KR101993709B1 - 반응표면분석법을 이용한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 반응표면분석법을 이용한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응표면분석법을 통해 추출온도, 추출시간 및 추출용매:시료 비율에 따른 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS 생성 억제활성이 증가된 혼합 추출물의 추출 최적조건을 확립하였으며, 이를 이용하여 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS 생성 억제활성이 증가된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 효율적으로 수득할 수 있으므로, 상기 혼합 추출물을 포함하는 음료 조성물을 제조하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 반응표면분석법을 이용한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.
RSM(response surface methodology)은 최소의 실험횟수로부터 최대의 정보를 얻을 수 있는 실험계획법으로, 이를 통해 얻어진 실험 자료를 분석하여 복잡한 시스템의 성능을 이해하고, 반응변수에 영향을 주는 유의한 요인들을 찾고 최적화하는데 사용된다. 여러 개의 인자 중 하나씩 각각 변화시켜 실험을 진행하는 전통적인 실험법인 1회 1인자(one factor at a time) 실험법은 최적의 실험 조건을 찾기 어렵고 복합 공정에서 중요한 인자 간에 상호작용을 고려하지 못하고, 실험영역 전체를 균형 있게 판단하지 못하기 때문에 국지적 최적점을 찾게 되는 문제점이 있다. RSM은 전형적인 최적화 방법으로 일반적으로 여러 변수를 사용하여 최적 조건을 찾는 시스템으로 하나의 변수와 다른 변수들과의 상호작용으로 인한 효과를 측정하여 변수들의 최적값을 확인할 수 있다.
황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과 오갈피속의 상록활엽교목으로, 높이 15m 이상까지 자라는 한국 고유의 토종나무이다. 어린 가지는 녹색이며 광택이 있고, 꽃은 6월에 피며, 길이 7~19mm의 열매가 검게 익는다. 최저기온이 영하 2℃ 이상 및 연평균기온이 12~15℃ 이상인 지역에서 자라는 난대성 식물이다. 세계적으로 황칠을 분비하는 황칠나무는 한반도 서남부 내륙과 해안, 도서, 그리고 제주도에서만 자라는 희귀종이며, 현재는 그 수량이 극히 제한되어 있다. 현재 도서 지역으로 신안, 진도, 완도 등지와 제주도가 있고, 해안지역으로는 해남, 장흥, 강진, 고흥, 승주, 광양, 여수 등지에 소규모의 자생지가 있다.
헛개나무(Hovenia dulcis var. koreana Nakai)는 갈매나무과의 낙엽활엽교목으로, 수고 20m 및 흉고직경 80cm까지 자란다. 일본, 중국 등 동북아시아 지역에서도 동속의 Hovenia dulcis 및 Hovenia tomentosa가 자생하고 있으나 과경의 크기, 종자, 꽃색 등에서 다르게 나타나 우리나라의 특산종으로 기록되고 있다. 또한, 헛개나무는 내한성과 내음성이 강하고 맹아력이 강한 수종으로 우리나라의 경기, 강원 이남의 고도 70~900m의 사면이나 계속 부위의 비옥한 임지에서 잘 자라며 예로부터 주독해독, 정혈, 이뇨, 갈증해소, 해독작용 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
운지버섯(Coriolus versicolor)은 담자균류의 민주름버섯목 구멍장이 버섯과에 속하는 버섯으로 균모는 얇고 단단한 가죽질이며 반원형이고, 침엽수나 활엽수의 고목에 군생하는 일년생이며, 한국, 일본, 중국 등의 산악지대에 주로 자생하고 있다. 운지버섯은 일명 구름버섯이라고도 불리며 전통적으로 건강보조식품이나 민간 치료약으로 이용되었으며, 운지버섯의 일반 성분은 수분 5.62%, 단백질 4.20%, 탄수화물 65.09%, 섬유질 23.24%, 회분 6.37% 및 지방질 1.10%를 함유하고 있다.
인진호(Artemisia capillaris)는 국화과(Compositae)에 속하는 사철쑥 및 동속 근연식물의 어린 줄기와 잎으로서 그의 성분으로는 카필라리신(capillarisin), 스코파론(scoparone), 카페인산(caffeic acid), 정유성분인 β-피넨(pinene), 카필린(capillin), 카필렌(capillene), 카필라린(capillarin), 지방산인 스테아린산(stearic acid), 팔미틴산(palmitic acid), 무기성분인 산화칼슘 등이 존재하는 것으로 알려져 있다.
미나리(Oenanthe javanica Dc.)는 주로 한국, 일본, 중국, 타이완, 말레이시아, 일본 등지의 습지에서 서식하는 크기가 20∼50cm인 미나리과의 여러해살이 풀 로서 그 전초에 플라보노이드(flavonods) 및 콜린(cholin) 정유가 포함되어 있고, 퀴놀린(quinoline)계의 알칼로이드(alkaloid)로 루타민(rutamin)과 r-파가린(r-pagarin), 쿠마린(cumarin) 등도 함유하고 있다.
한편, 한국공개특허 제2006-0081014호는 헛개나무 추출물의 제조 방법을 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2015-0047814호는 반응표면분석법을 이용한 머위로부터 페타신 함유 추출물을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 반응표면분석법을 이용한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 반응표면분석법을 이용하여 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 최적 추출조건을 확립하였다. 구체적으로, 독립변수로서 추출온도, 추출시간 및 추출용매:시료 비율에 대하여, 5단계의 -2, -1, 0, 1 및 2로 코드화하여 중심합성계획(central composite design)에 따라 16구간으로 설정하여 추출 실험을 실시하였으며, 상기 독립변수에 의해 영향을 받는 종속변수로서 추출수율, DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity), 총 폴리페놀 함량(TPC; total polyphenol content) 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성을 3회 반복측정하여 평균값을 계산한 후, 회귀분석을 실시하였다. 그 결과, 추출수율은 추출온도, DPPH 라디칼 소거능은 추출시간, 총 폴리페놀 함량은 추출용매:시료 비율 및 ROS 생성 억제활성은 추출온도에 큰 영향을 받는 것을 알 수 있었으며, 이때의 최적 추출조건을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1) 물, C1~C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합 용매를 추출용매로 사용하고, 80~120℃의 추출온도, 2~10시간의 추출시간 및 5~15:1의 추출용매(㎖):시료(g)의 비율의 추출 조건으로, 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합물을 추출하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 추출한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 여과하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 여과물을 감압농축하는 단계;를 포함하며, 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 포함하는 음료 조성물을 제공한다.
본 발명은 반응표면분석법을 이용한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 반응표면분석법을 통해 추출온도, 추출시간 및 추출용매:시료 비율에 따른 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS 생성 억제활성이 증가된 혼합 추출물의 추출 최적조건을 확립하였으며, 이를 이용하여 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS 생성 억제활성이 증가된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 효율적으로 수득할 수 있으므로, 상기 혼합 추출물을 포함하는 음료 조성물을 제조하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 추출온도 및 추출시간(A), 추출온도 및 시료에 대한 추출용매비(B) 및 추출시간 및 시료에 대한 추출용매비(C)에 따른 본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 추출수율에 대한 반응표면 분석 결과이다.
도 2는 추출온도 및 추출시간(A), 추출온도 및 시료에 대한 추출용매비(B) 및 추출시간 및 시료에 대한 추출용매비(C)에 따른 본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 반응표면 분석 결과이다.
도 3은 추출온도 및 추출시간(A), 추출온도 및 시료에 대한 추출용매비(B) 및 추출시간 및 시료에 대한 추출용매비(C)에 따른 본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 총 폴리페놀 함량(TPC)에 대한 반응표면 분석 결과이다.
도 4는 추출온도 및 추출시간(A), 추출온도 및 시료에 대한 추출용매비(B) 및 추출시간 및 시료에 대한 추출용매비(C)에 따른 본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 ROS 생성 억제활성에 대한 반응표면 분석 결과이다.
도 2는 추출온도 및 추출시간(A), 추출온도 및 시료에 대한 추출용매비(B) 및 추출시간 및 시료에 대한 추출용매비(C)에 따른 본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 반응표면 분석 결과이다.
도 3은 추출온도 및 추출시간(A), 추출온도 및 시료에 대한 추출용매비(B) 및 추출시간 및 시료에 대한 추출용매비(C)에 따른 본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 총 폴리페놀 함량(TPC)에 대한 반응표면 분석 결과이다.
도 4는 추출온도 및 추출시간(A), 추출온도 및 시료에 대한 추출용매비(B) 및 추출시간 및 시료에 대한 추출용매비(C)에 따른 본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 ROS 생성 억제활성에 대한 반응표면 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 물, C1~C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합 용매를 추출용매로 사용하고, 80~120℃의 추출온도, 2~10시간의 추출시간 및 5~15:1의 추출용매(㎖):시료(g)의 비율의 추출 조건으로, 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합물을 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 추출한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 여과물을 감압농축하는 단계;를 포함하며, 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에서, 상기 혼합 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 물을 용매로 이용하여 추출한 것이다.
또한, 상기 혼합 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출물, 추출물의 희석액 또는 농축액, 추출물을 건조하여 얻어지는 건조물, 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 열수 추출, 냉침 추출, 초음파 추출, 및 환류 추출 등이 있다. 추출물을 농축할 경우에는, 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물은 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리를 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 중량비로 혼합하여 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리를 1:1:1:1:1의 중량비로 혼합하여 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단계 1)의 추출 조건은,
(a) 박스 벤켄 계획법(BBD, Box-Behnken design)으로 추출온도(X1), 추출시간(X2), 추출용매:시료의 비율(X3)에 대하여, 5단계의 -2, -1, 0, 1 및 2로 코드화하여 실험범위를 설계하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 설계된 실험범위로, 상기 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합물을 추출하여 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 또는 ROS 생성 억제활성에 대한 실험값을 획득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 실험값을 이용하여 하기 수학식 1~4로 표시되는 이차 회귀식 모델을 도출하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 도출된 수학식 1~4로 표시되는 이차 회귀식 모델을 변랑분석(ANOVA)하여 신뢰도를 입증하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[수학식 1]
Y1 = 92.45 - 1.62X1 + 10.44X2 + 2.21X3 + 0.01X1 2 + 0.13X1X2 - 0.19X2 2 - 0.001X1X3 + 0.1X2X3 - 0.1X3 2
[수학식 2]
Y2 = -105.07 + 2.97X1 + 8.77X2 + 1.94X3 - 0.02X1 2 - 0.02X1X2 - 0.13X2 2 + 0.06X1X3 - 0.68X2X3 - 0.17X3 2
[수학식 3]
Y3 = -32.19 + 1.02X1 + 6.73X2 - 0.36X3 - 0.01X1 2 - 0.05X1X2 + 0.17X2 2 + 0.02X1X3 - 0.44X2X3 + 0.10X3 2
[수학식 4]
Y4 = 344.52 - 3.54X1 + 5.77X2 + 4.09X3 + 0.02X1 2 - 0.04X1X2 + 0.04X2 2 + 0.01X1X3 - 0.38X2X3 - 0.07X3 2
(상기 수학식 1 내지 4에 있어서, Y1는 추출수율의 예측값(%), Y2는 DPPH 라디칼 소거능의 예측값(%), Y3는 총 폴리페놀 함량의 예측값(mg/g), Y4는 ROS 생성 억제활성의 예측값(%), X1은 추출온도(코드 단위), X2는 추출시간(코드단위) 및 X3는 추출용매:시료 비율(코드단위)를 의미한다).
또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 포함하는 음료 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
재료 및 방법
1. 황칠나무,
헛개나무
,
운지버섯
,
인진호
및 미나리 준비
본 발명에서 사용한 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리는 영석영농조합법인으로부터 공급받아 사용하였으며, 황칠나무는 동부생약영농조합에서 보관되어있는 것을 사용하였다. 상기 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리를 세척한 후 물기를 제거하여 시료로 사용하였다.
2. 최적 추출조건 설정을 위한 실험모델 계획
추출조건 설정을 위한 추출물의 추출방법은 1:1:1:1:1의 중량비로 혼합한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 분말 혼합물 1.5kg에 추출 조건별로 물의 첨가량, 추출온도 및 추출시간을 달리하면서 추출한 후, 감압여과하여 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물(하기 '시료'라 함)을 제조하였으며, 각 조건별로 3회 반복 추출하였다.
추출특성의 모니터링과 추출조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법(repose surface methodology, RSM)을 이용하였으며, 상기 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 최적 추출조건을 확립하기 위해 중심합성계획법(central composite design)을 실시하였다. 중심합성법에 의한 요인(factor; 독립변수)(Xi)의 실험계획은 하기 표 1에 개시한 바와 같이 추출온도(X1), 추출시간(X2) 및 추출용매:시료 비율(X3)를 5단계의 코드값(coded value)(-2, -1, 0, 1, 2)로 부호화하였으며, 중심합성계획에 따라 16구로 설정하여 추출 실험을 실시하였다. 또한, 이들 독립변수에 영향을 받을 종속변수(Yn)로는 추출수율(Y1), DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity)(Y2), 총 폴리페놀 함량(TPC; total polyphenol content)(Y3) 및 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제활성(Y4)으로 하였으며, 3회 반복 측정하여 평균값을 계산한 후, 회귀분석에 사용하였다. 회귀분석에 의한 최적 조건의 예측은 SAS(STATISTICAL Analysis System) 통계패키지를 이용하였으며, 회귀분석 결과 임계점이 최대점이거나 최소점이 아니고 안장점(saddle point)일 경우에는 능선분석을 하여 최적점을 구하였다. 반응표면분석에서 독립변수의 종속변수에 대한 2차 회귀식은 하기와 같다.
Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X2 2 + b21X2X1 + b22X2 2 + b31X3X1 + b32X3X2 + b33X3 2
(Y: 종속변수, X1, X2 및 X3: 독립변수, b0: 절편, bn: 회귀계수)
| 실험 조건의 개수1 ) | 추출 조건 | ||
| 추출 온도(X1) | 추출 시간(X2) | 시료에 대한 추출용매비(X3) | |
| 1 | 90 (-1) | 4 (-1) | 7.5 (-1) |
| 2 | 90 (-1) | 4 (-1) | 12.5 (+1) |
| 3 | 90 (-1) | 8 (+1) | 7.5 (-1) |
| 4 | 90 (-1) | 8 (+1) | 12.5 (+1) |
| 5 | 110 (+1) | 4 (-1) | 7.5 (-1) |
| 6 | 110 (+1) | 4 (-1) | 12.5 (+1) |
| 7 | 110 (+1) | 8 (+1) | 7.5 (-1) |
| 8 | 110 (+1) | 8 (+1) | 12.5 (+1) |
| 9 | 100 (0) | 6 (0) | 10 (0) |
| 10 | 100 (0) | 6 (0) | 10 (0) |
| 11 | 80 (-2) | 6 (0) | 10 (0) |
| 12 | 120 (+2) | 6 (0) | 10 (0) |
| 13 | 100 (0) | 2 (-2) | 10 (0) |
| 14 | 100 (0) | 10 (+2) | 10 (0) |
| 15 | 100 (0) | 6 (0) | 5 (-2) |
| 16 | 100 (0) | 6 (0) | 15 (+2) |
1) 중심합성계획에 의한 실험 조건의 개수
3. 추출 수율 측정
시료의 수율은 항량을 구한 수기에 20mL의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 취하여 105℃에서 증발 건고시킨 후 그 무게를 측정하였으며, 추출물 제조에 사용된 원료량(건물량)에 대한 백분율로서 추출수율(%, total extraction yield)을 나타내었다.
4.
DPPH
라디칼
소거능
(
DPPH
radical scavenging activity) 측정
DPPH 라디칼 소거능 측정은 블로이스의 방법(Blois MS., 1958, Nature, 181:1199-1200)에 따라 조건별 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 즉, 일정 농도의 시료 2mL에 2×10-4M의 DPPH(dissolved in 99% ethanol) 용액을 1mL를 가하고, 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 흡수분광광도계를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity, %)은 하기 식으로 계산하였으며, 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 평균과 표준편차로 나타내었다.
DPPH(%)= (대조군(control)의 흡광도-시료의 흡광도)/대조군(control)의 흡광도×100
5. 총 폴리페놀 함량(
TPC
; total
polyphenol
content) 측정
총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법(Folin O. and Denis W., 1912, J Biol chem. 12:239-249)에 따라 실시하였다. 메탄올에 희석한 25㎕의 시료에 75㎕의 메탄올과 25㎕의 폴린-시오칼투 페놀 시약(Folin-Ciocalteu phenol reagent)을 첨가하여 6분간 실온에서 반응시킨 후, 포화용액 Na2Co3 100㎕를 첨가하여 혼합하고, 90분간 실온에서 방치한 후 765nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 갈릭산(gallic acid)을 사용하여 표준 검량선을 작성하였으며, 추출물의 총 폴리페놀 함량을 mg GAE(gallic acid equivalent)/g로 나타내었다. 표준물질은 갈릭산(gallic acid)을 각각 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50 및 100mg/mL로 제조하여 처리한 후 흡광도와 농도와의 관계를 나타내는 표준곡선을 만들어 총 폴리페놀 함량(total polyphenol content)을 나타내었다.
6.
ROS
(reactive oxygen species) 생성 억제활성 측정
세포 내에서 산화 스트레스에 의해 발생하는 ROS 생성에 대한 본 발명의 혼합 추출물의 억제활성을 알아보기 위해, HepG2 세포에 t-BHP로 산화적 스트레스를 유도한 뒤 DCFH-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 이용하여 ROS의 양에 따른 형광의 발생 정도를 측정하였다. 구체적으로, HepG2 세포(1×104cells/well)를 CO2 배양기 내에서 24시간 배양한 후, 본 발명의 혼합 추출물을 전처리하여 12시간 후 간독성 유발물질인 t-BHP을 50μM의 농도로 처리하고 12시간 동안 CO2 배양기에서 배양하였으며, 배양된 세포를 PBS로 세척한 후, 10μM의 DCFH-DA를 포함하는 HBSS(Hank's balanced salt solution)에서 30분 동안 반응시킨 후 세포의 형광광도(SpectramaxGemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)를 측정하였다.
실시예
1. 모델 구축 및 통계분석
본 발명의 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 최적 추출조건을 확립하기 위해, 중심합성계획법(central composite design)을 실시하여 독립변수(Xi)인 추출온도(X1), 추출시간(X2) 및 추출용매:시료 비율(X3)에 따른 추출수율, DPPH 라디칼 소거능, 총 폴리페놀 함량 및 ROS 생성 억제활성 결과를 얻을 수 있었다(표 2).
| 실험 조건의 개수1) | 추출조건 | 추출 수율(%) (Y1) |
DPPH 소거능(%) (Y2) |
TPC (mg/g) (Y3) |
ROS 억제활성(%) (Y4) |
||
| 온도 (X1) |
시간 (X2) |
추출용매비 (X3) |
|||||
| 1 | 90 | 4 | 7.5 | 8.73 | 77.10 | 32.31 | 190.32 |
| 2 | 90 | 4 | 12.5 | 11.68 | 81.35 | 42.70 | 196.31 |
| 3 | 90 | 8 | 7.5 | 7.43 | 80.14 | 41.74 | 187.86 |
| 4 | 90 | 8 | 12.5 | 10.38 | 71.41 | 40.19 | 190.44 |
| 5 | 110 | 4 | 7.5 | 11.49 | 69.38 | 34.34 | 172.35 |
| 6 | 110 | 4 | 12.5 | 12.40 | 80.53 | 43.51 | 183.86 |
| 7 | 110 | 8 | 7.5 | 18.57 | 71.64 | 36.75 | 171.33 |
| 8 | 110 | 8 | 12.5 | 23.46 | 68.48 | 40.09 | 170.86 |
| 9 | 100 | 6 | 10 | 16.33 | 74.71 | 38.74 | 176.56 |
| 10 | 100 | 6 | 10 | 15.22 | 76.39 | 38.14 | 175.36 |
| 11 | 80 | 6 | 10 | 12.16 | 64.81 | 37.14 | 190.31 |
| 12 | 120 | 6 | 10 | 24.05 | 72.23 | 36.01 | 173.63 |
| 13 | 100 | 2 | 10 | 7.22 | 80.72 | 47.60 | 180.32 |
| 14 | 100 | 10 | 10 | 18.06 | 66.18 | 34.75 | 172.86 |
| 15 | 100 | 6 | 5 | 8.50 | 65.20 | 37.55 | 162.65 |
| 16 | 100 | 6 | 15 | 18.09 | 77.45 | 44.50 | 185.87 |
1) 중심합성계획에 의한 실험 조건의 개수
이러한 결과를 바탕으로 반응표면 회귀분석을 실시하였으며, 각 종속변수(Yn)인 추출수율(Y1), DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical scavenging activity)(Y2), 총 폴리페놀 함량(TPC; total polyphenol content)(Y3) 및 ROS 생성 억제활성(Y4)에 대한 회귀식을 얻을 수 있었다.
(1) 추출 조건에 따른 수율 변화 확인
각 추출 조건(독립변수; Xi)에 따른 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 추출수율(Y1)을 측정한 결과, 7.22~24.05%의 범위로 측정되었으며(표 2), 이에 대한 반응표면 회귀식은 하기와 같다. 회귀식의 R2의 값은 0.9432로 높은 상관관계를 보였으며, 5% 이내의 범위에서 유의성이 인정되는 것으로 확인되었다(표 3). 또한, 도 1 및 표 4에 개시한 바와 같이 각 추출조건에 따른 수율 변화의 반응표면 분석 결과, 추출온도에 큰 영향을 받는 것으로 나타났으며, 예측된 정상점에 대해 안장점(saddle point)으로 능선분석(ridge analysis)을 실시한 결과, 하기 표 3에 개시한 바와 같이 최대값은 28.68%였으며, 이때의 추출조건은 116.43℃의 추출온도, 8.13시간의 추출시간 및 11:1의 추출용매:시료 비율로 확인되었다.
Y1 = 92.45 - 1.62X1 + 10.44X2 + 2.21X3 + 0.01X1 2 + 0.13X1X2 - 0.19X2 2 - 0.001X1X3 + 0.1X2X3 - 0.1X3 2
| 반응 | R2 | 유효성 | 추출조건 | 예상값 | 형태 (Morphology) |
||
| 온도(X1) | 시간(X2) | 추출용매비(X3) | |||||
| 수율(%) | 0.9432 | 0.0042 | 87.118876 | 7.902651 | 7.004434 | 6.166568 (MIN) |
Saddle point |
| 116.434424 | 8.131664 | 11.009639 | 28.682258 (MAX) |
||||
| DPPH 라디칼 소거능(%) |
0.7057 | 0.2924 | 95.002142 | 9.020745 | 13.030046 | 64.803263 (MIN) |
Saddle point |
| 103.030195 | 2.961041 | 13.161646 | 87.665673 (MAX) |
||||
| TPC(mg/g) | 0.7184 | 0.2667 | 118.138603 | 7.121696 | 8.428059 | 33.863028 (MIN) |
Saddle point |
| 102.920407 | 3.325746 | 13.645891 | 50.520560 (MAX) |
||||
| ROS 억제활성(%) |
0.8077 | 0.1114 | 110.320794 | 5.879805 | 5.719813 | 165.105426 (MIN) |
Saddle point |
| 81.347171 | 5.245124 | 11.537571 | 198.564855 (MAX) |
||||
| 추출조건 | F-value | |||
| 수율(%) | DPPH 라디칼 소거능(%) |
TPC(mg/g) | ROS 생성 억제활성(%) | |
| 온도(X1) | 13.82** | 0.74 | 0.30 | 3.86 |
| 시간(X2) | 9.35** | 2.36 | 1.67 | 0.70 |
| 시료에 대한 추출용매비(X3) | 4.16 | 1.85 | 2.64 | 1.78 |
**은 5% 레벨에서의 유의성(significant)
(2) 추출 조건에 따른
DPPH
라디칼
소거능
변화 확인
각 추출 조건(독립변수)에 따른 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 DPPH 라디칼 소거능(Y2)을 측정한 결과, 64.81~81.35%의 범위로 측정되었으며(표 2), 이에 대한 반응표면 회귀식은 하기와 같다. 회귀식의 R2의 값은 0.7057으로 나타났으며(표 3), 도 2 및 표 4에 개시한 바와 같이 각 추출조건에 따른 DPPH 라디칼 소거능 변화의 반응표면 분석 결과, 추출시간에 큰 영향을 받는 것으로 나타났으며, 예측된 정상점에 대해 안장점(saddle point)으로 능선분석(ridge analysis)을 실시한 결과, 표 3에 개시한 바와 같이 최대값은 87.66%였으며, 이때의 추출조건은 103.03℃의 추출온도, 2.96시간의 추출시간 및 13.16:1의 추출용매:시료 비율로 확인되었다.
Y2 = -105.07 + 2.97X1 + 8.77X2 + 1.94X3 - 0.02X1 2 - 0.02X1X2 - 0.13X2 2 + 0.06X1X3 - 0.68X2X3 - 0.17X3 2
(3) 추출 조건에 따른 총 폴리페놀 함량(
TPC
)의 변화 확인
각 추출 조건에 따른 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 총 폴리페놀 함량(Y2)의 결과, 32.31mg/g~47.60mg/g의 범위로 측정되었으며, 이에 대한 반응표면 회귀식은 하기와 같다. 회귀식의 R2의 값은 0.7184로 나타났으며(표 3), 도 3 및 표 4에 개시한 바와 같이 각 추출조건에 따른 총 폴리페놀 함량 변화의 반응표면 분석 결과, 시료에 대한 추출용매비가 큰 영향을 받는 것으로 나타났으며, 예측된 정상점에 대해 안장점(saddle point)으로 능선분석(ridge analysis)을 실시한 결과, 표 3에 개시한 바와 같이 최대값은 50.52%였으며, 이때의 추출조건은 102.92℃의 추출온도, 3.32시간의 추출시간 및 13.64:1의 추출용매:시료 비율로 확인되었다.
Y3 = -32.19 + 1.02X1 + 6.73X2 - 0.36X3 - 0.01X1 2 - 0.05X1X2 + 0.17X2 2 + 0.02X1X3 - 0.44X2X3 + 0.10X3 2
(4) 추출 조건에 따른 ROS 생성 억제활성 변화 확인
세포 내에서 산화 스트레스에 의해 발생하는 ROS(reactive oxygen species) 생성 억제 활성을 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 각 추출 조건에 따라 제조하여 확인한 결과, 162.65~196.31%의 범위로 측정되었으며, 이에 대한 반응표면 회귀식은 하기와 같다. 회귀식의 R2의 값은 0.8077로 나타났으며(표 3), 도 4 및 표 4에 개시한 바와 같이 각 추출조건에 따른 ROS 생성 억제 활성 변화의 반응표면 분석 결과, 추출온도에 큰 영향을 받는 것으로 확인되었으며, 예측된 정상점에 대해 안장점(saddle point)으로 능선분석(ridge analysis)을 실시한 결과, 표 3에 개시한 바와 같이 최대값은 198.56%로 이때의 추출조건은 81.35℃의 추출온도, 5.25시간의 추출시간 및 11.54:1의 추출용매:시료 비율로 확인되었다.
Y4 = 344.52 - 3.54X1 + 5.77X2 + 4.09X3 + 0.02X1 2 - 0.04X1X2 + 0.04X2 2 + 0.01X1X3 - 0.38X2X3 - 0.07X3 2
Claims (5)
1) 물, C1~C4의 저급알코올 또는 이들의 혼합 용매를 추출용매로 사용하고, 80~120℃의 추출온도, 2~10시간의 추출시간 및 5~15:1의 추출용매(㎖):시료(g)의 비율의 추출 조건으로, 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리를 1~10:1~10:1~10:1~10:1~10의 중량비로 혼합한 혼합물을 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 추출한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 여과물을 감압농축하는 단계;를 포함하며, 추출수율 및 DPPH 라디칼 소거능이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법으로서,
상기 단계 1)의 추출 조건은,
(a) 박스 벤켄 계획법(BBD, Box-Behnken design)으로 추출온도(X1), 추출시간(X2), 추출용매:시료의 비율(X3)에 대하여, 5단계의 -2, -1, 0, 1 및 2로 코드화하여 실험범위를 설계하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 설계된 실험범위로, 상기 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합물을 추출하여 추출수율 및 DPPH 라디칼 소거능에 대한 실험값을 획득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 실험값을 이용하여 하기 수학식 1 및 2로 표시되는 이차 회귀식 모델을 도출하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 도출된 수학식 1 및 2로 표시되는 이차 회귀식 모델을 변랑분석(ANOVA)하여 신뢰도를 입증하는 단계;를 통해 도출되며,
[수학식 1]
Y1 = 92.45 - 1.62X1 + 10.44X2 + 2.21X3 + 0.01X1 2 + 0.13X1X2 - 0.19X2 2 - 0.001X1X3 + 0.1X2X3 - 0.1X3 2
[수학식 2]
Y2 = -105.07 + 2.97X1 + 8.77X2 + 1.94X3 - 0.02X1 2 - 0.02X1X2 - 0.13X2 2 + 0.06X1X3 - 0.68X2X3 - 0.17X3 2
(상기 수학식 1 및 2에 있어서, Y1는 추출수율의 예측값(%), Y2는 DPPH 라디칼 소거능의 예측값(%), X1은 추출온도(코드 단위), X2는 추출시간(코드단위) 및 X3는 추출용매:시료 비율(코드단위)을 의미한다)
최적의 추출 조건은 100℃의 추출온도, 6시간의 추출시간 및 15:1의 추출용매(㎖):시료(g)의 비율인 것을 특징으로 하는 추출수율 및 DPPH 라디칼 소거능이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법.
2) 상기 단계 1)에서 추출한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 여과물을 감압농축하는 단계;를 포함하며, 추출수율 및 DPPH 라디칼 소거능이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법으로서,
상기 단계 1)의 추출 조건은,
(a) 박스 벤켄 계획법(BBD, Box-Behnken design)으로 추출온도(X1), 추출시간(X2), 추출용매:시료의 비율(X3)에 대하여, 5단계의 -2, -1, 0, 1 및 2로 코드화하여 실험범위를 설계하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 설계된 실험범위로, 상기 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합물을 추출하여 추출수율 및 DPPH 라디칼 소거능에 대한 실험값을 획득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 실험값을 이용하여 하기 수학식 1 및 2로 표시되는 이차 회귀식 모델을 도출하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 도출된 수학식 1 및 2로 표시되는 이차 회귀식 모델을 변랑분석(ANOVA)하여 신뢰도를 입증하는 단계;를 통해 도출되며,
[수학식 1]
Y1 = 92.45 - 1.62X1 + 10.44X2 + 2.21X3 + 0.01X1 2 + 0.13X1X2 - 0.19X2 2 - 0.001X1X3 + 0.1X2X3 - 0.1X3 2
[수학식 2]
Y2 = -105.07 + 2.97X1 + 8.77X2 + 1.94X3 - 0.02X1 2 - 0.02X1X2 - 0.13X2 2 + 0.06X1X3 - 0.68X2X3 - 0.17X3 2
(상기 수학식 1 및 2에 있어서, Y1는 추출수율의 예측값(%), Y2는 DPPH 라디칼 소거능의 예측값(%), X1은 추출온도(코드 단위), X2는 추출시간(코드단위) 및 X3는 추출용매:시료 비율(코드단위)을 의미한다)
최적의 추출 조건은 100℃의 추출온도, 6시간의 추출시간 및 15:1의 추출용매(㎖):시료(g)의 비율인 것을 특징으로 하는 추출수율 및 DPPH 라디칼 소거능이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법.
삭제
삭제
제1항의 제조 방법으로 제조된 DPPH 라디칼 소거능이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물.
제4항의 DPPH 라디칼 소거능이 증진된 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물을 포함하는 음료 조성물.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170072234A KR101993709B1 (ko) | 2017-06-09 | 2017-06-09 | 반응표면분석법을 이용한 황칠나무, 헛개나무, 운지버섯, 인진호 및 미나리 혼합 추출물의 제조 방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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|---|---|
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| KR100690071B1 (ko) | 2005-09-16 | 2007-03-08 | 주식회사 벤스랩 | 숙취 예방 및 개선용 기능성 조성물 |
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2017
- 2017-06-09 KR KR1020170072234A patent/KR101993709B1/ko active IP Right Grant
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