KR101875571B1 - 키토산으로 코팅된 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는 키토산으로 코팅된 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말 및 이의 제조방법이 개시된다. 상기 푸코잔틴 미세분말은 키토산으로 코팅 또는 캡슐화된 것으로서 나노 크기의 평균 입경을 갖고 화학적 안정성이 높아 유제품 또는 물에 쉽게 분산, 용해되며 생체에 효과적으로 흡수되어 푸코잔틴의 높은 생리활성을 구현할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 명세서에는 키토산으로 코팅된 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말 및 이의 제조방법이 개시된다.
푸코잔틴 (fucoxanthin)은 카로티노이드 (carotenoid) 색소류 잔토필의 일종으로서, 갈조식물과 황색식물에 함유되어 있고 에폭사이드와 수산기들을 갖는 알렌 구조 (allene structure)를 가지고 있다. 생리활성 면에서, 푸코잔틴은 비만, 당뇨, 암, 그리고 염증 등에 효과가 있다고 보고된 바 있다 (Maeda H, Tsukui T, Sashima T, Hosokawa M and Miyashita K. (2008). Seaweed carotenoid, fucoxanthin, as a multi-functional nutrient. Asia Pac J Clin Nutr, 17:196-199).
푸코잔틴의 생산은 대부분 육상식물 및 해양 거대조류 (다시마 등), 혹은 이를 섭취하는 생물의 내장에서 추출하여 왔으나, 함유량이 매우 적어 생산 원가가 매우 비싼 단점이 있다. 최근에는, 미세조류에서 기존 원료 대비 10배에서 최대 200배 이상을 함유하고 있는 것이 확인되어 이러한 색소류의 생산이 육상식물 및 거대조류로부터 미세조류로 확대되고 있다.
한편, 푸코잔틴은 폴리엔 (polyene) 구조로 인하여 빛, 열 그리고 산소에 대해서 매우 불안정하다 (Delgado-Vargas F, Jimenez AR and Paredes-Lopez O. (2000). Natural pigments: carotenoids, anthocyanins, and betalains-characteristics, biosynthesis, processing, and stability. Crit Rev Food Sci Nutr, 40:173-289). 따라서, 푸코잔틴의 높은 생리활성을 얻기 위해서는, 푸코잔틴이 화학적으로 안정해야 하고 생체에 흡수가 효과적으로 잘 되어야 한다.
일 측면에서, 본 명세서는 푸코잔틴을 화학적으로 안정화시키고 용해도 및 생체 이용률을 높이기 위해 키토산으로 코팅 또는 캡슐화한 푸코잔틴 미세분말을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다른 측면에서, 본 명세서는 푸코잔틴을 화학적으로 안정화시키고 용해도 및 생체 이용률을 높이기 위해 키토산으로 코팅 또는 캡슐화한 푸코잔틴 미세분말을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 (1) 푸코잔틴을 알코올 용매에 용해시켜 푸코잔틴 용액을 제조하는 단계; (2) 카세인 수용액을 제조하는 단계; (3) 상기 푸코잔틴 용액 및 카세인 수용액을 혼합하는 단계; (4) 상기 혼합 용액에 칼슘염을 첨가한 후 균질화하는 단계; (5) 상기 균질화한 혼합 용액을 건조시켜 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말을 제조하는 단계; 및 (6) 상기 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말을 키토산으로 코팅하는 단계를 포함하는 푸코잔틴 미세분말의 제조방법을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (1)단계에서 푸코잔틴은 해조류 또는 미세조류에서 분리된 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (1)단계에서 알코올 용매는 탄소수 1 내지 6의 알코올 용매일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (1)단계에서 알코올 용매는 에탄올 용매일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (2)단계에서 카세인 수용액은 0.5 내지 3% (w/v)의 농도를 갖는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계에서 칼슘염은 구연산칼슘 (calcium salts of citric acid), 글루콘산칼슘 (calcium gluconate), 글리세로인산칼슘 (calcium glycerophosphate), 산화칼슘 (calcium oxide), 수산화칼슘 (calcium hydroxide), 염화칼슘 (calcium chloride), 젖산칼슘 (calcium lactate), 제삼인산칼슘 (calcium phosphate, tribasic), 제이인산칼슘 (calcium phosphate, dibasic), 제일인산칼슘 (calcium phosphate, monobasic), 탄산칼슘 (calcium carbonate) 및 황산칼슘 (calcium sulfate)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계는 혼합 용액에 1 내지 5 %(w/v) 농도의 칼슘염 용액을 첨가한 후 균질화하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계는 혼합 용액에 인산염을 더 첨가하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 인산염은 제일인산나트륨, 제이인산나트륨, 제삼인산나트륨, 제일인산칼륨, 제이인산칼륨 및 제삼인산칼륨으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계에서 균질화는 1,000 내지 20,000 rpm으로 교반하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (6)단계는 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말을 포함하는 용액; 및 산 용매에 키토산을 용해시킨 키토산 용액을 혼합하는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 푸코잔틴과 카세인을 포함하는 코어층; 및 상기 코어층에 형성되고, 키토산을 포함하는 코팅층;을 포함하는 용해도가 증진된 푸코잔틴 미세분말을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 푸코잔틴 미세분말은 1 ㎛ 이하의 평균 입경을 갖는 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 푸코잔틴을 화학적으로 안정화시키고 용해도 및 생체 이용률을 높이기 위해 키토산으로 코팅 또는 캡슐화한 푸코잔틴 미세분말을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 푸코잔틴을 화학적으로 안정화시키고 용해도 및 생체 이용률을 높이기 위해 키토산으로 코팅 또는 캡슐화한 푸코잔틴 미세분말을 제공하는 효과가 있다.
본 명세서에 따른 푸코잔틴 미세분말은 나노 크기의 평균 입경을 가져 유제품 또는 물에 쉽게 분산 및 용해되며 화학적 안정성이 높아 생체에 효과적으로 흡수되어 푸코잔틴의 높은 생리활성을 구현할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 명세서의 일 실시예에 따른 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말을 제조하는 방법의 개요도를 나타낸 것이다.
도 2는 소화 과정 동안 푸코잔틴의 대사 (A) 및 실시예에 기재된 Pt-powder, FX-fr, FX-CN, FX-CS-CN의 사진 (B)을 나타낸 것이다.
도 3은 500 nm의 스케일 바에서 FX-CN (A) 및 FX-CS-CN (B)의 전계방사형 주사전자현미경 (Field emission scanning electron microscope, FE-SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 명세서의 일 시험예에서 물에 첨가된 푸코잔틴 미세분말 (FX-CN, FX-CS-CN)과 푸코잔틴 분말 (FX-fr)의 용해도를 외관상 비교 관찰한 사진이다.
도 5는 FX-fr (A), 카세인 (B), FX-CN (C), 키토산 (D) 및 FX-CS-CN (E)의 푸리에 변환 적외선 (Fourier transform-infrared, FT-IR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 인 비트로 모조 소화 시험 동안 FX-CN, FX-CS-CN, Pt-poweder 내 푸코잔틴 (FX)의 소화 안정성 (A-C) 및 생체 접근률 (D-F)을 비교 분석한 것이다.
도 2는 소화 과정 동안 푸코잔틴의 대사 (A) 및 실시예에 기재된 Pt-powder, FX-fr, FX-CN, FX-CS-CN의 사진 (B)을 나타낸 것이다.
도 3은 500 nm의 스케일 바에서 FX-CN (A) 및 FX-CS-CN (B)의 전계방사형 주사전자현미경 (Field emission scanning electron microscope, FE-SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 명세서의 일 시험예에서 물에 첨가된 푸코잔틴 미세분말 (FX-CN, FX-CS-CN)과 푸코잔틴 분말 (FX-fr)의 용해도를 외관상 비교 관찰한 사진이다.
도 5는 FX-fr (A), 카세인 (B), FX-CN (C), 키토산 (D) 및 FX-CS-CN (E)의 푸리에 변환 적외선 (Fourier transform-infrared, FT-IR) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 인 비트로 모조 소화 시험 동안 FX-CN, FX-CS-CN, Pt-poweder 내 푸코잔틴 (FX)의 소화 안정성 (A-C) 및 생체 접근률 (D-F)을 비교 분석한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 (1) 푸코잔틴을 알코올 용매에 용해시켜 푸코잔틴 용액을 제조하는 단계; (2) 카세인 수용액을 제조하는 단계; (3) 상기 푸코잔틴 용액 및 카세인 수용액을 혼합하는 단계; (4) 상기 혼합 용액에 칼슘염을 첨가한 후 균질화하는 단계; (5) 상기 균질화한 혼합 용액을 건조시켜 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말을 제조하는 단계; 및 (6) 상기 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말을 키토산으로 코팅하는 단계를 포함하는 푸코잔틴 미세분말의 제조방법을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (1)단계에서 푸코잔틴은 80% 이상, 더욱 구체적으로 80 내지 99%의 순도를 갖는 것일 수 있다.
하기 화학식 1의 구조를 갖는 푸코잔틴은 갈조류가 띠는 갈색의 원인물질이며 엽록체의 부분색소이기도 하다. 푸코잔틴은 갈조식물과 황색식물에 함유되어 있으며, 예컨대 미역, 모자반, 다시마, 톳 등의 해조류, 페오닥틸룸 트리코르누툼 (Phaeodactylum tricornutum), 아이소크리시스 갈바나 (Isochrysis galbana), 체토세로스 그라실리스 (Chaetoceros gracilis), 사이린드로데카 클로스테리움 (Cylindrotheca closterium), 오돈텔라 아루리타 (Odontella aurita) 등의 미세조류로부터 분리될 수 있다. 본 명세서에서 푸코잔틴은 당해 기술분야에서 이용되는 통상의 방법에 따라 추출 또는 분리될 수 있으며, 시판되는 것 등의 제한이 없이 사용 가능하다.
[화학식 1]
카세인은 우유의 주요 단백질로서 일종의 인 단백질이며, 우유 속에 약 3% 함유되어 있으면서 우유에 함유된 전체 단백질의 약 80%를 차지한다. 카세인은 비교적 열에 강하고 pH 4.6에서 침전하는 성질이 있으며 이를 등전점 (Isoelectric point)이라고 한다. 즉, 카세인은 우유에 산을 가하여 pH를 4.6으로 하면 등전점에 도달하여 침전되므로, 쉽게 조제될 수 있다. 우유를 산성으로 하면 카세인 복합물의 칼슘과 일부의 염은 가용성이 되어 유청으로 유리되고 카세인만 순수한 상태로 침전하게 된다. 이러한 침전 방법으로 카세인과 유청이 분리되게 된다. 본 명세서에서 카세인 또는 카세인 수용액은 당해 기술분야에서 이용되는 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 시판되는 것 등의 제한이 없이 사용 가능하다.
카세인은 불용성이므로 직접 사용할 수 없어 수용액으로 제조하여 사용한다. 예시적인 일 구현예에서, 상기 (2)단계에서 카세인 수용액은 물에 잘 녹지 않는 카세인을 수산화나트륨 등으로 처리하여 물에 잘 녹게 만든 카세인 나트륨을 물 또는 에탄올 수용액에 용해시켜 제조될 수 있다. 다른 측면에서, 상기 카세인 수용액은 카세인 분말을 뜨거운 물에 넣고 탄산수소나트륨을 가하여 pH가 7이 되도록 조정하여 완전히 용해될 때까지 저어줌으로써 제조될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (2)단계에서 카세인 수용액은 0.5 내지 3% (w/v)의 농도를 갖는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 (2)단계에서 카세인 수용액은 0.5% (w/v) 이상, 1.0% (w/v) 이상, 1.5% (w/v) 이상 또는 2.0% (w/v) 이상이면서 3% (w/v) 이하, 2.5% (w/v) 이하 또는 2.0% (w/v) 이하의 농도를 갖는 것일 수 있다. 이에 따라, 푸코잔틴의 포집 효율을 높이고 화학적 안정성이 우수한 나노 크기의 푸코잔틴 미세분말을 제공하는 효과가 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (3)단계는 푸코잔틴 용액 및 카세인 수용액을 혼합하고 1 내지 5 시간 동안 교반하여 에탄올을 증발시키고 푸코잔틴 및 카세인 복합체를 형성하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계에서 칼슘염은 구연산칼슘 (calcium salts of citric acid), 글루콘산칼슘 (calcium gluconate), 글리세로인산칼슘 (calcium glycerophosphate), 산화칼슘 (calcium oxide), 수산화칼슘 (calcium hydroxide), 염화칼슘 (calcium chloride), 젖산칼슘 (calcium lactate), 제삼인산칼슘 (calcium phosphate, tribasic), 제이인산칼슘 (calcium phosphate, dibasic), 제일인산칼슘 (calcium phosphate, monobasic), 탄산칼슘 (calcium carbonate) 및 황산칼슘 (calcium sulfate)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계는 혼합 용액에 1 내지 5 %(w/v) 농도의 칼슘염 용액을 첨가한 후 균질화하는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 (4)단계는 혼합 용액에 1% (w/v) 이상, 1.5% (w/v) 이상, 2% (w/v) 이상, 2.5 (w/v) 이상, 3% (w/v) 이상, 3.5% (w/v) 이상, 4% (w/v) 이상 또는 4.5% (w/v) 이상이면서 5% (w/v) 이하, 4.5% (w/v) 이하, 4.0% (w/v) 이하, 3.5% (w/v) 이하, 3% (w/v) 이하, 2.5% (w/v) 이하, 2% (w/v) 이하 또는 1.5% (w/v) 이하 농도의 칼슘염 용액을 첨가한 후 균질화하는 것일 수 있다. 이에 따라, 카세인으로 둘러싸인 푸코잔틴 미셀 구조를 형성하여 푸코잔틴의 화학적 안정성이 우수한 나노 크기의 푸코잔틴 미세분말을 제공하는 효과가 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계는 혼합 용액에 인산염을 더 첨가할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 인산염은 제일인산나트륨, 제이인산나트륨, 제삼인산나트륨, 제일인산칼륨, 제이인산칼륨 및 제삼인산칼륨으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계에서 균질화는 1,000 내지 20,000 rpm, 또는 1,000 내지 15,000 rpm, 또는 1,000 내지 10,000 rpm, 또는 1,000 내지 9,000 rpm, 또는 1,000 내지 8,000 rpm, 또는 1,000 내지 7,000 rpm, 또는 1,000 내지 6,000 rpm, 또는 1,000 내지 5,000 rpm으로 교반하는 것일 수 있다. 상기 균질화는 혼합물의 각 성분들을 분산시켜 전체를 균질하게 하는 공정을 의미한다. 상기와 같이 균질화함으로써 카세인으로 둘러싸인 푸코잔틴 미셀 구조를 형성하여 푸코잔틴의 화학적 안정성이 우수한 나노 크기의 푸코잔틴 미세분말을 제공하는 효과가 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (4)단계에서 균질화 시간은 2분 내지 10분일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (5)단계는 균질화한 혼합 용액을 분무건조 (spray drying)하여 푸코잔틴 미세분말을 제조하는 것일 수 있다. 분무건조는 혼합 용액을 뜨거운 바람 중에 분무 분산시켜 열풍으로 수분을 제거하고 급속히 건조시켜 파우더 상태의 생성물을 얻는 건조법을 의미한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 (6)단계는 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말을 포함하는 용액; 및 키토산 용액을 혼합하는 것일 수 있다.
키토산은 새우, 가재, 게, 곤충의 껍질, 오징어 뼈 등 갑각류에 많이 함유되어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 물질을 말하며, 주성분은 폴리글루코사민으로 고분자 구조의 무색 비결정성 분말이다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산 용액은 산 용매에 키토산을 용해시킨 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 산 용매는 아세틱애씨드 (acetic acid). 글라이콜릭애씨드 (glycolic acid), 락틱애씨드 (lactic acid), 시트릭애씨드 (citric acid), 말릭애씨드 (malic acid) 및 타타릭애씨드 (tartaric acid)로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 포함하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 산 용매는 아세틱애씨드 (acetic acid). 글라이콜릭애씨드 (glycolic acid), 락틱애씨드 (lactic acid), 시트릭애씨드 (citric acid), 말릭애씨드 (malic acid) 및 타타릭애씨드 (tartaric acid)로 구성된 군에서 선택되는 1 이상을 0.05 내지 1% (w/w)의 농도로 포함하는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 산 용매는 0.05% (w/w) 이상, 0.06% (w/w) 이상, 0.07% (w/w) 이상, 0.08% (w/w) 이상, 0.09% (w/w) 이상 또는 0.1% (w/w) 이상이면서 1% (w/w) 이하, 0.9% (w/w) 이하, 0.8% (w/w) 이하, 0.7% (w/w) 이하, 0.6% (w/w) 이하, 0.5% (w/w) 이하, 0.4% (w/w) 이하, 0.3% (w/w) 이하, 0.2% (w/w) 이하 또는 0.1% (w/w) 이하의 농도로 산을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산 용액은 키토산을 0.05 내지 5% (w/w)의 농도로 포함하는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 키토산 용액은 키토산을 0.05% (w/w) 이상, 0.1% (w/w) 이상, 0.5% (w/w) 이상, 1% (w/w) 이상, 1.5% (w/w) 이상, 2% (w/w) 이상, 2.5% (w/w) 이상, 3% (w/w) 이상, 3.5% (w/w) 이상, 4% (w/w) 이상, 4.5% (w/w) 이상 또는 5% (w/w) 이상이면서, 5% (w/w) 이하, 4.5% (w/w) 이하, 4% (w/w) 이하, 3.5% (w/w) 이하, 3% (w/w) 이하, 2.5% (w/w) 이하, 2% (w/w) 이하, 1.5% (w/w) 이하, 1% (w/w) 이하, 0.5% (w/w) 이하, 0.1% (w/w) 이하 또는 0.05% (w/w) 이하의 농도로 포함하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 70% 이상, 구체적으로 70 내지 99%, 또는 70 내지 90%, 또는 70 내지 80%의 푸코잔틴 포집 효율을 가질 수 있다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 푸코잔틴과 카세인을 포함하는 코어층; 및 상기 코어층에 형성되고, 키토산을 포함하는 코팅층(또는 캡슐층);을 포함하는 용해도가 증진된 푸코잔틴 미세분말을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 코어층은 푸코잔틴이 카세인으로 둘러싸인 구조를 갖는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 푸코잔틴 미세분말은 구형 (bulb shape)일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 푸코잔틴 미세분말의 표면은 양전하를 띠는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 푸코잔틴 미세분말은 1 ㎛ 이하의 평균 입경을 갖는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 푸코잔틴 미세분말은 100 nm 이상, 200 nm 이상 또는 300 nm 이상이면서 900 nm 이하, 800 nm 이하, 700 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하 또는 300 nm 이하의 평균 입경을 갖는 것일 수 있다. 평균 입경은 미세분말 입자들의 평균 직경을 말한다.
본 명세서는 해조류 또는 미세조류에서 분리된 80% 이상의 순도를 갖는 푸코잔틴을 높은 포집 효율로 코팅 또는 캡슐화하여 화학적 안정성이 우수한 푸코잔틴 미세분말을 제공하는 효과가 있다. 상기 푸코잔틴 미세분말은 pH, 빛, 열 및 산소 등에 대한 화학적 안정성이 높다.
또한, 본 명세서에 따른 푸코잔틴 미세분말은 나노 크기의 평균 입경을 갖는 것으로서 푸코잔틴의 용해도를 증가시키고 푸코잔틴의 분산성을 높여 용해 시 응집 현상이 발생하는 것을 방지한다. 따라서, 유제품 또는 물에 쉽게 용해 및 분산되어 식품 소재로 활용이 높고 생체에 효과적으로 흡수되어 높은 생리활성을 구현할 수 있는 효과가 있다.
다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 기술은 상기 푸코잔틴 미세분말을 포함하는 식품 또는 식품 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 푸코잔틴 미세분말의 제조
BioOne Co. Ltd. (Gangneung-si, Gangwon-do, Korea)로부터 Phaeodactylum tricornutum 분말 (이하 Pt-power로 지칭) 및 Phaeodactylum tricornutum 유래 푸코잔틴 분획 분말 (이하 FX-fr로 지칭), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 카세인 나트륨 염 및 키토산을 입수하여 하기 시험에 사용하였다.
카세인 나트륨 염 3 g을 120분 동안 약한 열을 가하고 적절히 교반하여 40% (v/v) 에탄올 수용액 150 mL에 용해시킴으로써 카세인 수용액을 제조하였다. 카세인 나트륨 염이 완전히 수화된 후, 12 mg/mL 푸코잔틴 분말 (FX-fr)이 함유된 에탄올 용액 (2 mL)을 2% 카세인 수용액 150 mL에 60분간 교반하면서 첨가하였다. 이 과정에서 에탄올이 증발되고 푸코잔틴이 소수성 작용으로 응집되면서 푸코잔틴과 카세인이 집합체를 형성하기 시작하였다. 이후, 0.1 M K2HPO4 35 mL 및 0.4 M 트리포타슘 시트레이트 3 mL를 첨가하고, 0.03 M CaCl2 110 mL를 드롭 방식으로 첨가한 후 고속 균질기 (ULTRA-TURRAX® T18, IKA, Stauffen, Germany)를 사용하여 5분간 15000 rpm에서 균질화하여 카세인으로 둘러싸인 액상의 푸코잔틴 미셀 (micelle)을 형성하였다 (도 1 참조). 균질화 후, 실린지 펌프를 사용하여 혼합 용액을 전자분무 시스템에 주입하였다. 5 kV의 고정 전압 및 130 μL/min의 유량으로 혼합 용액을 노즐을 통해 분사하여 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말 (이하 FX-CN으로 지칭)을 수득하였다.
또한, 키토산을 0.1% (w/v)의 아세트산을 포함하는 증류수에 용해시켜 키토산 용액 (0.1%, w/v)을 준비하였다. 불순물을 제거하기 위해, 키토산 용액을 0.45-㎛ 시린지 필터 (Minisart®, Sartorius AG, Gottingen, Germany)로 여과하였다. 이후, 키토산 용액을 상기 제조한 FX-CN이 함유된 용액에 적가하고 1시간 동안 부드럽게 교반하여 최종적으로 키토산으로 코팅된 카세인 기반의 푸코잔틴 미세분말 (이하 FX-CS-CN으로 지칭)을 수득하였다.
상기 제조된 FX-CN 및 FX-CS-CN 미세분말 나노입자는 동결건조기 (FDCF-12003, OPERON, Kimpo, Korea)로 48시간 동안 -120 ℃에서 동결건조하였고, 건조된 샘플은 시험에 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하였다. 한편, 동결건조 후 노란색을 띠는 FX-CN 및 FX-CS-CN의 미세분말을 수득하여 도 2의 (B)에 나타내었다.
시험예
1.
푸코잔틴
미세분말의 특성 분석
상기 제조된 푸코잔틴 미세분말의 평균 입자 크기, 제탄 포텐셜, PDI (polydispersity index) 값은 25 ℃에서 90°A의 검출 각도로 NanoZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK)를 사용하여 동적광산란법 (dynamic light scattering)으로 측정하였다.
또한, 푸코잔틴 미세분말의 포집 효율 (Encapsulation efficiency)은 실질적인 입자 내 함유된 푸코잔틴의 함량으로서, 정확히 측정된 양 (0.1 g)을 에탄올에 분산 및 용해시키고 1시간 동안 초음파 처리하여 하기 식과 같이 측정되었다. 이론적 함량은 제조 과정 동안 어떠한 손실 없이 모든 푸코잔틴이 입자 내 포집되었음을 가정한 것이다.
포집 효율 (Encapsulation efficiency, %) = 포집된 푸코잔틴의 실제 함량(actual amount) / 이론적 함량(theoretical amount) × 100
| 나노입자 | 평균 입자 크기 (nm) |
제타 포텐셜 (mV) |
PDI | 포집 효율 (%) |
| FX-CN | 236.81 ± 12.58 | -12.87 ± 1.63 | 0.31 ± 0.03 | 73.72 ± 8.99 |
| FX-CS-CN | 276.90 ± 25.57 | 24.00 ± 2.84 | 0.39 ± 0.03 | 71.84 ± 2.19 |
평균 입자 크기는 입자들의 평균 입경을 의미하는 것으로서, 상기 실시예 1에서 제조된 FX-CN 및 FX-CS-CN은 나노 크기를 갖는 것을 확인하였다. 이에 따라, 본 명세서에 따른 푸코잔틴 미세분말은 음료 제형에 적용 시 용해도를 높일 수 있을 뿐만 아니라 수용액 내 분산성을 높여 하층부에 응집 현상이 발생하는 것을 방지할 수 있음을 알 수 있었다.
제타 포텐셜은 입자 표면의 전하 (charge) 값을 나타내고, 콜로이드 현탁액 (colloidal suspension)의 안정성을 나타내며 30 mV의 절대값 (±30 mV)에 가까운 입자의 제타 포텐셜이 안정한 상태인 것으로 알려져 있다. 카세인 자체는 음전하를 띠는 물질로서 푸코잔틴이 카세인으로 코팅될 경우 푸코잔틴 미세분말 입자 표면의 전하 값은 음전하를 띠게 된다. FX-CN은 입자 표면에 존재하는 카세인의 카르복실기로 인해 음전하를 띠고 FX-CS-CN은 입자 표면에 존재하는 키토산의 아민기로 인해 양전하를 띠는 것으로 나타났다. 이에 따라, FX-CN, FX-CS-CN은 푸코잔틴이 각각 카세인, 키토산에 의해 캡슐화 또는 코팅되어 안정한 상태로 존재할 수 있음을 확인하였다.
PDI는 이질성 지수를 나타내며, PDI 값이 높을수록 이질성이 높은 분산 상태를 나타낸다. 표 1에서 보는 바와 같이, FX-CN 및 FX-CS-CN은 비교적 안정하고 동질의 분산 상태를 갖는 것을 알 수 있었다.
푸코잔틴의 포집 효율의 최대화를 위해 0.5 내지 3% (w/v)의 범위로 카세인 농도를 변화시켜 푸코잔틴 미세분말을 제조하여 카세인 수용액의 최적 농도를 결정하였고, 그 중에서 2% 카세인 수용액이 가장 우수한 푸코잔틴 포집 효율을 나타내는 것을 확인하였다. 이 경우, FX-CN 및 FX-CS-CN의 포집 효율은 각각 73.72% 및 71.84%였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 푸코잔틴 미세분말의 제조 과정에서 초음파 균질화, 전자분무와 같은 기계적 공정이 푸코잔틴의 포집 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있음에도 불구하고 카세인과 키토산은 푸코잔틴의 우수한 포집 효율과 미세분말 나노입자의 높은 안정성을 제공할 수 있음을 알 수 있었다.
시험예 2. 푸코잔틴 미세분말의 표면 관찰
상기 제조된 푸코잔틴 미세분말의 형태는 FE-SEM (SU70, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 FX-CN (A) 및 FX-CS-CN (B)의 형태는 구형에 가깝고 거의 균일한 것을 알 수 있었다.
시험예 3. 푸코잔틴 미세분말의 용해도 관찰
상기 제조된 FX-CN, FX-CS-CN과 카세인 및 키토산으로 코팅되지 않은 푸코잔틴 분말 FX-fr을 각각 3 mg/mL의 농도로 물에 첨가하여 동일한 온도 및 시간 조건에서 용해도를 관찰하였다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 FX-CN 및 FX-CS-CN은 침전 현상을 보이지 않고 물에 잘 분산되어 완전히 용해되는 반면, FX-fr은 분산되지 못하고 튜브 벽과 바닥에 응집물을 형성하여 물에 완전히 용해되지 못하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 명세서에 개시된 푸코잔틴 미세분말은 카세인 및 키토산을 사용함에 따라 캡슐화된 지용성 성분의 물에 대한 용해도가 친수성 코팅 물질에 의해 개선됨을 알 수 있었다.
시험예 4. 푸코잔틴 미세분말의 구조 특성 분석
푸코잔틴 미세분말의 구조 특성은 20 ℃에서 모델 V430 장치 (Jasco, Tokyo, Japan)를 사용하여 FT-IR로 분석하였다. 모든 샘플은 포타슘 브로마이드 (KBr)와 1:10의 비율로 혼합되었고 수압기에서 5톤의 압축에 의해 펠릿으로 형성되었다. 각 스펙트럼은 600-4000 cm-1의 파장 범위에서 4 cm-1의 해상도로 64번 스캔의 평균으로부터 얻어졌다.
FT-IR 분석 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 FX-fr (A)은 일반적으로 푸코잔틴에서 발견되는 피크를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, FX-fr (A) 및 카세인 (B)에서 보인 주요 피크가 FX-CN (C)에서도 나타나 푸코잔틴이 카세인 내 잘 포집되어 있음을 알 수 있었고, FX-CS-CN (E)의 피크로부터 푸코잔틴이 카세인 및 키토산을 사용하여 나노입자를 잘 형성하고 있음을 확인하였다.
시험예 5. 인 비트로 모조 소화 시험 (
in vitro
simulated digestion assay)
인 비트로 모조 소화 시험은 공지된 방법 (Garrett, D. A.; Failla, M. L.; Sarama, R. J. Development of an in vitro digestion method to assess carotenoid bioavailability from meals. J. Agri. Food Chem. 1999, 47, 4301-4309.)을 약간 변형하여 실시하였다.
입에서 소장까지 인간 위장관 (gastrointestinal tract, GI tract)의 모조 소화 시험을 통해 단계별 소화 안정성 (digestive stability) 및 생체 접근률 (bioaccessibility)을 비교 분석하였고, 각 샘플은 입 (mouth), 위 (stomach), 및 3 단계의 소장 (십이지장(duodenum), 공장(jejunum), 회장(ileum))을 포함하는 소화 단계를 모사하기 위해 단일 시험 튜브에서 적당한 효소, 온도, 시간 및 pH로 연속적으로 처리되었다.
구체적으로, 120 mM NaCl, 5 mM KCl 및 6 mM CaCl2 (pH 5.5)를 포함하는 생리식염수 10 mL에 FX-CN, FX-CS-CN, Pt-poweder 분말 (25 mg) 각각을 균질화하고, α-아밀라아제 1000 유닛을 첨가한 후 pH를 6.5로 조정하였다. 생리식염수를 12.5 mL의 부피로 첨가한 후, 소화의 입 단계와 유사하도록 95 rpm으로 진탕수욕조 (shaking water bath)에서 샘플을 37 ℃에서 5분간 보관하였다. 소화의 위 단계와 유사하도록, 염산을 사용하여 샘플의 pH를 2.2로 산성화하고 돼지 펩신 용액 0.5 mL (0.1 N HCl 내 0.075 g/mL)를 첨가하였다. 샘플을 15 mL의 부피로 생리식염수로 재현탁하고 37 ℃에서 2시간 동안 보관하였다. 소장의 십이지장 (duodenum) 단계는 담즙 추출물 250 mg, 췌장 리파아제 0.5 mL (0.01 g/mL), 판크레아틴 0.5 mL (0.08 g/mL)를 첨가하고 1 M 탄산수소나트륨을 첨가하여 pH를 5.5로 조정한 후 최종 부피 20 mL로 37 ℃에서 30분간 보관하였다. 소장의 공장 (jejunum) 단계는 pH를 6.0으로 조정하고 최종 부피 22.5 mL로 샘플을 37 ℃에서 90분간 보관하였다. 마지막으로 소장의 회장 (ileum) 단계는 pH를 7.0으로 조정하고 최종 부피 25 mL로 샘플을 37 ℃에서 5시간 동안 보관하였다.
한편, 본 명세서에서 푸코잔틴 (FX 및 FXOH)은 다이오드 어레이 디텍터 (1200 series, Agilent, Santa Clara, CA, USA)와 연결된 고압 액체 크로마토그래피 (High pressure liquid chromatography)로 정량하였다. 분리를 위해 YMC C-30 카로티노이드 컬럼 (150 × 4.6 mm 내경, 3 μm 입자 크기, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였고, 메탄올 및 물 용매 시스템을 이동상으로 35 ℃의 컬럼 온도로 0.7 mL/min의 유량에서 실시하였다. 메탄올/물 비율은 20분 이상 90:10 내지 100:0으로 증가시켰고 다음 5분간 100% 메탄올에서 고정하였다. 450 nm에서 얻은 크로마토그램을 FX 및 FXOH의 정량 분석에 사용하였다.
카로티노이드인 푸코잔틴은 낮은 pH와 산소에 의해 쉽게 분해될 수 있고, 위장관에서 소화 과정 동안 푸코잔틴은 위산과 산화적 화학 물질에 의해 이러한 요인에 노출된다. 따라서, 소화 과정 동안 푸코잔틴의 소화 안정성은 식품 소재 개발에 있어서 중요한 요소이다.
전체 푸코잔틴 (FX 및 FXOH)의 소화 안정성을 측정하여 인 비트로 모조 소화 시험에서 푸코잔틴의 안정성을 시험한 결과, 도 6의 (A)-(C)에서 보는 바와 같이 FX-CN, FX-CS-CN, Pt-poweder 내 FX는 소장의 십이지장 단계에서 리파아제 및 콜레스테롤 에스테라아제에 의해 FXOH로 대사되기 시작하는 것을 알 수 있었다 (도 2의 (A) 참조). 모조 소화 과정 동안 전체 푸코잔틴이 약간 감소하였으나 소장의 마지막 단계인 회장 (ileum)까지 미세분말 입자 내의 푸코잔틴이 안정한 상태로 존재할 수 있음을 확인하였다. 특히, pH가 낮은 위 (stomach)에서 푸코잔틴의 안정성이 떨어진 Pt-powder 대비 FX-CN, FX-CS-CN에서는 보다 높은 푸코잔틴의 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다.
생체 내 소화 과정에서, 혼합된 미셀 및 베지클은 지방 소립 (lipid droplet)의 표면으로부터 지방 소화 생산물 및 지방을 가용화할 수 있고 흡수를 위해 점액층으로 코팅된 장관상피세포로 이동된다. 인 비트로 모조 소화 시험에서 미셀 상 (micelle phase)은 이러한 혼합된 미셀 및 베지클을 포함하고, 이에 따라 미셀 상에서 전체 푸코잔틴의 양을 분석함으로써 푸코잔틴의 생체 접근률을 유추할 수 있다. 전체 푸코잔틴 (FX 및 FXOH)의 생체 접근률을 측정하기 위해 용액의 원심분리를 통해 얻은 미셀 상을 분석하였다. 생체 접근률은 소화 과정 동안 음식 매트릭스로부터의 방출을 의미할 수 있으며, 생체 접근률이 높을수록 우수한 생체 이용률을 가질 수 있다.
도 6의 (D)-(F)에서 보는 바와 같이, 소화의 소장 단계 이전에 분리된 미셀 상에서 FX-CN, FX-CS-CN은 푸코잔틴을 포함하는 혼합된 미셀 및 베지클을 생산하는 반면, Pt-powder는 푸코잔틴을 포함하는 혼합된 미셀 및 베지클을 거의 생산하지 못하였다. 소화의 소장 단계에서는, FX-CN 및 FX-CS-CN의 미셀 상은 각각 64.30-73.28% 및 36.12-61.22% 수치 범위의 전체 푸코잔틴 (FX 및 FXOH)을 포함하였다. 이는 Pt-powder에서 보인 26.12-47.92%보다 높은 수치이다. 따라서, FX-CN 및 FX-CS-CN의 푸코잔틴 생체 접근률은 Pt-powder보다 우수하고, 또한 FX-CN 및 FX-CS-CN의 경우 푸코잔틴이 매트릭스로부터 용이하게 방출되어 우수한 생체 이용률을 가질 수 있음을 확인하였다.
시험예 6. 통계적 분석
모든 시험은 3번 반복하였고 모든 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 평균 간 유의적 차이는 t-test 및 one-way ANOVA(P < 0.05)로 분석되었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (13)
- 푸코잔틴 미세분말의 제조방법으로,
(1) 푸코잔틴을 에탄올 용매에 용해시켜 푸코잔틴 용액을 제조하는 단계;
(2) 0.5 내지 3% (w/v) 농도의 카세인 수용액을 제조하는 단계;
(3) 상기 푸코잔틴 용액 및 카세인 수용액을 혼합하고 교반하여 에탄올을 증발시키고 푸코잔틴 및 카세인의 복합체를 형성하는 단계;
(4) 상기 복합체에 칼슘염 용액을 첨가한 후 균질화하는 단계;
(5) 상기 균질화한 용액을 건조시켜 카세인으로 둘러싸인 푸코잔틴 미세분말을 제조하는 단계; 및
(6) 상기 카세인으로 둘러싸인 푸코잔틴 미세분말을 포함하는 용액과 키토산 용액을 혼합하여 카세인으로 둘러싸인 푸코잔틴 미세분말을 키토산으로 코팅하는 단계를 포함하는 구형 (bulb shape)의 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (1)단계에서 푸코잔틴은 해조류 또는 미세조류에서 분리된 것이고 80% 이상의 순도를 갖는 것인, 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 (2)단계에서 카세인 수용액은 1.5 내지 2.5% (w/v)의 농도를 갖는 것인, 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (4)단계에서 칼슘염은 구연산칼슘(calcium salts of citric acid), 글루콘산칼슘(calcium gluconate), 글리세로인산칼슘(calcium glycerophosphate), 산화칼슘(calcium oxide), 수산화칼슘(calcium hydroxide), 염화칼슘(calcium chloride), 젖산칼슘(calcium lactate), 제삼인산칼슘(calcium phosphate, tribasic), 제이인산칼슘(calcium phosphate, dibasic), 제일인산칼슘(calcium phosphate, monobasic), 탄산칼슘(calcium carbonate) 및 황산칼슘(calcium sulfate)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상인, 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (4)단계에서 칼슘염 용액은 1 내지 5% (w/v)의 농도를 갖는 것인, 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (4)단계는 복합체에 인산염을 더 첨가하는 것인, 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 인산염은 제일인산나트륨, 제이인산나트륨, 제삼인산나트륨, 제일인산칼륨, 제이인산칼륨 및 제삼인산칼륨으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상인, 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (4)단계에서 균질화는 1,000 내지 20,000 rpm으로 교반하는 것인, 푸코잔틴 미세분말의 제조방법.
- 삭제
- 제 1항, 제 2항, 제 5항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 구형 (bulb shape)의 푸코잔틴 미세분말.
- 제 12항에 있어서,
상기 푸코잔틴 미세분말은 200 내지 400 nm의 평균 입경을 갖는 것인, 구형 (bulb shape)의 푸코잔틴 미세분말.
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| JP2001506685A (ja) * | 1996-12-12 | 2001-05-22 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | キサントフィル類の安定な水性分散液および安定な水−分散性乾燥粉末、それらの製造および使用 |
| JP2008260783A (ja) * | 2008-07-10 | 2008-10-30 | Kitosan Shokuhin Kogyo Kk | キトサン含有粉体 |
| JP6163427B2 (ja) * | 2011-10-11 | 2017-07-12 | キッコーマンバイオケミファ株式会社 | 粉末褐藻およびその利用 |
-
2016
- 2016-11-04 KR KR1020160146679A patent/KR101875571B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| 일본 공표특허공보 특표2001-506685호(2001.05.22.) 1부. * |
Also Published As
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|---|---|
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