CN112352049A - 用于生产具有抗肿瘤活性的细胞颗粒的方法 - Google Patents
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Abstract
用于生产具有抗肿瘤活性的细胞颗粒的方法，包括分离来源自细胞群的细胞颗粒，该细胞群具有可以归因于人脂肪组织来源周细胞(AD‑PC)的表型，表达抗肿瘤TRAIL。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于在细胞疗法中生产具有抗肿瘤活性的细胞颗粒的方法，该方法可以离体实施。
背景技术
众所周知，成体祖细胞，包括具有归因于人脂肪组织来源周细胞(以下简称AD-PC)的表型的细胞群，可以用作携带生物活性分子的载体。
特别地，AD-PC可以携带所谓的“死亡配体”，即，属于肿瘤坏死因子超家族的分子家族。
其中，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(以下简称TRAIL)分子可以诱导病变组织中的细胞死亡，因此对于TRAIL分子在某些生物医学领域的可能用途特别令人感兴趣。
从欧洲专利EP2424979中已知一种生产用于治疗肿瘤的药物的方法，该方法包括制备编码TRAIL分子的可溶性变体并稳定转染脂肪周细胞(AD-PC)的逆转录病毒载体。
携带TRAIL的AD-PC已经在体外和体内显示出对某些肿瘤的细胞毒活性，因此在癌症治疗方面特别令人感兴趣。
此外，术语“细胞颗粒”表示细胞活性的产物，由自发释放到细胞外的粒子组成。
这些粒子由全部或部分由磷脂组成的封闭圆形膜界定。此外，这些粒子的特征在于直径尺寸介于40nm和5000nm之间。
细胞颗粒可以来源自质膜的突起，该突起随后从质膜脱离。
或者，细胞颗粒可以来源于细胞内细胞器(称为内体)，随后通过内体膜与质膜融合而释放到细胞外。
或者，在细胞凋亡过程中，细胞颗粒可以来源自质膜的突起。
已知在由组成细胞颗粒的粒子的内腔或膜中，细胞颗粒可以包括源自产生细胞颗粒的细胞的分子。
然后，这些分子与细胞颗粒一起被输送到细胞外。
但是，这种现有技术受到一些问题的影响。
第一个问题是，出于治疗目的提供的在生物体内接种携带生物活性分子的活细胞的治疗的安全性仍在争论中，因为被接种细胞的命运无法预先控制，即，接种后细胞的行为是未知的。主要的不确定因素涉及被接种细胞不受控制的扩增的潜力，这可能导致健康器官受损和生理功能改变。
第二个问题是，出于治疗目的在生物体内接种携带生物活性分子的活细胞会触发接受生物体的排斥反应，从而使治疗本身无效。
第三个问题是，携带必须注入的生物活性分子的活细胞的使用需要产生大量细胞，因此成本很高。
发明内容
本发明的一个目的是改善现有技术。
本发明的另一个目的是出于抗肿瘤目的，提供一种用于生产源自产生TRAIL的AD-PC(AD-PC-TRAIL)的细胞颗粒的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于生产源自AD-PC-TRAIL的细胞颗粒而不影响TRAIL的抗肿瘤作用的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于生产源自AD-PC-TRAIL的细胞颗粒的方法，该方法减少了AD-PC-TRAIL的同时施用，从而限制了归因于AD-PC自身的对生物体的每种不良副作用。
本发明的另一个目的是提供一种用于生产源自AD-PC-TRAIL的细胞颗粒的方法，该方法减少了AD-PC-TRAIL的同时施用，从而使TRAIL的施用是大体上经济的。
根据一个方面，本发明根据权利要求1的特征提供一种用于生产具有抗肿瘤活性的细胞颗粒的方法。
根据本发明的另一方面，根据权利要求5的特征提供一种细胞颗粒。
附图说明
通过以下对用于生产具有抗肿瘤活性的细胞颗粒的方法的实施例的描述，本发明的其他特征和优点将更加明显，作为非限制性示例根据附图给出，其中：
图1为示出了用流式细胞仪分析的已知直径介于500nm和3000nm之间的一类校准微珠的点图。水平线“A”将仪器的背景噪声(线以下)与代表获得的数据的点(线以上)分开。
图2为示出了用流式细胞仪分析的分离的细胞颗粒的点图。水平线“A”将仪器的背景噪声(线以下)与代表获得的数据的点(线以上)分开。
图3为示出了从AD-PC分离并用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)分子染色的细胞颗粒的荧光的直方图。
详细地，线“B”将与未用CFDA-SE染色的细胞颗粒的荧光强度相当的较低荧光强度的左视野与较高荧光强度的右视野分开。
图4为示出了在用空载体修饰因此不表达TRAIL的AD-PC(AD-PC-EMPTY)来源的细胞颗粒中或在AD-PC-TRAIL中(以pg/百万个细胞来表达)检测到的TRAIL浓度的表。
图5为在用源自AD-PC-EMPTY或AD-PC-TRAIL的细胞颗粒孵育的BXPC3肿瘤细胞之中细胞毒性试验的图。
图6为在用源自AD-PC-EMPTY或AD-PC-TRAIL的细胞颗粒孵育的A673肿瘤细胞之中细胞毒性试验的图。
图7为与对照A673细胞相比，对用AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒孵育的A673细胞的半胱氨酸蛋白酶8(Caspase 8)活化试验的图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于生产细胞颗粒(特别是源自AD-PC-TRAIL、已发现具有抗肿瘤活性的细胞颗粒)的方法。
根据图1，其示出了已知尺寸介于500nm和3000nm之间的校准微珠的样品的基于前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)形态学参数的流式细胞仪分析。
根据图2，其示出了根据FSC和SSC形态学参数对从AD-PC分离的细胞颗粒的流式细胞仪分析。
根据图3，其示出了用CFDA-SE染色后从AD-PC分离的细胞颗粒发出荧光。
特别是，95.9％的细胞颗粒的荧光测试呈阳性。
根据图4中的表，其示出了通过酶联免疫吸附试验(ELISA)在源自AD-PC-EMPTY或AD-PC-TRAIL的细胞颗粒中检测到的TRAIL浓度。
特别是，值得注意的是没有检测到从AD-PC-EMPTY来源的细胞颗粒释放的TRAIL的存在，而测量到从源自100万个AD-PC-TRAIL的细胞颗粒获得的446pg TRAIL。
根据图5，细胞毒性试验表明AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒能够对BXPC3肿瘤细胞系产生细胞毒性作用。
特别是，当用AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒孵育细胞时，测得的BXPC3细胞的死亡率为34.6±3.6％，而当用AD-PC-EMPTY来源的细胞颗粒孵育细胞时，死亡率为16.5±6.2％。使用T检验统计检验，两组之间具有统计学显著性差异，p<0.05(在图中用*表示)。
数据表示为平均值±SEM(平均值的标准误差)，在以下其他附图中使用相同的表示。
根据图6，细胞毒性试验表明AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒能够对肿瘤细胞系A673产生细胞毒性作用。
特别是，当用AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒孵育细胞时，检测到的死亡率为93.1％，而当用AD-PC-EMPTY来源的细胞颗粒孵育细胞时，死亡率为16.1±16.2％。
使用T检验统计检验，两组之间具有统计学显著性差异，p<0.01(在图中用*表示)。
数据表示为平均值±SEM。
根据图7，其示出了相对于参考对照，在用AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒孵育后，A673细胞上的半胱氨酸蛋白酶8的活化百分比。该治疗已确定半胱氨酸蛋白酶的活化比对照中的高296±5％。
使用T检验统计检验，相对于对照，具有统计学显著性差异，p<0.001。数据表示为平均值±SEM。
实施例1
分离由AD-PC产生的细胞颗粒。
用于分离由AD-PC产生的细胞颗粒的方法如下。
将培养的已经达到约80％融合度的AD-PC用PBS(由Biochrom GmbH生产)洗涤，并将培养基更换为含有1％L-谷氨酰胺(由Lonza生产)和1％青霉素/链霉素(在0.9％NaCl中的10000U/mL青霉素、10mg/mL链霉素，由PAA Laboratories生产)的αMEM培养基(由ThermoFisher Scientific Inc.生产)。
然后在进行上清液收集之前，将AD-PC在培养箱中培养48小时。
对从AD-PC-TRAIL和AD-PC-EMPTY的细胞培养物中收集的上清液进行差速离心处理：在+4℃下以2,000g的速度进行20分钟的初始离心，随后用0.8μm过滤器对上清液进行重力过滤，并在+4℃下以20,000g的速度进一步离心40分钟。
在这些阶段结束时，将含有细胞颗粒的沉淀物重悬于最合适的培养基中，以用于后续应用。
在流式细胞仪中显示细胞颗粒。
在流式细胞仪(BD FACS ARIA III，由Becton Dickinson生产)上显示之前，将用前述分离方法获得的细胞颗粒重悬于含有0.1％BSA(牛血清白蛋白，由Sigma生产)的PBS中，并用1μL CFDA-SE(CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒，由Invitrogen生产)染色。
使用已知尺寸的微珠(Megamix，由Biocytex生产)设置显示MV的FSC和SSC的最佳参数。
实施例1的结果
通过用0.8μm过滤器过滤分开的两次离心过程，从用AD-PC-EMPTY和AD-PC-TRAIL调节的培养基中分离出细胞颗粒物质，并显示在流式细胞仪上。
如与已知尺寸的Megamix微珠的尺寸比较所示(见图1和图2)，该方法可以分离出尺寸介于40nm和5000nm之间、特别是大约介于500nm和3000nm之间的一类粒子。
用CFDA-SE染色可以在流式细胞仪中更好地显示MV(见图3)。
这是一种能够渗透到细胞质中的染料，在细胞质中，通过细胞内酯酶将其转化成羧基荧光素(CFSE)的琥珀酰亚胺酯化合物，该化合物保留在与细胞内蛋白质结合的细胞内，并发出可以被检测到的发光荧光信号。
由于这种特性，CFDA-SE可以把由膜(在这种情况下为细胞颗粒)覆盖的封闭结构与细胞碎片区分开来。
实施例2
定量测定存在于细胞颗粒中的TRAIL的量。
对源自AD-PC-EMPTY和AD-PC-TRAIL的细胞颗粒进行ELISA测试(QuantikineELISA，由R&D Systems生产)以确定TRAIL浓度。
特别是，根据制造商的方案，在进行测试之前，将用前述实施例1中的分离方案分离的细胞颗粒重悬于含有0.1％BSA的PBS中，并用合适的裂解液(Lysis Buffer，由R&DSystems生产)裂解。
实施例2的结果
在诱导颗粒自身裂解之后，使用ELISA测试对源自AD-PC-EMPTY和AD-PC-TRAIL的细胞颗粒中的TRAIL含量进行定量测定。结果未显示在AD-PC-EMPTY来源的样品中存在TRAIL，而在源自100万个AD-PC-TRAIL的细胞颗粒中检测到446pg的浓度(见图4)。
众所周知，AD-PC-TRAIL产生的可溶性TRAIL分子缺乏将形成细胞颗粒的粒子插入膜中所必需的结构元素。因此，检测到的TRAIL分子最初位于形成颗粒的粒子的内腔中。
实施例3
对肿瘤细胞系上的细胞颗粒进行细胞毒性试验。
使用MTS试验(
AQueous One Solution细胞增殖试验，由Promega生产)测试了来自AD-PC-EMPTY和AD-PC-TRAIL的细胞颗粒对肿瘤细胞系A673和BXPC3的抗肿瘤能力。
对于每个被分析的样品，将5,000个肿瘤细胞接种到96孔板中，并在可控气氛培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养。
第二天，将肿瘤细胞培养基更换为添加有10％FBS和1％青霉素/链霉素的100μLDMEM培养基，将按照前述实施例1中的分离方案获得的完整细胞颗粒重悬于该培养基中。
24小时后，每MTS将20μL溶液添加到每个孔，在使用GloMax Discover仪器(由Promega生产)进行495nm处吸光度的测量之前，将板在37℃下孵育1小时，495nm处吸光度与活力和代谢活性成正比。
所有实验都包括基础死亡率的对照，该对照由与相同培养基接触但没有与细胞颗粒接触的肿瘤细胞组成。
为了证实TRAIL在诱导对A673细胞的细胞毒性中的作用，使用Caspase-Glo8测定试剂盒(由Promega生产)研究了半胱氨酸蛋白酶8的活性。
特别是，将肿瘤细胞以每孔5,000个细胞的浓度接种在白色多孔板中。
第二天，将培养基更换为含有如前所述分离的、完整的AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒的新鲜培养基。
18小时后，根据制造商提供的方案，使用GloMax Discover仪器评估半胱氨酸蛋白酶8的活性。
实施例3的结果
在用源自AD-PC-EMPTY和AD-PC-TRAIL细胞的细胞颗粒孵育24小时后，通过用MTS的细胞毒性试验，对诱导的BXPC3和A673肿瘤细胞系的死亡率进行了检测。
用AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒处理BXPC3细胞，死亡率为34.6±3.6％，显著高于用AD-PC-EMPTY来源的细胞颗粒所获得的死亡率，而后者没有显示出相关的细胞毒性作用(见图5)。
由AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒诱导的A673细胞的死亡率为93.1±9.6％，显著高于用AD-PC-EMPTY来源的细胞颗粒所获得的死亡率，而后者没有显示出显著的细胞毒性作用(见图6)。
在用AD-PC-TRAIL来源的细胞颗粒孵育A673肿瘤细胞18小时后，与未处理的对照相比，通过定量测定半胱氨酸蛋白酶8的活化百分比，可以验证TRAIL在诱导肿瘤细胞死亡中的作用。
该处理测得半胱氨酸蛋白酶的活化比对照的高296±5％，这支持由TRAIL介导的细胞毒性作用(见图7)。
在实践中，已经发现本发明达到了预期的目的。
所构思的本发明易于进行修改和变型，所有这些修改和变型都在本发明构思的范围内。
此外，所有细节都可以用其他技术上等效的细节进行替换。
在实践中，在不脱离所附权利要求的保护范围的前提下，可以根据需要使用任何材料、设备和数量。
Claims (8)
1.用于生产具有抗肿瘤活性的细胞颗粒的方法，其特征在于，该方法包括从收集自细胞群培养物的上清液中分离细胞颗粒，用逆转录病毒载体转染的该细胞群培养物表达抗肿瘤的可溶性TRAIL，该细胞群培养物具有人脂肪组织来源周细胞(AD-PC)的表型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以稳定的方式转染具有人脂肪组织来源周细胞(AD-PC)的表型的所述细胞群。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，具有周细胞(PC)表型的所述细胞是从组织中产生的，所述组织选自：脂肪组织、骨髓组织、胎盘、羊水、牙髓、肌肉组织、心脏组织、脐带、皮肤组织、胰腺组织、肠组织、蜕膜子宫内膜组织。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，表达TRAIL的所述群选自：自体细胞、异体细胞、人细胞、动物细胞。
5.细胞颗粒，其特征在于，该细胞颗粒包括具有封闭圆形膜的粒子，该封闭圆形膜由部分或全部由磷脂组成的双层形成。
6.根据权利要求5所述的细胞颗粒，其中，所述粒子的最大尺寸介于40nm和5000nm之间。
7.根据权利要求6所述的细胞颗粒，其中，所述粒子的最大尺寸介于500nm和3000nm之间。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的细胞颗粒，其中，所述粒子在其内腔中具有TRAIL，具有抗癌活性。
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