KR101978572B1 - 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

Description

증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Composition for preventing, or treating reflux esophagitis comprising an extract of steamed Allium hookeri}
본 발명은 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
역류성 식도염이란 위의 내용물 또는 위산이 식도로 역류하여 발생하는 식도의 염증질환으로 식도 하부에 궤양이나 미란 등의 형태학적 변화를 일으킨 상태를 말한다. 역류성 식도염의 주된 증상으로는 가슴쓰림과 위산역류가 있지만 기침, 흉통, 삼킴 곤란, 이물감 등의 증상이 나타나기도 한다. 이러한 병증의 원인으로는 다양한 원인이 존재한다. 내부적인 원인으로는 일시적인 하부식도조임근의 이완, 하부식도조임근의 긴장도 감소 등의 구조적인 이상이 원인이 되며, 외부적인 원인으로는 서구화된 식습관, 비만 및 노령인구의 증가, 음주와 흡연, 과도한 스트레스, 불규칙한 식생활 습관 등의 다양한 요인이 있다(Yu Il Kim, Reflux Esophagitis. Korean J Fam Pract. 2013; 3:388-394). 국민건강보험심사평가원 조사에 따르면 우리나라의 역류성 식도염 환자는 2012년 336만 7천여명에서 2016년 416만 5천 여명으로 2012년보다 23.7%의 발병증가율로 매년 증가하는 추세를 보였으며, 연령별 식도염 환자는 사회생활을 많이 하는 4-50대 중년환자들이 43.2%로 가장 많은 발병률을 보였다. 이러한 역류성 식도염을 대수롭지 않게 여겨 계속 방치하게 되면 증상이 악화되어 심하면 식도암이 유발될 수 있다. 역류성 식도염의 치료에 있어 가장 보편적인 것이 생활습관의 개선이며 약물치료로는 히스타민 수용길항제를 이용하고 있다.
삼채는 백합과에 속하는 다년생 식물로 단맛, 쓴맛, 매운맛과 같이 세가지 독특한 맛이 난다는 뜻에서 삼채라고 부르기도 하며,인삼의 어린 뿌리와 비슷하다고 하여 삼채라고 부르기도 한다.삼채는 서늘하고 고도가 높은 지대에서 잘 자라는 식물로, 원산지는 미얀마, 부탄, 스리랑카, 인도, 중국 시난, 티베트이다.삼채는 2010년에 국내로 들여 온 이후 전국에서 재배되고 있다. 최근 농촌진흥청 조사에 따르면 2014년 약 188㏊이던 삼채 재배면적은 2016년 400㏊까지 2년새 2배이상 증가했다. 우리나라에서는 충북뿐 아니라 제주, 전남 순천, 경기 파주, 강원 평창 등 전국에서 재배되고 있다. 삼채는 작물 특성상 병해충이나 산짐승의 피해가 적으며 식이유황 및 항산화 성분 등 기능성 성분이 많이 함유한다고 알려진 것이 재배확대 요인으로 꼽힌다.
따라서, 본 발명자들은 역류성 식도염에 대한 직접적인 치료 효과를 얻을 수 있는 천연 추출물을 개발하기 위해 노력하던 중, 증숙 삼채 추출물은 LPS에 의해 염증을 반응을 일으킨 Raw 264.7에서 염증인자를 억제하였고, 역류성식도염을 유발된 랫드 모델에서 식도조직 손상이 감소하였고, 조직 병리학적 검사에 있어서 정상 조직을 유지하고 있었으며, 분리된 식도조직에서 염증유도단백질인 COX-2의 발현량이 현저하게 억제되었다. 따라서, 본 발명의 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 증숙 삼채 추출물이 역류성 식도염 유도 랫드 모델에서 식도조직 손상 및 식도 상피의 광범위한 탈락의 치료 및 개선 효과, 식도조직에서 염증유도단백질 COX-2 발현량의 억제 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 증숙 삼채 조성물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 증숙 삼채 조성물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 삼채는 뿌리일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서,상기증숙 삼채는 90℃ 에서 2시간 증숙한 후 건조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 70% 에탄올로 추출한 한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 서술한 약학적 조성물에 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 삼채는 뿌리일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채는 90℃ 에서 2시간 증숙한 후 건조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 70% 에탄올로 추출한 한 것일 수 있다.
본 발명의 증숙 삼채 추출물은 역류성 식도염 유도 랫드 모델에서 식도조직 손상 및 식도 상피의 광범위한 탈락의 치료 및 개선 효과, 식도조직에서 염증유도단백질 COX-2 발현량의 억제 효과를 나타내므로, 본 발명의 증숙 삼채 추출물을 역류성 식도염에 대한 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 증숙 삼채 뿌리 추출물이 세포 독성 결과이다.
도 2은 본 발명의 증숙 삼채 뿌리 에탄올 처리군 (62.5, 125, 250 및 500 ug.ml) 및 대조군의 LPS로 활성화된 Raw264.7 cell에서 NO 생성능의 비교 결과이다.
도3은 본 발명의 증숙 삼채 뿌리 에탄올 처리군, 대조군, 정상군의 급성 역류성식도염 모델에서의 식도 조직 손상도 비교 결과이다.
도 4는 본 발명의 증숙 삼채 뿌리 에탄올 처리군, 대조군, 정상군의 급성 역류성식도염 모델에서의 조직병리학적 결과이다.
도 5은 본 발명의 증숙 삼채 뿌리 에탄올 처리군, 대조군, 정상군의 급성 역류성식도염 모델에서의 식도 조직에서의 COX-2 발현량을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 증숙 처리한 삼채를 통한 항염 활성에 관한 연구는 아직까지 보고된 바 없다.
본 발명에 따른 증숙 삼채 추출물은 역류성 식도염에 직접적 또는 간접적인 증상에 대하여 치료효과를 나타내므로, 증숙 삼채 추출물은 역류성 식도염의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "개선" 또는 "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 LPS로 염증을 유도한 Raw 264.7에서 확인한 결과, 증숙 삼채 추출물 62.5, 125, 250, 500 ㎍/ml 농도에서 각각 19%, 25%, 34%, 68%의 NO 생성 억제활성을 나타내었다 (도 2).
또한 역류성 식도염을 유도한 동물 모델에서는 증숙 삼채 추출물을 투여 군에서손상 부위 면적 비율이 3.92%로 대조군에 비해 손상도가효과적으로 감소됨을 확인하였으며, 이는 84%의 손상도 완화 효과를 보여주었다(도3). 역류성 식도염 발생에 대한 항염증 효과를 조직병리학적 검사한 결과, 증숙 삼채 추출물투여군에서는 정상 조직과 유사한 식도 상피의 조직 구조를 유지하고 있었다(도 4). 나아가, 분리된 식도조직을 이용하여 Western blot 을 통해 염증유도 단백질 COX-2 발현량을 측정할 결과 COX-2 발현율은 증숙 삼채 뿌리 추출물을 500mg/kg씩 경구투여 하였을 때 대조군에 비해 약 25%정도 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 5).
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 삼채는 뿌리일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채는 90 ℃ 에서 2시간 증숙한 후 건조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 70% 에탄올로 추출한 한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 서술한 약학적 조성물에 약학적으로 허용가능한 담체 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 60 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명은 또한, 증숙 삼채 추출물을 포함하는 역류성 식도염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
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본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 삼채는 뿌리일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서,상기증숙 삼채는 90 ℃ 에서 2시간 증숙한 후 건조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 증숙 삼채 추출물은 70% 에탄올로 추출한 한 것일 수 있다.
본 발명의 증숙 삼채 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 본 발명의 건강식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 증숙 삼채 추출물를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 증숙 삼채 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 화합물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 증숙 삼채 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 증숙 삼채 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 증숙 삼채 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] 증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물 제조
제습식 건조기를 이용하여 50에서 수분함량 15% 이내로 건조하였으며, (증숙전 삼채 건조) 무압식 스팀증숙기를 이용하여 스팀기 하부의 수조에 물을 채우고 예비가열 30분 후 90에서 2시간 증숙 한 후 건조온도 50에서 24시간 건조하였다. 상기 증숙처리한 삼채 뿌리 10g에 탄소수 1 내지 4의 알코올인 70% 에탄올 100ml를 가하여 2시간씩 3회 3반복 하여 추출하였다.추출물을 여과한 뒤 여과액을 rotary vacuum evaporator(JP/N-1000X, EYELA)를 사용하여 45~50의 수온에서 감압농축 후 동결건조(fd5508, ILshin) 하였다.동결건조한 증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물은 1.671g이 제조되었고,수율은 5.57%였다. 분획물을 냉동 보관하면서 in vitro 측정 시료를 만들기 위해 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 stock 용액으로 제조한 뒤 -20에 보관하여 사용하였고, in vivo 측정 시료를 만들기 위해 실험직전에 증류수에 희석하여 사용하였다.
[ 실시예 2] 세포내에서 증숙 삼채 추출물의 항염증 효과
<2- 1>증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 세포 독성 실험
이번 실험예에서는 증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물이 세포 독성에 미치는 영향에 대해서 측정하기 위해 Cell counting Kit-8을 이용하였다.더 구체적인 측정을 하기 위해서 증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 농도를 설정하여 세포 독성 실험을 디자인하였다.세포 독성을 확인하기 위하여 96-well plate에 염증분석에 사용되는 대표적인 cell model인 마우스 대식세포인 Raw264.7 cell세포를 seeding하였으며 각 well당 세포 수는 5x105cells/well으로 일정하게 설정하였다. 증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 농도를 0~500 ㎍/ml에서 처리하여 24시간 동안 배양하였다.이후 CCK-8 용액을 처리하고 37, 5 % CO2 Incubator에서 30분 동안 반응시킨 후 Elisa(Multiscan spectrum, thermo Scientific)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.측정 결과 증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물은 62.5, 125, 250, 500 ㎍/ml 농도에서 모두 100% 이상의 생존율을 보여 Raw264.7cell에서 세포 독성을 나타내지 않았다(도1).
세포 생존율(%) = [시료처리군의 흡광도/무처리군의 흡광도]x 100
<2- 2>증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 NO 생성 억제능 측정.
Raw264.7 cell을 96-well plate에 5x105cells/well 을 분주한 후 37, 5 % CO2 Incubator에서 배양하여 사용하였다.분주한 세포에 LPS 1 ㎍/ml를 처리하고 1시간 뒤 62.5~500 ㎍/ml 농도의 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양액 중의 Nitrite oxide를 Griss reaction에 기초한 NO coloricmetric assay(R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA)로 분석하였다. Sodium Nitrate를 사용하여 표준곡선을 작성한 후 세포가 생산한 NO함량을 측정하였다. NO 생성 억제활성을 측정한 결과 LPS 대조군에 비해 증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물은 500 ㎍/ml 농도에서 68% 이상의 높은 억제 활성을 보였고 농도의존적으로 증가하여 62.5, 125, 250, 500 ㎍/ml 농도에서 각각 19%, 25%, 34%, 68%의 NO 생성 억제활성을 나타내었다(도2).
[ 실시예 3] 역류성 식도염을 유발한 동물 모델에서 증숙 삼채 추출물의 항염증 효과
<3- 1>역류성 식도염의 유발
상기실시예 1에 따라 제조된 증숙처리한 삼채 뿌리 추출물의 역류성식도염 예방 또는 개선 효과를 확인하기 위해 동물실험을 시행하였다.동물실험을 하기 전에 전북대학교 실험동물센터에서 주관한 동물실험 윤리교육을 이수한 후 실험을 수행하였다.또한 모든 실험은 전북대학교 수의과대학의 승인(CBNU-2017-0048)을 얻어 시행되었으며 동물관리 규정을 준수하였다.역류성식도염 동물모델은 6주령의 Rat를 공급받아 22±2, 습도 40±5%, 12시간-12시간(light-night)의 환경에서 1주간 적응 후 실험에 사용하였으며 사료공급은 표준식이로 유지시켜 사용하였다.각 Rat의 무게는 표. 1 에 나타내었다. 처리군는 Group 1(Normal, n=5), Group 2(RE Control, n=5), Group 3(증숙삼채, n=5) 로 나누어 진행하였다.수술 전 18시간 동안 절식하여 사료공급을 중단하였으나 물은 제공하였다. 절식하는 도중에 자신의 배변을 섭취할 수도 있기 때문에 케이지 아래에 메쉬 바텀 케이지(mesh-bottom-cage)에 보관하여 배변섭취를 방지하였다.수술할 쥐를 꺼내어 Forane 가스로 호흡마취 시키기 위하여 마취통에 담아 마취시켰다.마취 후 복부 중앙부를 2cm가량 개복하여 수술하였다.Group 1은 개복수술만 이루어졌고 Group 2, 3 처리구는 각각 생리식염수, 증숙 삼채 추출물을 500mg/kg씩 경구투여 하였으며 1시간 30분 후 유문 및 전위부 결찰 뒤 봉합하였다. 수술 5시간 뒤 식도 조직을 분석하기 위해 개복하여 분리하였다.
Rat body weight Rat body weight Rat body weight
Normal 1 157 RE control-1 158 증숙 삼채 1 156
Normal 2 152 RE control-2 157 증숙 삼채 2 155
Normal 3 158 RE control-3 158 증숙 삼채 3 159
Normal 4 153 RE control-4 160 증숙 삼채 4 148
Normal 5 159 RE control-5 160 증숙 삼채 5 158
위에서 기술한 정상군(Normal), 대조군(Reflux esophagitis control; Vehicle) 및 약물투여군(RGE)에 대한 분석방법은 다음과 같다.
<3- 2>증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 식도조직 손상도 측정.
유문 및 전위부 결찰 수술 5시간 후, 식도를 분리하였고 수술용 가위를 이용하여 식도를 세로로 절단하였다. 절단된 식도 내부는 적당량의 0.9% NaCl로 세척하여 전개한 뒤 광학 디지털 카메라(Nikon)를 이용하여 촬영하였다. 손상된 식도점막 측정은 image J 프로그램을 이용하여 실제 손상부위의 면적을 측정하였다. 수술 전 생리식염수를 급여하여 역류성식도염을 유발한 대조군(Vehicle)에서는 식도 점막이 위산에 의한 화학적 손상으로 발적, 충혈, 염증이 발생하였고 손상 부위 면적 비율은 24.2%로 분석되었다. 증숙 삼채 추출물을 수술 전 500mg/kg씩 1회 경구투여 하여 역류성식도염을 유발한 실험군에서는 손상 부위 면적 비율이 3.92%로 대조군에 비해 손상도가효과적으로 감소됨을 확인하였으며, 이는 84%의 손상도 완화 효과를 보여주었다(도 3).
<3- 3>증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 조직병리학적 검사
역류성식도염 발생에 대한 항염증 효과를 조직병리학적 검사로 확인하기 위해 H-E 염색을 실시하였다. 실험 종료 시점에서 실험동물을 호흡마취하고 조직을 적출하였으며, 조직을 10% neutral buffered formalin으로 고정하고 수세 후 ethanol과 xylene으로 탈수와 투명을 거쳐 파라핀에 포매하였다. 조직을 5㎛ 두께로 박절하여 hematoxylin과 eosin으로 일반적인 방법으로 염색하였고, 염색된 조직은 광학현미경(Leica DM 2500)으로 관찰하여 image analysis program(i-solution DT)으로 촬영 및 분석하였다. 역류성식도염을 유발하지 않은 군에서는 정상적인 점막 구조가 관찰되었으나, 역류성식도염 발생군에서는 식도 상피의 광범위한 탈락이 관찰되었다. 반면, 증숙 삼채 추출물투여군에서는 정상 조직과 유사한 식도 상피의 조직 구조를 유지하고 있었다(도 4).
<3- 4>증숙 삼채 뿌리 에탄올 추출물의 염증유도단백질 COX- 2발현량 측정
분리된 식도조직을 이용하여 Western blot 을 통해 발현량을 측정하였다. 분리된 식도 조직에서 Buffer A를 이용하여 세포질을 분리한 후 BSA를 통해 단백질 정량 후 Blue-buffer 을 첨가하여 loading sample을 제조하였다. 각 Sample 은 running gel 과 stacking gel을 이용하여 120V에서 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 실시하였다. Transfer를 위해 membrane을 transbuffer를 이용하여 60분간 이동시켰고 5% skim-milk solution 으로 blocking 하였다. COX-2, b-actin 1차 항체는 4에서 18시간 이상 반응시켰고, 1X PBS로 3회 세척 후 실온에서 2차 항체를 2시간 반응시킨 후 1X PBS로 세척하였다. 세척된 membrane에 ECL detection kit 의 발색시약 ,Ⅱ를 1:1로 혼합하여 도포하고 Chemidoc system(Bio-rad)을 이용하여 관찰하였다.그 결과, COX-2 발현율은 증숙 삼채 뿌리 추출물을 500mg/kg씩 경구투여 하였을 때 대조군 Vehicle에 비해 약 25%정도 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다(도 5).

Claims (11)

  1. 증숙 삼채의 뿌리 추출물을 포함하는 식도조직의 손상도 완화 효과를 통한 역류성 식도염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 증숙 삼채의 뿌리는 90 ℃ 에서 2시간 증숙한 후 건조한, 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 증숙 삼채의 뿌리 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 것인, 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 증숙 삼채의 뿌리 추출물은 70% 에탄올로 추출한 것인, 약학적 조성물
  6. 제 1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 약학적 조성물.
  7. 증숙 삼채의 뿌리 추출물을 포함하는 식도조직의 손상도 완화 효과를 통한 역류성 식도염 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 7항에 있어서, 상기 증숙 삼채의 뿌리는 90℃ 에서 2시간 증숙한 후 건조한, 건강기능식품 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 증숙 삼채의 뿌리 추출물은 물, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매를 사용하여 추출한 것인, 건강기능식품 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 증숙 삼채의 뿌리 추출물은 70% 에탄올로 추출한 것인, 건강기능식품 조성물.
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KHUMANTHEM DEEPAK SINGH 외. ANTIULCER AND IN VITRO ANTIOXIDANT ACTIVITY OF ALLIUM HOOKERII: AN ETHNOMEDICINAL PLANT OF MANIPUR. Asian J Pharm Clin Res. Vol. 8, Issue. 5, 2015, pp. 137-142*
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