновую кислоту.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей комплекс гликогена на основе катионного полимера и анионного соединения и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению комплекса гликогена на основе катионного полимера и анионного соединения для доставки или трансфекции указанного анионного соединения в определенную фармакологическую мишень, например орган, ткань или клетку.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления, указанное анионное соединение является активным ингредиентом. Указанное анионное соединение преимущественно представляет собой нуклеиновую кислоту.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 -8 представлено восемь гелей агарозы, полученных после электрофореза геля, как описано в примере 5. На всех фиг. 1-8 показано, что высевали маркеры 81РНК (*) и ДНК (*), получая при этом соответствующие окрашенные полосы, применяемые для сравнительных целей и проверки функционирования способа электрофореза.
На фиг. 1 представлен гель агарозы, на котором высевали комплексы, полученные из полимера 3 согласно изобретению и 81РНК, при различных концентрациях (от 0,5 до 8 мас.%). Полимер 3, не содержащий нуклеиновую кислоту (0%), применяли в качестве сравнительного образца для проверки того, что катионный полимер согласно данному изобретению не мешает обнаружению пятна, относящегося к 81РНК.
На фиг. 2 представлен гель агарозы, на котором высевали комплексы, полученные из полимера 3 согласно изобретению и 81РНК, при концентрациях от 10 до 20 мас.%; полимер 3, не содержащий нуклеиновую кислоту (0%), в качестве сравнительного образца с целью проверки того, что катионный полимер согласно данному изобретению не мешает обнаружения пятна, относящегося к 81РНК; и полимер 50 (немодифицированный гликоген полглумит™) в качестве сравнительного образца для проверки того, что гликоген, не модифицированный согласно настоящему изобретению, не способен образовывать ком плексы с нуклеиновыми кислотами.
На фиг. 3 представлен гель агарозы, на котором высевали комплексы, полученные из полимера 3
- 5 032479 согласно изобретению и 81РНК, при различных концентрациях (от 30 до 800 мас.%).
На фиг. 4 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 1, 2 и 6 согласно изобретению и 81РНК, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 5 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 10, 14 и 15 согласно изобретению и 81РНК, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 6 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 8, 12 и 16 согласно изобретению и 81РНК, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 7 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 21, 24 и 25 согласно изобретению и 81РНК, при концентрациях 5 и 20 мас.% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 8 представлен гель агарозы, на который высевали комплексы, полученные из полимеров 20, 23 и 28 согласно изобретению и 81РНК, при концентрациях 5 и 20% относительно общей массы каждого полимера.
На фиг. 9 показана кривая титрования для полимеров 2, 3 и 4 согласно изобретению, полученных, как описано в примере 8.
На фиг. 10 показана кривая титрования для полимеров 4 (полимер согласно изобретению) и 18 (сравнительный полимер), полученных, как описано в примере 8.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании и в формуле изобретения, которая представлена ниже, термин катионный полимер означает полимер с общим положительным зарядом при физиологическом значении рН.
В настоящем описании и в формуле изобретения, которая представлена ниже, термин гликоген означает обычно гомополимер глюкозы, характеризующийся высокой степенью разветвленности, у которого мономеры глюкозы связаны посредством а-(1,4)-связей в линейных цепей, в то время как цепи разветвления обычно привиты посредством а-(1,6)-связей, но без ограничения, каждый мономер глюкозы 7-11, как показано в следующей формуле:
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин на основе гликогена применяют для указания того, что полимер содержит структуру гликогена, описанную выше, которая частично модифицирована для получения катионного полимера согласно настоящему изобретению.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин повторяющееся звено означает мономер, который присутствует по меньшей мере один раз в катионном полимере согласно настоящему изобретению.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин (С1С6)алкил означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, например, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, нпентил, втор-пентил, 3-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, втор-гексил или неогексил.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин азоциклил означает 5- или 6-членное ароматическое или алифатическое гетероциклическое кольцо, такое как, например, кольцо пиррола, пирролина, пирролидина, пиридина или пиперидина. Предпочтительно вышеуказанное 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо может содержать по меньшей мере второй гетероатом, выбранный из Ν, О и 8, и представлять собой, например, кольцо диазола, оксазина или тиазина. Предпочтительно, указанное гетероциклическое кольцо представляет собой алифатическое кольцо.
Более предпочтительно гетероциклическое кольцо представляет собой кольцо морфолина или пипиридина.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин комплекс означает продукт, полученный взаимодействием катионного полимера на основе гликогена согласно настоящему изобретению по меньшей мере с одним анионным соединением посредством нековалентных связываний (например, посредством образования электростатических, ионных или ван-дерваальсовых связей, водородных связей и тому подобного).
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлены ниже, термин ак
- 6 032479 тивный ингредиент содержит природные, полусинтетические или синтетические молекулы, которые после введения способны взаимодействовать с биологической функцией клетки или живого организма и, возможно, модифицировать указанную биологическую функцию. Активные ингредиента, которые являются применимыми согласно настоящему изобретению, являются таким образом молекулами с общим отрицательным зарядом, другими словами, анионными молекулами, которые можно применять для лечения, профилактики или диагностики патологического состояния. Указанные анионные молекулы могут быть органическими или неорганическими. Например, они могут быть органическими анионными молекулами и могут иметь низкую молекулярную массу (например, аминокислоты, сульфамиды или витамины) или высокую молекулярную массу (например, вакцины или глюкозаминогликаны, такие как гепарин).
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термин нуклеиновая кислота означает нуклеотидные макромолекулы природного или синтетического происхождения, которые являются двухцепочечными или одноцепочечными и которые имеют общий отрицательный заряд. В частности, этот термин включает в себя олигонуклеотиды, РНК (δΐΡΗΚ, 6§РИК, 8§ΚΝΑ, 8ЙРИК, Ш1РИК, гРНК, йпРИК, тРИК, ΐΡΗΚ, 8пРИК, пре-тРИК, каталитическую РНК, антисмысловую РНК), ДНК (сДНК, т!ДИК, §§ДИК, бзДИК, антисмысловую ДНК, плазмиднную ДНК).
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, выражения доставка активного ингредиента и доставление активного ингредиента означает перенос активного ингредиента в виде комплекса с катионным полимером согласно настоящему изобретению к конкретной физиологической мишени, например ткани или органу.
Для целей настоящего описания и формулы изобретения, которая представлена ниже, термины трансфекция и трансфицирование означает введение последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, в частности в цитоплазму и/или ядро.
В частности, настоящее изобретение относится к катионному полимеру на основе гликогена, содержащему по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а)
(а) в которой группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из N 12-(С|-С6)аэкила, [Н^ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, NИ2-[(С1-С6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, !|М^ди(С.^С6)аэкиэа\1и11о|-(С.^С6)аэкиэди(С^С6)аэкиэа\1\1о11ио!-(С|-С6)аэкиэа, N^-[^1-^) алкиламино]-(С1-С6)алкила, {[Ν, ^ди^-СДалкиламиноХСгСДалкиламино^СгСДалкила, [три (С1С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, азоциклил-(С1-С6)алкила, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одним или несколькими гидроксиль ными группами;
п равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь)
в которой К1 выбран из атома водорода; карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащей группы, выбранной из NИ2-(С1-С6)алкила, [Н^ди^-С^алкиламиноН^-С^алкила, N^-[(01-0^0килди(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, {[Н^ди^-СДалкиламиноНСгС^алкилди^-СДалкиламмонио}-(С1-С6)алкила, NИ2-[(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, {^^-ди^-СДалкиламиноНСгСД алкиламино}-(С1-С6)алкила, [три(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидро ксильными группами;
Х1 и Х2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -ΝΙ1К2, у которой К2 выбран из атома водорода, (С1-С6)алкила и Н-^И-(СгС6)алкил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и т равно целому числу, которое больше или равно 1;
при условии, что по меньшей мере один из К, К1, Х1 и Х2 представляет собой азотсодержащую группу, как указано соответственно для каждого из К, К1, Х1 и Х2, и при условии, что указанный катионный полимер на основе гликогена отличается от продукта, по
- 7 032479 лученного реакцией гликогена с хлоридом М-(3-хлор-2-гидроксипропил)триметиламмония, как описано в частности в параграфе 2.2 статьи Ра1 8 с1 а1. (Со11о1б§ апб 8пгГасс5 А: Рйуысосйет. Епд. АкресЦ 289, 2006, радек 193-199).
Группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, предпочтительно представляют собой атом водорода;
карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из [Ν,Ν-диЩ-СЛалкиламино] -(С1 -С3)алкила, {[Ν,Ν-диЩ -С3)алкиламино] -(С1 -С3)алкилди(С1 -С3)алкиламмонио}-(С1 -С3) алкила, {Щ,№ди(С1-С3)алкиламино]-(С1-С3)алкиламино}-(С1-С3)алкила или [три(С1-С3)алкиламмонио](С1-С3)алкила, азоциклил-(С1-С3)алкила, у которых (С1-С3)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
Гетероциклическое кольцо, содержащее по меньшей мере один атом N и представленное термином азоциклил, является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, таким как, например, кольцо пиррола, пирролина, пирролидина, пиридина или пиперидина. Указанное 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо преимущественно содержит по меньшей мере второй гетероатом, выбранный из Ν, О и 8, и представлено, например, кольцом оксадиазола, оксазина и тиазина. Указанное гетероциклическое кольцо предпочтительно является циклоалифатическим. Еще более предпочтительно, указанное гетероциклическое кольцо является кольцом морфолина или пиперидина.
Более предпочтительно, группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из Ν,Ν-диметиламиноэтила, Ν,Ν-диметиламинопропила, Ν,Ν-диэтиламиноэтила, [(Ν,Ν-диметиламиноэтил) диметиламмонио]этила, [Щ,№диметиламинопропил)диметиламмонио]пропила, [(Ν,Ν-диэтиламиноэтил) диэтиламмонио]этила, [триметиламмонио]-2-гидроксипропила, пиперидил-№этила или морфолинил-Νэтила.
К1 предпочтительно представляет собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу выбранную из Щ^-ди(С1-С3)-алкиламино]-(С1-С3)алкила, {[Ν,Ν-диЩ-СЭалкиламино] -(С1 -С3)алкилди(С1 -С3)алкиламмонио } -(С1 -С3)алкила, {[Ν,Ν-диЩ -С3)алкиламино] -(С1 -С3)алкиламино}-(С1-С3)алкила, или [три(С1-С3)алкиламмонио]-(С1-С3)алкила, у которых (С1-С3)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
Более предпочтительно Κι представляет собой атом водорода или карбоксиметильную группу.
Χι и Х2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ΝΗΚ2, в котором К2 представляет собой атом водорода или Н-[NΗ-(С1-С4)алкил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С4)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными.
Указанная группа Н-[NΗ-(С1-С4)алкил]р- предпочтительно представляет собой полиэтиленимин с молекулярной массой от 50 до 3000 Да и более предпочтительно с молекулярной массой от 1000 до 2300 Да, спермин (Н^(СН2)3ОТ(СН2)41МН(СН2)3]МН2) или спермидин (Η2Ν^Η2)4ΝΗ^Η2)4ΝΗ2).
Примерами фармацевтически приемлемых органических оснований являются трометамин, лизин, аргинин, глицин, аланин, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, пропиламин, дипропиламин, трипропиламин, этилендиамин, моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, гуанидин, морфолин, пиперидин, пирролидин, пиперазин, 1-бутилпиперидин, 1-этил-2-метилпиперидин, Ν-метилпиперазин, 1,4-диметилпиперазин, Ν-бензилфенэтиламин, Ν-метилглюкозамин и трис(гидроксиметил)аминометан.
Примерами фармацевтически приемлемых неорганических оснований являются гидроксиды или карбонаты щелочных металлов или щелочноземельных металлов, такие как, например, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид кальция, карбонат натрия, карбонат калия и карбонат кальция.
Указанные повторяющиеся звенья (а) и (Ь) преимущественно расположены произвольно в цепях гликогена.
Примеры повторяющихся звеньев (а) и (Ь) представлены соответственно в таблицах А и В, приведенных ниже.
- 8 032479
Таблица А. Примеры повторяющихся звеньев (а)
Положение заместителя Заместитель Повторяющееся звено формулы (а)
6 Ν,Ν-диэтиламиноэтил г сн2
н<Т он
Н3С\ /СН3 N
6 Ν,Ν-диметиламиноэтил Г от 9Н2
4 он от
сн3 1
ί 1 /Ν\ сн3
6 Ν,Ν-диметиламинопропил г от сн2
но-[ 4 ОТ^Н
Н3СТ ΧΝ'Χ^ΟΗ3 )
6 [(Ν,Ν-диэтиламиноэтил)диэтиламмонио]этил но^ л. Н,С N ^0 сн2 он 'Х'ХСН3 ОТ—|— н
сн, 1
ОТ'ОТн
6 [(Ν,Ν-диметиламинопропил)диметиламмонио]пропил НЧ\1 / сн2 от Чн3
но-}) от он от п
Н3С \ /СНз
6 [(Ν,Ν-диметиламиноэтил)диметиламмонио]этил ноИ Н3С. βθΗ3 ОТ 2 от сн2 - ОТ”^°\ ^ОТон η ОТ1 Ото—ι Η
он п
- 9 032479
6 [триметиламмонио]-2гидроксипропил СН3 НзС\Ь ^ОН /О сн2 ноф<ТЁ°Х=-Р он п
2 [триметиламмонио]-2гидроксипропил ^он СНз Н3С \ СНз
6 [(Ν,Ν-диметиламинопропил) диметиламмонио]пропил сн, 1 А ^0Η3 ''''СНз
2 Ν,Ν-диметиламинопропил Г ^0 СН2 /Ν
6 [(Ν,Ν-диэтиламиноэтил) диэтиламмонио]этил Нзс СН3 Η,Ο^Χ'Ν^^ΟΗ.,
2,3 Ν,Ν-диэтиламиноэтил г /О сн2 О О п / Α--, г\ Ϊ он- НзС / ^СН3 НзС
3 Ν,Ν-диметиламиноэтил /ОН сн2 О п сн3
6 3 Ν,Ν-диметиламиноэтил Ν,Ν-диэтиламиноэтил н3с. сн3 л /О сн2 С< ОН>^ Ί Η0-η_ \ Ιχ^^ο—к-н к
- 10 032479
6 карбоксиметил но-р он Λ
6 натриевая соль карбоксиметила но^ 9 №+ А /О сн2 Α>χ н он п
6 триметиламмонио-2гидроксипропил / (ХХн сн, I 2
3 Ν,Ν-диэтиламиноэтил ко-р N
6 [триметиламмонио]-2гидроксипропил £ ^0 сн2 ХЭ'4 X
3 [(Ν,Ν-диэтиламиноэтил) диэтиламмонио]этил НО''''”
6 Ν,Ν-диметиламинопропил сн. 1 X
1 /О сн. /1---О
2 карбоксиметил но'] XX X
6 [(Ν,Ν-диметиламинопропил) диметиламмонио]пропил сн. 1 /\н3 н+Х
3 натриевая соль карбоксиметила «гр Ыа+ ] О X ^0
- 11 032479
6 2 карбоксиметил [триметиламмонио]пропил А /О Ыо 4 ’ Η3°/|Χ4°Η3 СН3
2 Ν,Ν-диэтиламиноэтил с<0Н ° ч п II Ын ° ы ^-сн3
3 натриевая соль карбоксиметила
6 Ν-этилпиперидил О он п
6 Ν-этилморфолинил О N а он п
Таблица В. Примеры повторяющихся звеньев (Ь)
Положение заместителя Заместитель Повторяющееся звено формулы (Ь)
2 Спермин /он .χ>·+· ОН ΝΗ νη^^^~νη
2,3 Спермин ^он сн2 Х++ ^-ΝΗ ΝΗ - Ы 5 / ΝΗ
2 Тетраэтиленпентамин /°Н сн2 но-Еу ЧТН ОН ΝΗ > ΗΝ \ ΝΗ
2,3 Тетраэтиленпентамин /он сн2 „Х>А ^-ΝΗ ΝΗ /Ч
- 12 032479
6 Карбоксиметил он Λ сн2 ХОТ ОН ΝΗ ΗΝ \
2 Тетраэтиленпентамин
6 Карбоксиметил X /О сн2 „..Ототру _^ΝΗ ΝΗ ... у 5 / ΝΗ ХОТ^/ ΝΗ ΝΗ
2,3 Спермин
2 Полиэтиленимин (мол. масса = 1300 Да) Хуу Ν \ ОТн2
3 Полиэтиленимин (мол. масса = 2000 Да) хои ОТОТ- Ν4 ОТОТ ^-от ОТМН 1
2 Полиэтиленимин он А /° сн2 ОН ОТн2
6 Карбоксиметил
2 Полиэтиленимин /у· ОТн2
6 Ν,Ν-диэтиламиноэтил
Согласно предпочтительному варианту осуществления указанные повторяющиеся звенья (а) и (Ъ) содержат по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способны ионизироваться при физиологическом значении рН и которая облегчает комплексообразование указанного анионного соединения, и по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая является ионизируемой при значении рН ниже физиологического значения рН и которая облегчает высвобождение комплекса из цитоплазматических телец.
Указанные азотсодержащие группы, которые способны ионизироваться при физиологическом значении рН, предпочтительно присутствуют в числовых процентах от 1 до 30% относительно общего числа
- 13 032479 гидроксильных групп в гликогене, применяемом для получения катионных полимеров согласно настоящему изобретению.
Указанные азотсодержащие группы, которые способны ионизироваться при значении рН, которое ниже значения физиологического рН, предпочтительно присутствуют в числовых процентах от 0,1 до 10% относительно общего числа гидроксильных групп в гликогене, применяемом для получения катионных полимеров согласно настоящему изобретению.
Для целей настоящего изобретения указанными азотсодержащими группами, которые способны ионизироваться при физиологическом значении рН, являются МН2-(С1-С6)алкил, [М,М-ди(С1-С6)алкиламино] -(С1 -С6)алкил, МН2-[(С1 -С6)алкиламино] -(С-С6)алкил, {[Ν,Ν-ди^ -С6)алкиламино] -(С1 -С6)алкиламино}-(С1-С6)алкил и азоциклил-(С1-С6)алкил.
Указанными азотсодержащими группами, которые способны ионизироваться при значении рН, которое ниже значения физиологического рН, преимущественно являются NН2-{[(С1-Сз)алкил]ди(С1-С6) алкиламмонио } -(С1 -С6)алкил и {[Ν,Ν-ди(С1 -С6)алкиламино] -(С1 -С3)алкилди(С1 -С6)алкиламмонио }-(С1 С6)алкил.
Новые катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению преимущественно имеют низкую вязкость и, следовательно, их можно применять в фармацевтических композициях для введения в виде инъекций. В частности, новые катионные производные гликогена согласно настоящему изобретению имеют вязкость менее 10 мПа и предпочтительно менее 5 мПа, измеренную при концентрации 1% в РВ8 ротационным вискозиметром.
Гликоген, применяемый для получения катионных полимеров согласно настоящему изобретению, можно получать по одному из методов, известных в данной области.
Гликоген предпочтительно получают, как описано в международной патентной заявке \¥О 94/03502.
Указанный гликоген предпочтительно получают из видов Муй1и8 сйиЙ5 и МуШик да11орго\'тс1а115.
Другие источники гликогена, которые можно применять для целей настоящего изобретения, включают в себя моллюски, такие как устрицы и Сгер|йн1а £огшса1а, и богатые гликогеном органы позвоночных животных, такие как печень и мышцы.
Указанный гликоген, по существу, предпочтительно не содержит азотсодержащие соединения и редуцирующие сахара. Применяемое в настоящем описании и в формуле изобретения, представленной ниже, выражение по существу не содержит азотсодержащие соединения и редуцирующие сахара, означает, что содержание азота составляет менее 60 частей на миллион, измеренное при помощи метода Кьельдаля, и содержание редуцирующих сахаров составляет меньше 0,25%, измеренное при помощи метода Ε.Ό. 8ие11 анй 8ие11 (Со1ог1ше1пс Ме11юЙ5 о£ Апа1у818, Νο\ν Уогк, 1954, νοί. III, р. 204).
Гликоген, применяемый согласно настоящему изобретению, предпочтительно характеризуется также содержанием углерода от приблизительно 44% до приблизительно 45%, молекулярной массой приблизительно (2,5±0,1)х106 дальтон и вращением плоскости поляризации света (а)с 20 197±2,0 (с=1, в воде).
Более предпочтительно гликоген, применяемый согласно настоящему изобретению, является гликогеном полглумит™, изготовленным А/1енйе Сйншсйе Вшпйе Апдейт Ргаисексо Л.С.В.Л.Е.8.р.Л.
Специалист в данной области техники легко поймет, что настоящее изобретение по существу не относится к новым классам соединений с терапевтической эффективностью. Вернее, настоящее изобретение относится к применению катионного полимера на основе гликогена, описываемого ранее, для получения комплекса по меньшей мере с одним анионным соединением.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к комплексу катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения, в котором указанный катионный полимер на основе гликогена содержит по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев (а) и (Ь), описанных ранее.
Указанное анионное соединение предпочтительно является органическим или неорганическим соединением с низкой молекулярной массой или высокой молекулярной массой.
Более предпочтительно, указанное анионное соединение представляет собой активный ингредиент, относящийся, например, к одному из следующих классов активных ингредиентов: противоинфекционных агентов, например, антибиотиков и противовирусных средств; аналгетических средств; средств, снижающих аппетит; антигельминтных средств; противоастматических средств; противосудорожных средств; антидепрессантов; противодиабетических средств; антидиаррейных средств; антигистаминных средств; противовоспалительных средств; средств против мигрени; противорвотных агентов; противоопухолевых средств; средств против болезни Паркинсона; противозудных агентов; антипсихотических агентов; жаропонижающих средств; смазмолитических средств; антихолинергических средств; симпатомиметиков; производных ксантина; лекарственных средств для сердечнососудистой системы, например блокаторов калиевых, кальциевых каналов, бета-блокаторов, альфа-блокаторов и антиаритмических средств; гипотензивных средств; диуретиков и антидиуретиков; вазодилаторов центрального и периферического действия; стимуляторов центральной нервной системы; сосудосуживающих средств; противо- 14 032479 кашлевых средств; противоотечных средств; гормонов; снотворных средств; иммунодепрессантов; миорелаксантов; парасимпатолитиков; психостимуляторов; седативных средств; транквилизаторов.
Согласно предпочтительному варианту осуществления указанное анионное соединение представляет собой нуклеиновую кислоту.
Указанную нуклеиновую кислоту предпочтительно выбирают из олигонуклеотидов, РНК (81РНК, бкРНК, 88РНК, δΚΚΝΑ, тРНК, гРНК, ЬпРНК, тРНК, 1РНК. впРНК, пре-тРНК, каталитической РНК, антисмысловой РНК) и ДНК (сДНК, т1ДНК, 8§ДНК, бкДНК, антисмысловой ДНК, плазмидной ДНК).
Заявителем было обнаружено, что указанный комплекс способен образовывать нанометровые частицы со средним диаметром (Ζ) между 1 и 200 нм, предпочтительно между 20 и 100 нм и более предпочтительно между 30 и 50 нм.
Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве от 5 до 60 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
Указанный комплекс предпочтительно содержит указанное анионное соединение в количестве от 10 до 50 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
Указанный комплекс более предпочтительно содержит указанное анионное соединение в количестве от 10 до 30 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
Комплекс катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения можно преимущественно получить в виде фармацевтической композиции.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей комплекс катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, причем указанный катионный полимер на основе гликогена содержит по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев (а) и (б), описанных ранее.
В одном предпочтительном варианте осуществления указанное анионное соединение представляет собой нуклеиновую кислоту.
Термин эксципиент означает любой агент, известный в данной области техники, который является подходящим для получения фармацевтической формы.
Примерами эксципиентов, которые являются пригодными согласно настоящему изобретению, являются консерванты, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества, соли, регулирующие осмотическое давление, эмульгаторы, подсластители, корригенты, красители и тому подобное.
Указанную фармацевтическую композицию можно получить в виде дозированной лекарственной формы согласно способам, известным в данной области.
Указанная фармацевтическая композиция предпочтительно предназначена для инъекционного применения, например, в форме водного раствора, суспензии или эмульсии, или она может быть в форме порошка, который пересоздают с целью приготовления водного раствора, суспензии или эмульсии для внутривенного, внутримышечного, подкожного, чрескожного или внутрибрюшинного введение.
Альтернативно, указанная фармацевтическая композиция может быть, например, в форме таблеток, капсул, таблеток, покрытых оболочкой, гранул, растворов и сиропов для перорального введения; содержащих лекарственное средство пластырей, растворов, паст, кремов или помады для чрескожного введения; суппозиториев для ректального введения; стерильного раствора для аэрозольного введения; для немедленного и пролонгированного высвобождения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению комплекса катионного полимера на основе гликогена и анионного соединения, для доставки или переноса указанного анионного соединения к определенной фармакологической мишени, например органу, ткани или клетке, причем указанный катионный полимер на основе гликогена содержит по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев (а) и (б), описанных ранее.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, указанное анионное соединение является активным ингредиентом. Указанное анионное соединение преимущественно представляет собой нуклеиновую кислоту. Указанной фармакологической мишенью преимущественно является клетка.
В предпочтительном варианте осуществления катионный полимер на основе гликогена согласно настоящему изобретению может быть конъюгирован, непосредственно или посредством спейсера, с направляющей группы, которая способна связываться очень специфическим образом с мишенью, присутствующей на поверхности клетки и облегчить поглощение комплекса определенной клеткой (например, опухолевыми клетками, клетками печени, кроветворными клетками и тому подобными клетками).
Направляющую группу можно также применять для направления катионного полимера к компартменту клетки (например, ядру, митохондрию и тому подобному компартменту).
Направляющие группы можно выбрать, например, из фолиевой кислоты, моносахаридов, олигосахаридов, пептидов, белков и олигомеров гиалуроновой кислоты.
Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, однако, без ограничения его никоим образом.
- 15 032479
Примеры
Пример 1. Получение катионных полимеров на основе гликогена, содержащих звено (а).
(ί) Синтез катионных полимеров на основе гликогена, содержащих азотсодержащие группы 10 г гликогена полглумит™ (61,73 ммоль глюкозы) растворяли в 124 мл 1 н ΝοΟΗ (для синтеза продуктов 17, 9-11 и 13-15) или 2н. ΝοΟΗ (для синтеза продуктов 8, 12 и 16) в двугорлой круглодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником. После того, как растворение было завершено, смесь нагревали до 70°С и перемешивали в течение 2 ч.
В зависимости от желаемого продукта, добавляли один из следующих реагентов от (I) до (VI) в количествах (выраженных как ммоль реагента), представленных в табл. 1:
(ί) гидрохлорид 2-хлор-Н^диэтилэтиленамина;
(ϊϊ) гидрохлорид 3-хлор-Н^диметилпропиламина;
(Ш) гидрохлорид 2-хлор-Н№диметилэтиламина;
(ίν) раствор 60 масс.% хлорида 3-хлор-2-гидроксипропилтриметиламмония в Η2Ο;
(ν) 1-(2-хлорэтил)пиперидин и (νι) 4-(2-хлорэтил)морфолин.
Смесь перемешивали при 70°С в течение ночи.
На следующий день нагревание прекращали и смеси давали возможность охладиться до комнатной температуры. Неочищенный продукт реакции затем медленно выливали в 400 мл ацетона. После того, как добавление было закончено, полученную суспензию перемешивали в течение приблизительно 30 мин. После прекращения перемешивания смесь оставляли для осаждения до тех пор, пока не достигалось разделение супернатанта и осадка.
Супернатант выгружали и полученный осадок дважды промывали ацетоном (200 мл). Полученное таким образом твердое вещество отфильтровывали, растворяли в 200 мл дистиллированной воды, регулировали рН до нейтрального значения 1н. раствором НС1 и, наконец, подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величина 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
Выходы продуктов синтеза приводятся ниже в табл.1.
Таблица 1
Класс № полимера Реагент Ммоль реагента Выход в % (масс./масс.)
Диэтиламиноэтил- (ΏΕΑΕ)гликоген 1 (1) 2, 65 82
2 (1) 15, 43 80
3 (1) 30, 87 80
4 (1) 61,73 82
Диметиламинопропил- (ϋΜΑΡ)гликоген 5 (ϋ) 15, 43 82
6 (ϋ) 30, 87 83
7 (ϋ) 61,73 80
8 (ϋ) 123,46 82
Диметиламиноэтил- (ΏΜΑΕ)гликоген 9 (ίίί) 15, 43 81
10 (ίίί) 30, 87 80
11 (ίϋ) 61,73 83
12 (ίϋ) 123,46 80
2-Гидроксипропилтриметиламмоний (2-ОН-РТМА)гликоген 13 (ίν) 15, 43 83
14 (ίν) 30, 87 84
15 (ίν) 61,73 82
16 (ίν) 123,46 84
Гетероциклическое производное гликогена 40 (V) 30, 87 83
41 (νί) 30, 87 80
Посредством описанного метода были получены катионные полимеры 1-16 и 40-41, имеющие структуры, показанные ниже в табл. 2.
В представленных структурах аббревиатура С1и означает, что полимерная цепь может продолжаться повторяющимися звеньями немодифицированной глюкозы или повторяющимися звеньями со
- 16 032479 гласно настоящему изобретению. Кроме того, для облегчения визуализации не представлены разветвления и заместители представлены только в положении 6 и на разных повторяющихся звеньях.
Специалист в данной области техники легко поймет, что тоже самое повторяющееся звено может содержать от одного до трех заместителей, которые могут быть одинаковыми или разными, и что эти заместители могут независимо присутствовать в положениях 2, 3 и/или 6.
Таблица 2 (ΏΕΑΕ) гликоген (ШАР) гликоген (ШАЕ) гликоген
РТМА)(мультиплет) гликоген (мультиплет Н аномерный)
2-6, 2
(мультиплет 0Н3) 3,2-4,6 (мультиплет) 5, 2-6, 1 (мультиплет) (мультиплет 0Н3) 2,8-4,6 (мультиплет)
5, 2-6, 1 (мультиплету (мультиплет),
5, 2-6, 1 (мультиплет Н аномерный) (мультиплет), 5, 2-6, 1 (мультиплет Н аномерный) (мультиплет) (мультиплет Н аномерный)
Гетероциклическое производное гликогена
δ м.д.: 1,65-
2,35 (мультиплет),
2.6- 3,15 (мультиплет),
3,55-4,45 (мультиплет),
5,2-5,15 (мультиплет Н аномерный) δ м.д.: 2,8-
3, 1 (мультиплет),
3.6- 4,45 (мультиплет),
5, 2-6, 1 (мультиплет Н аномерный) (ΐΐ) Синтез катионных полимеров на основе гликогена, содержащих азотсодержащие группы и карбоксиметильные группы.
Гликоген полглумит™, содержащий по меньшей мере одну карбоксиметильную группу (гликоген
- 17 032479
СМ), синтезировали, как описано ниже.
9,57 г (59,07 ммоль глюкозы) безводного гликогена полглумит™, высушенного заранее в сушильном шкафу при 60°С в вакууме до постоянной массы, помещали в двугорлую круглодонную колбу, которая снабжена магнитной мешалкой и через которую пропускали поток азота, и растворяли в 200 мл безводного диметилсульфоксида. После того как растворение было завершено, добавляли гидрид натрия в количествах, указанных в табл.3, и смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее добавляли хлорацетат натрия в количествах, приведенных в табл.3, и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре.
На следующий день смесь медленно выливали в ацетон (800 мл) и полученную суспензию перемешивают в течение приблизительно 30 мин. Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (400 мл), снова отфильтровывали и растворяли в дистиллированной воде (200 мл). Полученный раствор подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величина 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
Степень превращения в производные (дериватизации) (1)1)), означающая число молекул глюкозы, превращенных в производное карбоксиметильной группой на 100 мономеров глюкозы, определяли способом ИК-спектроскопии, путем построения калибровочной кривой смесей, содержащих известный титр гликогена полглумит™ и ацетата натрия.
Таблица 3
Гликоген- СМ Ммоль ЫаН Ммоль С1СН2СООЫа Выход в % (масс./масс.) ϋϋ
100 5, 91 6, 50 83 1
101 11,82 13, 00 80 14
102 17,72 19,49 78 22
103 23, 63 25, 99 75 32
104 29, 54 32,49 74 39
Полученный таким образом гликоген-МС применяли в последующих синтезах для получения катионных полимеров, содержащих азотсодержащие группы.
В частности, были синтезированы гликогены-СМ, содержащие диэтиламиноэтильные (ΌΕΑΕгликоген-СМ) и 2-гидроксипропилтриметиламмониевые (2-ОН-РТМА-гликоген-СМ) группы.
ΌΕΑΕ-гликоген-СМ г продукта 103 растворяли в 10,8 мл 1 н ΝαΟΙ I в двугорлой круглодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником, и нагревали при 70°С в течение 2 ч.
Добавляли 0,929 г гидрохлорида 2-хлор-ХА-диэтилэтиламина (5,4 ммоль) и смесь перемешивали в течение ночи при 70°С.
На следующий день нагревание прекращали и смеси давали возможность охладиться до комнатной температуры. Неочищенный продукт реакции затем медленно выливали в 100 мл ацетона. В конце добавления полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин.
Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (100 мл), растворяли в 50 мл дистиллированной воды, рН регулировали до 6,5-7 при помощи 1 н хлористо-водородной кислоты и, наконец, подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
2-ОН-РТМА-гликоген-СМ
2,5 г продукта 103 растворяли в 27 мл 1н. ΝαΟΙ I в двугорлой круглодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником, и нагревали при 70°С в течение 2 ч.
Затем добавляли раствор хлорида 3-хлор-2-гидроксипропилметиламмония (60 мас.% раствор в Н2О, 8,1 ммоль) и смесь перемешивали при 70°С в течение ночи.
На следующий день нагревание прекращали и смеси давали возможность охладиться до комнатной температуры. Неочищенный продукт реакции затем медленно выливали в 80 мл ацетона.
Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (80 мл), растворяли в 50 мл дистиллированной воды и подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм, концентрировали в вакууме и, наконец, сушили вымораживанием.
Катионные полимеры 17 и 19, полученные с помощью описанных способов, указаны ниже в табл. 4.
Для облегчения визуализации не показаны разветвления и заместители показаны только в положе
- 18 032479 нии 6 и на разных повторяющихся звеньях. В показанных структурах аббревиатура С1и означает, что полимерная цепь может продолжаться повторяющимися звеньями немодифицированной глюкозы или повторяющимися звеньями согласно настоящему изобретению.
Специалист в данной области техники легко поймет, что одно и то же повторяющееся звено может содержать от одного до трех заместителей, которые могут быть одинаковыми или разными, и что эти заместители могут независимо присутствовать в положениях 2, 3 и/или 6 одного и того же повторяющегося звена.
Таблица 4
Класс Структурная формула № полимера τΗ-ΗΜΡ
ΏΕΑΕ- н3с—ч 17 δ м.д.: 1,25
гликоген- СН3 о № 1 лх /—' СН3 Η3Ο^Ν< 1,75
СМ Н3С н2(ОТ ^о з (мультиплет), 3-
О1и- О--СН2 СН2 /О н2ОТ /О н2с 4, 65
3---о У---°\ -1 Г—°\ (мультиплет) ,
ОТон />-3 °н <он ТотД ГОТЪн
О1и— -С —IV он 1 п он 1 П он 1— у О------С1и он -1п 5, 5-6, 15
(мультиплет Н
аномерный)
2-ОН- I 19 δ м.д.: 3,4-4, , 65
С1- 1+/ о- №
ΡΤΜΆ- г X 1 (мультиплет)
гликоген- Λ чон н2с Хо 5, 25-6,20
СМ С1и о—сн2 сн2 он Н2С н2с/° (мультиплет Н
У---о г— У---О.
ОТон ГОТон X. ПОТ он 1 ПОТ °н х аномерный)
С1и ( О—С(31и
он он он он -!п
Пример 2. Получение катионных полимеров на основе гликогена, содержащих звено (Ь).
Г ликоген полглумит™ окисляли периодатом калия согласно следующему методу.
г гликогена полглумит™ (123,46 ммоль глюкозы) растворяли в 400 мл дистиллированной воды в темной стеклянной колбе. Добавляли периодат калия в количествах, приведенных в таблице 5 (указаны в ммоль реагента) и смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре.
Реакцию останавливали добавлением избытка этиленгликоля (26 мл) с продолжением перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре.
Смесь подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Затем смесь фильтровали через фильтр 0,45 мкм и сушили вымораживанием.
Затем степень окисления (% окисленных мономеров глюкозы) определяли титрованием 0,1 н №ОН хлористоводородной кислоты, выделяемой в результате реакции между гидрохлоридом гидроксиламина и свободными альдегидными группами, присутствующими на различных углеводах. Реакция приводится ниже:
Гликоген- (СН=О) ζ+ζ *Н2Ы-ОН^НС1=гликоген- (СН=Ы-ОН) ζ+ζ * Н2О+ζ *НС1.
Процент окисленных мономеров определяли посредством следующей формулы:
в которой
V = мл ΝαΟΗ;
N = нормальность ΝαΟΙ I:
= мг безводного образца;
162 = молекулярная масса повторяющегося звена глюкозы.
Таблица 5
Окисленный гликоген Ммоль КЮ4 Выход в % (масс./масс.) ΌΌ
200 б, 17 88 5
201 12,35 87 10
202 24, 69 88 18
Окисленный гликоген полглумит™, полученный таким образом, подвергали взаимодействию с одним из указанных ниже реагентов (νΐΙ)-(Χ), применяемых в количествах, (указаны в ммоль реагента), приведенных в табл. 6.
(VII) Спермин (Р1ика, ссылка № 85590);
(VIII) тетраэтиленпентамин (Р1ика, ссылка № 15652843);
- 19 032479 (IX) раствор полиэтиленимина с мол. массой 1300 при концентрации его 50 масс.% в воде (А1йпсй, ссылка 482595);
(X) раствор полиэтиленимина с мол. массой 2000 при концентрации его 50 мас.% в воде (А1йпсй, 408700).
Производные синтезировали согласно следующему общему методу.
г окисленного гликогена полглумит™ растворяли в 200 мл боратного буфера при рН 8,5 в трехгорлой круглодонной колбе, снабженной механической мешалкой (модель 1КА ЬаЬог1есйтк). Амин растворяли в 40 мл боратного буфера, медленно добавляли в реакционную колбу и смесь перемешивали механически при комнатной температуре.
Спустя 4 ч добавляли борогидрид натрия (473 мг; 12,5 ммоль) и смесь перемешивали механически в течение ночи при комнатной температуре.
На следующий день неочищенный продукт реакции медленно выливали в 400 мл ацетона и полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин. Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (400 мл), снова отфильтровывали и растворяли в дистиллированной воде (100 мл). Раствор нейтрализовали 1н. НС1 и подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды до тех пор, пока проводимость не была постоянной (равной приблизительно 2-3 мкСм). Полученный раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм и, наконец, сушили вымораживанием.
Таблица 6
№ Исходный окисленный гликоген Реагент Ммоль реагента Выход в % (масс./масс. )
20 200 VII 0, 60 69
21 200 IX 0, 48 84
22 200 X 0, 31 70
23 201 VII 0, 60 65
24 201 VIII 0, 41 70
25 201 VIII 0, 83 44
26 201 IX 0, 48 83
27 201 X 0, 31 87
28 202 VII 1,20 24
29 202 IX 0, 48 95
30 202 IX 0, 96 98
Катионные полимеры 20-30, полученные с помощью описанных методов, показаны ниже в таблице 7. В показанных структурах, аббревиатура С1и означает, что полимерная цепь может продолжаться повторяющимися звеньями немодифицированной глюкозы или повторяющимися звеньями согласно настоящему изобретению. Для облегчения визуализации разветвления не показаны и заместители показаны на различных повторяющихся звеньях.
- 20 032479
Пример 3. Определение степени превращения в производные (дериватизации) (ИИ) катионных полимеров, содержащих повторяющиеся звенья типа (а).
Степень дериватизации относительно числа азотсодержащих групп, присутствующих в полимерах, содержащих повторяющиеся звенья (а), вычисляли превращением аминогрупп в соответствующие гидрохлориды и определением количества ионов галогена, присутствующих либо на аминогруппах, либо на четвертичных аммониевых группах.
Такую же процедуру применяли для гидрохлорида ИЕЛЕ-декстрана (коммерческий продукт гидрохлорид ИЕЛЕ-декстрана, 81§ша, ссылка № Ώ9885), используемого в качестве сравнительного продукта.
Количество ионов галогена определяли на массу сухого полимера, полученную путем вычитания содержания воды, определенного посредством метода Карла Фишера.
г производного амина растворяли в 10 мл дистиллированной воды. После завершения растворения добавляли 10 мл 1н. хлористо-водородной кислоты и смесь перемешивали в течение 30 мин. После того, как перемешивание было завершено, смесь выливали в ацетон (100 мл). Полученное твердое вещество отфильтровывали, дважды промывали ацетоном (100 мл) и сушили в сушильном шкафу при 60°С в вакууме.
Количество ионов галогена выражали в массовых процентах, то есть как массу ионов галогена на 100 г катионного полимера.
Для целей определения считали, что каждый атом азота является независимо замещенным.
Степень образования производных (дериватизации) вычисляли по уравнению, приведенному ниже.
/)/) =
Н./.(масса гидратированного образи,а)*100*М\Л/(гидрохлорид мономера) 45 /з
100 - %Нт.О
ДД = степень дериватизации;
Н.1. = граммы ионов галогена на 100 г гидратированного образца;
МА = молекулярная масса мономера, замещенного одной группой гидрохлорида алкиламина; 35,45 = молекулярная масса хлора.
Полученные результаты представлены ниже в табл. 8.
Таблица 8
(*) Сравнительный полимер: ИЕЛЕ-декстран.
Влияние степени дериватизации и функциональной группы изучали как функцию двух рабочих параметров, (ί) тенденции к агрегации, которая должна быть минимизирована; и (и) емкости заряда, которая должна быть максимизирована.
Пример 4. Измерение динамического рассеяния света (ИБ8).
Исследования динамического рассеяния света применяли для изучения тенденции к агрегации катионных полимеров.
Исследования динамического рассеяния света проводили, как указано ниже, на катионных полимерах на основе гликогена полглумит™, полученных, как описано в примере 1, и на соответствующих комплексах с 81РНК (1пу11го§еп, ссылка поставщика № 1299001), полученных при различных массовых процентных отношениях НРНК/полимер.
- 21 032479
Для изучений рассеяния света получали следующие растворы:
раствор 1: исходный раствор 0,1 мг/мл 81РИК в ЗФР, не содержащем рибонуклеазу;
раствор 2: исходные растворы различных катионных полимеров при концентрации 0,2 мг/мл в ЗФР без рибонуклеазы, отфильтрованные через стерильные фильтры 0,22 мкм;
раствор 3: раствор ЗФР без рибонуклеазы, отфильтрованный через стерильный фильтр 0,22 мкм.
Аббревиатура ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) означает стандартный, забуференный фосфатом физиологический раствор с рН 7,4, содержащий водный физиологический раствор 8 г/л хлорида натрия, 1,78 г/л фосфата натрия, 0,2 г/л хлорида калия и 0,27 г/л фосфата калия.
Образцы, которые анализировали, получали смешиванием растворов 1, 2 и 3 согласно отношениям, приведенным в табл. 9. Затем образцы дважды обрабатывали в течение 30 с перемешиванием и выдерживали в течение 30 мин. После последующей обработки перемешиванием в течение 30 с и выдерживанием в течение 1 ч, образцы анализировали ББ8 2е!а81/ег №по Макегп, не забывая о том, что раствор необходимо обрабатывать перемешиванием 5 мин перед анализом.
Измерения проводили с помощью гелий-неонового лазера (λ=632,8 нм) при 25°С и угле рассеяния 173°. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения 2е!а81/ег.
Таблица 9
31РНК, мг/мл Полимер, мг/мл Состав
мл раствора 1 мл раствора 2 мл раствора 3
- 0,1 - 0,5 0, 5
0, 050 0,1 0,5 0,5 -
0, 03 0,1 0,3 0, 5 0,2
0, 02 0,1 0,2 0, 5 0, 3
0, 015 0,1 0, 15 0, 5 0, 36
0, 010 0,1 0, 10 0,5 0,4
0, 005 0,1 0, 05 0, 5 0, 45
Исследование делает возможным определение следующих параметров:
1) среднего диаметра (Ζ) катионных производных гликогена полглумит™, не содержащих 81РИК (результаты приводятся в табл. 10);
2) отношения размеров наночастиц (результаты приводятся в таблице 10) и
3) максимального отношения в массовых процентах 81РИК и полимера, для которого не наблюдали эффект агрегации (результаты приводятся в таблице 10).
Таблица 10
№ полимера (1) Средний диаметр (Ζ) (нм) (2) Отношение размеров (3) Отношение в % (масс./масс) ΞίΡΗΚ/полимер без образования агрегатов
1 37 1,2 10
2 37 0, 8 50
3 38 0,9 15
4 41 0, 8 20
5 35 0,9 50
6 36 0, 8 10
7 38 0,9 10
8 38 0,9 15
9 35 1,1 50
10 36 0, 8 50
11 37 0, 8 50
12 40 0,9 15
13 36 0, 8 50
14 37 0,9 50
15 41 0, 8 10
16 41 0,9 15
17 35 1,0 50
18 (*) 76 4,5 20
(*) Сравнительный образец: БЕАБ-декстран
- 22 032479 (1) Средний диаметр (Ζ).
Как можно видеть на таблице 10, все производные имеют средний диаметр (Ζ) меньше 100 нм.
В отличие от ΌΕΆΕ-декстрана, катионные производные согласно изобретению преимущественно образуют наночастицы со средним диаметром (Ζ) меньше 70 нм.
(2) Отношение размеров.
Отношением размеров является ширина при средней высоте пика распределения размеров частиц, нормализованной средним диаметром, и таким образом это отношение описывает форму пика распределения размеров частиц.
Как можно видеть на таблице, все катионные полимеры согласно изобретению имеют распределение размеров с отношением размеров от 0,8 до 1,1, в отличие от ΌΕΆΕ-декстрана, который показал распределение размеров с отношением размеров, равным 4,5.
Это указывает на то, что с применение того же способа синтеза катионные полимеры на основе гликогена согласно настоящему изобретению можно получать в виде наночастиц регулируемых размеров с диапазоном размеров, близким к среднему значению.
(3) Максимальное массовое процентное отношение δΐΡΗΚ/полимер, для которого не наблюдается агрегация
Результаты показали, что катионные полимеры, содержащие все заместители согласно настоящему изобретению, образовывали комплексы без агрегирования частиц вплоть до 50 мас.% 8ΪΡΗΚ как функцию степени дериватизации.
Полимер 18 (ΌΕΆΕ-декстрана) образовывал комплексы без агрегирования частиц только вплоть до 20 мас.% δΐΡΗΚ.
Пример 5. Определение емкости заряда.
Емкость заряда определяли для ряда производных, содержащих повторяющиеся звенья (а) и (Ъ), с помощью гель-электрофореза.
Комплексы получали согласно следующему способу.
Комплексы 8ΪΡΗΚ и различных полимерных производных получали с применение различных отношений δΐΡΗΚ/полимер (мас.%).
Растворы полимеров при различных концентрациях, описанных в таблицах 11 и 12, смешивали в ЗФР без РНазы, фильтровали через фильтр 0,2 мкм с раствором в воде 8ΪΡΗΚ (1пуйгодеп, ссылка № 1299001) с концентрацией 0,340 мг/мл без РНазы. Далее смеси обрабатывали перемешиванием в течение приблизительно 30 с, выдерживали в течение 15 мин при комнатной температуре, обрабатывали снова перемешиванием в течение 30 с и после выдерживания в течение приблизительно 30 мин подвергали гель-электрофорезу.
Гели проявляли загрузкой 10 мкл раствора каждого комплекса на 4% гель агарозы, содержащий краситель Огееп Ое1 ΡΙιιΟ™ Ыис1е1с Ас1б 8£ат 20000Х, приготовленный в буфере ΜΟΡδ-ΕΌΤΆ-ацетат натрия при отношении 1:200000.
Гели агарозы проявляли в течение одного часа при постоянном напряжении 80 В. Изображения получали с помощью системы 1тареОаап1 ЕА8 4000 (ΟΕ 11еа1111саге).
Полученные гели показаны на фиг. 1-8.
Комплексы полимера 3 (ΌΕΆΕ-гликогена) и 8ΪΡΗΚ получали с применением растворов полимеров и 8ΪΡΗΚ в количествах, приведенных ниже в таблице 11. Полимер 3 загружали 8ΪΡΗΚ в количестве от 0,5 масс.% до 800 масс.% 8ΪΡΗΚ.
Г ели, на которые засевали комплексы полимера 3 и 8ΪΡΗΚ и которые затем проявляли электрофорезом, показаны на фигурах, перечисленных в табл. 11.
Таблица11
мг/мл полимера мг/мл 3ΪΡΗΚ % 31РНК (масс./масс.) Фигура
20 0,1 0,5 1
10 0, 1 1 1
5 0, 1 2 1
- 23 032479
2,5 0,1 4 1
1,25 0, 1 8 1
1 0,1 10 2
0, 66 о, 1 15 2
0,5 о, 1 20 2
0,333 0,1 30 3
0,2 о, 1 50 3
0,1 0,1 100 3
0, 05 о, 1 200 3
0, 025 0,1 400 3
0,0125 0,1 800 3
Немодифицированный гликоген полглумит™ (50*) применяли в качестве сравнительного гликогена.
Полимер Мг/мл полимера Мг/мл 31РНК % 31РНК (масс./масс.) Фигура
50 (*) 1 0, 1 10 2
0,0125 0,1 800 2
На фиг. 1 можно увидеть, что в колонках полимера 3 в комплексе с 81РНК при процентном содержании ее от 0,5 до 8 мас.% отсутствует белая полоса, соответствующая только 81РНК. Отсутствие полосы указывало на то, что полимер 3 был способен полностью образовывать комплекс с 81РНК в количестве от 0,5 до 8 мас.% относительно массы полимера.
На фиг. 2 отсутствие полосы, соответствующей 81РНК в колонках полимера 3 в комплексе с 81РНК, указывало на то, что полимер 3 был способен полностью образовывать комплекс с 81РНК при процентном содержании ее от 10 до 20 мас.% относительно массы полимера. Присутствие полосы, соответствующей 81РНК в колонках полимера 50 (немодифицированный гликоген полглумит™) указывало на то, что немодифицированный гликоген полглумит™ был не способен образовывать комплекс с 81РНК даже при проценте, равном 10 мас.% относительно массы полимера.
На фиг. 3 отсутствие полосы, соответствующей 81РНК в колонках полимера 3 в комплексе с 30% 81РНК, указывало на то, что полимер 3 был способен полностью образовывать комплекс с 30 мас.% 81РНК относительно общей массы полимера. В противоположность этому, присутствие полосы, соответствующей содержанию 81РНК от 50 до 800%, указывало на то, что полимер 3 был неспособен образовывать комплекс с 50 мас.% 81РНК относительно общей массы полимера.
Эти исследования таким образом показали, что, максимальная емкость заряда полимера 3 была 30 мас.% 81РНК. В противоположность этому, немодифицированный гликоген полглумит™ (полимер 50) был неспособен образовывать комплекс с 81РНК.
Кроме того, комплексы полимер-81РНК были получены с применением следующих полимеров:
№ 1, 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, содержащих повторяющееся звено (а);
№ 20, 21, 23, 24, 25, 28, содержащих повторяющееся звено (Ъ).
Применяли две загрузки 81РНК в процентах: 5 и 20% относительно массы полимера. Применяемые растворы указываются ниже в табл. 12.
- 24 032479
Таблица 12
На фиг. 4 присутствие полосы, соответствующей 8ΪΡΗΚ в колонках комплекса полимера 1 соответственно с 5 и 20 мас.% 8ΪΡΗΚ, указывало на то, что полимер 1 (ΌΕΆΕ-полглумит с низкой степенью дериватизации) был неспособен образовывать комплекс с 8ΪΡΗΚ. Полимер 2 был способен образовывать комплексы с 5 масс.% 8ΪΡΗΚ относительно общей массы полимера и полимер 6 был также способен образовывать комплекс с 20 мас.% 8ΪΡΗΚ относительно общей массы полимера.
На фиг. 5 присутствие полосы, соответствующей 8ΪΡΗΚ в колонках полимеров 10 и 14 в комплексах с 20 мас.% 8ΪΡΗΚ, указывало на то, что эти полимеры были способны образовывать комплексы с 5 мас.% 8ΪΡΗΚ. В противоположность этому, полимер 15 был способен образовывать комплексы с 20 мас.% 8ΪΡΗΚ.
На фиг. 6 отсутствие полосы, соответствующей 8ΪΡΗΚ, указывало на то, что полимеры 8, 12 и 16 были способны образовывать комплексы с 20 мас.% 8ΪΡΗΚ.
На фиг. 7 присутствие полосы, соответствующей 8ΪΡΗΚ в колонках полимеров 24 и 25, указывало на то, что эти полимеры были неспособны образовывать комплексы с 5% 8ΪΡΗΚ. В противоположность этому, полимер 21 также образовывал комплекс с 20% 8ΪΡΗΚ.
На фиг. 8 присутствие полосы, соответствующей 8ΪΡΗΚ в колонках полимеров 23 и 20 в комплексах с 20% 8ΪΡΗΚ, указывало на то, что эти полимеры образовывали комплексы с 5% 8ΪΡΗΚ. В противоположность этому, полимер 28 образовывал комплекс с 20% 8ΪΡΗΚ.
Таким образом, в общем исследования позволили показать, что только полимеры 1 (ΌΕΆΕ-гликоген с наименьшей степенью дериватизации), 24 и 25 были способны образовывать комплексы с менее чем 5 мас.% 8ΪΡΗΚ.
Все другие производные были способны образовывать комплексы с 20% 8ΪΡΗΚ, подобно сравнительному полимеру 18 (ΌΕΆΕ-декстрану). В противоположность этому, полимер 50 (немодифицированный гликоген полглумит™) был неспособен образовывать комплексы с 8ΪΡΗΚ.
- 25 032479
Пример 6. Исследования цитотоксичности катионных производных гликогена полглумит™.
Исследования токсичности проводили на (^ΕΑΕ)-гликогене (полимеры 1-4), (^ΜΑР)-гликогене (полимеры 5-8), (^ΜΑΕ)-гликогене (полимеры 9-12), (2-ОН-РТМА)-гликогене (полимеры 13-16), на немодифицированном гликогене полглумите™ (полимер 50), на гидрохлориде ΌΕΑΕ-декстрана (полимер 18) и на другом эталонном полимере, которые были широко исследованы для доставки нуклеиновых кислот, разветвленном полиэтиленимине (РЕ1) (Α16τώΗ, ссылка № 40872-7) (полимер 60).
(а) Исследования катионных полимеров согласно изобретению.
Получение катионных полимеров.
Катионные полимеры растворяли в воде и соответствующим образом разводили в среде для культивирования клеток для получения конечных концентраций от 10 до 10-5 мг/мл и применяли для оценки цитотоксичности спустя 24, 48 и 72 ч для двух клеточных линий: МопоМас-6 и НТ2 9.
Клеточная линия МопоМас-6.
Клеточная линия моноцитов/макрофагов человека МопоМас-6 была любезно пожертвована проф. Мап1отап1 (Нитапба®, Йа1у).
Клетки сохраняли в инкубаторе при 37°С в атмосфере с 5%.
СО2, в среде РРМ1 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (ГС8), 2% Б-глутамина, 1% раствором пенициллина/стрептомицина, 1% незаменимых аминокислот, 1% 100 мМ пирувата натрия и 1% щавелевоуксусной кислоты.
Клетки, которые растут в суспензии, сохраняли в культуре пассированием, выполняемым один раз в неделю посредством разведений клеточной культуры 1:4 в новой свежей полной среде.
Клеточная линия НТ29.
Клетки аденокарциномы ободочной кишки человека НТ-29, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС Магу1апб, υ8Α), сохраняли в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (БМЕМ с высоким содержанием глюкозы, рН 7,4), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (ГС8), 2% Б-глутамина, 1% раствором пенициллина/стрептомицина, 1% незаменимых аминокислот, 1% 100 мМ раствора пирувата натрия и 2% 1 М раствора НЕРЕ8.
Клетки, которые растут посредством прилипания, сохраняли в культуре выполнением пассирований один раз в неделю, высевали 300000 клеток на колбу перед обработкой системой трипсин/Ε^ТΑ для выделения клеток из монослоя.
Анализ цитотоксичности.
Клетки Моно Мас-6 и НТ-29, которые высевали в 96-луночных планшетах (10000 клеток/лунку) за 24 ч до эксперимента, инкубировали с катионными производными при различных концентрациях в течение 24, 48 и 72 ч.
В конце обработки испытываемыми соединениями жизнеспособность клеток определяли как функцию продуцирования аденозинтрифосфата (АТ Ф), используя набор ΑΤΜί!© (Рсгкш-Е1тсг).
Анализ набором ΑΤРI^ίс основан на генерации люминесценции, продуцированной после реакции АТФ, присутствующей в клетках, с люциферазой и б-люциферином, добавленными в лунки перед считыванием данных. Интенсивность генерированной люминесценции прямо пропорциональна концентрации АТФ, присутствующего в образце, и измеряется с помощью люминометра (У1СТОК-3 Ша11ас).
Перед проведением измерения люминометром, 50 мкл раствора для лизиса (0,5% Ттйоп Х-100 в 0,2 н NаОН) в 100 мкл культуральной среды добавляли в каждую лунку. После 5 мин инкубации при комнатной температуре и с перемешиванием со скоростью 700 оборотов в минуту к каждой лунке добавляли 50 мкл набора ΑΤРI^ίс и после перемешивания в течение 5 мин планшет инкубировали в течение еще 10 минут в темноте перед выполнением измерения люминесценции.
Для каждого производного эксперименты проводили в двух повторностях.
Процент выживаемости клеток определяли с учетом средних величин люминесценции для обработанных клеток и средних величин для необработанных контрольных клеток.
Процент жизнеспособности клеток (% СУ) для каждого производного предоставляли в виде среднего процента относительно контроля согласно следующему уравнению:
Средняя интенсивность люминесценции обработанных клеток
Жизнеспособность (%) =------------------------------------------------------- X 1 00
Средняя интенсивность люминесценции необработанных клеток
Соединение считается цитотоксичным, когда процент жизнеспособности клеток меньше 50%.
- 26 032479
Таблица 13. Концентрация катионных полимеров 0,01 мг/мл
№ Линия клеток МопоМас-6 (в Линия клеток НТ29
полимера суспензии) (прилипающих)
СУ (%) СУ (%)
24 часа 48 часов 72 часа 24 48 72
часа часов часа
1 111 97 114 115 78 143
2 112 61 136 136 107 136
3 115 208 65 96 131 160
4 108 217 60 86 118 140
5 100 176 56 113 107 165
6 109 132 124 111 138 158
7 104 80 105 317 92 95
8 - - - 103 61 92
9 111 143 129 101 120 156
10 110 144 80 103 143 162
11 125 110 129 323 101 97
12 - - - 127 72 86
13 135 121 136 301 95 90
14 108 71 81 305 92 91
15 126 115 161 227 92 68
16 - - - 131 83 79
17 107 137 134 106 123 131
18 (*) 97 74 109 97 73 105
50 (*) 105 105 120 97 128 158
60 (*) - - - 93 114 52
(*) полимеры, применяемые для сравнения: 18 = ДЕАЕ-декстран;
= немодифицированный гликоген полглумит™; 60 = полиэтиленимин (ΡΕΙ).
Результаты в табл. 13 делают возможным демонстрацию того, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению являются нецитотоксичными при концентрации 0,01 мг/мл.
Таблица 14. Концентрация катионных полимеров 0,01 мг/мл
№ Линия клеток МопоМас-6 (в Линия клеток НТ29
полимера суспензии) (прилипающих)
СУ (%) СУ (%)
24 часа 48 часов 72 часа 24 48 72
часа часов часа
1 108 86 61 101 96 132
2 105 152 167 116 110 169
3 107 182 100 102 127 140
4 105 165 66 104 122 131
5 107 182 87 85 147 152
6 102 151 107 102 110 147
7 99 54 95 342 81 102
8 - - - 114 149 92
9 109 182 128 105 118 168
- 27 032479
10 111 152 82 95 156 150
11 107 82 142 367 105 110
12 - - - 131 91 92
13 121 123 121 346 92 104
14 105 81 123 381 114 114
15 125 109 149 326 113 98
16 - - - 131 159 150
17 110 124 138 109 120 152
18 (*) 12 21 12 60 11 45
50 (*) 105 167 108 97 125 158
60 (*) - - - 7 6 3
(*) полимеры, применяемые для сравнения: 18 = ДЕАЕ-декстран;
= немодифицированный гликоген полглумит™; 60 = (РЕ1).
Результаты в таблице 14 позволили показать, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению являются нецитотоксичными при концентрации 0,1 мг/мл, в отличие от ΌΕΑΕ-декстрана и РЕ1.
Таблица 15. Концентрация катионных полимеров 0,01 мг/мл
№ Линия клеток МопоМас-6 (в Линия клеток НТ29
полимера суспензии) (прилипающих)
СУ (%) СУ (%)
24 часа 48 часов 72 часа 24 48 72
часа часов часа
1 91 70 76 89 133 109
2 117 118 153 95 121 145
3 88 115 32 112 136 133
4 55 81 50 84 115 108
5 88 175 45 79 127 159
6 102 132 89 103 130 149
7 11 16 12 280 82 84
8 - - - 74 113 86
9 115 132 103 99 127 163
10 99 136 55 131 143 155
11 113 78 136 371 110 111
12 - - - 108 169 135
13 97 169 63 329 111 99
14 107 75 131 373 104 112
15 140 101 105 333 110 100
16 - - - 107 165 125
17 98 138 138 95 134 128
18 (*) 12 11 12 49 22 22
50 (*) 98 158 69 98 115 157
60 (*) - - - 3 _6 2
(*) полимеры, применяемые для сравнения: 18 = ДЕАЕ-декстран;
= немодифицированный гликоген полглумит™; 60 = (РЕ1).
Результаты в табл. 15 позволили показать, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению, за исключением полимера 7, являются нецитотоксичными при концентрации 1 мг/мл, в отличие от ΌΕΑΕ-декстрана и РЕ1. Показано, что производное 7 является цитотоксичным только на культуре клеток в суспензии.
- 28 032479
Таблица 16. Концентрация катионных полимеров 10,0 мг/мл
№ полимера Линия клеток НТ29 (прилипающих)
СУ (%)
24 часа 48 часов 72 часа
1 112 156 164
2 97 130 177
3 78 104 128
4 63 82 71
5 106 130 174
6 101 132 170
7 277 76 83
8 43 77 56
9 104 135 165
10 52 120 172
11 362 116 108
12 93 166 115
13 379 116 113
14 361 123 108
15 308 110 92
16 79 146 95
17 97 129 176
18 (*) 49 27 2_8
50 (*) 89 135 151
60 (*) 2 2 1
(*) полимеры, применяемые для сравнения: 18 = ДЕАЕ-декстран;
= немодифицированный гликоген полглумит™; 60 = РЕ1.
Результаты в табл. 16 позволили показать, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению являются нецитотоксичными при концентрации 10 мг/мл, в отличие от ΌΕΑΕ-декстрана и РЕ1.
(Ь) Исследования флуоресцентных производных катионных полимеров согласно настоящему изобретению.
Исследования цитотоксичности проводили также с применением флуоресцентных производных катионных полимеров согласно настоящему изобретению для целей определения наиболее нецитотоксичной концентрации, при которой проводили исследования включения клетками полимеров.
Флуоресцентные производные катионных полимеров согласно настоящему изобретению синтезировали следующим образом.
500 мг одного из катионных полимеров согласно настоящему изобретению растворяли в отсутствие света в 10 мл дистиллированной воды в двугорлой круглодонной колбы, снабженной магнитной мешалкой. Добавляли 2 мл 1н. ΝαΟΙ I и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Затем добавляли 36 мг флуоресцеинизотиоцианата (Е1ТС), растворенного приблизительно в 0,3 мл ДМСО. Смесь перемешивали при комнатной температуре на протяжении ночи.
На следующий день 20 мл ацетона выливали в реакционную колбу и после перемешивания в течение приблизительно 30 мин делали возможным осаждение полимера. Супернатант выгружали и осадок дважды промывали приблизительно 20 мл ацетона.
Осадок затем растворяли приблизительно в 10 мл дистиллированной воды и раствор подвергали диализу в трубках с мембраной из регенерированной целлюлозы (до предельной величины 15000) против дистиллированной воды в отсутствие света. После завершения диализа раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкл и сушили вымораживанием.
Эти исследования проводили на адгезивных клетках НТ29, полученных, как описано ранее.
Результаты представлены ниже в таблице 17, в которых флуоресцентные производные катионных полимеров согласно настоящему изобретению были обозначены такими же номерами, как в таблице 2, с добавлением ί.
- 29 032479
Таблица 17
Конц. 0,01 мг/мл Конц. 0,1 мг/мл Конц. 1 мг/мл Конц. 10 мг/мл
Νο. 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч
1ΐ 119 142 115 111 116 125 106 108 131 97 116 125
2ΐ 102 159 133 101 112 83 100 115 119 77 100 89
3ΐ 92 123 102 71 84 107 75 90 105 53 74 61
4ΐ 69 86 94 79 59 78 56 31 71 36 32 34
5ΐ 114 100 133 98 94 134 107 106 116 105 78 106
6ΐ 105 90 118 101 154 91 98 92 116 98 72 75
7ΐ 94 128 114 102 120 112 73 72 88 59 52 40
8ΐ 103 61 92 114 149 92 74 113 86 43 77 56
9ί 92 67 69 89 83 3Ζ 72 71 36 77 57 33
10ΐ 95 151 114 93 119 82 94 120 75 56 79 35
11ΐ 111 105 147 100 90 144 75 75 123 81 50 94
12ΐ 127 72 86 131 91 92 108 169 135 93 166 115
13ΐ 93 100 96 97 122 75 110 90 104 63 70 4Ζ
14ΐ 102 94 103 102 119 137 103 78 156 74 65 101
15ΐ 93 81 137 81 105 150 77 87 122 69 59 88
16ΐ 131 83 79 131 159 150 107 165 125 79 146 95
18ΐ(*) 15 10 11 20 ζ 13 17 12 6 20 8 10
(*) сравнительный образец: 18Г = флуоресцентное производное БЕАЕ-декстрана.
Из полученных результатов было видно, что самая высокая концентрация, при которой все флуоресцентные производные катионных полимеров согласно настоящему изобретению были нецитотоксичными в течение 24-часового периода, составляла 1 мг/мл. В противоположность этому, флуоресцентное производное ΌΕΑΕ-декстрана было очень токсичным при всех анализированных концентрациях.
Пример 7. Исследования поглощения клетками.
Исследования поглощения клетками проводили через 2, 6 и 24 ч, применяя флуоресцентные производные катионных полимеров настоящего изобретения (1Г-16Г) и гидрохлорида ΌΕΑΕ-декстрана при концентрации 1 мг/мл, т.е. наиболее высокой концентрации, анализированной при исследовании цитотоксичности, при которой оказалось, что флуоресцентные производные 1Г-16Г были нецитотоксичными в течение периода 24 ч.
Исследования проводили с применением клейких клеток НТ29, обработанных согласно следующей процедуре.
Клетки НТ-29, которые высевали за день до эксперимента при плотности 20000 клеток/лунку, инкубировали с соответствующими флуоресцентными производными при концентрации 1 мг/мл в течение 2, 6 и 24 ч. В конце каждого периода инкубации среду удаляли из лунок и клетки промывали три раза стандартным забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР) с рН 7,4. Затем клетки обрабатывали 200 мкл раствора для лизиса (0,5% тритона Х-100 0,5% в 0,2н. ΝοΟΙ I) и флуоресценцию измеряли флуориметрией (λ возбуждения 485 нм; λ излучения 535 нм). Для каждого соединения и для каждого периода времени вычисляли среднюю флуоресценцию двух повторностей, величины которой приводятся в табл. 18.
Таблица 18
N° полимера Инте
2 часа
11 1696
21 5567
3ί 17531
4ί 70210
5ί 4845
6ί 6842
7ί 26268
8ί 19638
9ί 2386
10ί 3122
11ί 10866
12ί 14020
13ί 937
14ί 4599
15ί 13319
16ί 23560
18ί(*) 15227
контроль 833
энсивность флуоресценции
6 часов 24 часа
1372 744
6327 7217
24101 30573
63668 120662
4365 3274
8306 7651
36314 52612
34463 58024
2991 2487
4318 3177
12491 8906
21569 37090
1736 1008
7724 4190
22623 30889
48650 56919
13689 12626
1152 349
- 30 032479
Эффективное количество поглощения клеток для флуоресцентных производных вычисляли построением калибровочной кривой для каждого флуоресцентного производного в растворителе для лизиса клеток (0,5% тритона Х-100 в 0,2н. ΝαΟΗ).
Из калибровочных кривых и из наблюдаемых интенсивностей флуоресценции вычисляли количество в мг/мл поглощения клетками, как указано в табл. 19.
Таблица 19__________
Концентрация, мг/мл
N° полимера 2 часа 6 часов 24 часа
2ΐ 0.006 0.006 0.007
3ΐ 0.008 0.014 0.021
41 0.019 0.017 0.036
51 0.002 0.001 0.000
61 0.002 0.003 0.002
71 0.026 0.036 0.053
81 0.005 0.012 0.024
111 0.002 0.003 0.001
121 0.004 0.008 0.016
141 0.006 0.009 0.005
151 0.004 0.014 0.022
161 0.008 0.020 0.025
18ί(*) 0.002 0.002 0.001
(*) флуоресцентный ΏΕΆΕ-декстран.
Полученные результаты показали степень поглощения клетками катионных полимеров согласно изобретению по сравнению с ΏΕΆΕ-декстраном.
Кроме того, было отмечено, что степень дериватизации была прямо пропорциональна влиянию на поглощение клетками полимеров.
Пример 8. Оценка буферной емкости.
Буферную емкость оценивали для проверки того, что катионные полимеры согласно настоящему изобретению могут иметь такие характеристики, что они могут также индуцировать эффект протонной губки, который считается необходимым для того, чтобы сделать возможным высвобождение комплекса полимер-нуклеиновая кислота из цитоплазматических телец после клеточного поглощения.
Катионные полимеры согласно изобретению (ΏΕΆΕ-гликоген) и ΏΕΆΕ-декстран титровали при превращении в гидрохлорид (как описано в примере 2) посредством ΝαΟΗ, причем мониторинг титрования проводили варьированием рН.
100 мг гидрохлорида полимера растворяли в 100 мл дистиллированной воды, причем раствор перемешивали на протяжении ночи при комнатной температуре. На следующий день раствор титровали 0,01 н ΝαΟΗ, причем добавление титранта проводили дозиметром и мониторинг титрования проводили рНметром.
Исследования титрования, проводимые на катионных производных согласно настоящему изобретению, сделали возможным идентификацию распределения рКа при рН ниже физиологического значения рН и приблизительно при физиологическом значении рН в диапазоне приблизительно 4,5-8, которое придает катионным полимерам изобретения высокую буферную емкость.
Величины рКа приблизительно при физиологическом значении рН были применимы для придания катионным полимерам изобретения положительного заряда, необходимого для образования комплекса с нуклеиновыми кислотами.
Величины рКа при рН ниже физиологического значения рН были применимы для обеспечения освобождения комплексов из цитоплазматических телец в цитоплазму (посредством эффекта протонной губки).
На фиг. 9 представлены кривые титрования для катионных полимеров 2, 3 и 4 (ΏΕΆΕ-гликогена согласно настоящему изобретению) для сравнительных целей. Можно отметить, что в рамках одного и того же класса производных емкость буфера увеличивалась, когда увеличивалась степень дериватизации.
Кроме того, было обнаружено, что полимер 4 (ΏΕΆΕ-гликоген) и продукт 18 (ΏΕΆΕ-декстран) имели сходную степень дериватизации и сравнимую буферную емкость, как показано на фигуре 10.
Пример 9. Реологические измерения.
Реологические исследования проводили на катионных производных 1-16 согласно настоящему изобретению (ΏΕΆΕ-, ΏΜΆΡ-, ΏΜΆΕ-, 2-ОН-РТМА-гликоген) и на гидрохлориде ΏΕΆΕ-декстрана при концентрации 1% в ЗФР. Измерения проводили с помощью ротационного вискозиметра ВоЫт Оетт1 150, который пилотировали программным обеспечением ВоЫт К6 40.5.32, оснащали геометрией конусплоскость 2°/55 мм, температуру которого термостатически поддерживали при 25°С инструментом Ре1Еег ВоЫт и измерения которым проводили способом регулируемого напряжения в диапазоне напряже
- 31 032479 ния сдвига 1 -5 Па.
Все анализированные образцы показали очень низкую величину вязкости порядка мПа. Эта характеристика позволяет применять катионные производные согласно настоящему изобретению также в виде инъекций. В качестве примера в табл. 20 представлены величины вязкости различных производных при одной величине напряжения (2,5 Па).
Таблица 20
N° полимера Вязкость полимера при 2,5 Па (Па)
1 1.97x10'3
2 1.91x10'3
3 1.91x10'3
4 1.95x10'3
5 1.97x10'3
6 1.95x10'3
7 1.91x10'3
8 1.96x10'3
9 1.87x10'3
10 1.96x10'3
11 1.92x10'3
12 1.91x10'3
13 1.93x10'3
14 1.94x10'3
15 1.93x10'3
16 1.98x10'3
180 2.36x10'3
(*) Сравнительный образец: ЭЕЛЕ-декстран.
Пример 10. Исследования цитотоксичности комплексов катионных производных комплекса гликогена с анионными молекулами.
Клетки НТ-29 высевали за день до эксперимента при плотности 10000 клеток/лунку в объеме 100 мкл среды ЭМЕМ, содержащей 10% сыворотку.
В день эксперимента среду удаляли из лунок и добавляли 150 мкл среды ЭМЕ М, содержащей 2,5% сыворотку. Затем добавляли 50 мкл комплексов, образованных из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентных 81РНК. Комплексы, образованные из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентной 81РНК получали согласно следующей процедуре.
Приготовляли четыре растворы, каждый из которых содержал 6,283 мг катионного полимера 3, 7, 11 и 15 в 40 мл ЗФР без РНазы. К 142,86 мкл каждого из растворов добавляли 6,6 мкл раствора 81РНК в ЗФР без РНазы (концентрация 20 мкМ), и спустя несколько минут каждый раствор разводили 350,54 мкл ЗФР без РНазы. Конечная концентрация 81РНК в растворах была 264 нМ, что соответствует 10 мас.% 81РНК относительно массы полимера.
Полученные таким образом растворы перемешивали в течение приблизительно 30 с, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, снова перемешивали в течение 30 с и выдерживали в течение 5 мин. Перед выполнением эксперимента растворы перемешивали в течение 30 с.
Растворы (50 мкл) катионных полимеров 3, 7, 11 и 15 в 40 мл ЗФР без РНазы, к которым не добавляли 81РНК, применяли в качестве образцов для первого сравнения.
Комплексы 81РНК и реагента для трансфекции липофектамина® 2000, полученные согласно процедуре, описанной изготовителем Е1£е-1есЕпо1од1е8™ для трансфекции 81РНК, и содержащие такое же количество 81РНК, как и количество, применяемое в комплексах с полимерами, применяли в качестве образцов для второго сравнения.
Реагент для трансфекции липофектамин® 2000, к которому не добавляли 81РНК, применяли в качестве образца для третьего сравнения.
Комплексы и все сравнительные образцы, полученные, как описано выше, помещали в контакт с клетками. Клетки инкубировали в течение 4 и 24 ч при 37°С, после чего супернатант удаляли и добавляли 100 мкл среды, содержащей 2,5% сыворотку.
В конце обработки образцов тестируемыми соединениями, жизнеспособность клеток определяли как функцию продуцирования аденозинтрифосфата (АТФ), используя набор АТР111е (Регкт-Е1шег), как описано выше в примере 6.
Результаты, полученные, как описано в примере 6, представили ниже в таблице 21 как процент живых клеток.
- 32 032479
Таблица 21
№ полимера Жизнеспособность клеток СУ (%)
4 часа 24 часа
3+3ΪΡΗΚ 58 100
7+3ΪΡΗΚ 89 85
11+3ΪΡΗΚ 91 70
15+3ΪΡΗΚ 101 59
Образец для первого сравнения
3 92 105
7 90 99
11 85 65
15 86 72
Образец для второго сравнения
липофектамин® 2000+31РНК 130 110
Образец для третьего сравнения
липофектамин® 2000 110 108
Полученные результаты показали, что комплексы, полученные из катионных полимеров согласно настоящему изобретению и 81РИК, не были цитотоксическими.
Поэтому катионные полимеры 3, 7, 11 и 15 применяли в следующем исследовании включения клетками комплексов.
Пример 11. Исследования включения клетками катионных производных гликогена в комплексе с люминесцентными анионными молекулами.
Исследования проводили способом, подобным способу, который описан выше в примере 7, применяя адгезивные клетки НТ29. НТ29 клетки высевали за день до эксперимента при плотности 20000 клеток/лунку в объеме 100 мкл среды ΌΜΕΜ, содержащей 10% сыворотку.
В день эксперимента, среду удаляли из лунок и добавляли 150 мкл среды ΌΜΕΜ, содержащей 2,5% сыворотку. Затем добавляли 50 мкл комплексов, образованных из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентной 81РНК.
Комплексы, образованные из катионного полимера согласно настоящему изобретению и флуоресцентной 81РНК, получали согласно следующей процедуре.
Приготовляли четыре раствора, каждый из которых содержал 6,2832 мг катионного полимера 3, 7, 11 и 15 в 40 мл ЗФР без РНазы. К 142,86 мкл каждого из этих растворов добавляли 6,6 мкл раствора 81РНК в ЗФР без РНазы (концентрация 20 мкМ) и спустя несколько минут каждый раствор разводили 350,54 мкл ЗФР без РНазы. 81РНК метили флуоресцентным соединением А1еха-488. Конечная концентрация 81РНК была 264 нМ, что соответствует 10 мас.% 81РНК относительно массы полимера.
Полученные таким образом растворы перемешивали в течение приблизительно 30 с, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, перемешивали в течение еще 30 с и выдерживали в течение 5 мин. Перед выполнением эксперимента растворы снова перемешивали в течение еще 30 с.
Комплекс 81РНК и реагента для трансфекции липофектамина® 2000, полученный согласно процедуре, описанной производителем Е1£е-1еекпо1о§1е8™ для трансфекции 81РНК и содержащий такое же количество 81РНК, как и количество, применяемое в комплексах с полимерами, применяли в качестве первого сравнительного образца.
Флуоресценцию только 81РНК измеряли для последующего сравнения.
Комплексы и все сравнительные образцы, полученные, как описано выше, помещали в контакте с клетками.
Клетки инкубировали в течение 4 ч при 37°С и после удаления супернатанта клетки промывали дважды 200 мкл ЗФР.
Далее клетки обрабатывали 200 мкл раствора для лизиса (0,5% тритона Х-100 в 0,2 н ΝαΟΙ I) в течение 5 минут при комнатной температуре при перемешивании.
Флуоресценцию, испускаемую 81РНК, меченой А1еха-488, которая поглощалась, измеряли флуориметром (λ возбуждения 485 нм; λ испускания 535 нм.) после того, как комплексы полимеров и 81РНК выдерживали в контакте с клетками в течение 4 ч.
Для каждого полимера эксперимент проводили в трех повторностях и вычисляли среднюю величину интенсивности флуоресценции. Из этой величины вычитали среднюю величину интенсивности флуоресценции, вычисленную только для культуральной среде, которая была равна 1366, получая при этом величину конечной интенсивности флуоресценции.
Такую же процедуру применяли для первого образца для сравнения (липофектамин® 2000 +
- 33 032479
81РИК), для которого средняя величина интенсивности флуоресценции только для культуральной среды была равна 1328.
Результаты представлены в табл. 22.
Таблица 22
№ полимера Интенсивность флуоресценции
Регистрированная Средняя Конечная
3 2533 2504 2642 2560 1194
7 2721 2973 3066 2920 1554
11 1906 1801 1856 1854 489
15 2493 2927 2851 2757 1391
Липофектамин® 2000 + 31РНК 1811 1820 1845 1825 498
зтРНК 1334 1351 1267 1317 -
Полученные результаты показали, что катионные полимеры согласно изобретению способны индуцировать включение 81РИК в клеточную мембрану. Кроме того, катионные полимеры согласно изобретению делают возможным включение большего количества 81РИК, чем комплекс, применяемый в качестве сравнения и включающий в себя липофектамин® 2000.

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Катионный полимер на основе гликогена, содержащий по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а) в которой группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из NИ2-(С1-С6)алкила, [Ν,Ν -ди(С1 -С6)алкиламино]-(С 1 -С6)алкила, ΝΠ^ {[(С1 -С6)алкил]ди(С 1-С6)алкиламмонио }-(С1 -С6) алкила, {[Ν,Ν-ди(С 1-С6)алкиламино]-(С1 -С6)алкилди(С 1 -С6)алкиламмонио }-(С гС6)алкила, ΝΠ^-[(С 1 -С6) алкиламино]-(С1 -С6)алкила, {[Ν,Ν-диСС 1 -С6)алкиламино]-(С гС6)алкиламино }-(С1 -С6)алкила, [три(С 1 -С6) алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, азоциклил(С1-С6)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и п равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь) в которой К! выбран из атома водорода; карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащей группы, выбранной из NИ2-(С1-С6)алкила, [Н№ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, NИ2-[(С1С6)алкилди(С 1 -С6)алкиламмонио]-(С 1 -С6)алкила, {[Ν,Ν-диСС 1 -С6)алкиламино] -(С1 -С6)алкилди(С 1 С6)алкиламмонио }-(С1 -С6)алкила, ΝΠ^- [(С -С6)алкиламино]-(С1 -С6)алкила, {[Ν,Ν-диСС 1 -С6)алкиламино] (С1-С6)алкиламино}-(С1-С6)алкила, [три(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, у которых (С1С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами;
    Х1 и Х2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -МНЕ. у которой К2 выбран из атома водорода, (СгС6)алкила и Н-[№И-(С1С6)алкил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и т равно целому числу, которое больше или равно 1;
    при условии, что по меньшей мере один из К, К15 Х1 и Х2 представляет собой азотсодержащую группу, как указано соответственно для каждого из К, К15 Х1 и Х2, и при условии, что указанный катионный полимер на основе гликогена отличается от продукта, по
    - 34 032479 лученного реакцией гликогена с хлоридом ОТ(3-хлор-2-гидроксипропил)триметиламмония.
  2. 2. Катионный полимер на основе гликогена по п.1, у которого указанные группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из | Х,\-ди(СгС3)алкила\1ино|-(СгС3)алки.1сГ {[НОТди^-СД алкиламино]-(С1-С3)алкилди(С1-С3)алкиламмонио}-(С1-С3)алкила, !|\,\-ди(С|-С3)алкила\1ино|-(С|-С3) алкиламино}-(С1-С3)алкила, [три(С1-С3)алкиламмонио]-(С1-С3)алкила, азоциклил-(С1-С3)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6-членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (С1-С3)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
  3. 3. Катионный полимер на основе гликогена по п.2, у которого указанные группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода; карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из Ν,Ν-диметиламиноэтила, Ν,Ν-диметиламинопропила, Ν,Νдиэтиламиноэтила, [(N,N-диметиламиноэтил)диметиламмонио]этила, [(НОТдиметиламинопропил^иметиламмонио]пропила, [(N,N-диэтиламиноэтил)диэтиламмонио]этила, пиперидил-ОТэтила или морфолинил-ОТэтила.
  4. 4. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого К1 представляет собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием; или азотсодержащую группу, выбранную из [НОТди^-СДалкиламиноНОТ-СДалкила, {[НОТди^-СДалкиламино](С1-С3)алкилди(С1-С3)алкиламмонио}-(С1-С3)алкила, {[НОТди^-СДалкиламиноНСгСДалкиламино}(С1-С3)алкила или [три(С1-С3)алкиламмонио]-(С1-С3)алкила, у которых (С1-С3)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены гидроксильной группой.
  5. 5. Катионный полимер на основе гликогена по п.4, у которого К1 представляет собой атом водорода или карбоксиметильную группу.
  6. 6. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого Х1 и Х2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой азотсодержащую группу -ΝΗΚ2, у которой К2 представляет собой атом водорода или Н-[NΗ-(С1-С4)алкил]ρ-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С4)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными.
  7. 7. Катионный полимер на основе гликогена по п.6, у которого указанная группа Н-^НДСрСДалкил]р- представляет собой полиэтиленимин с молекулярной массой от 50 до 3000 Да, спермин (ОТМСОТ^ЩСОТ^ЩСОТ^ОТ) или спермидин (ΗΝ^Η^ΝΗ^^ΝΗ).
  8. 8. Катионный полимер на основе гликогена по любому из предыдущих пунктов формулы изобретения, у которого указанные повторяющиеся звенья (а) и (Ь) содержат по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способна ионизироваться при физиологическом значении рН и выбрана из группы, состоящей из NΗ2-(С1-С6)алкила, [НОТди^-СДалкиламино](С1-С6)алкила, NΗ2-[(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, {[НОТди^-СДалкиламиноНСгСДалкиламино}-(С1-С6)алкила и азоциклил-(С1-С6)алкила, и по меньшей мере одну азотсодержащую группу, которая способна ионизироваться при значении рН, которое ниже значения физиологического рН, и выбрана из группы, состоящей из ΝΗ^^^-^^кил]ди(С1-С6)алкиламмонио}-(С1-С6)алкила и {[НОТди^-СДалкиламиноНСгСДалкилди^-СДалкиламмонио}-(С1-С6)алкила.
  9. 9. Комплекс катионного полимера на основе гликогена по любому из пп.1-8 и анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты.
  10. 10. Комплекс по п.9, где указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве между 5 и 60 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
  11. 11. Комплекс по п.10, где указанный комплекс содержит указанное анионное соединение в количестве между 10 и 50 мас.% относительно массы указанного катионного полимера на основе гликогена.
  12. 12. Фармацевтическая композиция, содержащая (А) комплекс (1) катионного полимера на основе гликогена, содержащего по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а) в которой группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащую группу, выбранную из ΝΗ^^-^^
    - 35 032479 кила, ^^-ди^-С^алкиламиноНСдС^алкила, КИзАСдС^алкилди^-С^алкиламмониоНСдС^алкила, {^,№ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио}-(С1-С6)алкила, ΝΗ2-[(αΑ6)Ηπкиламино]-(С1-С6)алкила, {СМ^-ди^-С^алкиламиноНСдС^алкиламино^СдС^алкила, [три(С1-С6) алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, азоциклил(С1-С6)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами; и η равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь) в которой К1 выбран из атома водорода, карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащей группы, выбранной из КИ^СгС^алкила, [Н^ди^-С^алкиламиноНСдС^алкила, КИгАСдС^алкилди(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, {[N,N-ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио}-(С1-С6)алкила, NΗ2-[(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, {[N,N-ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкиламино}-(С1-С6)алкила, [три(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами;
    Х1 и Х2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -ΝΗΚ2, у которой К2 выбран из атома водорода, (С1-С6)алкила и Н-рМ^^-С^алкил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и т равно целому числу, которое больше или равно 1;
    при условии, что по меньшей мере один из К, К1, Х1 и Х2 представляет собой азотсодержащую группу, указываемую соответственно для каждого из К, К1, Х1 и Х2, и (2) анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты;
    и (В) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
  13. 13. Фармацевтическая композиция по п.12, в которой указанным анионным соединением является нуклеиновая кислота.
  14. 14. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пп.12 и 13, пригодная для инъекци онного применения.
  15. 15. Применение комплекса (1) катионного полимера на основе гликогена, содержащего по меньшей мере одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из звеньев формулы (а) в которой группы К, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой атом водорода, карбоксиметильную группу, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащую группу, выбранную из ΝΗ^^-^^кила, [N,N-ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, NΗ2-{[(С1-С6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио]}-(С1-С6) алкила, {[Ν,Ν-ди(С 1-С6)алкиламино]-(С 1-С6)алкилди(С 1-С6)алкиламмонио]} -(С1-С6)алкила, ΝΗ2- [(С 1-С6) алкиламино]-(С1-С6)алкила, {[N,N-ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкиламино}-(С1-С6)алкила, [три(С1-С6) алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, азоциклил(С1-С6)алкила, где указанный азоциклил является 5- или 6членным ароматическим или алифатическим гетероциклическим кольцом, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами, и η равно целому числу, которое больше или равно 1; и (Ь) в которой К1 выбран из атома водорода, карбоксиметильной группы, необязательно в форме соли с фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим основанием, или азотсодержащей группы, выбранной из NΗ2-(С1-С6)алкила, [N,N-ди(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, ΝΗ2-[(^
    - 36 032479
    С6)алкилди(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, {[К,К-ди(С1 -С6)алкиламино]-(Сх-С6)алкилди(Сх-С6)алкиламмонио}-(С1-С6)алкила, ЫН2-[(С1-С6)алкиламино]-(С1-С6)алкила, {|\,\-ди(С|-С6)алкиламино|-(С|С6)алкиламино}-(С1-С6)алкила, [три(С1-С6)алкиламмонио]-(С1-С6)алкила, у которых (С1-С6)алкильные цепи, которые могут быть одинаковыми или разными, необязательно замещены одной или несколькими гидроксильными группами;
    Χι и Х2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой группу -ОН или азотсодержащую группу -ЫНК2, у которой К2 выбран из атома водорода, (С1-С6)алкила и Н-[ЫН-(Сх-С6)алкил]р-, где р равно целому числу, которое больше или равно 1, и (С1-С6)алкильные группы могут быть одинаковыми или разными; и т равно целому числу, которое больше или равно 1;
    при условии, что по меньшей мере один из К, Κι, Χχ и Х2 представляет собой азотсодержащую группу, как определено соответственно для каждого из К, Κχ, Χχ и Х2, и (2) анионного соединения, где анионное соединение выбрано из группы, состоящей из активного ингредиента и нуклеиновой кислоты для доставки или трансфекции указанного анионного соединения в определенную фармакологическую мишень.
    ззззз δίΡΗΚ з ДНК
    0,5% 1% 2% 4% 8% (*) 0% (*)
EA201491613A 2012-03-15 2013-02-21 Катионные полимеры на основе гликогена EA032479B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12159710 2012-03-15
PCT/EP2013/053422 WO2013135471A1 (en) 2012-03-15 2013-02-21 Glycogen-based cationic polymers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491613A1 EA201491613A1 (ru) 2014-12-30
EA032479B1 true EA032479B1 (ru) 2019-06-28

Family

ID=47739282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491613A EA032479B1 (ru) 2012-03-15 2013-02-21 Катионные полимеры на основе гликогена

Country Status (29)

Country Link
US (1) US9717801B2 (ru)
EP (1) EP2825565B1 (ru)
JP (1) JP6247234B2 (ru)
KR (1) KR101997018B1 (ru)
CN (2) CN107236052B (ru)
AR (1) AR090307A1 (ru)
AU (1) AU2013231561B2 (ru)
BR (1) BR112014018617A8 (ru)
CA (1) CA2859273C (ru)
CY (1) CY1121829T1 (ru)
DK (1) DK2825565T3 (ru)
EA (1) EA032479B1 (ru)
ES (1) ES2732216T3 (ru)
GE (1) GEP201606581B (ru)
HK (1) HK1203984A1 (ru)
HR (1) HRP20191114T1 (ru)
HU (1) HUE045049T2 (ru)
IL (1) IL233823B (ru)
LT (1) LT2825565T (ru)
ME (1) ME03429B (ru)
MX (1) MX351599B (ru)
PL (1) PL2825565T3 (ru)
PT (1) PT2825565T (ru)
RS (1) RS58985B1 (ru)
SG (2) SG11201403816YA (ru)
SI (1) SI2825565T1 (ru)
TR (1) TR201909387T4 (ru)
UA (1) UA115135C2 (ru)
WO (1) WO2013135471A1 (ru)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR095937A1 (es) 2013-04-05 2015-11-25 Acraf Potenciador de la solubilidad en agua a base de glucógeno
KR102214865B1 (ko) 2013-04-26 2021-02-15 마이렉서스 바이오테크놀로지스 인코퍼레이티드 파이토글리코겐 나노입자와 이를 제조하는 방법
US20180036409A1 (en) * 2014-12-29 2018-02-08 Bonac Corporation Composition containing nucleic acid molecule stably
CN104558246B (zh) * 2015-01-20 2017-03-01 武汉理工大学 一种叶酸/生物素修饰的壳聚糖材料及其制备方法
DE102015205088C5 (de) * 2015-03-20 2024-09-26 Kuka Deutschland Gmbh Verfahren zum Ermitteln eines Kalibrierungsparameters eines Fahrzeuges sowie Fahrzeug hierzu
JP6872782B2 (ja) * 2016-03-08 2021-05-19 国立大学法人京都大学 カチオン性グルカンナノスフェア、複合体、核酸導入剤及びがん治療剤
CA3020772A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Mirexus Biotechnologies Inc. Anti-infective compositions comprising phytoglycogen nanoparticles
US20190117681A1 (en) * 2016-05-04 2019-04-25 Mirexus Biotechnologies Inc. Glycogen and phytoglycogen nanoparticles as immunosuppressive compounds, and compositions and methods of use thereof
CN105949344B (zh) * 2016-05-13 2019-05-17 中山大学 一种阳离子超支化多糖衍生物及其在增强血卟啉类光敏剂对肿瘤细胞光毒性方面的应用
EP3661563A4 (en) 2017-07-31 2021-11-10 The Ohio State Innovation Foundation BIOMIMETIC NANOMATERIALS AND USES THEREOF
WO2019140304A1 (en) * 2018-01-11 2019-07-18 Virgina Tech Intellectual Properties Inc. Amphiphilic polysacchardides,polysaccharide-based hydrogels, and methods of manufacture

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7144713B1 (en) * 1995-10-02 2006-12-05 Emd Biosciences, Inc. Method for precipitating nucleic acid with visible carrier
EP2275085A1 (en) * 2009-07-07 2011-01-19 University of Rostock Biodegradable copolymer suitable for delivering nucleic acid materials into cells

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8904370D0 (en) * 1989-02-25 1989-04-12 Cosmas Damian Ltd Liquid delivery compositions
IT1255488B (it) 1992-08-04 1995-11-06 Angelini Francesco Ist Ricerca Polisaccaridi del glicogeno
GB9600272D0 (en) 1996-01-06 1996-03-06 Univ Nottingham Polymers
US6106858A (en) * 1997-09-08 2000-08-22 Skyepharma, Inc. Modulation of drug loading in multivescular liposomes
EP1399189A1 (en) 2001-06-11 2004-03-24 Universite De Montreal Compositions and methods for enhancing nucleic acid transfer into cells
US20030147958A1 (en) 2002-01-29 2003-08-07 Cheol-Hee Ahn Biodegradable multi-block copolymers of poly(amino acid)s and poly(ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
WO2003078576A2 (en) 2002-03-12 2003-09-25 Nitto Denko Corporation Vector for transfection of eukaryotic cells
JPWO2005094894A1 (ja) * 2004-03-31 2008-02-14 株式会社メドジェル 細胞に核酸を導入するための製剤
WO2007038769A1 (en) 2005-09-28 2007-04-05 Hetzel Adrian H Electro-hydraulic timed angle controlled joint simulation torque calibration, certification and analysis device
UA97559C2 (ru) * 2007-11-08 2012-02-27 Оцука Фармасьютікал Ко., Лтд. Комплекс нуклеиновой кислоты и композиция для доставки нуклеиновой кислоты
CN101235098A (zh) * 2008-01-09 2008-08-06 浙江大学 功能性植物多糖的修饰方法
WO2010072628A1 (en) * 2008-12-22 2010-07-01 Unilever Plc Laundry compositions
ES2393529T3 (es) * 2008-12-22 2012-12-26 Unilever Nv Composiciones de lavandería
US8575131B2 (en) 2009-05-08 2013-11-05 National University Corporation Kagoshima University Glucuronic acid-containing glucan, process for production of same, and use of same
CN102068698A (zh) * 2009-11-24 2011-05-25 深圳先进技术研究院 纳米疫苗及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7144713B1 (en) * 1995-10-02 2006-12-05 Emd Biosciences, Inc. Method for precipitating nucleic acid with visible carrier
EP2275085A1 (en) * 2009-07-07 2011-01-19 University of Rostock Biodegradable copolymer suitable for delivering nucleic acid materials into cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAL, S. ; MAL, D. ; SINGH, R.P.: "Synthesis, characterization and flocculation characteristics of cationic glycogen: A novel polymeric flocculant", COLLOIDS AND SURFACES A: PHYSIOCHEMICAL AND ENGINEERING ASPECTS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 289, no. 1-3, 15 October 2006 (2006-10-15), AMSTERDAM, NL, pages 193 - 199, XP027995507, ISSN: 0927-7757 *

Also Published As

Publication number Publication date
ME03429B (me) 2020-01-20
BR112014018617A2 (ru) 2017-06-20
IL233823A0 (en) 2014-09-30
MX351599B (es) 2017-10-20
CY1121829T1 (el) 2020-07-31
UA115135C2 (uk) 2017-09-25
KR101997018B1 (ko) 2019-07-05
SG10201607577QA (en) 2016-11-29
RS58985B1 (sr) 2019-08-30
TR201909387T4 (tr) 2019-07-22
ES2732216T3 (es) 2019-11-21
CA2859273A1 (en) 2013-09-19
US20140378532A1 (en) 2014-12-25
HUE045049T2 (hu) 2019-12-30
CN107236052A (zh) 2017-10-10
HRP20191114T1 (hr) 2019-09-20
CA2859273C (en) 2020-04-14
GEP201606581B (en) 2016-11-25
HK1203984A1 (en) 2015-11-06
EP2825565A1 (en) 2015-01-21
IL233823B (en) 2018-05-31
EP2825565B1 (en) 2019-04-03
CN107236052B (zh) 2019-09-24
PL2825565T3 (pl) 2019-10-31
US9717801B2 (en) 2017-08-01
JP2015510020A (ja) 2015-04-02
AR090307A1 (es) 2014-11-05
AU2013231561A1 (en) 2014-07-10
EA201491613A1 (ru) 2014-12-30
KR20150006414A (ko) 2015-01-16
DK2825565T3 (da) 2019-06-24
SG11201403816YA (en) 2014-08-28
LT2825565T (lt) 2019-07-10
JP6247234B2 (ja) 2017-12-13
BR112014018617A8 (pt) 2017-07-11
CN104080812B (zh) 2017-06-27
CN104080812A (zh) 2014-10-01
PT2825565T (pt) 2019-07-10
AU2013231561B2 (en) 2017-06-08
SI2825565T1 (sl) 2019-08-30
MX2014010698A (es) 2015-03-10
WO2013135471A1 (en) 2013-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA032479B1 (ru) Катионные полимеры на основе гликогена
Cavallaro et al. Polymeric nanoparticles for siRNA delivery: Production and applications
Muddineti et al. Cholesterol-grafted chitosan micelles as a nanocarrier system for drug-siRNA co-delivery to the lung cancer cells
Jain et al. A new horizon in modifications of chitosan: syntheses and applications
Yao et al. Amphoteric hyaluronic acid derivative for targeting gene delivery
Gao et al. Arginine-chitosan/DNA self-assemble nanoparticles for gene delivery: In vitro characteristics and transfection efficiency
Sk et al. Enhancing the efficacy of Ara-C through conjugation with PAMAM dendrimer and linear PEG: a comparative study
WO2009036022A1 (en) Enhancement of polysaccharide-mediated nucleic acid delivery
WO2009112402A1 (fr) Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene
Licciardi et al. Synthesis and characterization of polyaminoacidic polycations for gene delivery
Opanasopit et al. Nuclear localization signal peptides enhance transfection efficiency of chitosan/DNA complexes
Fan et al. Ternary complexes with core-shell bilayer for double level targeted gene delivery: in vitro and in vivo evaluation
Jana et al. Synthesis of a carboxymethylated guar gum grafted polyethyleneimine copolymer as an efficient gene delivery vehicle
EP4282433A1 (en) Drug delivery composition, method for producing same and use thereof
Ganbold et al. Efficient in vivo siRNA delivery by stabilized d-peptide-based lipid nanoparticles
EP2903651B1 (en) Carboxylated polyamine derivatives as transfection reagents
McMullen et al. Exploring phosphonium and ammonium chitosan polymers and their PEGylated analogs for high performance gene delivery
KR101200176B1 (ko) 풀루란 유도체?폴리에틸렌이민 접합체를 포함하는 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법
Park et al. Highly Osmotic Oxidized Sucrose-Crosslinked Polyethylenimine for Gene Delivery Systems. Pharmaceutics 2021, 13, 87
CA3214764A1 (en) Chitosan-containing nanoparticles for delivery of polynucleotides
KR100346577B1 (ko) 간세포 특이적인 담체 및 이의 ｄｎａ와의 복합체
EP2995627B1 (en) Synthesis of nanoparticular gene carrier systems based on chitosan
Biswas Cholesterol-grafted chitosan micelles as a nanocarrier system for drug-siRNA co-delivery to the lung cancer cells
WO2022140850A1 (en) Immune- stimulating compounds linked to glycogen-based polysaccharide nanoparticles for sensitizing cancer cells to a chemotherapeutic drug
TW201304804A (zh) 核酸傳遞化合物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU