KR101874246B1

KR101874246B1 - 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 단풍마 단백질 추출물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101874246B1
Application number: KR1020170048400A
Authority: KR
Inventors: 이동철
Original assignee: 충북도립대학산학협력단
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2018-07-03

Abstract

본 발명은 단풍마(Dioscorea quinqueloba)에서 분리한 특정한 단백질 추출물의 제조법에 관한 것으로서, 더 자세하게는 이온교환크로마토그래피의 방법으로 특정한 NaCl 농도에서 용출된 단백질 추출물이다. 본 발명에 따라 제조된 단풍마 단백질 추출물은 B 세포와 T 세포의 증식을 자극하고 대식세포와 자연살해세포의 암세포 독성 활성을 증가시키는 면역 증진 효능을 가지고 있다. 본 발명의 단풍마 단백질 추출물은 이러한 면역 증진 효능을 바탕으로 저온스트레스에 노출된 생쥐에서 일어나는 면역 세포 감소와 혈중 면역 싸이토카인 농도 감소 그리고 혈중 효소들의 비정상적 역가 상승을 효과적으로 억제하여 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 단풍마 단백질 추출물은 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 건강기능식품이나 약제의 용도로 사용될 수 있다.

Description

스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 단풍마 단백질 추출물의 제조 방법{Process for manufacturing the protein extract from Dioscorea quinqueloba that improves lowered immunity under stress}

본 발명은 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 효능을 갖는 단풍마 단백질 추출물 제조 방법에 관한 것이다.

인체의 면역 기능에 문제가 생기면 다양한 질환이 일어날 수 있다. 면역 기능이 떨어지면 외부 바이러스, 세균 등의 침입이나 암의 발생이 용이하게 되어 바이러스성 질환, 세균성 질환, 암 등이 발생하게 된다. 인체 면역 기능이 저하되는 요인으로는 노화, 스트레스, 수면 부족, 음주, 흡연 등이 알려져 있다. 특히, 사람이 스트레스를 받으면 뇌는 시상하부를 자극하게 되고 내분비선을 통해 코르티솔과 같은 스트레스 호르몬이 분비되는데, 이 호르몬은 가슴샘을 위축시켜 T 세포나 B 세포 등 림프구의 성숙을 방해하고 말초 혈중의 림프구를 파괴시키기도 한다. 만성 스트레스는 자연살해(NK)세포의 활성을 저하시키고, 림프구의 증식과 항체 생성력을 감소시켜서 전체적인 면역력을 저하시키게 된다. 즉, 스트레스로 인하여 세균이나 바이러스에 의한 감염성 질환이 증가하고, 암 발생율이 증가될 수 있다.

면역력을 보강하는 방법으로는 적절한 영양 보충과, 적당한 운동, 스트레스 조절, 그리고 충분한 수면 등이겠으나, 이러한 요건들을 충족시키기에 현대인들은 너무 바쁘고 사회는 점점 치열해지고 있다. 현대 사회가 복잡해지고 경쟁이 심화됨에 따라 인체 면역 기능 저하에 대한 문제는 꾸준히 대두되고 있다. 이에 따라 면역 기능 향상에 도움을 줄 수 있는 생리 활성 원료들을 함유한 다양한 건강 기능 식품, 건강 보조 식품들이 개발되어 출시되고 있으며, 본 발명도 이러한 목적으로 개발된 것이다. 본 발명은 특히 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 의약 원료 혹은 기능성 식품 원료에 대한 것이다.

본 발명의 주 재료인 단풍마(Dioscorea quinqueloba)는 마과(Dioscoreaceae)에 속하는 다년생 덩굴성 초본 식물로서 우리나라 각지의 산기슭이나 개울가 또는 떨기나무 숲 사이에서 자란다. 근연 식물로는 우리나라에 자생하는 것들로 마(D. batatas), 참마(D. japonica), 국화마(D. septemloba), 도꼬로마(D. tokoro) 등이 있다. 한방에서는 단풍마의 뿌리줄기를 천산룡(穿山龍)이라는 약재로 쓰는데, 술에 담가서 복용하여 어혈 때문에 생긴 관상 동맥 장애에 사용하며, 기침과 천식을 가라앉히거나, 종기와 피부가 헐어 생긴 발진에 사용하고 있다. 국내에서 단풍마의 뿌리 줄기는 농산물로서 널리 생산되고 있으며, 시장이나 인터넷 쇼핑몰에서 쉽게 구매할 수가 있다. 그러나, 현재까지 단풍마의 성분 및 약리활성에 대한 과학적인 연구 자료는 거의 없는 실정이며, 다만 한방 약초로 사용될 때 신장 독성의 부작용 가능성이 국내에서 보고된 바 있다(BMC Nephrology, 15:143, 2014). 국내 특허로는 한국등록특허 제10-0684434호, 제10-0684435호, 제10-0684436호에서의 항산화, 항염증 및 거담 활성을 갖는 단풍마 유기용매 추출물에 대한 보고가 거의 유일하다. 그러나, 근연 식물들인 같은 마 속(Dioscorea)의 다른 종에 대해서는 연구가 많이 진행되어 있어서, 뿌리 줄기에서 보고된 성분으로 사포닌(saponin)류의 디오스신(dioscin) 및 디오스게닌(diosgenin) 등이 있으며, 다량의 점액질 및 전분이 함유되어 있다고 알려져 있다. 마 속(Dioscorea)의 다른 종 식물의 뿌리 줄기에 대한 현재까지의 약리 실험에서는, 혈중 콜레스테롤을 낮추고 혈압을 내리며, 관상혈관의 혈액순환을 좋게 하고, 기침을 멎게 하여 숨찬 증상을 없애는 작용 등이 보고되었으며, 민간에서도 뼈마디 통증, 뼈마디 운동장애, 갑상선종, 갑상선 기능 항진증, 만성 기관지염, 동맥 경화증 등을 예방 치료하는데 사용하는 것으로 알려져 있다.

이상과 같이 마 속(Dioscorea)의 근연 식물들에 대한 연구는 많이 진행되었으나 우리나라에 자원으로서 분포도가 높은 단풍마에 대한 성분 및 활성에 대한 보고가 거의 없고, 유기 용매 추출물의 항산화, 항염증에 관한 국내 특허만 몇 건 있는 바이다. 본 발명자는 단풍마의 수용성 단백질들을 분리 정제하여 효능에 대한 연구를 지속적으로 진행하여 왔으며, 특정 단백질 추출물이 면역 증진 효과를 나타내고 이에 의해 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 효능을 가지고 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

스트레로 인한 면역력 저하를 개선하는 효능을 가지는 단풍마 단백질 추출물을 제공하고, 이를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 단백질 추출물을 단풍마로부터 분리하여 제조하는 본 발명의 방법은 아래와 같은 단계를 특징으로 한다(도1).

(a) 단풍마 뿌리 줄기를 믹서기로 분쇄한 후, pH 8.0 인 Tris 수용액을 4 ~ 6배의 무게비로 첨가하고 30분 이상 교반해준다.

(b) 위 (a)단계의 혼합액을 5 μm 이상 크기 입자를 제거하는 여과필터에 통과시키고, 다시 0.45 μm 이상 크기 입자를 제거하는 여과필터에 통과시켜서 여과액을 수득한다.

(c) 위 (b)단계의 여과액을 분자량 10,000 dalton 이상 크기 입자를 분획할 수 있는 한외 여과(ultrafiltration) 필터와 pH 8.0 인 Tris 수용액을 이용하여 투석여과(diafiltration)하고 저분자 성분을 99% 이상 제거한 농축액 (retentate)을 얻는다.

(d) pH 8.0 인 Tris 수용액으로 평형화된 Q-Sepharose 음이온 교환 컬럼에 위 (c)단계의 농축액을 통과시키고, 다시 pH 8.0 인 Tris 수용액을 통과시킨다.

(e) 0.20 mole/L 농도의 NaCl (sodium chloride)을 함유하고 pH 8.0 인 Tris 수용액을 위 (d)단계의 음이온 교환 컬럼에 통과시켜서 컬럼에서 용출된 용액을 수득한다. 이 용출액을 분자량 10,000 dalton 이상 크기 입자를 분획할 수 있는 한외 여과 필터와 증류수를 이용하여 투석여과하고 NaCl 과 Tris 성분을 99% 이상 제거한 농축액을 얻는다. 이 농축액을 동결건조하여 단풍마 단백질 추출물인 DQP-2 분말을 수득한다.

(f) 0.30 mole/L 농도의 NaCl 을 함유하고 pH 8.0 인 Tris 수용액을 위 (d)단계의 음이온 교환 컬럼에 통과시키고 컬럼에서 용출된 용액을 수득한다. 이 용출액을 분자량 10,000 dalton 이상 크기 입자를 분획할 수 있는 한외 여과 필터와 증류수를 이용하여 투석여과하고 NaCl 과 Tris 성분을 99% 이상 제거한 농축액을 얻는다. 이 농축액을 동결건조하여 단풍마 단백질 추출물인 DQP-1 분말을 수득한다.

단풍마의 뿌리 줄기로부터 위와 같은 본 발명의 제조 방법으로 수득한 DQP-1 분말과 DQP-2 분말은 98 중량% 이상 단백질로 구성된 추출물이고 분자량이 약 27,000 ~ 33,000 dalton 인 폴리펩티드로 주로 구성되어 있으며, 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 효능을 나타낸다.

본 발명에서 생쥐 세포를 대상으로 한 세포 실험 결과들은, 림프구, 대식세포, 자연살해세포를 매개로 하는 특이적 면역 반응에 대해 본 발명의 제조 방법으로 수득한 단풍마 단백질 추출물인 DQP-1 과 DQP-2 이 유의한 수준으로 면역 증진 효과가 있음을 보여준다. 특히, DQP-1 추출물이 DQP-2 추출물보다 우수한 면역 증진 효과를 나타낸다. 그리고, 본 발명에서 생쥐를 대상으로 한 동물 실험의 결과들은, 스트레스로 인한 면역 장기의 위축, 스트레스로 인한 혈중 면역 세포 수와 면역 싸이토카인 농도의 감소, 스트레스로 인한 비정상적인 혈중 효소들의 역가 상승 등을, 본 발명의 DQP-1 추출물이 유의한 수준으로 정상 회복시켜서 스트레스로 인한 면역력 저하를 효과적으로 개선할 수 있음을 보여준다. 결론적으로, 본 발명의 제조 방법으로 수득한 단풍마 단백질 추출물 DQP-1 은 세포 수준에서 면역력을 증진시키고 생체 수준의 면역력 증진에도 영향을 미쳐서, 스트레스로 인한 면역력 저하를 효과적으로 정상화 시키는 효능을 갖고 있다. 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물의 이러한 효능들을 좀더 자세히 설명하자면 아래와 같다.

생쥐 세포를 대상으로 한 본 발명의 실험에서, 유사 분열 촉진제인 Lipopolysaccharide 와 Concanavalin A 로 각각 유발된 림프구 B 세포와 T 세포의 증식을 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물이 유의한 수준으로 증가시키는 것이 확인된다(도2). 특히, DQP-2 추출물보다 DQP-1 추출물이 더 우수한 림프구 증식 자극 효과를 나타낸다. 이것은, 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물이 B 세포와 T 세포의 증식을 자극하는 효과가 있음을 의미하며, 이는 면역 증진을 유도할 수 있는 것이다.

또한, 생쥐 세포를 대상으로 한 본 발명의 실험에서, 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물이 자연살해세포와 대식세포의 암세포 사멸 활성을 유의한 수준으로 증가시키는 것이 확인된다(도3). 특히, DQP-2 추출물보다 DQP-1 추출물이 더 우수한 암세포 사멸 활성을 나타낸다. 자연살해세포와 대식세포는 바이러스 감염이나 세균 감염 그리고 암 세포에 대항하는 면역적 방어 기전의 제일 선에서 중요한 역할을 담당하고 있다. 따라서, 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물이 자연살해세포와 대식세포의 면역 반응을 증진시키는 효과가 있음을 의미하며, 이는 면역 증진 효과가 있음을 나타낸다.

본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물이 세포 수준에서 보여주는 위와 같은 우수한 면역 증진 효과가 생체 수준에서도 면역계에 영향을 미치게 된다. 특히, 세포 수준에서 DQP-2 보다 면역 증진 효과가 더 우수한 단풍마 DQP-1 단백질 추출물은 생체 수준에서 스트레스로 인한 면역력 저하를 효과적으로 개선하는 효능을 아래와 같이 보여준다.

많은 실험 동물 연구들이 스트레스에 의해 면역계가 영향을 받는다는 것을 보고하고 있다. 열이나 추위에 의한 스트레스는 비장, 흉선, 림프절 같은 면역 관련 기관들의 퇴화를 야기할 수 있다고 알려져 있다. 이러한 면역 관련 기관들의 크기는 면역 반응과 연관되므로, 저온에 노출된 생쥐들의 경우 비장의 크기가 작아지게 되고 결국 낮은 면역 반응성을 나타낸다는 것도 보고되었다. 본 발명의 동물 실험 결과는, 생쥐에 대한 DQP-1 단백질 추출물의 경구 투여가 저온 스트레스에 의한 비장의 무게 감소를 유의적인 수준으로 회복시킬 수 있음을 보여준다(도4). 이는 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 스트레스로 인한 면역 기관의 퇴화를 방지하고 면역력 저하를 개선시킬 수 있음을 나타낸다.

스트레스에 노출된 결과로 림프구 증식 등이 억제된다는 것도 알려져 있는데, 혈액과 비장 림프구들에서 CD4⁺ 세포들과 CD8⁺ 세포들의 비율이 스트레스에 의해 감소된다는 것이 보고되었다. CD4⁺ T 세포와 CD8⁺ T 세포는 효과적인 면역 반응 기전에 필수적이다. 본 발명의 동물 실험과 유동 세포 분석의 결과에서도, 저온 스트레스를 받은 생쥐들의 경우 비장 T 세포들의 소분포에서 CD4⁺ 세포들과 CD8⁺ 세포들의 비율이 낮아진다는 것을 확인할 수 있고, 이는 면역 기능의 저하를 의미한다. 그러나, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 경구 투여된 생쥐들의 경우에는, 저온 스트레스로 인해 CD4⁺ 세포들과 CD8⁺ 세포들의 비율이 낮아지는 것이 억제되고 세포 비율이 정상화된다는 것이 확인된다(표1). 이는 스트레스에 인해 면역 세포 수가 감소되고 면역 기능이 저하되는 것을 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 개선시키고 회복시킬 수 있음을 나타낸다. 역시 본 발명의 동물 실험 결과에서, 저온 스트레스를 받은 생쥐들의 혈청에서는 면역 관련 싸이토카인들인 IL-2, IL-12, IFN-g 의 농도가 유의적인 수준으로 감소된다는 것이 확인된다. 그러나, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물을 경구 투여한 생쥐들의 경우에는, 저온 스트레스에 의한 이러한 변화가 유의적인 수준으로 억제되고, 오히려 IL-12 와 IFN-g 의 농도가 저온 스트레스를 받지 않은 생쥐들보다도 증가한다는 것이 확인된다(표2). 이 역시, 스트레스에 인해 면역 싸이토카인 량이 감소되고 면역 기능이 저하되는 것을 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 개선시키고 회복시킬 수 있음을 나타낸다.

혈액 중에는 많은 효소가 포함되어 있고 정상적인 신체의 경우 일정 범위 내의 효소 역가 수치를 나타낸다. 그러나, 질병 특히 급성 질환이 발생하면 효소들의 역가 값이 이상(異常) 수치가 되는데, LDH(Lactate dehydrogenase) 와 AST(Aspartate aminotransferase) 효소 수치는 간 손상이나 심장 이상의 지표이고, ALT(Alanine aminotransferase)는 간 손상의 지표로서, 해당 장기에 이상이 생겼을 경우 수치가 비정상적으로 상승하게 된다. 이런 혈중 효소들의 역가 수치는 스트레스에 의해서도 변화가 생긴다는 것이 알려져 있다. 본 발명의 동물 실험 결과에서도 저온 스트레스가 생쥐 혈액의 LDH, AST, ALT 수치를 모두 비정상적으로 상승시킨다는 것이 확인된다. 그러나, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 경구 투여된 생쥐들의 경우에는 LDH, AST, ALT 수치들의 비정상적인 상승을 유의적인 수준으로 억제하고 정상화시킨다는 것이 확인된다(도5). 이는 스트레스에 의한 장기 손상의 가능성도 본 발명의 DQP-1 단백질 추출물이 효과적으로 억제하고 개선할 수 있음을 보여준다.

위와 같이, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물은 생체 수준에서 스트레스로 인한 면역력 저하를 효과적으로 개선하고 정상화 시킨다는 것을 알 수 있다.

도 1 은 단풍마 뿌리 줄기로부터 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 단백질 추출물을 제조하는 과정을 도식화한 그림.
도 2a 은 본 발명의 DQP-1 이나 DQP-2 추출물의 투여가 생쥐 B 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그림.
도 2b 는 본 발명의 DQP-1 이나 DQP-2 추출물의 투여가 생쥐 T 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그림.
도 3a 는 본 발명의 DQP-1 이나 DQP-2 추출물의 투여가, 자연 살해(NK) 세포의 YAC-1 종양세포에 대한 항암 작용에 미치는 영향을 나타낸 그림.
도 3b 는 본 발명의 DQP-1 이나 DQP-2 추출물의 투여가, 대식 세포의 B16 흑색종 세포에 대한 항암 작용에 미치는 영향을 나타낸 그림.
상기 도2 와 도3 에서 각 막대 그래프의 값은 평균±표준오차로 나타낸 것이다(n=5). * 와 ** 표시는 대조군(DQP = 0 μg/mL)에 대한 유의차(각 P<0.05 와 P<0.01)를 나타낸 것이다.
도 4 는 본 발명의 DQP-1 추출물의 경구 투여가 저온 스트레스를 준 생쥐의 비장 무게에 미치는 영향을 나타낸 그림.
도 5a 는 본 발명의 DQP-1 추출물의 경구 투여가 저온 스트레스를 준 생쥐의 혈중 Alanine aminotransferase(ALT) 역가 수치에 미치는 영향을 나타낸 그림.
도 5b 는 본 발명의 DQP-1 추출물의 경구 투여가 저온 스트레스를 준 생쥐의 혈중 Aspartate aminotransferase(AST) 역가 수치에 미치는 영향을 나타낸 그림.
도 5c 는 본 발명의 DQP-1 추출물의 경구 투여가 저온 스트레스를 준 생쥐의 혈중 Lactate dehydrogenase(LDH) 역가 수치에 미치는 영향을 나타낸 그림.
상기 도4 와 도5 에서 각 막대 그래프의 값은 평균±표준오차로 나타낸 것이다(n=5). * 와 ** 표시는 저온 스트레스를 주지 않은 대조군에 대한 유의차(각 P<0.05 와 P<0.01)를 나타내고, + 와 ++ 표시는 저온 스트레스를 준 실험군들 중에서 위약 투여군(0 mg/kg)에 대한 유의차(각 P<0.05 와 P<0.01)를 나타낸 것이다.

이하 실시 예를 통해서 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이하의 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

달리 정의 되지 않는 한 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에서 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

실시예 1: 단풍마로부터 스트레스로 인한 면역력 저하를 개선하는 활성을 갖는 단백질 추출물을 수득하는 제조 방법

이하 실시예에서 사용하는 Tris 수용액은 pH 8.0 이고 50 mmole/L 농도인 Tris (Sigma-Aldrich, 미국) 수용액이다. 단풍마 뿌리 줄기 500g 의 껍질을 상당 부분 제거하고 깨끗이 세척한 후, 일반 식용 믹서기에 넣고 단속적으로 5분 간 분쇄한다. 이 분쇄물에 Tris 수용액을 2.5 kg 첨가하고, 교반기에서 400 rpm 으로 1시간 동안 교반해준다. 이 혼합액을 여과지(Advantec 3, 일본)와 감압여과장치를 이용하여 여과하고 여과액을 수득한다. 이 여과액을 마이크로 여과 필터(pore size 0.45μm)와 감압여과장치를 이용하여 여과하고 여과액을 수득한다. 이 여과액을 한외 여과(ultrafiltration) 필터(NMWL 10000, Merck Millipore, 미국)와 수직 흐름 여과(tangential flow filtration) 장치(ProFlux M12, Merck Millipore, 미국)를 이용하여 투석여과(diafiltration)하며 저분자 성분을 99% 이상 제거한다. 이때 첨가하는 희석 용액으로는 Tris 수용액을 사용한다. 이 수직 흐름 여과 장치에서 최종적으로 500mL 농축액(retentate)을 얻는다. 이 농축액을 마이크로 여과 필터(pore size 0.45μm)와 감압여과장치를 이용하여 여과하고, 이 여과액을 음이온 크로마토그래피를 시행할 원료액으로 수득한다. 100mL 부피의 Q-Sepharose 음이온 교환 수지(GE Healthcare, 미국)로 충진된 유리 컬럼을 Tris 수용액으로 평형화시키고, 이 음이온 교환 컬럼에 상기에서 마련한 원료액을 흘려 보내준다. 그리고, 이 음이온 교환 컬럼에 Tris 수용액을 200mL 흘려 보내준다. 그 다음, 0.20 mole/L 농도의 NaCl 이 함유된 Tris 수용액 100mL 을 상기의 음이온 교환 컬럼에 흘려 보내주어 용출액 DQP-B 를 수득한다. 그리고, 0.30 mole/L 농도의 NaCl 이 함유된 Tris 수용액 100mL 을 상기의 음이온 교환 컬럼에 흘려 보내주어 용출액 DQP-A 를 수득한다. 상기에서 마련한 용출액 DQP-B 를 한외여과필터(NMWL 10,000)와 수직 흐름 여과 장치를 이용하여 투석여과하며 NaCl 과 Tris 성분을 99% 이상 제거한다. 이때 첨가하는 희석 용액으로는 증류수를 사용한다. 이 수직 흐름 여과 장치에서 최종적으로 수득한 농축액(retentate)을 동결건조하여, 단풍마 단백질 추출물인 DQP-2 분말을 약 1.4 g 수득한다. 같은 방법으로 상기에서 마련한 용출액 DQP-A 를 투석여과하고, 최종적으로 수득한 농축액(retentate)을 동결건조하여, 단풍마 단백질 추출물인 DQP-1 분말을 약 0.85 g 수득한다.

실험예 1: 단풍마 단백질 추출물인 DQP-1 과 DQP-2 분말의 조성

BCA 단백질 분석 키트(BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 제조사에서 제공하는 실험법으로 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 분말의 단백질 함량을 분석하였으며, 모두 98 중량% 이상 단백질로 이루어져 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 분말을 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 전기 영동 실험법으로 분석한 결과, DQP-1 과 DQP-2 분말 모두 분자량 30,000 dalton 부근의 1개 밴드만이 주로 관찰되었다. 이 결과는 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물 모두 약 30,000 dalton 분자량의 폴리펩티드로 주로 구성되어 있음을 나타낸다.

실험예 2: 생쥐 림프구 증식능 시험

무균 상태에서 수컷 C57BL/6 생쥐의 비장을 적출하고, 세포 배양 배지에 비장 세포들을 부유시켜서 세포 농도가 2x10⁶개/mL 되도록 조정하였다. 배지로는 10% 열처리 우태혈청(이하 FBS), 페니실린(100 IU/mL), 그리고 스트렙토마이신(100 μg/mL) 을 함유한 RPMI1640(GIBCO, 미국)(이하 RPMI-FBS)를 사용하였다. 세척된 비장세포 현탁액을 마이크로 플레이트에 well 당 5x10⁵개 세포수가 되도록 조정하여 첨가하고, 각 well 에 본 발명의 DQP-1 혹은 DQP-2 추출물을 농도별로(4, 20, 100, 500 μg/mL) 첨가하였다. 이 혼합액 well 에 따라 B 세포 분열 촉진제(mitogen)로는 대장균 유래 lipopolysaccharide(이하 LPS, Sigma, 미국)를 10 μg/mL 농도로, T 세포 분열 촉진제로는 concanavalin A(이하 Con A, Sigma, 미국)를 4 μg/mL 농도로 처치하고, 각 well 혼합액의 최종 부피가 200 μL 되도록 하였다. 이 마이크로 플레이트를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 48시간 동안 배양한 후, 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(이하 MTT) 분석법을 통해 살아있는 세포 량을 흡광도로 측정하여 B 세포와 T 세포의 증식능을 확인하였다. 생쥐 1 마리의 비장으로부터 세포를 마련하여 1회 분석을 수행하였으며, 매 분석마다 새로운 비장 세포를 마련하여 수행하였다.

DQP-1 혹은 DQP-2 추출물로 B 세포 증식을 촉진한 결과는 도2a 와 같았다. DQP-2 보다 DQP-1 의 증식 효과가 더 우수하였으며, LPS 만 처리한 경우(DQP = 0 μg/mL)보다, DQP-1 을 함께 처리한 경우에 B 세포 증식을 거의 2배 이상 유의적인 수준으로 증가시켰다. DQP-1 혹은 DQP-2 추출물로 T 세포 증식을 촉진한 결과는 도2b 와 같았다. DQP-2 보다 DQP-1 의 증식 효과가 더 우수하였으며, Con A 만 처리한 경우(DQP = 0 μg/mL)보다, DQP-1 을 함께 처리한 경우에 T 세포 증식도 2배 가까이 유의적인 수준으로 증가시켰다. 이러한 실험결과는, 본 발명의 DQP-1 과 DQP-2 추출물이 B 세포와 T 세포의 증식을 자극하는 효과가 있음을 의미하며, 이는 면역 증진을 유도할 수 있는 것이다. 특히, DQP-1 추출물이 더 우수한 면역 증진 효능이 있음을 나타낸다.

실험예 3: 생쥐 자연살해(NK) 세포에 의한 항암 효과 시험

무균 상태에서 수컷 C57BL/6 생쥐의 비장을 적출하고, 세포 배양 배지에 비장 세포들을 부유시킨 후, 0.83% Tris-NH₄Cl 로 적혈구를 용해시켰다. 배지로는 10% 열처리 FBS, penicillin(100 IU/mL), 그리고 streptomycin(100 μg/mL) 을 함유한 RPMI1640 을 사용하였다. 세척된 비장세포 현탁액을 마이크로 플레이트에 well 당 2.5x10⁵개 세포수가 되도록 조정하여 첨가하였고, 각 well 에 본 발명의 DQP-1 혹은 DQP-2 추출물을 농도별로(0, 4, 20, 100, 500 μg/mL) 투여하였으며 다른 well 에 양성 대조군 물질로서 인터류킨2(이하 IL-2, 1000 U/mL)를 투여하였다. 그리고 모든 well 에 polymyxin B (50 μg/mL)를 첨가하였다. 각 well 의 혼합액에 YAC-1 종양세포를 well 당 1x10⁴개 세포수가 되도록 가하고 최종 부피가 200 μL 되도록 하였다. 세포 독성률(%)을 측정하기 위하여 비장세포 현탁액만 있는 well 과 YAC-1 종양세포만 있는 well 도 포함시켰다. 이 마이크로 플레이트를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 48시간 동안 배양한 후, MTT 분석법을 통해 살아있는 세포량을 흡광도로 측정하였다. 실험 결과로, 비장 세포 중 자연살해 세포의 YAC-1 종양세포에 대한 세포 독성은 아래와 같은 수식으로 계산하였다. 생쥐 1 마리의 비장으로부터 세포를 마련하여 1회 분석을 수행하였으며, 매 분석마다 새로운 비장 세포를 마련하여 수행하였다.

[세포 독성(%)] = [ 1 - { (비장세포 현탁액과 YAC-1 종양세포 혼합액 well 의 흡광도) - (비장세포 현탁액 well 의 흡광도) } / (YAC-1 종양세포 well 의 흡광도) ] x 100

실험 결과는 도3a 와 같았다. DQP-1 추출물은 자연살해(NK) 세포에 의한 YAC-1 종양세포 사멸율을 약 1.5배 이상 유의적인 수준으로 증가시켰으며, 500 μg/mL 농도의 DQP-1 은 양성 대조군 물질인 1000 U/mL 의 IL-2 보다 우수한 효과를 나타내었다. 이러한 실험 결과는 본 발명의 DQP-1 추출물이 자연살해 세포의 면역 반응을 증진시키는 효과가 있음을 의미하며, 이는 면역 증진을 유도할 수 있는 것이다.

실험예 4: 생쥐 대식 세포에 의한 항암 효과 시험

대식 세포 활성화를 위해 Brewer Thioglycollate broth(4.05 g/100 mL) (Difco Laboratories, 미국) 1 mL 을 수컷 C57BL/6 생쥐의 복강 내에 주입하고, 3~4일 후에 5mL 의 RPMI 16040 배지로 복강을 세척하였다. 삼출되어 나온 세포들을 원심분리법으로 2번 세척하고, RPMI 16040 배지에 부유시켰다. 사용한 RPMI 16040 배지는 10% 열처리 FBS, penicillin(100 IU/mL), 그리고 streptomycin(100 μg/mL) 을 함유(이하 RPMI-FBS)하였다. 복강에서 삼출된 세포들을 테프론 코팅된 페트리 디쉬(100 x 15mm)에 cm² 면적 당 5~6×10⁵ 개 세포수 농도로 접종하고, CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 2~3 시간 배양하여 대식 세포가 바닥에 부착되도록 하였다. 그 페트리 디쉬를 10mL 의 배지로 2번 세척하여, 부착되지 않은 세포들을 제거하고, 페트리 디쉬를 4℃ 에 10 분간 보관하였다. 상등액을 버린 후에, 그 페트리 디쉬를 D-PBS(GIBCO, 미국)로 1번 세척하였다. 1.5 % FBS 를 함유한 차가운 PBS 15 mL 을 페트리 디쉬에 첨가하고, 0.1M EDTA (pH 7.0)를 0.3 mL 첨가하였다. 그 페트리 디쉬를 상온에서 15 분간 보관한 후, 10mL 주사기를 이용하여 배지로 10번 헹구어 내며 대식 세포를 떼어낸다. 떼어낸 세포들의 생존 상태는 trypan blue 염색법으로 확인하고, 대식 세포의 비율은 acridine orange 로 세포질 염색을 한 후 형광현미경 관찰로 확인하였다. 마련된 세포들은 생존율이 95% 이상이었으며, 대식 세포의 비율이 95% 이상이었다. 3 마리의 생쥐로부터 대식 세포를 마련하여 다음의 1회 분석에 사용하였다. 마련된 대식 세포 현탁액을 마이크로 플레이트에 well 당 1.0x10⁵개 세포수가 되도록 조정하여 첨가하였다. 각 well 에 본 발명의 DQP-1 혹은 DQP-2 추출물을 농도별로(0, 4, 20, 100, 500 μg/mL) 투여하였으며, 다른 well 에 양성 대조군 물질로서 LPS(1 μg/mL)와 함께 인터페론 감마(이하 IFN-g, 50 U/mL)를 투여하였다. 그리고 모든 well 에 polymyxin B(50 μg/mL)를 첨가하였다. 각 well 의 혼합액에 B16 흑색종(melanoma) 세포를 well 당 1x10⁴개 세포수가 되도록 가하고 최종 부피가 200 μL 되도록 하였다. 세포 독성률(%)을 측정하기 위하여 대식 세포 현탁액만 있는 well 과 B16 흑색종 세포만 있는 well 도 포함시켰다. 이 마이크로 플레이트를 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 24시간 동안 배양한 후, MTT 분석법을 통해 살아있는 세포량을 흡광도로 측정하였다. 실험 결과로, 대식 세포의 B16 흑색종 세포에 대한 세포 독성은 아래와 같은 수식으로 계산하였다.

[세포 독성(%)] = [ 1 - { (대식 세포 현탁액과 B16 흑색종 세포 혼합액 well 의 흡광도) - (대식 세포 현탁액 well 의 흡광도) } / (B16 흑색종 세포 well 의 흡광도) ] x 100

실험 결과는 도3b 와 같았다. 본 발명의 DQP-1 나 DQP-2 추출물은 모두 대식 세포에 의한 B16 흑색종 세포 사멸율(%)을 증가시켰으며, 특히 DQP-1 은 약 1.4배 만큼 유의적인 수준으로 항암 작용을 증가시켰다. 4 μg/mL 농도의 DQP-1 이, 양성 대조군 물질로서 투여된 1 μg/mL LPS + 50 U/mL IFN-g 와 유사한 항암 작용 증진 효과를 나타내었다. 이러한 실험 결과는 본 발명의 DQP-1 추출물이 대식 세포의 면역 반응을 증진시키는 효과가 있음을 의미하며, 이는 면역 증진을 유도할 수 있는 것이다.

실험예 5: 환경적 스트레스에 대한 생쥐의 면역 반응 시험

수컷 ICR 생쥐들을 4일 간 매일 일정 시간 동안 4℃ 온도의 방에 두어서 저온 스트레스를 유발시켰다. 그 4일 간 24시간 간격으로 본 발명의 DQP-1 추출물을 농도별로(0, 25, 50, 100, 200 mg/kg) 경구 투여하였다. 첫째 날에는 경구 투여 후에 4시간 동안, 둘째 날에는 경구 투여 후에 7시간 동안, 그리고 셋째와 넷째 날에는 각각 경구 투여 후에 24시간 동안 4℃ 온도의 방에 두었다. 대조군(control)으로는 저온 처리나 시험물질 처리를 하지 않은 생쥐들로 하였다. 그리고, 다섯째 날에 각 생쥐들에 대해 혈액과 기관 시료를 채취하여 아래의 분석을 수행하였다. 먼저, 생쥐 별로 체중과 비장(spleen)의 기관 무게를 측정하였다.

흉선에 존재하는 림프구 소집단들의 분포를 정량하기 위하여, 아래와 같이 흉선 세포 시료를 마련하고 유동 세포 분석을 실시하였다. 형광물질이 표지된 단클론 항체로는 rat anti-mouse CD8 항체와 rat anti-mouse CD4 항체(Invitrogen, 미국)들을 사용하였다. 실험에 사용된 생쥐들의 흉선들을 유리구슬 조직 파쇄기로 부드럽게 갈아서 세포들을 분리하였고 인산 완충 생리 식염수(이하 PBS)로 2번 세척 및 원심분리하였다. 2% 의 불활성화한 우태혈청(fetal bovine serum, 이하 FBS) (GIBCO, 미국)과 0.1% 의 NaN₃ 를 포함한 40 mL 의 PBS(이하 PBS-FBS-NaN₃)에 세포를 부유시키고, 여기에 PBS-FBS-NaN₃ 로 희석시킨 각 항체액 10 mL 씩을 첨가하였다. 이 혼합액을 얼음 수조에서 30분 동안 놔두었다가, 420 g 와 4℃ 의 조건에서 10분간 원심분리하였다. 침전된 세포는 다시 PBS-FBS-NaN₃ 로 2번 세척 및 원심분리하였다. 세포들을 1% p-formaldehyde 로 고정하고, Bryte-HS 유세포 분석기(Bio-Rad Laboratories, 미국)로 유동 세포 분석을 실시하였다.

혈액 시료들은 4℃ 의 10,000 g 에서 5분 동안 원심 분리하여 혈청 시료를 분리하였다. 혈청 속의 인터류킨-2(이하 IL-2), 인터류킨-12(이하 IL-12), 그리고 인터페론-감마(이하 IFN-g) 함량은 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, 이하 ELISA)으로 측정하였다. 혈청의 Alanine Aminotransferase(이하 ALT), Aspartate Aminotransferase(이하 AST), Lactate Dehydrogenase(이하 LDH) 활성도는 Hitachi 7600 자동분석기(Hitachi, 일본)를 이용하여 분석하였다.

실험 결과, 저온 스트레스를 받지 않은 생쥐들에 비해, 저온 스트레스를 받은 생쥐들의 비장의 상대 무게는 70% 수준으로 감소되었다. 그러나, 본 발명의 DQP-1 추출물을 50 mg/kg 이상 경구 투여한 생쥐들의 경우에는, 저온 스트레스에 의한 비장의 상대 무게 감소가 유의적인 수준으로 억제되어 상대 무게가 정상 수치까지 회복되었다(도4). 이러한 실험 결과는, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 스트레스로 인한 면역 기관의 퇴화를 방지하여 면역력 저하를 개선시키고 회복시킬 수 있음을 나타낸다.

또한 실험 결과, 저온 스트레스를 받지 않은 생쥐들에 비해, 저온 스트레스를 받은 생쥐들의 흉선 림프구에서는 CD4⁺ 세포들과 CD8⁺ 세포들, 그리고 더블 포지티브 CD4⁺CD8⁺ 세포들의 백분율이 유의적인 수준으로 감소되었다. 그러나, 본 발명의 DQP-1 추출물을 100 mg/kg 이상 경구 투여한 생쥐들의 경우에는, 저온 스트레스에 의한 이러한 변화가 유의적인 수준으로 억제되어 세포들의 백분율이 정상 수치까지 회복되었다(표1). 이러한 실험 결과는, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 스트레스에 의한 면역 관련 세포수 저하를 억제하여 면역 기능을 개선하고 회복시킬 수 있음을 나타낸다.

또한 실험 결과, 저온 스트레스를 받지 않은 생쥐들에 비해, 저온 스트레스를 받은 생쥐들의 혈청에서는 면역 관련 싸이토카인(cytokine)인 IL-2, IL-12, IFN-g 의 농도가 유의적인 수준으로 감소되었다. 그러나, 본 발명의 DQP-1 추출물을 100 mg/kg 경구 투여한 생쥐들의 경우에는, 저온 스트레스에 의한 이러한 변화가 유의적인 수준으로 억제되었으며, 특히 IL-12 와 IFN-g 의 농도는 정상적인 수준까지 완전히 회복시켰다(표2). 이러한 실험 결과는, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 스트레스에 의한 혈중 면역 싸이토카인 농도 저하를 억제하고 정상적인 수준으로 회복시켜서 면역 기능을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.

또한 실험 결과, 저온 스트레스는 생쥐들의 혈청 효소 역가 수치들을 비정상적인 수준으로 증가시켰는데, 저온 스트레스를 주지 않은 경우에 비해 ALT, AST, LDH 효소들의 역가 수치가 각각 1.6배, 1.6배, 1.8배까지 유의적인 수준으로 증가하였다. 그러나, 본 발명의 단풍마 DQP-1 추출물을 경구 투여한 생쥐들의 경우에는, 저온 스트레스에 의한 효소 역가 수치의 비정상적인 상승이 유의적인 수준으로 억제되었다. 50 mg/kg 이상 농도의 DQP-1 투여군에서 ALT, AST, LDH 효소 역가는 거의 정상 수치까지 회복되었다(도5a , 5b, 5c). 이러한 실험 결과는, 본 발명의 단풍마 DQP-1 단백질 추출물이 스트레스에 의한 혈중 효소 수치의 비정상적인 상승과 이에 따른 장기 이상의 가능성도 효과적으로 억제하고 개선시킬 수 있음을 나타낸다.

결론적으로, 본 발명의 단풍마 단백질 추출물 DQP-1 은 세포 수준에서 면역력을 증진시키고 생체 수준의 면역력 증진에도 영향을 미쳐서, 스트레스로 인한 면역력 저하를 효과적으로 개선하고 정상화시키는 효능을 갖고 있음을 알 수 있다.

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다음의 단계들을 포함하는 단풍마 단백질 추출물 제조방법.
(a) 단풍마 뿌리 줄기를 믹서기로 분쇄한 후, pH 8.0 인 Tris 수용액을 4~6배의 무게비로 첨가하고 30분 이상 교반하는 단계
(b) 위 (a)단계의 혼합액을 5 μm 이상 크기 입자를 제거하는 여과필터에 통과시키고, 다시 0.45 μm 이상 크기 입자를 제거하는 여과필터에 통과시켜서 여과액을 수득하는 단계
(c) 위 (b)단계의 여과액을 분자량 10,000 dalton 이상 크기 입자를 분획할 수 있는 한외 여과(ultrafiltration) 필터와 pH 8.0 인 Tris 수용액을 이용하여 투석여과(diafiltration)하고 저분자 성분을 99% 이상 제거한 농축액 (retentate)을 얻는 단계
(d) pH 8.0 인 Tris 수용액으로 평형화된 Q-Sepharose 음이온 교환 컬럼에 위 (c)단계의 농축액을 통과시키고, 다시 pH 8.0 인 Tris 수용액을 통과시키는 단계
(e) 0.20 mole/L 농도의 NaCl 을 함유하고 pH 8.0 인 Tris 수용액을 위 (d)단계의 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 용출액을 수득하는 단계
(f) 0.30 mole/L 농도의 NaCl 을 함유하고 pH 8.0 인 Tris 수용액을 위 (e)단계의 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 용출액을 수득하는 단계
(g) 위 (f)단계의 용출액을 분자량 10,000 dalton 이상 크기 입자를 분획할 수 있는 한외 여과 필터와 증류수로 투석여과하여 NaCl 과 Tris 성분을 99% 이상 제거한 농축액을 얻는 단계
(h) 위 (g)단계의 농축액을 동결건조하여 단풍마 단백질 추출물 분말을 수득하는 단계