KR101893323B1 - 포모노네틴을 포함하는 피부질환 개선 및 피부장벽 강화용 조성물 - Google Patents

포모노네틴을 포함하는 피부질환 개선 및 피부장벽 강화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포모노네틴을 포함하는 피부질환 개선 및 피부장벽 강화용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물에 따르면, 대기 중 오염물질로 인해 증가한 피부세포의 세포사멸을 억제하고, 피부 각질형성세포의 증식을 촉진하여, 미세먼지로 인하여 발생하거나 악화되는 피부장벽의 손상, 피부염, 아토피, 검버섯 등의 피부질환 증상을 개선할 수 있으므로, 이를 위해 제공되는 의약품 및 화장품의 개발 소재로써 유용하게 활용될 수 있다.

Description

포모노네틴을 포함하는 피부질환 개선 및 피부장벽 강화용 조성물{A Composition for Improving Skin Diseases and Enhancing Skin Barrier including Formononetin}
본 발명은 포모노네틴을 포함하는 피부질환 개선 및 피부장벽 강화용 조성물에 관한 것이다.
세계보건기구 산하 국제암연구소(IARC)가 2013년에 미세먼지를 1군 발암물질로 지정한 이래 해가 지날수록 미세먼지에 우려가 커지고 있으며, 이러한 미세먼지는 자동차의 배기가스, 공장의 매연 등에 함유된 대기오염 물질과 중금속 등이 혼재되어 있어 피부질환은 물론, 각종 호흡기 질환과 안구 질환, 심혈관 질환 등의 질병을 야기하는 것으로 보고되고 있다.
특히, 대기 중 미세먼지에 포함된 다환방향족탄화수소류(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons; PAHs)는 지방에 잘 녹는 친유성 물질로써, 표피를 통해 피부세포로 용이하게 침투할 수 있다. 이러한 탄화수소는 아릴 탄화수소 수용체(aryl hydrocarbon receptor; AHR)를 통해 피부세포에 산화성 스트레스를 일으키며 이것이 각질형성세포의 세포사멸이나 증식을 억제하여 피부장벽의 손상으로 이어진다.
이러한 미세먼지에 의한 피부 문제를 해결하기 위하여, 일반적으로 외출 후에 세안을 자주 하거나, 미세먼지의 접촉을 막기 위한 피부 보호 화장품이 사용되고 있으나, 종래에 개발된 미세먼지 관련 화장품은 미세한 거품을 이용하여 메이크업 잔여물을 포함하여 미세먼지나 각종 오염 물질까지 말끔하게 씻어내는 방식의 클렌징 제품이 대부분으로, 피부와 접촉된 미세먼지는 세안을 통해 일부 제거가 가능하지만, 모공동의 경로를 통해 피부 속으로 침투된 미세먼지를 제거하는 것은 매우 어려우므로, 미세먼지에 의해 유발되는 피부질환에 대한 근본적인 해결책이 될 수 없다.
한편, 황기(Astragali Radix; Astragalus membranaceus)는 콩과에 속하는 다년생의 초본으로써, 황기 추출물을 함유하는 화장품 등이 피부 미용을 목적으로 개발되었으나, 황기 추출물은 스테로이드 성분을 함유하고 있으므로(Kim, Chungsook, et al.(2003)), 황기 추출물을 미세먼지에 의해 유발되는 피부질환의 예방 또는 치료 목적으로 사용할 경우, 스테로이드 성분에 의한 부작용 가능성이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 포모노네틴의 피부질환 개선 및 피부장벽 강화 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 특허공개 제10-2014-0002374호
본 발명의 하나의 목적은 포모노네틴(formononetin)을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포모노네틴(formononetin)을 포함하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 포모노네틴(formononetin)을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 포함되는 포모노네틴은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.
Figure 112018022379657-pat00001
한편, 포모노네틴은 황기로부터 추출될 수 있는데, 스테로이드 성분을 포함하는 황기 추출물과는 달리, 포모노네틴은 비스테로이드 성분이므로 스테로이드 성분에 의한 부작용이 없을 뿐만 아니라, 포모노네틴을 단독으로 사용하는 것이 황기 추출물을 사용하는 것보다 피부질환의 예방 또는 치료에 효과가 우수하므로, 본 발명의 포모노네틴은 피부질환 특히, 미세먼지에 의해 유발된 피부질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 피부질환의 발병이 감소하는 것을 의미하며, 이미 발병한 피부질환의 증세가 악화되지 않도록 상태를 유지하는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 피부질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 공지된 피부질환에 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 피부질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 피부 외용으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001~1000㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여 시 다양한 제형으로 투여될 수 있는데, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 등일 수 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 겔, 페이스트, 연고, 산제, 유제 및 에어로졸로 이루어진 군에서 선택되는 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 피부질환은 미세먼지에 의해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명의 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함된 유효성분인 포모노네틴은 대기 중 오염물질로 인해 증가한 피부세포의 세포사멸을 억제하고, 피부 각질형성세포의 증식을 촉진하므로, 미세먼지에 의해 유발된 다양한 피부질환의 개선용도로 효과적으로 사용될 수 있으며, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 피부질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름, 검버섯 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 포모노네틴(formononetin)을 포함하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 피부장벽 강화용 화장료 조성물은, 예를 들어, 크림, 수중유(oil in water), 수중실리콘(silicone in water), 에멀션, 유중수(water in oli), 실리콘중수(water in silicone)의 에멀션, 수/유/수 종류 또는 수/실리콘/수 유형의 에멀션 그리고 유/수/유 유형 또는 실리콘/수/실리콘 유형의 에멀션과 같은 다수의 에멀션, 무수의 조성물, 수성 분산액, 기름, 우유, 발삼(balsams), 폼, 로션, 젤, 크림 젤, 히드로알콜 용액, 히드로글리콜릭 용액, 도포제, 비누, 샴푸, 유연제, 세럼(serum), 다당류막, 연고, 무스, 포마드, 파우더, 막대기, 연필, 스프레이와 같은 다수의 에멀션과 같은 임의의 고체, 액체 또는 반-고체 제제로 제시될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 피부장벽 강화용 화장료 조성물은, 예를 들어, 물수건, 히드로겔, 접착용 패치, 비-접착용 패치, 마이크로전자 패치 또는 얼굴 마스크와 같은 다른 종류의 고체 용구에 당해 분야의 기술자에게 알려진 사용 기술을 사용하여 포함될 수 있거나, 메이크업 파운데이션, 예를 들어, 유체 파운데이션 및 콤팩트 파운데이션, 메이크업 제거용 로션, 메이크업 제거용 우유, 컨실러, 아이섀도, 립스틱, 립 프로텍터, 립 글로스 및 파우더와 같은 다른 메이크업 생산물에 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속 이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 포모노네틴은 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 20.0 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 포모노네틴이 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 중량부 미만으로 포함될 경우, 각질형성세포의 세포사멸 억제 및 각질형성세포의 증식 촉진에 대한 충분한 효과가 나타나지 않고, 20.0 중량부 초과로 포함될 경우, 초과분에 대한 피부장벽 강화 효과의 증가분이 미미하므로, 제조원가가 불필요하게 상승하며, 피부 세포에 자극 반응이 나타날 수 있다.
한편, 본 발명의 포모노네틴은 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 20.0 중량부로 포함될 수 있으나, 0.05 내지 17.0 중량부로 포함되는 것이 바람직하며, 0.1 내지 15.0 중량부로 포함되는 것이 피부장벽 강화 효과 측면에서 가장 바람직하다.
포모노네틴을 포함하는 피부질환 개선 및 피부장벽 강화용 조성물에 따르면, 대기 중 오염물질로 인해 증가한 피부세포의 세포사멸을 억제하고, 피부 각질형성세포의 증식을 촉진하여, 미세먼지로 인하여 발생하거나 악화되는 피부장벽의 손상, 피부염, 아토피, 검버섯 등의 피부질환 증상을 개선할 수 있으므로, 이를 위해 제공되는 의약품 및 화장품의 개발 소재로써 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 면역조직화학 검사에 따른, 각질형성세포 증식 마커인 Ki67에 대한 포모노네틴의 발현 유도효과를 나타낸 사진이다.
도 2는 각질형성세포 증식 마커인 Ki67에 대한 포모노네틴의 발현 유도효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 각질형성세포 증식 마커인 KRT17에 대한 포모노네틴의 발현 유도효과를 나타낸 그래프이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미세먼지에 의한 피부손상 평가 방법
<1-1> 식물소재 준비
황기(Astragali Radix; AR)는 경희대 병원(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 황기 15g을 EtOH 200ml로 70℃에서 3시간 동안 추출한 후, Whatman #2 여과지(Whatman International, Maidstone, UK)로 여과하고, 회전 진공 농축기(rotary vacuum evaporator; FD8508S, 부산, 대한민국)에서 증발 및 동결건조하여 황기 추출물을 제조하였다(수율 7.33% w/w). 사용하기 전, 수득한 황기 추출물을 증류된 디메틸 설폭사이드(distilled dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시킨 후, 0.22㎛ 주사기 필터(Millipore, MA, USA)에 통과시켜 멸균하였다.
<1-2> 세포독성 검사
96 well plate에 seeding된 HaCaT 세포주를 하루 배양한 후, 포모노네틴을 10, 50 및 100μM 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양한 다음, PBS로 3회 세척하고, 전날 제조한 50mg/mL의 XTT를 well당 최종농도로 희석하여 넣어, 37℃에서 5% CO2로 조절된 정온기에서 배양하였다. 배양완료 후 spectrophotometer로 450nm에서 흡광도를 측정한 다음 대조군과 비교 조사하였다.
<1-3> 3D 인간 피부 재현 모델 배양, 피부 세포 손상 유도 및 황기 추출물 또는 포모노네틴 처리
제조사에서 제공한 1ml의 배지가 들어있는 12-well plate에 3D 인간 피부 재현 모델(3D human skin reconstructed model)을 넣었다. 미세먼지에 의한 피부 세포 손상을 유도하기 위하여, 3D 피부 재현 모델을 200μg/ml의 디젤배기입자(Diesel Particulate Matter; PM)로 2일마다 6일 동안 자극하였다.
이후, 피부 세포 손상을 유도한 3D 피부 재현 모델에 상기 실시예 <1-1>의 황기 추출물을 100μg/ml로 처리하거나 포모노네틴(formononetin; FMT)을 50μM로 처리한 후, 37℃의 5% CO2 공기 중에서, 2일마다 배지를 교체하며 6일 동안 배양하였다.
<1-4> 면역조직화학 검사
상기 실시예 <1-3>에서 황기 추출물 또는 포모노네틴을 처리한 3D 인간 피부 재현 모델을 4% 파라 포름알데하이드에 고정시키고, 일련의 절편(5μm)을 위해 파라핀에 포매(embedding)한 후, 처리된 절편을 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다(H/E). 면역조직화학검사를 위하여, 염색한 절편을 anti-KRT 17, Ki67 및 절단된 카스파제-3(cleaved Caspase-3)와 72시간 동안 4℃의 가습실(humidified chamber)에서 배양하였다. 그 후, 절편을 상온에서 24시간 동안 적절한 2차 항체와 반응시킨 다음, 슬라이드를 아비딘-바이오틴(avidin-biotin) 복합체 키트(Vector Lab, CA, USA)로 처리한 후, 0.05% 3,3'-디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 및 0.01% HCl로 이루어진 0.05M Tris-HCl 완충액(pH 7.4)으로 처리하고, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색하였다.
DIXI image solution 2.89 소프트웨어(DIXI Optics, Daejeon, Korea)를 사용하는 위상차 현미경(Olympus CK40-32PH, Japan)에 장착된 디지털 카메라(Olympus UC30, 일본)를 사용하여 대조염색한 모든 절편을 검사하였다.
<1-5> HaCaT cell 배양 및 황기 추출물 또는 포모노네틴 처리
HaCaT 세포를 10% FBS, 100units/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 고 포도당(high glucose) DMEM에서 유지시켰다. 다습한 37℃의 5% CO2 공기 중에서, 2일마다 배지를 교체하며 세포를 배양하였다. 컨플루언스(confluence)가 70 내지 80% 일 때, 24시간 동안 무혈청 배지에서 기아(starvation)에 의해 세포를 정지시킨 후, 황기 추출물을 50 또는 100μg/ml로 처리하거나 포모노네틴을 30 또는 50μM로 처리하였다. 이후, 상기 모델을 37℃의 5% CO2 공기 중에서, 2일 마다 배지를 교체하며 6일 동안 배양하였다.
<1-6> 웨스턴 블롯 분석
상기 실시예 <1-3> 및 <1-5>에서 황기 추출물 또는 포모노네틴을 처리한 3D 인간 피부 재현 모델 및 HaCaT 세포를 각각 조직 추출 시약(Thermo Fisher Scientific, IL, USA)으로 용해시켰다. 단백질을 15분 동안 8,000 × g의 4℃에서 원심 분리하여 추출한 후, 상등액을 회수하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 NE-PER 추출 시약(Thermo Fisher Scientific, IL, USA)을 사용하여 세포핵 및 세포질 추출물을 처리하였다. 그 후, 25 내지 50μg의 단백질을 10 내지 12% SDS-PAGE 전기영동으로 분석한 다음, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Merck Millipore, Carrigtwohill, Ireland)으로 옮겼다. 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 1×PBS의 5% 탈지유로 블로킹하고, 1차 항체와 배양한 다음, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)가 컨쥬게이트된 anti IgG 2차 항체와 배양하였다. 그 후, 강화 화학발광(enhanced chemiluminescence, BioRad, CA, USA)으로 모든 멤브레인을 검출하였다. 단백질의 밴드 강도는 GelPro V3.1 소프트웨어(Media Cybernetics, MD, USA)를 사용하여 정량화하였다.
실시예 2. 포모노네틴의 세포독성 범위 확인
포모노네틴의 세포독성 범위를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 세포 생존율을 분석하였다.
그 결과, 정상세포의 생존율을 기준으로 포모노네틴의 10, 50 및 100μM 농도 범위에서, 약 100%의 생존율을 확인하여, 상기 범위에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 1).
실시예 3. 포모노네틴에 의한 Ki67 발현 유도효과 확인
포모노네틴의 피부손상 회복 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-3>의 각 3D 인간 피부 재현 세포에서, 상기 실시예 <1-4> 및 <1-6>의 방법으로 Ki67의 발현을 분석하였다.
그 결과, 6일 동안 PM에 노출된 3D 인간 피부 재현 모델에서는 Ki67 발현이 감소되었으나, 6일 동안 PM에 노출된 3D 인간 피부 재현 모델에 포모노네틴을 처리할 경우, Ki67의 발현이 증가되었다. 한편, 황기 추출물에 비하여, 포모노네틴의 Ki67 발현 유도효과가 더욱 우수하였다(도 2 및 도 3).
즉, 각질형성세포 증식 마커인 Ki67의 미세먼지에 의한 발현 감소는 포모노네틴에 의해 회복될 수 있으므로, 손상된 각질세포의 회복에 따른 피부장벽 강화 효과를 확인하였다.
실시예 4. 포모노네틴에 의한 KRT17 발현 유도효과 확인
포모노네틴의 피부손상 회복 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-5>의 각 HaCaT 세포에서, 상기 실시예 <1-6>의 방법으로 KRT17의 발현을 분석하였다.
그 결과, PM에 노출된 HaCaT 세포에서는 KRT17 발현이 감소되었으나, PM에 노출된 HaCaT 세포에 포모노네틴을 처리할 경우, KRT17의 발현이 증가되었다. 한편, 황기 추출물에 비하여, 포모노네틴의 KRT17 발현 유도효과가 더욱 우수하였다(도 4).
즉, 상기 결과를 통하여, 각질형성세포 증식 마커인 KRT17의 미세먼지에 의한 발현 감소는 포모노네틴에 의해 회복될 수 있으므로, 손상된 각질세포의 회복에 따른 피부장벽 강화 효과를 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 포모노네틴(formononetin)을 포함하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 포모노네틴은 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 20.0 중량부로 포함되는 것인 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
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