KR101874654B1 - 암으로부터 고통받는 대상의 예후 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 OCT4의 발현과 같은 적어도 하나의 줄기세포 특성을 갖는 화학요법제 내성 세포를 분리하기 위해, 아가로스로 코팅된 아가로스 함유 비드에 암세포의 앤캡슐화의 사용에 관한 것이다. 따라서, 상기 분리된 세포 또한 본 발명의 특징이 있고, 이는 잠재적인 치료제를 스크린하기 위한 방법이다.

Description

암으로부터 고통받는 대상의 예후 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법 {Method for providing necessary information to determine prognosis of a subject suffering from cancer}
본 출원은 2010년 11월 23일 출원된 가특허출원 제61/458,390호 및 제61/458,391호의 우선권을 주장하며, 상기 특허들의 전체적인 내용은 참조로서 본 발명에 포함된다.
본 발명은 암 줄기세포를 분리하는 방법, 및 상기 분리된 암 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 관심 화합물이 항-종양제로서 잠재적인 효능을 갖는지를 결정하기 위해 관심 화합물을 스크린하는 방법에 관한 것이다.
화학요법 (chemotherapy) 및 병의 회복 (remission)을 수반하는 대부분의 암으로부터의 사망은 최초로 치료된 종양 또는 종양들의 재발에 의한 것이다. 항상 그런 것은 아니지만, 때때로 환자가 "치료" 되었다고 선언될 수 있게 적절히 종양을 제거하는 공지의 암 치료법은 다소 직관에 반하는 것으로 나타난다.
종양 성장 자체 뿐만 아니라, 종양의 재발을 설명하기 위한 진보된 이론은 "암 줄기 세포 (cancer stem cell)" 또는 "CSC" 이론이다. 간단히 말하면, 이러한 이론은 줄기 세포의 몇몇 특성을 소유하는 암세포 (cancer cells)의 희귀 개체군 (rare population)이 대체 줄기 세포, 및 종양 증폭 세포 (tumor amplifying cells)의 좀더 계통이 한정된 개체군 (lineage restricted populations)을 차례로 유도하는 비대칭 분할 (asymmetric division)을 수행하는 것을 전제한다. 이들 "새로운" 세포는 느린-세포주기 (slow-cycling)의 휴지기 (quiescent)인, 줄기 세포와는 대조적으로, 빠르게 증식되고 종양의 대부분을 구성하며, 빠르게 분할하는 세포를 타겟으로하는 치료법에 내성을 갖는다. 이러한 결과는 종양에서 세포의 대부분이 하나 이상의 이러한 표적 치료 (targeted therapies)에 영향받기 쉬운 반면, 줄기 세포 유사 세포 작은 개체군인, 화학-내성 (chemo-resistant) 암세포는 파괴되지 않고, 상기 논의된 세포주기가 자체로 반복한다는 것이다.
명백하게, 특정 대상 (subject) 또는 환자의 종양에서 줄기세포-유사 암세포를 확인하는 것이 필요할 뿐만 아니라, 그들의 존재를 정량화할 필요가 있다. 또한, 종양학 (oncology)의 분야가 "어떤 크기는 모두 적합하지 않은" 수많은 암에 대한 화학요법을 인지하는 반면에, 잠재적으로 유용한 항-종양 약물을 확인하기 위한 좀더 일반적인 방법 뿐만 아니라, 표적 치료를 개발하기 위한 필요는 남아있다.
미국특허 제5,888,497호; 제6,303,151호; 제6,808,705호; 제6,818,230호; 제7,041,504호; 및 제7,297,331호는 아가로스로 순차적으로 코팅된, 아가로스 비드에서 암세포를 앤캡슐화시키기 (encapsulating) 위한 방법을 개시하고 있고, 이들 모두는 전체적으로 참조문헌으로서 본 발명에 포함된다. 아가로스의 타입은 다른 세포 타입 (섬세포 (islets))의 내용에서 나타난 바와 같이, 예를 들어, 미국 공개특허 제2007/0071732호에 따라, 다양할 수 있고, 이는 전체적으로 참조문헌으로서 본 발명에 포함된다.
이들 암세포의 앤캡슐화하기 위한 작업은 줄기세포 (paralleling stem cells)와 유사한 특성을 소유할 수 있는 세포 발생 (cells develop)의 개체군을 관찰하기 위해 유도한다. 따라서 만약 이들 참고문헌에서 기술된 물질이 줄기 세포-유사 세포 특성을 또한 갖는 화학요법 내성 암세포를 분리하기 위해 사용될 수 있는지를 결정하는 것에 관심이 있다. 이렇게 함에 있어서, 이러한 앤캡슐화는 화합물이 암에 효과적으로 대항하는 것인지를 결정하는 관심 화합물을 스크린하기 위해 사용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명은 (i) 아가로스로 코팅된 아가로스 함유 비드에 암세포의 샘플을 앤캡슐화시키는 단계 (encapsulating); (ⅱ) 상기 암세포의 적어도 일부를 사멸시키기 위해 충분한 시간 동안 상기 비드와 적어도 하나의 항-암 화학요법제를 접촉시키는 단계; (ⅲ) 상기 비드로부터 생존 세포를 제거하는 단계; (ⅳ) 상기 생존 세포에 대해 적어도 하나의 줄기세포 특성을 분석하는 단계; 및 (v) 상기 줄기세포 특성을 나타내지 않는 어떤 세포와 상기 줄기세포 특성을 나타내는 어떤 세포를 분리시키는 단계를 포함하는 줄기세포 특성을 갖는 화학요법제 (chemother apeutic agent) 내성 암세포를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 OCT4의 발현과 같은 적어도 하나의 줄기세포 특성을 갖는 화학요법제 내성 세포를 분리하기 위해, 아가로스로 코팅된 아가로스 함유 비드에 암세포의 앤캡슐화의 사용에 관한 것이다. 따라서, 상기 분리된 세포 또한 본 발명의 특징이 있고, 본 발명은 잠재적인 치료제를 스크린할 수 있다.
본 발명의 이들 방법 및 다른 관점들은 다음의 기술된 바에 의해 달성될 수 있다.
실시 예 1
아가로스 코팅된, RENCA 세포를 함유하는 아가로스 비드는 Smith, et al., Cane Res., 71(3): 716-724 (2011); 및 Smith et al., Cane. Res. 71(3): 725-735 (2011)에 따라 제조되고, 상기 내용은 본 발명에 참조로서 포함된다. 최종 비드는 12 주동안 배지에서 배양한다.
비드의 샘플은 그 다음 단일의, 공지의 항-암 약물에, 셋 중 하나의 변화하는 농도로 노출된다. 상기 노출은 알려진, 약물의 반감기에 기초한 시간 동안 상기 약물의 존재하에서 상기 비드의 배양을 포함한다.
배양을 위해, 상기 비드는 두 번 세척되고, 천연 배양 배지로 이동된다. 또한 준비된 대조구는 상기 약물을 용해시키기 위해 사용된 어떤 비히클 (vehicle)에 노출된 비드 뿐만 아니라, 미처리 비드를 포함한다.
상기 비드의 조직학적 조사 (Histological examination)는 상기 약물에 노출하여 한 주 동안 수행된다. 몇몇 경우에 있어서, 변화가 없는 반면, 다른 것의 경우에 있어서, 상기 약물은 세포 생존력 (viability)의 완전한 손실을 결과하고, 또 다른 것들에 있어서, 중간 효과 (intermediate effect)가 있다. 결과는 하기 표 1과 같다:
시약 처리시간 투여량 효과

시스플라틴 (Cisplatin)
1 시간
 60 ng/ml -
600 ng/ml -
6000 ng/ml -

카보플라틴 (Caboplatin)
5 일
 25 ㎍/㎖ +/-
250 ㎍/㎖ +
2500 ㎍/㎖ +

메토트렉세이트 (Methotrexate)
1 일
 0.45 ㎍/㎖ -
4.5 ㎍/㎖ -
45 ㎍/㎖ -

독소루비신 (Doxorubicin)
2 일
 5 ㎍/㎖ +
50 ㎍/㎖ +
100 ㎍/㎖ +

비노렐빈 (Vinorelbine)
2 일
 0.1 ㎍/㎖ -
1 ㎍/㎖ +/-
10 ㎍/㎖ +/-

도세탁셀 (Docetaxel)
1 일
 0.5 ㎍/㎖ +/-
5 ㎍/㎖ +/-
50 ㎍/㎖ +/-

파클리탁셀 (Paclitaxel)
1 일
 0.35 ㎍/㎖ -
3.5 ㎍/㎖ +/-
35 ㎍/㎖ +/-
실시 예 2
도세탁셀 (Docetaxel) 및 파클리탁셀 (Paclitaxel)로 처리는 앤캡슐된 종양 콜로니 (colonies)내에 세포의 모두를 파괴하지 않고, 따라서 이들 약물로 처리된 비드는 또 다른 연구를 위해 선택된다. 저 농도에서 카보플라틴 (Caboplatin), 또는 중간 농도의 비노렐빈 (Vinorelbine)으로 처리된 비드는 잘 사용될 수 있다.
상기 파클리탁셀 및 도세탁셀로 처리된 비드는 표준 조건 하에서 배양되고, 이는 상기 두 약물을 운반하기 위한 비히클인, DMSO에 노출된 대조 비드이다. 상기 배양 기간은 18주이다.
DMSO로 처리된 비드에서 앤캡슐된 세포는 내부 파편 (internal debris) 주변의 1-2 세포 두께인, 세포의 림 (rim)으로 이루어진 타원형 종양 콜로니 (elliptical tumor colonies)인, 정상의 모폴로지를 나타낸다. 대조적으로, 3.5 ㎍/ml의 파클리탁셀로 처리된 비드는 6주 동안 세포의 손실을 나타내고, 18주까지 미리-처리된 세포의 수로 되돌아 가는 것을 나타낸다. 도세탁셀 (5 ㎍/ml)로 처리된 비드는 후-처리 6주에서, 콜로니 당 오직 1-2 세포의 일정한 패턴으로 나타난다. 약 비드의 10 %는 18 주에, 1 또는 2의 큰 콜로니가 발생된다.
상기 세포 손실을 정량화하기 위하여, 상기 DMSO 대조구, 파클리탁셀 및 도세탁셀 그룹으로부터 대표적인 비드는 세포 핵 (cell nuclei)을 카운팅(counting)하기 위하여, 표준 방법을 사용하여, 구획 (sectioned) 및 염색 (stained)된다. 결과는 DMSO 처리된 비드로 표준화된다.
파클리탁셀로 처리하는 경우에 있어서, 1-3 주에 걸쳐 콜로니 당 세포의 약 25 % 내부적 손실이 있다. 콜로니의 대부분은 생존성 세포를 함유한다. 세포수는 대조구 DMSO 비드에 동일하게 18주 후에 증가된다. 도세탁셀 처리된 비드의 경우에 있어서, 매우 빠른게 생존성 세포가 손실되어, 오직 1-2 생존성 세포가 처리 후 6주 콜로니에서 나타난다. 18주에, 비드의 약 10%는 세포의 1 또는 2의 큰 콜로니가 발생되고, 따라서 드물게, 도세탁셀 내성 RENCA 세포는 비드안에 새로운 콜로니를 형성할 수 있다.
실시 예 3
최신 증거는 배아 줄기 세포 (embryonic stem cells)에 대한 마커 (marker)인, 0CT4 ("옥타머 결합 전이 인자 4" (octamer binding transcription factor 4"))가 다능성 (pluripotent), 유사 줄기 세포에 대해, 성체 세포 (adult cells)를 유도하도록 다른 전이 인자와의 접합하는데 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 예를 들어, Park et al., Nature 451 (7475): 141-146 (2008)를 참조. 줄기 세포의 부가적인 마커 특징은, 예를 들어, International Stem Cell Initiative, et al, Nat. Biotechnol 25(7):803-16 (2007)에서 발견될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 본 발명의 참조로 포함된다.
실험은 도세탁셀로 6 주 후-처리 세포에서, 이러한 마커를 나타내는, 세포가 남아있는지를 결정하기 위해 수행된다.
상기 세포는 살아있는 세포를 확인하기 위해, DAPI로 염색되는 반면, 표준 면역화학적 (immunochemical) 절차는 OCT4에 대한 폴리크로날 항체 (polyclonal antibody)의 토끼 및 플로로 488 접합체 (Fluor 488 conjugate)로 표지된 항-IgG 항체의 염소를 사용하여, OCT4에 대한 염색에 사용된다.
상기 결과는 살아있는 세포가 OCT4를 발현하는 것을 나타낸다. 도세탁셀에 대한 내성을 갖는, 상기 발현은 상기 잔여 세포가 암 줄기세포라는 것을 의미한다.
실시 예 4
암 줄기 세포의 필수조건은 암세포의 콜로니를 형성하는 능력이다. 만약 기술된 상기 세포가 그렇게 할 수 있는지를 결정하기 위해, 상기 콜로니는 비드로부터 제거되고, 생존 세포는 제거 후 5-6주에, 기계적 분쇄를 통해, 수확되고, 콜로니는 RPMI 1640과 10% 우아혈청 (newborn calf serum)에서 포셉 (forceps)으로 잘게 썬다 (mince). 현탁액은 그 다음 어떤 아가로스 파편을 최소화하도록 하기 위해 40 ㎛ 세포 여과체 (cell strainer)에 통과되고, 원심분리를 통해 펠렛된다. 세포 펠렛들은 자연 배양 배지에서, 재현탁되고, 생체 외 (10% 우아혈청으로 보충된 RPMI 1640에서, 200 세포/ml) 또는 생체 내에서 배양된다. 좀더 구체적으로는, 200 세포들은 레시피언트 마우스 (recipient mouse)로부터 얻은 혈액 한 방울과 혼합되고, 따라서 혈병 (clot)이 형성되며, 그 다음 취해진 혈액으로부터 마우스의 신장 (kidney capsule)하에 임플란트된다. 상기 마우스들은 그 다음 종양의 성장에 대해 관찰된다. 정화된 줄기 세포의 생체내 이식 (transplantation)후에 종양의 발전은 암 줄기세포를 확인하기 위해 기술분야에서 인지된 "가장 신뢰성 있는 (gold standard)" 것으로 고려된다.
생체 외에서 성장된 RENCA 세포는 단분자층 (monolayer)에서 성장된 정상 RENCA 세포보다 휠씬 더 크고, 이들은 약 16 주 동안 세포 성장이 진행되는 것이 관찰되지 않는다. 16-17주 후-배양에서, 세포는 플라크 (plaques)가 형성되고 매주 계대 배양 (weekly passage)에 따라 증식, 및 배양에서 단분자층으로 성장이 시작된다. 그러나 단분자층 성장의 개시 2 주 후에, 이러한 세포는 정상 RENCA 세포와 비교할 만한 성장 속도를 갖고, 균등의 크기 및 모폴로지를 갖는 정상 RENCA 단분자층 세포로 나타난다.
임플란트 받은 10 마리의 마우스 중, 어떤 것은 상기 캡슐 (capsule) 하에서 종양으로 발전되어, 유도 후 98일에는 죽었다. 이것은 또한 폐 전이 (lung metastasis)로 발전된다.
상기 결과는 이러한 세포는 따라서 암 줄기세포로 고려될 수 있다는 것을 나타낸다.
전술한 실시 예는 도세탁셀과 같은 화학요법제에 내성을 갖는 암세포를 분리하기 위한 방법, 및 OCT4의 발현과 같은 줄기 세포의 하나 이상의 특성을 갖는 것을 포함하는, 본 발명의 다양한 관점을 기술한 것이다. 줄기세포의 다른 특성은 기술분야에서 잘 알려져 있고 여기서 반복하지는 않는다. 상기 방법은 비드를 함유하고, 그 다음 아가로스로 코팅된 아가로스에서 암세포의 샘플을 앤캡슐시키는 단계, 여기에 함유된 암세포를 성장하기 위한 최종 비드를 배양시키는 단계, 화학요법제 (chemotherapeutic agent)으로 비드를 접촉시키는 단계, 및 인시튜 (in situ) 또는 그것으로부터 제거된, 상기 잔여 세포 발현 OCT4를 결정하는 단계를 포함한다.
이러한 방법은, 전술한 바와 같이, 본 발명에 기술된 세포의 타입은 대상에서 암의 재발에 대한 원인이 되기 때문에, 예를 들어, 암으로부터 고통받는 대상을 위한 예후를 발전시키는데 사용될 수 있다. 본질적으로, 높은 퍼센트의 상기 세포는 상기 앤캡슐된 샘플에서 거의 없는, 또는 이러한 세포가 없이 나타내는 환자의 경우에서 보다 환자에 대한 약한 예후로 나타난다.
어떤 화학요법제는 암의 유형이면 무엇이든, 본 발명에서 사용될 수 있다. 당업자들은, 암 치료법에 대한 많은 다른 알려진 치료제 (therapeutic agents)를 인식할 것이다. 유사하게, 이것은, 예를 들어, 본 발명에 기술된 것 외에 사용될 수 있는 다양한 암 및 아가로스가 상술된 참고 문헌으로부터 인지될 수 있다. 또한, 본 발명의 비드는 콜라겐 같은 물질, 또는 아가로스와 비교될 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 암세포는 바람직하게 포유류 세포 (mammalian cells)이고, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.
상기 분리된 세포가 여기에 보고되지 않은 알려진 화학요법제에 내성이 있다는 사실은 이들이 화학내성 "그 자체"라는 것을 의미하지는 않는다. 나타낸 바와 같이, 본 발명에 시험된 시약은 급속한 증식 세포의 파괴에서 유용하고, 일반적인 약물이다. 당업자에게 잘 알려진, 아가로스 코팅된, 아가로스 비드에서 남아있는 세포에 의해 대표되는 타입의 세포에 대해 이용가능한 다른 치료법이 있다.
여기에 보고되지 않았지만, 이러한 약물은 이들 줄기 세포와 같은 화학요법제 내성 OCT4 발현 세포에 대해 시험될 수 있고, 치료적 계획 (therapeutic regime)은 본 발명에 기술되고, 분리된 세포의 타입에 직접적인 시약에 의해 수반되는, 치료의 제1 코스 (first course)로서, 표준 항-암제로, 예를 들어, 대상에 사용하도록, 개발될 수 있다.
이러한 세포들로부터 도세탁셀과 같은 화학요법제에 내성을 갖고, OCT4를 발현하는 암세포들이 분리된다. 본 발명의 이러한 관점에 있어서, 관심물질은 제1 약물과 접촉한 후에 잔존하는 줄기-세포 유사 암세포에 대하여 시험될 수 있고, 또는 줄기세포 유사 암세포의 분리된 샘플을 앤캡슐화할 수 있으며, 같은 방식으로 진행된다.
당업자들은 또한 본 발명의 관심화합물이 항-암제로서 효과가 있는지를 결정하기 위한 방법과 관련되어 있다는 것에 주목할 것이다. 보여진 바와 같이, 본 방법은 선택된 시간 및 선택된 농도에 대하여, 암세포의 샘플을 함유하는, 아가로스 코팅된, 아가로스 비드에 관심 화합물을 접촉하는 단계, 및 만약 상기화합물이 대조구보다 더 높은 페센트로 파괴하는 지를 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 경우에 있어서, 상기 화합물은 혼합된 세포 개체군에서 암세포를 파괴하는 단계, 또는 세포 혼합으로부터 비-줄기 세포 암세포를 제거하는 단계에서 사용되는 것 처럼, 비-치료적 상황 (non-therapeutic contexts)에서 유용할 뿐만 아니라, 치료학적으로 유용하다고 고려될 수 있다. 또한 비-치료적 상황에서 조합 치료 또는 적용이 적절한지를 결정하기 위해, 하나 이상의 잠재적 유용한 치료제의 "칵테일", 또는 시험 화합물과 공지의 치료제의 조합이 고려된다.
본 발명의 다른 특성들은 당업자에게는 명백할 것이므로 여기서 반복하지 않는다.
사용된 용어 및 표현들은 본 발명을 한정하지 않는 용어로써 사용되고, 이러한 용어 및 표현의 사용은 기술되고 보여진 특성 또는 이의 부분의 어떤 균등물을 배제할 의도는 없으며, 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형은 가능하다.

Claims (14)

  1. 암으로부터 고통받는 대상의 예후 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
    (i) 아가로스로 코팅된 아가로스 함유 비드에 상기 대상으로부터 채취된 암세포의 샘플을 앤캡슐화시키는 단계 (encapsulating);
    (ⅱ) 상기 암세포에 대하여 유효하다고 알려진 항암제를, 유효하다고 알려진 농도에서, 유효하다고 알려진 시간 동안, 상기 아가로스로 코팅된 아가로스 함유 비드와 접촉시키는 단계;
    (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 시간 후에, 상기 비드에서 잔존하는 암세포의 개수를 결정하는 단계를 포함하고,
    (ⅳ) 여기서, 양호한 (good) 예후를 갖는 환자와 비교하여, 많은 개수의 암세포는 상기 대상에 대하여 불량한 (poor) 예후를 나타내는, 암으로부터 고통받는 대상의 예후 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 (ⅱ)의 시간 후에, 상기 비드에서 세포가 잔존하지 않는 것은 상기 대상에 대하여 긍정적인 (positive) 예후를 나타내는, 암으로부터 고통받는 대상의 예후 결정에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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