KR101860639B1

KR101860639B1 - 난독성 보호 활성을 갖는 오수유 추출물을 포함하는 조기난소부전 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101860639B1
Application number: KR1020160129640A
Authority: KR
Inventors: 김동일; 이주희; 김희정
Original assignee: 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2018-05-24
Also published as: US10835564B2; US20190183957A1; KR20170064986A

Abstract

본 발명은 난독성 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 오수유 추출물을 포함하는 난독성 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 오수유 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 증가시키므로 항산화 활성이 우수하고, 난소 세포의 세포사멸 (apoptosis)을 억제하며, PI3K/Akt 신호전달 경로를 활성화시켜 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)에 의해 유도되는 난독성에 대한 유의적인 보호 효과를 가지는바, 난독성, 조기난소부전 등의 개선, 예방, 억제 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다. 따라서 관련 적용례로서 난임의 치료 혹은 예방, 조기난소부전 및 폐경 전 갱년기장애 등을 고려할 수 있다.

Description

난독성 보호 활성을 갖는 오수유 추출물을 포함하는 조기난소부전 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising extract of evodiae fructus having protective activity against ovotoxicity for preventing or treating premature menopause}

본 발명은 난독성 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 오수유 추출물을 포함하는 난독성 예방 또는 치료용 조성물 또는 이를 포함하는 조기난소부전 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

성의 생식노화는 자연적인 노화뿐만 아니라 다양한 환경적 요인에 의할 수 있다. 이러한 생식노화에 의한 난소의 기능부전이 40세 이전에 발생할 경우 조기난소부전이라 한다.

조기난소부전은 여러 가지 요인에 의해 난소에 있는 난포들이 반응을 않거나 소멸되어 나타나는 임상적 상태이다. 조기난소부전은 40세 이전의 여성의 약 1%에서 발생하며, 1차성 무월경의 10~28%, 2차성 무월경의 4~18%가 조기난소부전으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다. 난소의 기능이 완전히 정지된 폐경과는 달리 5~10%에서 임신이 가능한 경우가 있으나 예후를 가늠하기는 불가하다. 이러한 조기 난소부전의 원인으로는 유전적 요인, 자가 면역에 의한 난소 손상이 원인이 되어 발생하기도 하고 항암치료, 방사선 치료, 난소 수술 등에 의한 의인성 원인이나 바이러스 감염, 혹은 약물, 흡연 등에 의한 환경적 요인을 병인으로 들고 있으나, 대부분의 환자에서 발생 기전과 원인을 규명하기 어려운 경우가 많다. 이러한 조기난소부전은 이른 폐경으로 말미암아 자연적인 폐경 경과의 여성에 비해 더욱 심각한 폐경관련 증상을 조기에 그리고 더욱 위중하게 호소할 수 있다. 이것은 폐경 이후의 여명 (life expectancy)을 고려할 때 정서적 안녕감과 성적 자아 훼손은 물론 심혈관계 질환 및 골다공증 등 건강관련 삶의 질 저하의 심각한 선행 원인이 될 수 있다.

한의학에서는 조기난소부전과 관련하여 "年未者而經水斷"로 표현되지만 광범위하게는 폐경 (閉經)의 범주 안에서 찾아볼 수 있다. <소문 (素問)> 「상고천진론 (上古天眞論)」에 '七七任脈虛太衝脈衰少天癸竭地道不通故形壞而無子也'라고 하여 여성은 일반적으로 49세에 폐경이 되는데, 이는 자연스러운 노화과정으로 인한 것이며, 이와 달리 조기난소부전에 의해 초래되는 폐경은 「부청주남녀과 (傅靑主男女科)」에서 '女子七七天癸絶, 未及其年而先經斷者'라 하여 폐경기에 달하기 전에 월경이 폐지 (閉止)되는 병적 상황을 말하였다.

한편, 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)는 고무 타이어, 폴리에스테르, 플라스틱을 제조하는데 전형적으로 사용되어온 물질이다. 그런데 이러한 VCD는 생식노화와 관련된 환경적 요인의 화학물질로서 주목받아왔다. VCD는 자연 세포 사멸 과정을 가속화함으로써 선택적으로 ovarian small pre-antral (primordial and primary) follicles의 파괴를 유발한다. 또한 VCD는 백서 모델에서 선택적으로 원시 난포를 파괴하는 물질로 직접적으로 oocyte-associated c-kit receptor에 상호작용하여 인산화작용 (auto phosphorylation)을 억제하게 되어 난모세포의 생존능력을 손상시킨다. 이 과정에서 kit의 distribution 문제가 생기면서 하위 (downstream)에 있는 PI3K protein의 활성과 PI3K family인 Akt에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

따라서, 이러한 난독성, 보다 구체적으로 VCD에 의해 유도되는 난독성 및 이를 통한 조기난소부전을 치료하기 위한 치료제 물질을 개발하기 위하여 다양한 연구들이 진행되고 있고, 특히 인체에 무해하여 장기간 안전하게 복용할 수 있는 생약재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 (일본 공개특허 JP2005-298450), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 조기난소부전에 효과적인 생약재 추출물 소재를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 오수유 추출물이 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)에 의해 유도되는 난독성에 유의적인 보호 효과가 있으며, 이에 따라 조기난소부전 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 난독성 (ovotoxicity) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조기난소부전 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 난독성 (ovotoxicity) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 난독성은 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 오수유 추출물은 난소 세포의 세포사멸 (apoptosis)을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 오수유 추출물은 PI3K/Akt 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조기난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조기난소부전 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 오수유 추출물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 조기난소부전의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 오수유 추출물의 조기난소부전의 예방 또는 치료 용도를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 오수유 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 증가시키므로 항산화 활성이 우수하고, 난소 세포의 세포사멸 (apoptosis)을 억제하며, PI3K/Akt 신호전달 경로를 활성화시켜 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)에 의해 유도되는 난독성에 대한 유의적인 보호효과를 가지는바, 난독성, 조기난소부전 등의 개선, 예방, 억제 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다. 따라서 관련 적용례로서 불임, 난임의 치료 혹은 예방, 조기난소부전 및 폐경 전 갱년기장애 등을 고려할 수 있다.

도 1은 오수유 추출물을 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 순서도이다.
도 2는 오수유 추출물과 5가지 약재 (토사자, 애엽, 산약, 목향 및 유백피) 추출물의 DPPH radical 소거활성을 비교한 결과이다.
도 3은 오수유 추출물과 5가지 약재 (토사자, 애엽, 산약, 목향 및 유백피) 추출물의 Superoxide anions 소거활성을 비교한 결과이다.
도 4는 CHO-K1 세포에 대한 VCD의 세포독성 확인한 결과이다.
도 5는 VCD로 유도된 난독성 (ovotoxicity)에 대한 오수유 추출물의 보호 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 VCD로 유도된 난독성 (ovotoxicity)에 대한 오수유 추출물의 농도별 보호 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 CHO-K1 세포에 대한 오수유 추출물 단독의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 8은 VCD로 유도된 CHO-K1 세포의 세포사멸 (Apoptosis)에서 오수유 추출물이 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10은 오수유 추출물 처리에 따른 PI3K/Akt 신호경로 활성변화를 확인한 결과이다.
도 11은 오수유 추출물의 난독성 예방 효과를 평가하기 위한 동물실험 모식도이다.
도 12는 대조군 (CON), VCD, VCD+오수유 (EF), 및 오수유 (EF)의 처리에 따른 자궁 및 난소 조직의 육안 관찰 결과이다.
도 13은 오수유 추출물 처리에 따른 자궁 및 난소의 무게 지수를 나타내는 도이다.
도 14는 오수유 추출물 처리에 따른 난소의 무게 지수를 나타내는 도이다.
도 15는 오수유 추출물 처리에 따라 분비된 Serum antimullerian hormone (AMH)의 농도를 측정한 결과이다.
도 16은 H&E 염색을 통한 난소 조직의 병리조직학적 분석 결과이다.

본 발명은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 난독성 (ovotoxicity) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "난독성 (ovotoxicity)"이란 화학적 원인에 의해 난소가 손상되는 것을 의미하며, 상기 손상은 난소의 기능이 소실되거나 난소 세포가 세포사멸 (apoptosis)하는 것을 모두 포함한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분인 오수유 추출물은 통상적인 추출 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 통상적인 추출 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 오수유 추출물을 하기와 같은 방법으로 얻을 수 있다. 먼저, 오수유를 물로 깨끗이 세척하고 건조한 후 혼합하고 분쇄한다. 분쇄된 혼합물을 물, C₁~C₄의 알콜 또는 물과 C₁~C₄의 알콜의 혼합용매로 50~100 ℃에서 2~5 시간, 바람직하게는 4 시간 동안 환류추출한다. 이때, 용매의 부피는 분쇄한 오수유 중량의 1~10 배, 바람직하게는 5~8 배로 한다. 이후, 추출액을 여과하고 여과액을 농축한 후 농축액을 동결건조하여 분말 형태의 오수유 추출물을 얻는다.

본 발명에서, 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)는 자연 세포 사멸 과정을 가속화함으로써 선택적으로 ovarian small pre-antral (primordial and primary) follicles의 파괴를 유발하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명자들은 이러한 VCD에 의해 유도되는 난독성에서의 오수유 추출물의 효과를 관찰하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 햄스터 난소 유래의 주화세포인 CHO-K1 세포에 오수유 추출물을 전처리한 후 VCD를 처리하여, VCD에 의한 난독성으로부터 상기 오수유 추출물의 보호 효능을 확인한 결과, 종래에 불임 치료에 사용되어온 약재 추출물들에 비하여 현저히 우수한 보호 효과가 있을 뿐만 아니라 (실시예 4 참조), VCD로 유도된 세포사멸 (Apoptosis)도 억제시킴을 확인하였다 (실시예 7 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 난독성 보호 효능의 기전을 알아보기 위해 PI3K/Akt 신호경로 활성화를 확인한 결과, 오수유 추출물이 PI3K/Akt의 활성을 증가시키는 것을 확인하였다 (실시예 8 참조).

따라서, 본 발명에 따른 오수유 추출물은 대표적인 난소 독성 물질인 VCD에 의한 생식세포 독성에 대한 우수한 보호효과를 나타내는바, 조기난소부전, 불임, 난임, 폐경 전 갱년기장애 등의 개선, 예방, 억제 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조기난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 조기난소부전을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 조기난소부전에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 대상으로 하는 질병인 "조기난소부전"은 정상적인 발달을 보인 여성에게서 40세 이전에 여러 가지 요인에 의해 난소의 기능이 정지된 것을 의미하며, 난포의 고갈이나 난포의 기능부진도 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물은 오수유 추출물과 함께 난독성 또는 조기난소부전 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.0001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조기난소부전 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 조기난소부전의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 오수유 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 오수유 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 오수유 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 오수유 추출물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 조기난소부전, 불임, 난임, 또는 폐경 전 갱년기장애의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간 또는 비-인간을 포함하는 포유류이며, 비-인간 포유류는 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 돼지, 토끼 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 약재 추출물 제조

오수유와 종래에 불임 치료에 사용되어 온 토사자, 애엽, 산약, 목향, 유백피를 실험에 사용하였고, 상기 약재는 (주)옴니허브의 한약재를 구입하여 선별하고 정선한 것을 사용하였다. 오수유, 토사자, 애엽, 산약, 목향, 유백피 각 100 g에 증류수 800 ml를 가한 뒤, 4 시간 동안 가열 환류 추출하였다. 추출물을 상온으로 식힌 뒤에 8 μm pore size filter paper로 두 번 filtering한 후, 걸러진 용액은 감압 농축 및 동결 건조하고, 이를 분말화하여 하기 표 1과 같이 각 약재의 추출물을 얻었다 (도 1 참조).

Herbal name	오수유 (吳茱萸)	토사자 (兎絲子)	애엽 (艾葉)	산약 (山藥)	목향 (木香)	유백피 (楡白皮)
Latin name	Evodiae Fructus (EF)	Cuscutae Semen (CS)	Artemisiae Argyi Folium (AAF)	Dioscoreae Rhizoma (DR)	Aucklandiae Radix (AR)	Ulmi cortex (UC)
Yield(g)	16.5/100	15.7/100	8.5/60	8.4/100	53.4/100	10.9/100
Yield(%))	16.5	15.7	14.2	8.4	53.4	10.9

1-2. DPPH 라디칼 (radical) 소거 활성 측정

DPPH 라디칼에 대한 소거 활성은 종래에 공지된 방법에 따라 측정하였다. 보다 구체적으로, 먼저 시료 50 μl에 1M DPPH 용액 1 ml 및 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) 450 μl를 가하여 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30 분간 반응시킨 다음, microplate reader (VersaMax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 파장 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼의 소거 활성은 50 %의 소거능을 보이는 농도 (IC₅₀)로 표시하였다.

1-3. 과산화물 음이온 (Superoxide anions) 소거 활성 측정

항산화 활성의 또 다른 지표로서 대표적인 활성산소종의 하나인, 과산화물 음이온에 대한 소거 활성을 NBT 환원법을 이용하여 측정하였다. 보다 구체적으로, 시료 30 μl에 30 mM EDTA (pH 7.4) 10 μl, 30 mM hypoxanthine 1 μl, 1.42 mM NBT 200 μl를 가한 다음 실온에서 3분 반응시킨 후에, 1 U/ml xanthine oxidase 10 μl를 첨가하고 50 mM phosphate buffer (pH 7.4)로 총 용량을 300 μl로 맞췄다. 반응용액을 실온에서 20 분간 배양시킨 후, 560 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 결과는 과산화물 라디칼 (superoxide radical)에 의한 NBT reduction IC₅₀ 값으로 환산하여 표시하였다.

1-4. MTT assay

세포 생존률은 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay 방법으로 분석하였다. 48 well plate에 2×10⁴ cells/well의 CHO-K1 세포를 배양한 후 4시간 동안 혈청 고갈 (serum starvation) 후, VCD의 다양한 농도 처리 또는 각 약재들을 100 μg/ml로 전처리하고, VCD (1.5 mM)를 순차적으로 처리하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24 시간 동안 배양하였다. 웰 당 30 μl의 MTT solution (2 mg/ml)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3 시간 동안 반응시킨 후, MTT 용액과 배양액을 완전히 제거 후 150 μl dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, USA)로 세포 내에 형성된 formazan 결정체를 용해하여 ELISA plate reader (DYNEX, Opsys MR,USA)로 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

1-5. 웨스턴 블롯 (Western blot)

전기영동을 위한 단백질의 추출을 위하여, 세포를 PBS로 3회 세척한 후, RIPA buffer를 넣어 4 ℃에서 30 분간 반응시키고 12,000 × g에서 30 분간 원심분리하여 상층액을 모았다. 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리시킨 후, 단백질을 PVDF 멤브레인 (membrane)에 트랜스퍼 (transfer)하였다. 이 멤브레인을 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer (5% non-fat milk)를 1 시간 처리 한 후, 0.1 % Tween 20을 함유한 PBST 용액으로 세척하였다. 각각의 보고자 하는 단백질의 항체를 사용하여 4 ℃에서 밤새 처리하였으며, 2차 항체는 HRP-linked anti-rabbit 혹은 anti-mouse를 사용하였고, ECL chemiluminescence detection reagents를 이용하여 발색한 후 Image analyzing system을 사용하여 관찰하였다.

1-6. 실험 동물

실험 동물은 11~18 g의 B6C3F1계 암컷 마우스를 중앙실험동물로부터 구입하여 1주일 동안 사료와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험실 환경은 온도 22±2 ℃를 유지하면서 12 시간 단위로 낮과 밤이 계속되는 상황을 실험 종료 시까지 유지하였다.

1-7. 사료 제조

마우스 한 마리가 하루에 섭취하는 사료량을 5g으로 가정하여 오수유 추출물의 섭취 농도를 100mg/kg/day 또는 300mg/kg/day로 하여 사료에 섞어 실험 식이를 제조하였다 (피드랩, 한국).

1-8. 조기난소부전 유발

VCD를 sesame oil (Sigma, USA)에 녹인 후, 160 mg/kg/day의 농도로 15 일 동안 매일 1회 복강주사를 하여 조기난소부전을 유발시켰고, 정상군은 동일한 양의 sesame oil을 복강주사 하였다.

1-9. 실험군의 선정

정상군 (control group)은 sesame oil을 복강주사 하고, 대조군 (VCD group) 및 실험군 (EF group)은 VCD를 sesame oil에 160 mg/kg/day의 농도로 복강주사 하였다. 정상군과 대조군은 4 주간 정상식이를 섭취시켰고, 실험군은 VCD 처리 일주일 전부터 4 주간 100mg/kg 또는 300mg/kg 농도의 오수유 추출물을 함유한 실험 식이를 섭취시켰다.

1-10. 체중 및 자궁과 난소 무게 측정

실험 시작일 (day 1)에 측정한 체중을 기준으로, 매주 체중 변화를 관찰하였다. 실험 마지막 날 마우스를 희생시킨 후, 자궁 및 난소 전체를 적출하여 무게를 측정하였고, 한쪽 난소만 따로 떼어 난소 무게를 측정하여 희생 직전의 체중에 대한 비율로 결과를 처리하였다.

1-11. 병리조직학적 관찰

한쪽 난소 및 자궁은 10 % 포르말린 (formalin)에 고정하여 파라핀 포매하고 5 μm의 박절편을 만들어, Hematoxylin-Eoxin (H&E) 염색하여 광학현미경하에서 일반적인 병리조직학적 소견을 관찰하고, 분석하였다.

1-12. 혈중 AMH 함량 측정

실험 마지막 날 마우스로부터 심장 채혈 방법으로 혈액을 얻어 원심분리기 (Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 이용하여, 3000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 얻어진 혈청에서 Mouse AMH (Anti-Mullerian Hormone) ELISA kit (Elabscience)를 이용하여 AMH 함량을 측정하였다.

실시예 2. 오수유 추출물의 항산화 효능 확인

상기 실시예 1-1을 통해 제조된 오수유, 토사자, 애엽, 산약, 목향 및 유백피 추출물의 항산화 효능을 측정하여 서로 비교하였다.

먼저, 상기 실시예 1-2에 기재된 방법을 통해 각 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였고, 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 6가지 약재 추출물의 EC₅₀(effective concentration 50%)을 확인하였을 때 오수유 추출물의 EC₅₀값이 93.1 μM로 6가지 약재 중 가장 낮게 나타났다.

다음으로, 상기 실시예 1-3에 기재된 방법을 통해 각 추출물의 과산화물 음이온 소거 활성을 측정하였고, 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, DPPH 라디칼 소거 활성 결과와 마찬가지로 오수유 추출물의 EC₅₀이 가장 낮음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. CHO-K1 세포에 대한 VCD 독성 확인

CHO-K1 세포에 대한 VCD의 세포독성을 상기 실시예 1-4에 따른 MTT assay로 평가하였으며, 그 결과, VCD에 의해 CHO-K1 세포의 생존율이 약 50%가 되는 농도 (1.5 mM)를 결정하고 (도 4 참조), 이를 하기 실험에 적용하였다.

실시예 4. VCD로 유도된 난독성 (ovotoxicity)에 대한 오수유 추출물의 보호 효과 확인

CHO-K1 세포에 VCD 1.5 mM을 처리하기 전 2시간 동안 상기 실시예 1-1을 통해 제조된 오수유, 토사자, 애엽, 산약, 목향 및 유백피 추출물 각각을 100 μg/ml의 농도로 전처리 한 후, VCD에 의한 난독성으로부터 상기 추출물들의 보호 효능을 평가하는 스크리닝을 실시하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 다른 5가지의 추출물에 비하여 오수유 추출물이 VCD로부터 보호 효능이 가장 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 5. VCD로 유도된 난독성 (ovotoxicity)에 대한 오수유 추출물의 농도별 보호 효과 확인

CHO-K1 세포에 오수유 추출물을 다양한 농도 (5, 10, 50, 100, 300, 500 μg/ml)로 2 시간 전처리하고, VCD 1.5 mM로 난독성을 유발시킨 후, 난독성에 대한 보호효과를 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 오수유 추출물은 농도의존적으로 난독성에 대한 보호 효능을 보였으며, 100 μg/ml 이상의 농도에서 VCD를 처리하지 않은 대조군과 거의 유사한 생존율을 보임을 확인할 수 있었다.

실시예 6. CHO-K1 세포에 대한 오수유 추출물 단독의 세포독성 측정

CHO-K1 세포에 오수유 추출물을 농도별로 단독 처리한 후 상기 실시예 1-4에 따른 MTT assay을 통해 오수유 추출물 자체의 세포독성을 평가하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교할 때, 500 μg/ml까지는 CHO-K1 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

실시예 7. 오수유 추출물 처리에 따른 VCD로 유도된 세포사멸 (Apoptosis) 억제 효과 확인

CHO-K1 세포에서 VCD 1.5 mM을 처리했을 때, 세포사멸 (Apoptosis)이 일어나고, 오수유 추출물 (100 μg/ml)의 전처리로 VCD로 인한 세포사멸이 억제되는지 여부를 확인하기 위해, 오수유 추출물 처리에 따른 Apoptosis-related protein (PARP, caspase-3)의 발현 변화를 상기 실시예 1-5에 따른 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교할 때, VCD를 처리한 경우, PARP cleavage가 일어나 band가 2개로 나타나고, 프로폼 (proform)의 caspase-3의 경우, band 강도 (intensity)가 감소한 바, 세포사멸이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 오수유 추출물을 전처리하고 VCD를 처리한 경우, PARP band가 2개로 분리되지 않았고, caspase-3의 경우도 VCD 단독 처리보다 감소하지 않음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 오수유 추출물이 VCD로 유도된 세포사멸 즉, 난독성으로부터 세포 보호 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 8. 오수유 추출물의 난독성 (ovotoxicity) 보호 효능의 기전 확인

오수유 추출물의 난독성 보호 효능의 기전을 알아보기 위해, 오수유 추출물 처리에 따른 VCD의 독성 기전으로 알려져 있는 PI3K/Akt 신호전달경로에서의 변화를 상기 실시예 1-5에 따른 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, PI3K/Akt 신호전달의 주요한 키나아제 (kinase)인 Akt, mTOR, 및 GSK-3β의 발현이 오수유 추출물 (100 μg/ml)을 처리한 시간-의존적으로 하위 시그널 (signal) 쪽으로 활성화되는 것을 확인하였다. 즉, 오수유 추출물 처리에 의해 전체적으로 PI3K/Akt 신호 경로를 순차적으로 활성화 시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 오수유 추출물이 PI3K/Akt 신호전달경로의 활성화를 통하여 VCD로부터 세포 보호 효능을 가진다는 것을 알 수 있었다.

실시예 9. ( in vivo ) 동물모델을 이용한 오수유 추출물의 조기난소부전 예방 효과 확인

상기 실시예들의 결과에 기초하여, 오수유 추출물의 조기난소부전 예방 효과를 실시예 1-6 내지 1-12의 방법으로 동물모델을 이용하여 확인하였으며, 상기 실험의 모식도를 도 11에 나타내었다.

9-1. 자궁 및 난소 조직의 육안 관찰

자궁 및 난소 조직을 육안으로 관찰한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 정상군은 난소 및 자궁 조직 모두 정상적인 크기를 유지하고 있는 반면, VCD군은 현저히 위축되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, VCD+오수유 투여군은 정상군과 비슷한 정도의 크기가 관찰되었으며, 이는 오수유 단독 투여군에서도 마찬가지로 특이적인 육안적 소견은 발견되지 않았다.

9-2. 난소 및 자궁 전체의 무게와 난소 무게 비교를 통한 난소/자궁 보호 효과 확인

난소 및 자궁 전체의 무게와 난소 무게를 비교한 결과, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, VCD군이 정상군에 비해서 유의성있게 감소하였으며, VCD+오수유 투여군은 VCD군에 비해서 유의성있게 농도 의존적으로 증가되었고, 무게 또한 정상군과 거의 비슷함을 알 수 있었다. 반면, 오수유 단독 투여군에서는 무게에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 오수유의 투여는 VCD로 인한 난소 및 자궁의 무게 감소로부터 난소와 자궁을 효과적으로 보호한다는 것을 알 수 있었다.

9-3. 혈중 AMH 함량 측정을 통한 난소 보호 효과 확인

항뮬러관 호르몬 (Anti-Mullerian Hormone, AMH)은 난소의 난포에서만 분비되는 호르몬으로 난소예비력 (ovarian reserve)을 잘 반영하는 직접적인 평가지표이다.

이에, 마우스의 혈청에서 ELISA kit을 이용하여 혈중 AMH 농도를 측정한 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 정상군에 비해 VCD군은 유의성을 나타내지 않았지만, AMH 농도가 감소하는 경향을 보였고, VCD+오수유 투여군에서는 AMH 농도가 정상군과 유사한 것을 확인할 수 있었다. 또한 오수유 단독 투여군은 AMH의 농도에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, 오수유의 투여가 VCD로 인한 AMH 농도 감소로부터 난소 보호 효과가 있음을 알 수 있었다.

9-4. 병리조직학적 분석을 통한 조기난소부전 예방 효과 확인

H&E 조직염색을 통하여 병리조직학적 분석 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 정상군의 난소는 다양한 크기의 원시난포에서 성숙난포 및 황체가 잘 발달되어 있었으며, 정상적인 크기를 유지하고 있었으나, VCD군의 난소는 크기가 현저히 위축되었고, 난포의 수 또한 현저히 감소하는 등 폐경을 암시하는 조직학적 소견을 보였다. 반면, VCD+오수유 투여군은 300 mg/kg의 고농도 투여군에서 난소 크기의 위축 또는 난포 및 황체의 퇴화가 관찰되지 않고 정상군과 거의 유사함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 오수유 투여가 VCD로 유발되는 조기난소부전을 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 난독성 (ovotoxicity) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 난독성은 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오수유 추출물은 난소 세포의 세포사멸 (apoptosis)을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오수유 추출물은 PI3K/Akt 신호전달 경로를 활성화시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조기난소부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
오수유 추출물을 유효성분으로 포함하는 조기난소부전 개선용 건강기능식품 조성물.