PT2777398T - Método para isolar uma célula de cancro resistente a agentes quimioterapêuticos com propriedades de células estaminais - Google Patents

Método para isolar uma célula de cancro resistente a agentes quimioterapêuticos com propriedades de células estaminais Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
MÉTODO PARA ISOLAR UMA CÉLULA DE CANCRO RESISTENTE A AGENTES QUIMIOTERAPÊUTICOS COM PROPRIEDADES DE CÉLULAS
ESTAMINAIS
Campo de invenção
Esta invenção refere-se a métodos para isolar células estaminais cancerígenas e as células estaminais cancerígenas assim isoladas. Também se relaciona com métodos para rastrear compostos de interesse para determinar se têm potencial eficácia como agentes anti tumorais.
Antecedentes e técnica anterior A maioria das mortes por cancro após quimioterapia e remissão resulta da recorrência do tumor ou tumores tratados originalmente. Isso parece ser algo contraintuitivo, como as terapias de cancro conhecidas às vezes, mas nem sempre, eliminam os tumores até o ponto em que um paciente pode ser declarado "curado".
Uma teoria que tem sido avançada para explicar a recorrência de tumores, bem como o crescimento tumoral per se, é a teoria das "células estaminais cancerígenas" ou "CSC". Em suma, esta teoria postula que uma população rara de células cancerosas que possuem algumas caracteristicas de células estaminais sofre divisão assimétrica que, por sua vez, leva a células estaminais de reposição e a mais linhagens de populações restritas de células amplificadoras de tumores. Essas células "novas" proliferam rapidamente e compõem a maioria do tumor, em contraste com as células estaminais, que são de ciclo lento, quiescentes e são resistentes a terapias que visam células que se dividem rapidamente. 0 resultado disso é que, embora a maioria das células de um tumor seja suscetível a uma ou mais dessas terapias direcionadas, a pequena população de células estaminais, células cancerígenas quimo-resistentes, não são destruídas e o ciclo discutido supra repete-se.
Claramente, há uma necessidade de identificar essas células estaminais cancerígenas, bem como a necessidade de quantificar a sua presença em tumores de um determinado sujeito ou paciente. Além disso, enquanto o campo da oncologia reconhece uma série de quimioterapias para o cancro, "um tamanho não corresponde a todos", e continua a existir necessidade de desenvolver terapias direcionadas, bem como um método mais geral para identificar medicamentos anti tumorais potencialmente úteis.
As Patentes US 5888497; 6303151; 6808705; 6818230; 7041504; e 7297331, descrevem métodos para encapsular células cancerosas em esferas de agarose, que são por sua vez revestidas com agarose. O tipo de agarose pode variar, como mostrado no contexto de outros tipos de células (ilhotas), conforme, por exemplo, o pedido publicado 2007/0071732. O trabalho sobre essas células cancerosas encapsuladas levou à observação de que as populações de células se desenvolvem, que podem possuir propriedades paralelas às células estaminais. Foi, portanto, de interesse determinar se os materiais descritos nessas referências poderiam ser usados para isolar células cancerosas resistentes à quimioterapia, que também possuem propriedades semelhantes a células estaminais. Ao fazê-lo, também foi aprendido que estes encapsulados podem ser utilizados para pesquisar compostos de interesse para determinar se o composto é eficaz contra cancros.
Como estes e outros aspetos da invenção são alcançados serão vistos na descrição que se segue.
Descrição detalhada das formas de realização preferidas A presente invenção refere-se a um método para determinar o prognóstico para um indivíduo que sofre de cancro, compreendendo: i) encapsular uma amostra de células cancerígenas tiradas do referido sujeito num cordão revestido com agarose contendo agarose; ii) cultivar o referido cordão revestido com agarose contendo agarose para crescer as referidas células cancerosas; iii) contactar o referido cordão revestido com agarose contendo agarose com um agente quimioterapêutico; e iv) determinar qual das células cancerosas que permanecem após o contacto com o referido agente quimioterapêutico expressam 0CT4; e v) em que uma elevada percentagem das referidas células cancerosas que expressam 0CT4 é indicativa de um prognóstico mais fraco para o referido sujeito em comparação com um sujeito que exibe poucas ou nenhuma célula que expressa 0CT4 na amostra encapsulada correspondente. 0 método de acordo com a reivindicação 1 encontra suporte experimental nos seguintes exemplos. EXEMPLO 1
As esferas de agarose revestidas com agarose contendo células RENCA foram preparadas de acordo com Smith, et al., Canc Res., 71 (3): 716-724 (2011); e Smith et al., Canc. Res. 71 (3): 724-735 2011). As esferas resultantes foram cultivadas em meio durante 12 semanas. As amostras de esferas foram então expostas a um único fármaco anti cancro conhecido, em uma das três concentrações variadas. A exposição envolveu a incubação das esferas na presença do fármaco por um período de tempo com base na vida média conhecida do fármaco. Após a incubação, as esferas foram lavadas duas vezes e transferidas para meios de cultura ingénuos. Também foram preparados controlos, que incluíram esferas não tratadas, bem como, esferas expostas a qualquer veículo utilizado para solubilizar o fármaco. 0 exame histológico das esferas foi realizado uma semana após a exposição ao medicamento. Em alguns casos, não houve mudança, enquanto em outros, o fármaco resultou em perda completa de viabilidade celular e em outros, e houve efeito intermediário. Os resultados seguem:
Agente Tempo de tratamento Dose Efeito 60 ng/ml
Cisplatina 1 hora 600 ng/ml 6000 ng/ml 25 pg/ml +/-
Carboplatina 5 dias 250 pg/ml + 2500 pg/ml + 0,45 pg/ml
Metotrexato 1 dia 4,5 pg/ml - 45 pg/ml 5 pg/ml +
Doxorrubicina 2 dias 50 pg/ml + 100 pg/ml + 0,1 pg/ml
Vinorelbina 2 dias 1 pg/ml +/- 10 yg/ml +/- 0,5 pg/ml +/-
Docetaxel 1 dia 5 pg/ml +/- 50 pg/ml +/- 0,35 pg/ml
Paclitaxel 1 dia 3,5 pg/ml + /- 35 μg/ml +/- EXEMPLO 2 O tratamento com Docetaxel e Paclitaxel não destruiu todas as células dentro das colónias tumorais encapsuladas e, portanto, as esferas que foram tratadas com esses medicamentos foram selecionadas para estudo posterior. As esferas tratadas com Caboplatina com baixa concentração, ou a Vinorelbina, numa concentração intermediária, também poderiam ter sido usadas.
As esferas tratadas com Paclitaxel e Docetaxel foram cultivadas, em condições padrão, tal como as esferas de controlo que haviam sido expostas ao DMSO, que era o veiculo para a administração dos dois fármacos. O período de cultura foi de 18 semanas.
As células encapsuladas em esferas tratadas com DMSO exibiram uma morfologia normal, que é colónias tumorais elípticas, consistindo num rebordo de células, de 1 a 2 células de espessura, cercando detritos internos. Em contraste, as esferas que foram tratadas com 3,5 pg/ml de Paclitaxel mostraram perda de células durante 6 semanas, com retorno ao número de células pré-tratamento na semana 18. As esferas tratadas com Docetaxel (5 pg/ml) exibiram um padrão consistente de apenas 1-2 células por pé, às 6 semanas após 0 tratamento. Aproximadamente 10% das esferas desenvolveram 1 ou 2 grandes colónias, na semana 18. A fim de quantificar a perda de células, as esferas representativas do controle DMSO, os grupos Paclitaxel e Docetaxel foram seccionadas e coradas, usando métodos padrão, para permitir a contagem de núcleos celulares. Os resultados foram normalizados para as esferas tratadas com DMSO.
No caso do tratamento com Paclitaxel, houve uma perda inicial durante as semanas 1-3, de cerca de 25% das células por colónia. A maioria das esferas contém células viáveis. 0 número de células aumentou após 18 semanas para ser equivalente às esferas DMSO de controlo. No caso das esferas tratadas com docetaxel, estas células viáveis perdidas foram muito rápidas, de modo que apenas 1 a 2 células viáveis estavam presentes nas colónias 6 semanas após o tratamento. Na semana 18, cerca de 10% das esferas desenvolveram 1 ou 2 grandes colónias de células, indicando assim que raras células RENCA resistentes ao Docetaxel podem formar novas colónias dentro das esferas. EXEMPLO 3
Evidências recentes sugerem que OCT4 ("fator de transcrição de ligação de octâmetro 4") , um marcador para células estaminais embrionárias, pode ser usado em conjunto com outros fatores de transcrição para induzir células adultas como uma célula estaminal pluripotente. Veja, por exemplo, Park et al., Nature 451 (7475): 141-146 (2008). Possíveis mercados adicionais característicos das células estaminais, por exemplo, International Stem Cell Initiative, et al, Nat. Biotechnol 25(7):803-16 (2007).Foram realizadas experiências para determinar se as células que permaneceram nas células tratadas com Docetaxel, seis semanas após o tratamento, exibiram esse marcador.
As células foram coradas com DAPI, para identificar células vivas, enquanto os procedimentos imunoquímicos padrão foram utilizados para manchar para OCT4, usando um, anticorpo policlonal de coelho para OCT4 e um anticorpo de cabra anti-Ig 6 marcado com um conjugado Fluor 488. Os resultados indicaram que as células vivas expressaram 0CT4. A expressão, tomada com a resistência ao Docetaxel, sugere que as células restantes são células estaminais cancerígenas. EXEMPLO 4
Um requisito das células estaminais cancerígenas é a capacidade de formar colónias de células cancerígenas. Para determinar se as células descritas supra poderiam fazê-lo, as colónias foram desalojadas das esferas e as células sobreviventes foram colhidas, por meio de rutura mecânica, 5-6 semanas após a remoção, e as colónias foram picadas com fórceps em RPMI 1640 mais 10% de soro de bezerro recém-nascido. A suspensão foi então colocada através de um filtro de células de 40 μιη, de modo a minimizar quaisquer detritos de agarose e sedimentar por centrifugação. As esferas de células foram ressuspensas, em meio de cultura ingénuo e cultivadas in vitro (200 células/ml, em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro de bezerro recém-nascido) , ou cultivadas in vivo. Para elaborar, 200 células foram misturadas com uma gota de sangue de um rato recetor, formando assim um coágulo, que foi então implantado sob uma cápsula renal do rato a partir da qual o sangue foi retirado. Os ratos foram então observados para o crescimento de tumores. 0 desenvolvimento de um tumor após o transplante in vivo de células estaminais purificadas é considerado o "padrão-ouro" reconhecido pela técnica para identificar células estaminais cancerígenas.
As células RENCA crescidas in vitro foram muito maiores do que as células RENCA normais que foram cultivadas em monocamada, e não foram observadas a sofrerem crescimento celular durante cerca de 16 semanas. 16-17 semanas após a cultura, as células formaram placas e começaram a proliferar após a passagem semanal, e crescendo como uma monocamada em cultura. Mas duas semanas após o início do crescimento monocamada, essas células apresentaram taxas de crescimento que eram comparáveis às células RENCA normais e apareceram como células monocamadas RENCA normais, com tamanho e morfologia equivalentes.
Dos dez ratos que receberam implantes, um desenvolveu um tumor sob a cápsula e morreu 98 dias após a indução. Também desenvolveu uma metástase pulmonar.
Os resultados indicam que essas células podem assim ser consideradas células estaminais cancerígenas.
Os exemplos anteriores apresentam vários aspetos da invenção, que incluem um método para isolar células de cancro que são resistentes a agentes quimioterapêuticos, tais como Docetaxel, e que possuem uma ou mais propriedades de células estaminais, como a expressão de 0CT4. Outras propriedades das células estaminais são bem conhecidas da técnica e não são repetidas aqui. 0 método envolve a encapsulação de uma amostra de células cancerígenas numa esfera contendo agarose que é então revestida com agarose, cultivando a esfera resultante para crescer as células cancerosas nela contidas, contactando o talão com um agente quimioterapêutico e determinando quais das referidas células restantes expressam 0CT4, in situ ou por remoção da mesma.
Este método pode ser usado, por exemplo, para desenvolver um prognóstico para um indivíduo que sofre de cancro, porque, como observado supra, as células do tipo aqui descrito são responsáveis pela recorrência de cancro em indivíduos. Essencialmente, uma alta percentagem das referidas células indica um pior prognóstico para um paciente do que seria o caso de um paciente que exibe poucas ou nenhuma dessas células na amostra encapsulada.
Qualquer agente quimioterapêutico pode ser utilizado no método da invenção, como pode qualquer tipo de cancro. 0 especialista na técnica estará ciente de muitos outros agentes terapêuticos conhecidos para a terapia do cancro. Da mesma forma, será reconhecido, por exemplo, pelas referências citadas supra, que podem ser utilizados vários tipos de cancro e agaroses, além dos aqui descritos. Além disso, as esferas da invenção podem incluir materiais, tais como, colagénio, ou outros materiais compatíveis com agarose. As células cancerosas são preferencialmente células de mamífero, e mais preferencialmente, células humanas. 0 facto de que as células isoladas são resistentes aos agentes quimioterapêuticos conhecidos aqui relatados não significa, no entanto, que elas sejam quimiorresistentes "per se". Os agentes aqui testados, como indicado, são medicamentos que são úteis, geralmente, na destruição de células que proliferam rapidamente. Existem outras terapias disponíveis para células do tipo representado pelas células que permanecem nas esferas de agarose revestidas com agarose, que serão conhecidas pelo especialista na técncica. Embora não sejam aqui relatados, tais fármacos podem ser testados contra essas células que expressam 0CT4 resistentes a células estaminais, células quimioterapêuticas e um regime terapêutico pode ser desenvolvido onde, por exemplo, um sujeito recebe, como primeiro curso de terapia, um agente padrão anti cancro, seguido por um agente direcionado ao tipo de células isoladas e descritas aqui. Tais células são células de cancro isoladas que são resistentes a agentes quimioterapêuticos, como Docetaxel, e que expressam 0CT4. Neste aspeto da invenção, a substância de interesse pode ser testada contra as células cancerosas da célula estaminal que permanecem após o contato com o primeiro agente, ou uma pode encapsular uma amostra separada de células estaminais como células cancerosas e proceder da mesma maneira. 0 especialista na técnica também notará que a invenção se refere a um método para determinar se um composto de interesse tem eficácia como agente anti tumoral. Como se verá, o método envolve o contacto de um composto de interesse para uma esfera de agarose revestida com agarose, que contém uma amostra de células cancerosas, durante um período de tempo escolhido e numa concentração escolhida, e determinando se o referido composto destrói uma percentagem de células maior do que um controlo nesses casos, o composto pode ser considerado terapeuticamente útil, bem como útil em contextos não terapêuticos, tais como, o uso na destruição de células cancerígenas numa população celular mista ou na eliminação de células cancro de células não estaminais de uma mistura de células. Também são contemplados "coquetéis" de mais de um agente terapêutico potencialmente útil, ou combinações de agentes terapêuticos conhecidos com os compostos de teste, para determinar se a terapia combinada é apropriada.
Outras características da invenção serão claras para o especialista na técnica e não precisam ser reiteradas aqui.
Os termos e a expressão que foram empregados são utilizados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou suas partes, sendo reconhecido que são possíveis várias modificações dentro do âmbito da invenção.

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES
  2. 1. Método para determinar o prognóstico para um indivíduo que sofre de cancro, que compreende: i) encapsular uma amostra de células cancerosas retiradas do referido indivíduo num cordão revestido com agarose contendo agarose; i) cultivar o referido cordão revestido com agarose contendo agarose para crescer as referidas células cancerosas; iii) contactar o referido cordão revestido com agarose contendo agarose com um agente quimioterapêutico; e iv) determinar qual das células cancerosas permanecendo após o contato com o referido agente quimioterápico expressam 0CT4; e v) em que uma elevada percentagem das referidas células cancerígenas que expressam 0CT4 é indicativa de um prognóstico mais fraco para o referido sujeito em comparação com um indivíduo que exibe poucas ou nenhuma célula que expressa 0CT4 na amostra encapsulada correspondente.
PT141717330T 2010-11-23 2011-11-22 Método para isolar uma célula de cancro resistente a agentes quimioterapêuticos com propriedades de células estaminais PT2777398T (pt)

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