KR101854380B1 - 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결정격자에서 부분적으로 칼슘이온을 대체하는 Fe²⁺ 이온과 Fe³⁺ 이온이 도핑된 하이드록시아파타이트와 연관된다. 하이드록시아파타이트는 3 vol% 보다 적은 제한된 자성인 제2 상의 양이 존재한다는 것이 주어지면서, HA의 결정 격자에서 자성인 나노 영역의 존재로 인해, 34 Oe의 자기장을 인가함으로써 측정된 0.05 내지 8 emu/g의 본질적인 자성에 의해 특징지어진다. 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트는 외부자기장의 제어 하에, 생물학적 물질이나 약물의 캐리어 또는 방출제로서, 진단의 조영제로서 또는 뼈 및 뼈연골조직의 재생을 위해 단백질, 유전자, 줄기세포, 생장인자, 혈관신생인자, 활성물질, 그리고 약물로 이루어진 군에서 선택된 생물학적인 물질로 적재될 수 있다.

Description

본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트{INTRINSICALLY MAGNETIC HYDROXYAPATITE}

본 발명은 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트 및 생물학적 물질 및/또는 약물 캐리어로서, 그리고 진단에서의 조영제로서 뼈와 뼈연골조직의 재생에서의 그의 용도에 관한 것이다.

하이드록시아파타이트 (HA, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)는 뼈 조직의 주요 무기 구성성분이다. 높은 생체적합성, 생물학적 물질에 대한 자연적 친화성 때문에, 하이드록시아파타이트는 보통 뼈와 뼈연골조직에서 대체/재생 용도로 사용되고, 단백질, 유전자, 줄기세포, 생장인자, 활성물질 등의 캐리어로서 사용된다.

하이드록시아파타이트는 인산이온, 하이드록실이온 및 칼슘이온을 포함하는 육방정계 격자를 가지며, 칼슘이온은 6가 또는 4가의 배위 (6h 및 4f 위치)인 것이 잘 알려져 있다.

하이드록시아파타이트의 구조는 인산이온, 하이드록시이온, 칼슘이온 위치에서 다양한 형태의 이온 치환을 구조 내에서 어떠한 붕괴도 없이 수용할 수 있다는 것 또한 잘 알려져 있다.

즉, 하이드록시아파타이트는 그것의 상 저하를 유발하지 않고 이온들의 다른 타입을 도핑시킬 수 있는 물질이다.

뼈 조직을 구성하는 무기질 상에 대해 그 생체모방 특성 강화를 목적으로 수행되는 하이드록시아파타이트의 도핑 외에, Fe, Co, Mn 및 La 등의 자기 특성을 부여할 수 있는 이온에 의한 다수의 치환이 행해졌다.

특히, 메이어 등 (Journal of Inorganic Biochemistry 1992, 45, 129-133)은 시약으로서 Fe(NO₃)₃ 를 사용하여 제2 철 이온이 도핑된 하이드록시아파타이트(Fe³⁺ HA)의 합성을 보고했다. 저자들에 따르면, 제2 철 이온은 아파타이트 격자에 그 일부로 포함되지 않지만, FeOOH 의 형태로 아파타이트 그 자체내에 존재한다.

Wu 등 (Nanotechnology 2007, 18, 165601-10)은 Fe^{2 +} 이온원으로서 FeCl₂*4H₂O 을 사용하여 제1 철 이온이 도핑된 하이드록시아파타이트 (Fe^{2 +} HA)의 합성을 보고했다. 그러나, 그들은 오직 하이드록시아파타이트가 자철석과 같은 제2 자성 상의 형성을 수반하는 경우에만 자성을 나타내는 제품을 얻었다.

Ming Jang 등 (Review, Condensed Matter and Materials Physics, 2002, 66, 224107-224115)는 Ca(NO₃)₂ 및 Fe(NO₃)₂ 용액을 암모늄 인산 용액에 한 방울씩 첨가하는 것으로 시작하여, 하이드록시아파타이트에 Fe^{2 +} 이온과 Fe^{3 +} 이온을 도핑 했다. 이 논문은 하이드록시아파타이트의 본질적인 자화 가능성에 관해서는 어떠한 암시도 제공하지 않는다.

뼈 또는 뼈 연골 재생용 스캐폴드의 사용과 관련된 가장 관련성 있는 제한은 스캐폴드 이식 위치에서의 세포 분화 및 신생 혈관 형성의 전개와 속도 제어에 있어서의 어려움이라고 생각된다.

이 과정들은 뼈 조직 생장인자 및 혈관 신생 인자의 이식 위치로의 이동 속도에 의해 선호된다.

환자의 필요와 장기적인 기간에 따라, 특정 인자의 이식부위로의 이동에 대한 제어는 인공 보철물의 골 유착능과 뼈 조직의 재생의 적합성에 대해 매우 중요하고, 따라서 환자의 치유에도 매우 중요하다.

따라서 이 부분에서, 골 유착과 뼈 재생을 가속화하고 적합하게 할 수 있는 생장인자, 혈관신생 인자, 또는 다른 생물학적 물질의 이동을 제어할 수 있는 생물학적 물질과 약물의 캐리어 및 방출 시스템에 대한 강한 요구가 있다.

약물이 선택적인 방식으로 직접적으로, 그리고 병리에 영향을 받는 위치에서만 실재 질적-양적 요구에 따라 방출될 수 있도록 정확하고 정밀한 방식으로 안내될 수 있는 약물 캐리어 시스템에 대해서 역시 강한 요구가 있다.

이 부분에서 또한 생체적합적이고 동시에, 환자의 몸 밖의 제어 시스템에 의해 생체 내의 특정 이식부위에서 조작 및 제한할 수 있으며, 그에 의해 의과적 고정 시스템에 대한 현재의 필요성을 제거하는 뼈와 뼈연골조직 재생을 위한 인공 보철물에 대한 필요성이 존재한다.

이러한 요구는 첨부된 특허청구범위에 약술된 바와 같이 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트와 그것을 얻기 위한 방법에 의해 해결된다.

본 발명의 상세한 설명이 첨부된 도면을 참조하여 하기에 제시된다.

도 1은 철 이온으로 치환된 HA 샘플의 형태를 나타낸다.
도 2는 40℃에서 Fe³⁺ 이온의 존재 하에 합성된 HA 샘플의 XRD 분석을 나타낸다. (Fe/Ca 비율 = 0.20).
도 3은 다른 온도 [D = 25℃; E = 40℃; F = 60℃]에서 도핑되지 않은 HA와, Fe²⁺이온 (Fe/Ca = 0.20)을 부가함으로써 합성된 HA의 RX 디프랙토그램이다; 기호 ㆍ로 표시된 피크는 자철석 상(Fe₃O₄)에 해당한다;
도 4는 도핑 되지 않은 HA와 40℃ 에서 Fe³⁺와 Fe²⁺ 이온 (Fe/Ca = 0.20)을 부가함으로써 생성된 하이드록시아파타이트 (H)의 XRD 패턴을 나타낸다.
도 5A와 5B는 각각 샘플 E (검은 화살표는 자철석 입자를 나타냄)와 샘플 H의 저해상도 TEM 사진이며; 박스 부분은 공통적으로 두 개의 샘플에서 나노 보이드 (nanovoid)의 존재를 보여주는 증폭된 TEM 사진이다.
도 6은 HA의 [2,0,1] 축을 따라 관찰된 샘플 E 또는 H의 대표적인 입자를 보여주는 TEM 현미경 사진의 고 해상도 세부사항을 나타낸다; 검은 화살표는 이미지의 푸리에 변환 (박스)으로 얻어진 HA 격자의 c축 방향을 나타내고, 흰 화살표는 입자의 비정질 영역 쪽을 지시한다.
도 7은 방사선 손상 후 샘플 E의 입자를 보여주는 TEM 사진을 나타낸다; 사진의 어두운 영역은 철이 풍부한 나노 상에 대응한다.
도 8은 샘플 E와 H에 대해 얻어진 자화 값과 XRD 패턴과의 관계를 나타낸다.
도 9A와 9B는 700℃에서 처리된 물질의 저해상도 TEM 사진으로: A) 샘플 E_t; B) 샘플 H_t 이다. (화살표는 철이 풍부한 상을 나타낸다.)
도 10은 100 Oe의 자기장을 인가한 상태에서 샘플 H의 자성 ZFC-FC 곡선을 나타내며; 화살표는 차단온도 (T_B)를 나타낸다.
도 11은 샘플 H에 대해 300K에서 인가한 자기장의 함수로서 자력을 나타낸다.

본 발명은 34 Oe의 자기장을 인가함으로써 기록된 자화도가 0.05 내지 8 emu/g의 범위, 바람직하게는 0.1 내지 5 emu/g 인 특징을 갖는 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트에 관한 것이다.

특히, 본 발명의 하이드록시아파타이트는 결정격자에서 부분적으로 칼슘을 치환하는 Fe²⁺ 와 Fe³⁺ 이온으로 도핑된다.

하이드록시아파타이트 격자에서 Fe³⁺ /Fe²⁺ 비율은 1 내지 4, 바람직하게는 2 내지 3.5이다. 본 발명의 하이드록시아파타이트는 본질적으로 자기적이다. 즉, 본 발명의 하이드록시아파타이트는 상호 간의 위치, 격자에서 산화상태/위치의 관계, 그리고 자성을 발생하는 특정한 배위 상태에서 (부분적으로) 상당량의 칼슘을 치환하는 Fe^{3 +}와 Fe^{2 +} 이온이 격자에 도핑됨으로써 자성을 구비한다.

어떠한 이론에 제한됨이 없이, 자철석의 구조와 유사하고, 초상자성 특성의 메커니즘을 활성화 할 수 있는 도핑된 HA 격자 내의 매우 작은 구조적인 영역의 존재로 인해 자성이 생긴다고 생각된다.

구조모델에 대한 XRD 분석 및 컴퓨터 시뮬레이션은 두 종류의 Fe 모두 HA 격자 내의 내부 위치가 아닌 칼슘 치환 위치에 존재한다는 것을 분명하게 나타낸다.

배위수 6인 Ca(2) 위치와 배위수 4인 Ca(1) 위치는 분말에 대해 자화율을 부여하는 방식으로 상호관계에서 점유된다.

자기 측정뿐만 아니라 TEM 연구들은 자철석과 유사한 나노 클러스터를 포함하는 HA의 신규한 자기 상의 존재를 확인했다. 이 신규한 상은 명목상의 2가 상태의 Fe^{2 +}와, 명목상의 3가 상태에서 편차를 갖는 Fe^{3 +}에 의해 왜곡되고, 무질서화되며, 표면 및 벌크 수준에서 조직화되고 HA 그 자체에서 자성을 생성하도록 배위된 하이드록시아파타이트이다.

본 발명의 하이드록시아파타이트는 약 3 부피% 미만의 제2 자성 상 (예를 들면, 자철석 형태의 제2 상)의 양을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제2 자성 상의 양은 2 부피% 이하이다.

본 발명의 하이드록시아파타이트와 함께 존재하는 제2 상의 양이 적은 것은 철 이온의 대부분이 HA 격자에서 칼슘을 치환하는데 사용되고, 그들의 적은 양만이 자성을 가진 철 산화물 (자철석 같은)의 형성에 기여했음을 나타낸다.

제2 자성 상 (예를 들면, 자철석)의 적은 양 덕분에, 본 발명의 도핑된 하이드록시아파타이트는 도핑되지 않은 하이드록시아파타이트의 전형적인 특징인 뛰어난 생체적합성을 유지한다. 사실상, 제2 자성 상의 양이 많을수록, 하이드록시아파타이트의 생체적합성은 낮아진다.

본 발명의 하이드록시아파타이트는 바람직하게는 1.5 내지 1.9 범위의 (Fe+Ca)/P 비율을 갖는다. 이러한 값은 도핑되지 않은 HA에서 Ca/P의 비율의 값에 접근한다.

1.5 내지 1.9의 (Fe + Ca)/P 비율의 값은 칼슘에 대한 치환물질로서 철 이온의 도핑이 그 물질의 화학구조에서 큰 변화를 가져오지 않았고, 도핑 후에도 도핑되지 않은 하이드록시아파타이트의 전형적인 특징의 화학구조를 유지하고 있음을 나타낸다.

본 발명의 도핑된 하이드록시아파타이트는 바람직하게는 너비가 5-10 nm 내지 20-30 nm 이고, 길이가 80-150 nm 까지의 크기를 갖는 입자 (바람직하게는 나노 입자)의 형태이다. 그 입자는 2-5 nm의 구형 빈 공간을 함유할 수도 있다.

본 발명의 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트는 다음 단계를 포함하는 방법으로 합성된다.

a) Ca(II)이 포함된 현탁액/용액에 Fe(II)와 Fe(III)로 구성된 용액을 첨가하는 단계;

b) 단계a)의 현탁액을 15℃ 내지 80℃ 범위의 온도로 가열하는 단계;

c) 단계a)의 현탁액/용액에 인산이온 용액을 첨가하는 단계;

d) 모액으로부터 침전물을 분리하는 단계;

바람직하게는, 상기 Fe(II) 와 Fe(III) 이온은 각각 FeCl₂ 와 FeCl₃ 로부터 유래한다.

바람직하게는, 상기 Ca(II)이온은 수산화칼슘, 질산칼슘, 아세트산칼슘, 탄산칼슘 및/또는 다른 칼슘염으로부터 유래한다.

인산이온의 용액은 칼슘이온과 철 이온을 함유하는 현탁액/용액에 1-3 시간 동안 바람직하게는, 현탁액을 가열하거나 교반함으로써 첨가된다. 바람직하게는, 인산이온은 인산, 및/또는 그 수용성 염으로부터 유래한다.

사용된 철 이온의 양은 5 내지 30, 바람직하게는 10 내지 20 mol%의 범위의 Fe/Ca의 몰비를 얻을 수 있는 양이다.

이 단계의 완료시, 상기 현탁액은 1-2 시간 동안 일정한 교반 하에 유지될 수 있고, 그리고 나서 교반 또는 가열 없이 12 - 36 시간 동안 휴지된다.

이런 방식으로 침전물은 모액으로부터 분리되어, 바람직하게는 원심분리에 의해 얻어진다.

분리된 침전물은 이어서 증류수에서 분산 되고, 적어도 세 번 원심 분리된다.

바람직하게는, 침전물은 적어도 세 번 세척되고, 냉동건조되고, 걸러진다.

본 발명의 주제는 또한 상기 설명된 합성방법으로 얻을 수 있는 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트, 바람직하게는, 본질적으로 자성인 나노 입자들의 형태에 관한 것이다.

본 발명의 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트는 도핑되지 않은 하이드록시아파타이트의 생체적합성에 전적으로 필적하는 생체적합성을 유지하는 물질이고, 따라서 임상 및/또는 진단 영역에서 다른 목적으로 사용될 수 있다.

특히, 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트는 생물학적 인자 또는 약물의 캐리어 및 방출제로서, 진단 등에서 조영제로서, 뼈 및 뼈연골조직의 재생을 위한 생체활성 자성 대체물질로서 사용될 수 있다.

진단 분야에서의 용도에 있어서, 본 발명의 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트는 예를 들면, 자기 공명 영상 (MRI)에서 조영제로서 사용된다. 이 경우, 자성인 하이드록시아파타이트가 일단 적절하게 기능화되면 (예를 들어, 신체의 소정 영역, 예컨대 종양 내에서 그들 자신의 위치를 결정할 수 있는 특정 항체로 기능화), 환자에게 투여되고, 적절한 강도의 외부 자기장을 인가함으로써 입자의 위치를 결정하여 어떠한 병적인 변화가 있는지 여부를 검출할 수 있다.

본 발명의 하이드록시아파타이트의 또 다른 용도는 병소 부분에서 선택적인 치료를 위한 예를 들면, 항종양 약물 및/또는 항생제와 같은 활성물질의 캐리어 및 방출제로서 사용되는 것이다. 이 경우, 일단 투여되면, 자성인 하이드록시아파타이트 입자들은 적절한 자기장을 인가함으로써 병소 위치로 유도되어 그들이 운반한 활성성분을 방출할 수 있다.

이런 방식으로 속도와 방출 선택성에 관하여 제어된 방식으로 약물을 캐리어하고 방출하는 시스템이 만들어진다.

종양의 치료에서 국부적으로 온도를 증가시키기 위해 (온열치료 또는 자성열치료 (magnetothermia)) 본 발명의 자성인 하이드록시아파타이트를 사용할 수 있다. 실제로, 환자에게 일단 투여되면, 하이드록시아파타이트 입자(활성물질이 전혀 없는)는 자기장을 인가함으로써 종양 부위로 유도될 수 있다. 입자들이 그 부위에 도달하면, 종양세포 괴사를 유발할 수 있도록 적합한 자기장을 인가함으로써 온도가 증가될 수 있다.

본 발명의 하이드록시아파타이트 입자의 또 다른 용도는 특히, 단백질, 유전자, 줄기세포, 생장인자, 혈관신생인자와 같은 생물학적 제제에 대한 캐리어 및 방출 시스템으로서 사용되는 것이다. 상기 시스템은 이식된 자성 뼈 대체물질 (예를 들어 동일한 자성 하이드록시아파타이트로 구성된) 또는 이식된 비자성 스캐폴드 방향으로 외부 자기장을 인가함으로써 유도될 수 있다.

이와 같은 방식으로 개별 환자의 필요에 따라 치료 과정에서 어려움이 검출된 위치에서 생장인자 및 혈관신생인자의 양을 필요한 만큼 증가시킴으로써 이식된 뼈 및/또는 뼈연골 대체물질의 골유착 및 조직재생의 속도에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 뼈 또는 뼈연골재생이 특히 어려운 것으로 밝혀진 위치를 향해 본 발명의 입자가 안내되도록 외부 자기장을 인가함으로써 상기 인자들의 양을 증가시킬 수 있다.

따라서, 발명의 주제는, 상기 설명된 물리화학적 특징을 가지며, 단백질, 유전자, 줄기세포, 생장인자, 혈관신생인자 및 활성물질 중에서 선택된 생물학적 물질, 또는 약물을 전달하는 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트이다. 상기 하이드록시아파타이트는 바람직하게는 본질적으로 자성인 나노 입자 형태이다.

상기 설명된 모든 용도들은 외부 자기장을 인가함으로써, 원격 위치에서 캐리어 및 방출 시스템의 내부 분포를 제어할 수 있다는 원리에 기초한다.

본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트 입자는 따라서 생물학적인 그리고 약학적인 물질을 전달하고 방출하기 위한 나노 장치로서 정의될 수 있다.

본 발명의 하이드록시아파타이트의 주요한 이점은 도핑 되지 않은 하이드록시아파타이트의 생체적합성에 필적할 수 있을 정도로 높으며, 하이드록시아파타이트와 제2 자성 상으로 구성된 시스템의 생체적합성보다 뛰어난 생체적합성에 있다. 따라서, 본 발명의 캐리어 및 방출 시스템은 이 기술 분야에서 공지된 자성 캐리어 및 방출 시스템와 달리, 그것의 생체적합적인 특성을 강화시키기 위한 추가적인 변형 (예를 들면, 코팅의 사용)을 요구하지 않는다.

사실상, 공지된 자성 입자는 예를 들면 실리카와 같은 비활성 물질의 다양한 단층에 의해 보호되는 자기 중심을 갖는다. 또는, 유기/생물학적 물질이 또한 사용될 수 있다; 이것들은 생체적합적인 코팅을 형성할 수 있도록 자성 입자들의 표면 위에 흡착될 수 있다.

유기/생물학적 코팅의 예에는 항체와 생체고분자 (콜라겐과 같은) 또는 자성 입자가 생체적합성을 갖게 하는 유기 분자의 단층이 포함된다. 나아가, 전달되는 물질은 양 말단의 작용기를 포함하는 링커에 의해 공지의 자성 입자로 연결되어야만 한다.

하나의 작용기는 링커를 입자의 표면에 연결시키고, 반면에 다른 작용기는 전달될 분자들을 결합시키는데 사용된다.

본 발명의 하이드록시아파타이트 입자들의 장점은 자성과 생체적합성을 향상시키기 위해 유기/무기 물질의 추가적 층을 더 적용할 필요 없이 본질적으로 자성이며, 본질적으로 생체적합적이라는 것이다. 더욱이, 전달될 물질들은 링커 물질을 사용할 필요 없이 하이드록시아파타이트에 직접 적재될 수 있다.

본 발명의 자성 하이드록시아파타이트의 또 다른 용도는 뼈나 뼈연골조직 재생용도에서 뼈나 뼈연골조직의 대체물질로 사용되기 위한 3차원 생체모방 구조물을 제조하기 위해 사용되는 것이다.

이러한 자성 생체모방 스캐폴드는 외부로부터 적절한 자력을 인가함으로써 생체 내에서 주어진 위치로 제한될 수 있다. 게다가, 이러한 스캐폴드는 본 발명에 의한, 생장인자, 혈관신생 인자, 줄기세포, 약물 또는 경우에 따라, 생물학적 제제가 충전된 자성 하이드록시아파타이트의 다른 입자들을 자기적인 장치 방향으로 유도할 수 있게 하는 외부의 적절한 자기장을 인가함으로써 제자리에서 (in situ) 생물학적으로 조절될 수 있어 환자의 양적-질적 및 시간적인 요청에 따라 상기 언급된 물질들을 제자리에 방출할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 주제는 입자, 바람직하게는 본 발명에 의한 본질적으로 자성인 하이드록시아파타이트의 나노 입자들을 포함하는 특히 뼈 및 뼈연골조직의 재생용 3D생체모방장치에 관한 것이다.

실험부분

자기적이고 생체모방적인 하이드록시아파타이트 (HA) 분말은 도핑이온인 Fe²⁺ 과 Fe^{3 +} 의 원천으로서 FeCl₂과 FeCl₃을 사용하여 제조되었다. 전술한 염으로부터 세가지 다른 합성방법이 비교된다; 이들은 실시예 1-3 에서 자세히 설명된다.

합성된 Fe-HA 분말의 화학조성, 구조 그리고 자기적 성질은 다음의 방법으로 결정된다.

화학분석은 유도결합 플라즈마 광학 방출 분광 (ICP-OES) (ICP-OES; Liberty 200, Varian, Clayton South, Australia)에 의해 수행된다: 분말 20 mg을 HNO₃ 2 ml에 용해시키고, 탈 이온수를 첨가함으로써 용액의 부피를 100ml로 맞추었다.

Fe^{2 +}의 양은 510 nm 에서 결정될 수 있는 Fe^{2 +} 이온의 오쏘페난트롤린과의 착물 형성능을 활용하여 자외선-가시광선 분광(UV-Vis) 분석에 의해 확인되었다.

Fe^{3 +}의 양은 철의 전체 양 (ICP로 결정)과 Fe^{2 +}의 양 (UV-Vis로 결정)과의 차이를 계산함으로써 결정되었다.

분말의 형태학상 평가는 주사전자현미경 (SEM; Stereoscan 360, Leica, Cambridge, UK)을 관찰하여 수행되었다.

후방산란전자 (BSE)의 결정은 분말에서 Fe 분포를 질적으로 시각화하기 위해 이용되었다. EDS (에너지 분산 분광, Link Oxford)는 반정량적인 화학분석 목적으로 이용되었다.

X-ray 회절 분석 (CuKa radiation; Rigaku Geigerflex, Tokyo Japan)은 결정상의 존재를 결정하고, 분말의 결정의 정도를 측정하기 위해 사용되었다.

투과 전자 현미경 (JEOL TEM 3010-UHR, Japan, 300kV)은 나노 크기 수준인 물질의 특성들을 관찰하기 위해 사용되었다.

분말의 자성은 YSZ 01C/02C 서셉토미터 (Sartorius Mechatronics, Italy)로 낮은 장 (34 Oe)에서 측정되었다.

또한 자성 측정은 H = 5T (50000 Oe)의 최대 인가된 자기장에서 1.8K 내지 350K에서 작동할 수 있는 자성 측정기인 초전도 양자 간섭 소자 (SQUID) 자력계를 사용하여 수행되었다.

이 경우 수 밀리그램의 분말 샘플 (20 mg)은 M (자성) 대 T (온도) 곡선을 얻기 위해 H=100 Oe의 인가된 자기장에서 5K 내지 300K에서 측정되었다. 반면에 M 대 H 곡선(자기장 강도)은 T = 300K 에서 2T 내지 -2T (+/- 20000 Oe)의 단일자기장 사이클에서 측정되었다.

합성예 1 (비교목적)

앞서 설명된 일반적인 합성과정을 유지하면서, 합성 방법 중 하나는 Fe³⁺ 이온의 원료로서 단독으로 FeCl₃를 첨가한 후, 이어서 Fe³⁺/Fe²⁺의 비율을 대략 3 정도로 얻기 위해 부분적으로 Fe²⁺이온으로 환원시키는 것을 포함한다.

초기 Fe/Ca 몰비율 0.20, 40℃의 온도를 채택하고, Fe^{3 +}이온을 첨가함으로써 합성된 분말은 HA 격자 내에서 상당한 뒤틀림을 보인다. 그러나, XRD 회절기 분석에 의해 알려진 바와 같이, 제2 상은 발견되지 않았다 (도 2).

환원 과정을 거치지 않은 합성된 분말은, 철은 가장 높은 산화 상태에서만 존재한다는 점으로부터 예측되는 바와 같이 자화의 표시를 나타내지 않았다. 상기 분말은 환원 처리되었다.

환원과정은 폐쇄된 오토클레이브 (Parr, Alloy C276)에서 다른 압력의 환원기체로서 96% Ar에서 H₂ (4%)를 사용하여 수행되었다. 표 1은 Fe^{3 +} HA 분말의 실험 오토클레이브 환원 조건을 정리한 것이다.

샘플	T red [℃]	시간[분]	교반	P[psi]
A	300	60	없음	270
B	300	60	있음	270
C	300	60	있음	400

환원된 분말의 특성들은 자기성과 환원된 Fe^{3 +} HA 샘플에 대해 계산된 Fe³⁺/Fe²⁺ 몰 비율 사이의 관계를 보여주는 표 2에 주어진다.

환원 샘플	Fe2+(HA) [wt%]	Fe3+(HA) [wt%]	Fe3+/Fe2+ (HA)	자화 [emu/g]
A	5.5	4.9	0.89	0.00122
B	7.3	3.1	0.42	0.00108
C	9.6	0.8	0.08	0.00128

모든 합성된 분말에 대해 매우 낮은 자화 값이 기록되었다. 벌크의 불균일한 환원을 수반하는 Fe^{3 +} 이온의 우선적인 환원이 표면상에 존재하고, 이로 인해 과량의 Fe^{2 +} 이온 형성이 생기게 된다는 것을 추정할 수 있을 것이다. 적용된 환원방법은 HA 격자에서 Fe^{3 +}/Fe^{2 +} 이온의 균형된 분배를 얻기에는 지나치게 극단적인 반응조건을 특징으로 하는 것으로 보인다.

사실상, Fe^{2 +} 이온의 오쏘페난트롤린과의 착물 형성능을 활용한 UV-Vis 분광기 분석에 의해 결정된 Fe^{2 +} 의 농도는 매우 높은 것으로 나타났고, 따라서 Fe^{3 +}/Fe^{2 +} 비율이 크게 감소하였다.

합성예2 (비교목적)

앞서 설명된 일반적인 합성 과정을 유지하면서, 대안적인 합성방법은 Fe^{2 +} 이온의 원료로서, FeCl₂만을 첨가하는 것을 상정한다. 이는 그 반응 조건하에서 Fe³⁺ 이온으로의 자발적인 산화를 수행한다.

분말은 초기의 Fe/Ca 몰 비를 0.20으로 채택하고, 합성 온도를 다양화하여 (25℃, 40℃, 60℃) Fe^{2 +} 이온이 추가됨으로써 합성되었다.

실험적인 반응조건과 결과로 얻어진 분말의 성질들은 표 3에 주어진다.

샘플	합성 조건	Fe 3 O 4 [vol%]	Fe (tot) [wt%]	Fe 2+ (HA) [wt%]	Fe 3+ /Fe 2+ (HA)	(Fe+Ca)/P (HA)	M [emu/g]
D	Fe2+ T:25℃ Fe/Ca=0.20	0.00	9.10	1.30	5.99	1.728	0.006
E	Fe2+ T:40℃ Fe/Ca=0.20	3.00	8.81	1.03	4.13	1.716	0.339
F	Fe2+ T:60℃ Fe/Ca=0.20	5.50	8.72	2.79	0	1.601	0.558

도 3의 XRD 그래프는 샘플 E와 F에서 2θ ~ 36°에서 자철석 피크를 보이는 반면에, 낮은 온도에서 제조되었기 때문에 샘플 D의 스펙트럼에서 해상도 패턴은 예상된 대로 감소한다.

분말의 특징들은 표 3에서 나타난 바와 같이 거의 합성 과정에 의존한다.

자철석의 형성은 높은 온도 (60℃ 와 40℃)를 선호하고, 이들 조건 하에서 자성값은 주로 Fe-치환된 HA를 따라 형성되는 자철석의 기여에 의해 증가한다. 25℃에서 자철석의 형성은 최소화되고 철 이온은 그것의 왜곡에 의해 설명되는 바와 같이 (도 3) 더 많은 수가 격자에 도입된다. ICP에 의해 결정된 철 이온의 전체 양은 (표 3) 모든 샘플에서 도입된 FeCl₂의 명목 상의 농도에 대응한다. Fe³⁺/Fe²⁺ 비율은 UV로 결정된 Fe²⁺의 양과 ICP로 결정된 전체 철 함량으로부터 Fe²⁺의 양을 감산함으로써 얻어진 Fe³⁺의 양을 사용하여 계산되고, 두 경우 모두 자철석을 형성하는 Fe²⁺ 와 Fe³⁺ 이온의 기여도를 뺀 다음 계산된다. 표 3에서 나타낸 바와 같이, Fe³⁺/Fe²⁺ 비율은 샘플 D와 E에서 매우 높다. 반응온도가 증가하면서 (샘플 F), 제2 상으로서 자철석의 양은 똑같이 증가하고, HA 격자로 도입될 수 있는 Fe³⁺의 양은 감소한다.

샘플 D의 자화 값은 다음의 이유로 매우 낮다; i) 제2 상으로서 자철석이 존재하지 않는다. ii) 철 이온의 두가지 종이 격자내에 도입되지만, Fe³⁺/Fe²⁺의 비율은 매우 높고 Fe²⁺ 와 Fe³⁺이온의 분포와 그들의 배위 상태가 적절하지 않다. 샘플 E 및 F에서 높은 자화 값은 자철석의 농도에 본질적으로 기인한다.

합성예 3 (본 발명)

FeCl₂와 FeCl₃는 Fe³⁺:Fe²⁺ 의 비를 1:1로 하여 수산화칼슘 현탁액에 동시에 첨가된다.

인산 (Aldrich 85% wt)용액은 분산된 수산화칼슘 (Aldrich 95% wt)을 함유하는 현탁액과 철 이온을 약 1-2 시간 동안 일정하게 가열하고 교반하면서 첨가한다. 합성 반응은 40℃에서 수행된다. 염화철의 양은 초기 Fe/Ca 몰비율을 0.10 과 0.20 로 만들 수 있는 양이다.

반응 생성물은 1시간 동안의 일정한 가열과 교반에 의해 현탁액에서 유지된다. 그 이후 24시간 동안은 가열과 교반 없이 방치한다.

갈색으로 얻어진 침전물은 원심분리에 의해 모액으로부터 분리된다. 그리고 난 후 세척되고, 세 번 원심 분리된다.

이어서 침전물은 냉동 건조되고, 150 μm 로 걸러진다.

두 가지 시약 (FeCl₂와 FeCl₃)의 첨가는 HA의 핵화 동안에 Fe²⁺ 와 Fe³⁺를 동시에 만든다: 이들 조건 하에서 형성되는 자철석의 양은 상술한 비교예의 방법에 비해 더 작다. 도 4의 XRD 스펙트럼은 Fe²⁺ 와 Fe³⁺ 의 동시의 첨가가 HA 격자 내에서 강한 왜곡을 야기하며, 이는 격자 파라미터의 측정을 매우 어렵게 한다는 것을 보여준다.

표 4는 반응 조건과 Fe^{2 +}Fe^{3 +} HA의 특성 간에 존재하는 관계를 나타낸다.

샘플	합성 조건	Fe 3 O 4 [vol%]	Fe (tot) [wt%]	Fe 2+ (HA) [wt%]	Fe 3+ /Fe 2+ (HA)	(Fe+Ca)/P (HA)	M [emu/g]
G	Fe3+ + Fe2+ T:40℃ Fe/Ca=0.10	1.50	4.92	0.71	3.41	1.750	0.476
H	Fe3+ + Fe2+ T:40℃ Fe/Ca=0.20	2.00	9.93	1.82	3.15	1.678	0.679

샘플 H의 높은 자화 값 (표 4)은 자철석에 의한 단독 기여에 의해서는 설명될 수 없다. 높은 자화는 그러므로 철 이온 간의 최적 비율 (Fe^{3 +}/Fe^{2 +} = 3.15)과 특정한 관련된 위치 및 철의 두 가지 산화상태의 배위수에 의한 것일 수 있다.

이러한 결과는 자철석의 구조를 시뮬레이트하고, 초상자기성의 성질의 원인이 되는 메커니즘을 활성화 할 수 있는 HA 격자내의 매우 작은 구조적인 영역의 존재를 암시한다.

분석에 의하면 매우 낮은 농도에서 산화 철 입자들을 함유하는 비정질의 Ca-P 상이 나타났다. 빔 아래의 상은 역시 높은 비정질도로 인해 매우 불안정하다.

EDS 조사로 결정된 철 함량은 15-20%이고, 아마도 HA 격자 내에 또는 1-2 nm 미만의 매우 작은 클러스터 내에 존재한다.

샘플 E와 H의 전형적인 현미경 사진은 도 5에 도시된다. 입자들은 주로 매우 균일한 사이즈의 연장된 형태를 보인다. 너비는 5-10 nm 내지 20-30 nm 이고, 길이는 최대 80-150 nm 이며, 2-5 nm의 구형 빈 공간을 함유할 수도 있다.

샘플 E의 경우에는 자철석이 10-30 nm 크기의 나노 입자의 형태이다.

HRTEM 분석 (도 6)은 재료의 일부분이 c축 방향으로 연장된, HA의 비정질 영역과 결정질 영역으로 이루어지며, 이들은 동일 입자 내에 공존할 수 있음을 밝혔다 (도 6과 대응하는 상세 참조). 철, 인산칼슘 내의 인과 칼슘의 전체 함량은 EDS/TEM을 사용하여 분말 E 와 H 모두에 대해 측정되었다 (샘플 E의 경우 자철석이 존재하지 않는 영역을 주의깊게 선택). 존재하는 성분들 간의 몰비 형태의 결과 (표 5)는 이전에 보고된 ICP, XRD 및 UV-Vis에 의해 얻어진 결과 (표 4)와 일치한다.

표 5는 샘플 E 와 H, 그리고 700℃ 에서 처리된 같은 샘플 (Et와 Ht) 들의 양적인 EDS/TEM 분석 결과를 보인다.

샘플	Fe (CaP) /Ca	(Ca+Fe)/P (CaP)
E	9 ± 1.5	1.5 ± 0.1
Et	18 ± 3	1.5 ± 0.1
H	20 ± 0.5	1.6 ± 0.1
Ht	16 ± 1	1.4 ± 0.1

분말 H (칼슘에 대한 Fe의 초기 몰 비율이 Fe_tot/Ca (하이드록시아파타이트)=0.20 인)에서도, 철이 풍부한 상이 존재한다는 증거가 발견되지 않았기 때문에, 철 이온이 HA 격자의 Ca^{2 +} 이온의 치환물내에 또는 매우 작은 클러스터 (< 1nm)로서 비정질 상에서 균일하고 우세하게 분포되어 있음을 추정할 수 있다.

철 이온의 균일한 분포의 간접적인 증거는 상대적으로 큰 전자의 노출량에 노출된 샘플의 거동으로부터 나올 수 있다. 이러한 조건 하에서, 사실상 상기 물질들은 매우 불안정하다: 빈 공간이 급격하게 붕괴되고, 입자들은 구조적인 재배열이 동반된 형태학적인 변화를 수행하고, 그 물질의 일부는 CaO로 전환된다.

수 초 후에, 직경 1-1.5 nm의 새로운 입자들이 형성된다 (도 7 참조)는 것에 주목하는 것은 흥미롭다. 형성된 새로운 상은 아마도 전자와의 충돌의 결과로서 일어나는 손상의 과정 중에 철 이온이나 클러스터의 융합으로부터 유래하는 철이 풍부한 화합물이다.

700℃에서 1시간 동안 Ar 환경에서의 열처리가 분말 E 와 H에 적용된다. XRD 스펙트럼분석 결과는 도 8에 나타낸다.

많은 양의 자철석을 함유하는 샘플 E는 매우 안정화되고, 열처리 (Et)후 HA의 양은 대략 72% 남아있다.

자철석이 거의 사라진 반면, 제2 상인 ß-TCP Ca₃(PO₄)₂가 형성됐기 때문에 (26%), 철 이온들은 ß-TCP 격자로 도입되어 Ca₉Fe(PO₄)₇ 와 Ca₉FeH(PO₄)₇을 형성하는 것으로 추정된다.

샘플 H (자기적으로 활동적인 마이크로 영역을 형성하는 Fe^{2 +} 와 Fe^{3 +}에 의해 격자가 부분적으로 점유된 HA로 만들어진 것으로 추정되는)의 경우, 열적 안정화는 매우 낮다. 이것은 철 이온들 (Ht)에 의한 동시 점유가 결정 구조를 크게 방해하는 것을 증명한다.

샘플 (Et)와 (Ht)의 TEM 현미경 사진은 도 9에 보여진다. 샘플 (Et)는 너비가 약 30-50 nm이고, 다양한 길이를 갖고 있는 매우 불규칙한 회전타원체 형태인 입자를 보이며, 이들은 출발 분말들의 일차 입자들의 소결에 의해 얻어진다.

상기 샘플은 철의 균일한 분산을 나타내는 균일한 대조 (contrast)의 특징을 가진다.

HRTEM 분석은 인산 칼슘 상이 약간의 ß-TCP 부분을 포함하는 주로 HA형 이라는 것을 확인하였고, 상기 물질의 적은 부분이 비정질 특성을 나타내는 순수한 상으로 이루어짐을 밝혔는데, 이것은 아마도 열처리 결과 구조를 상실한 자철석 입자에서 유래할 것이다.

이 경우뿐만 아니라, 상기 샘플은 빔에 의한 손상에 대한 저항이 더 있음에도 불구하고, 인산칼슘이 다량의 전자에 노출된 후, 새로운 작은 입자들이 나타나고, 이것은 손상되지 않은 HA 내 또는 ß-TCP 격자 내에서 철 종의 매우 작은 클러스터의 존재를 나타낸다. 인산칼슘 내에서 측정된 철 함량 (Fe_tot/Ca (HA))이 출발 분말보다 두 배 이상인 대략 18 ± 3% (표 5 참조)정도로 관측되는 것은 흥미롭다. 이것은 열처리가 자철석으로 부터 인산칼슘으로 철 종의 확산을 촉진한다는 것을 나타낸다. 이것은 자철석의 비정질화와 함께, RX 디프랙토그램에서 관찰된 자철석 피크가 사라진 것을 설명한다 (도 8).

반면에, 샘플 (Ht)의 입자들은 더 커지고 더 구형이 되고 (내부에 보이드 없이), 그리고 출발 분말에서는 관찰되지 않은 철이 풍부한 상의 존재와 연관된 명확한 대조 베리에이션 (도 9)를 나타낸다.

HRTEM과 EDS 분석은 함께 인산 칼슘이 철로 치환된 ß-TCP의 형태로 가장 많이 존재하며, 이는 산화물과 비정질 철 입자로 캡슐화되어 있음을 확인한다.

측정된 Fe/Ca 비율(순수한 산화 철이 존재하지 않는 영역에서)은 출발 분말에서보다 더 낮은 대략 16 ± 1% 이다.

물리화학적 및 자기적인 특성

얻어진 분말은 갈색이고, 도 1의 SEM 사진에서 도시된 바와 같이, 약 30-60 μm의 크기로 응집되는 특징을 갖는다.

XRD 디프랙토그램 패턴은 매우 넓게 나타난다; 이것은 HA 격자 내에서 상당한 왜곡을 나타낸다; 어떠한 경우이든 제2 인산 상은 HA 옆에서 검출되지 않는다.

구조적 모델에 대한 컴퓨터 시뮬레이션의 도움으로 Fe 이온이 하이드록시아파타이트 격자에서 격자 사이 위치에 존재하지 않으며, 오히려 Fe 이온은 Ca 이온 (4 배위 격자위치와 6 배위 격자위치인 4f 및 6h 사이에서 약간 차이를 두고)을 대신하고 있음이 명확하게 밝혀졌다.

ICP 분석은 도입된 명목상의 양과 동일한 양인 분말 내 철의 존재를 확인했다; Ca/P 비율은 칼슘의 소모로 인해 이론적인 것보다 더 낮다.

(Fe+Ca)/P 비율이 이론값에 접근하기 때문에, Fe^{3 +}, Fe^{2 +} 그리고 (Fe^{3 +} + Fe^{2 +})인 철에 대응하는 양이 Ca를 치환하는 것으로 추측된다.

BSE 분석은 분말에서 철의 균일한 분배를 확인했다; 마이크로프로브 분석은 또한 반응 동안 첨가된 동일한 명목상의 철의 양을 탐지할 수 있었다.

높은 자기장 하에서 자성인 성질은 SQUID 자기측정기 (Quantum Design)를 사용하여 측정되었다. 하이드록시아파타이트 격자 내에서 본질적으로 자성인 상의 존재의 증거가 샘플 H에서 발견되었다. 도 10은 100 Oe의 인가된 자기장에서, 5K 내지 300K의 제로-필드-냉각 (zero-field-cooled) (ZFC)과 필드-냉각 (field-cooled) (FC) 조건 하에서 자화의 온도 의존성을 나타낸다. 두 곡선은 모두 TB=170K의 평균 차단온도 (TB)에서 상호작용하는 자기 입자 시스템의 전형적인 거동을 보여준다. TB는 상당히 높은데 이것은 아마도 이차 상으로서 행동하고 (하이드록시아파타이트 격자 외부에 제2 상으로서 자철석의 2 vol%의 존재를 확인하는 다른 측정 기법에 따르면), 초상자기성 상태에 의해 차단된 상태를 분리하는, 더 작은 자철석 나노 입자 (~10 nm)의 응집의 존재 때문이다. TB 미만에서는 입자들의 자기적인 모멘트의 자유로운 움직임은 차단된다; TB 이상에서는 열에너지가 관측시간과의 관계에서 전체 입자의 자성 모멘트에 급격한 변동을 유도하여 상기 시스템이 초상자기성을 나타나게 한다. TB는 입자간 쌍극성 상호작용과 밀접하게 연관되고, 쌍극성 상호작용이 증가함과 함께 증가한다.

응집 형성 결과로서, 나노입자들의 국부 농도가 증가하고, 따라서 입자간 쌍극성 상호작용의 힘이 증가하여 자기적인 완화를 위한 에너지장벽을 변형하고, 샘플의 전체적인 자기적인 거동을 결정한다.

도 11은 샘플 H의 300K 에서 -2 내지 2 테슬라의 인가된 자기장의 함수로서 자화 곡선을 보여준다.

입자크기가 자성인 다중영역 범위 (자철석의 25-30 nm)미만을 나타내는 단일영역의 자성 나노 입자들의 전형적인 초상자기성 (SPM) 거동을 명확하게 관찰할 수 있을 것이다. 이것은 대략 5-10 nm의 자철석 응집을 발견할 수 있는 도 5B에 도시된 TEM 현미경사진과 일치한다. 반면에 샘플의 포화 자화 (Ms)는 상당히 낮고 (약 4-5 emu/g), 자철석 나노 입자들 (2 vol%를 나타내는)의 형태로 정의된 제2 상은 관찰된 자화 값을 설명하기에 충분하지 않다. 그러므로 두 가지 다른 자성인 기여가 그 물질 내에서 전체적인 자화와 관련된다: 한가지는 명백하게 자철석 나노 입자에 의한 것이고, 다른 한가지는 Fe^{2 +} 와 Fe^{3 +} 이온으로 치환된 하이드록시아파타이트 입자들에 의한 것이다.

전자의 경우, 자성의 근원이 알려져 있지만, 후자의 경우 자성은 자성인 Fe²⁺와 Fe^{3 +} 이온을 가진 HA 격자 내에서 특정한 Ca^{2 +}위치의 부분적인 치환에서 유래한다.

하이드록시아파타이트 격자 내에서 자성에 원인이 되는 구조적이고 자성인 상을 찾기 위해, 전체 정규화된 포화 자기화 (Ms~4-5 emu/g)에서 자철석 나노 입자 (ø~10nm, Ms~60-80 emu/g) 시스템의 공통 자화를 감산하였다. 이러한 방식으로 철 치환된 HA 단독의 자기화를 결정하는 것이 가능했다. 어떠한 경우이든, 계산된 Ms는 예측값보다 더 크다. 또한, 물질 (6-7 중량%)내에서 전체의 Fe 질량은 자철석으로서 존재한다.

그러므로, 자기적인 데이터는 Ms 값이 하이드록시아파타이트 격자 내에서 구조적인 자기적 영역 (자철석 및/또는 다른 철 산화물과 유사한)의 존재에 의한 것이라는 가정을 지지한다는 것을 발견했다.

체외 실험

예비적인 세포 점착성과 생체적합성 테스트는 특성화 이후, 비필수 아미노산 1%와 항생제, 태아 소혈청 (FBS) 10%가 보충된 DMEM (Sigma, Milan, Italy)내에서 제어된 환경 (5% CO₂; T=37℃)에서 배양된 간엽줄기세포 (MSC)를 사용하여 과립화된 HA와 자성인 HA 분말에 대해 수행되었다. 상기 세포는 1주 간격을 두고 1:2로 나뉘었고, 세 번째와 네 번째 계대 사이에서 사용되었다. MSC의 컨플루언트 (confluent) 배양으로부터 세포들은 1 ml MEDTA에서 0.25% 트립신을 사용하여 분리됐고, 실험을 위한 과립화된 분말 및 대조군으로서 25웰 폴리스티렌 플레이트 위에서 각각 5×10⁴ 와 1×10⁴ cells/cm²의 밀도로 3회 플레이트 되었다.

플레이트 배양액은 37℃에서 7일 동안 배양되었다. 배양 이후, 배지는 제거되었다; MTT의 200 μl (비색실험 3-디메틸티아졸-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 Aldrich 135038)와 배양 배지의 1.8 ml가 개별적인 세포 단층들에 첨가되었다; 다중 층 플레이트는 37℃ 에서 다시 3시간 동안 배양되었다.

상청액의 분리 이후, 푸른색 포르마잔 결정은 2 ml 용매 (무수이소프로판올에서 4% HCl 1N)을 첨가함으로써 용해되었고 570 nm 에서 분광측정법으로 측량되었다.

화학양론적인 HA에 대해, 자성인 HA 분말은 세포 점착성과 골아 세포 전구체 (MSC)의 증식에 있어서 적합한 기질을 나타낸다.

MTT 값은 자성인 HA에 대해 80%인 반면에 HA에 대해서는 82%이다. SEM 형태학적 분석이 실험된 모든 분말들에 의해 MSC의 뛰어난 생체적합성을 보여준 배양된 세포에 대해 수행되었다. HA에 대한 그들의 거동과 유사하게, 자성인 HA에서 상기 세포들은 분말과 접촉된 다수의 세포질의 확장과 함께, 분산된 “스트레칭 아웃된 (stretched out)” 형태를 보였다.

결론적으로, HA 격자 내에서 칼슘을 부분적으로 치환하기 위한 이온의 원천으로서, FeCl₂와 FeCl₃의 동시 첨가와 최적화된 합성 파라미터의 사용은 Fe^{3 +}/Fe^{2 +} 비율이 약 3인 Fe^{3 +}/Fe^{2 +} 치환된 HA를 얻는 것이 가능하도록 만들었고, (Fe+Ca)/P 비율은 이론값과 매우 근사하다.

XRD와 구조적 모델에 대한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여, Fe의 두 종 모두가 칼슘 치환 위치에 있고 HA 격자에서 내부의 위치에 존재하지 않는다는 것을 분명하게 알 수 있다.

배위수 6인 Ca(2) 위치와 배위수 4인 Ca(1) 위치는 엄격하게 정의된 합성 파라미터로 인해 분말에 대해 자기적인 민감성을 부여할 수 있는 방식으로 상호 관계에서 점유된다.

자기적인 측정뿐만 아니라, TEM 조사는 자철석과 유사한 나노 클러스터와 함께 HA의 새로운 자성인 상의 존재를 확인한다.

이 신규한 상은 명목상의 2가 상태인 Fe^{2 +}와 명목상의 3가 상태로부터 편차를 가진 Fe^{3 +}에 의해 표면과 벌크 수준에서 조직화되고 HA 그 자체 내에서 자화를 발생시키기 위해 배위된 왜곡되고 무질서화된 하이드록시아파타이트이다.

자성인 HA의 생체적합성과 함께, 이러한 결과들은 적합한 외부 자기장을 통해 제어되고 조작될 수 있는 생체적합적인 생체모방물질의 새로운 군을 가진 재생 의약을 제공한다; 이러한 물질들은 사실상 다음 세가지를 생산하는 목적으로 쓰여질 수 있다. 1) 생체활성 인자 및/또는 약물을 캐리어하고 방출하기 위한 나노 입자들, 2) 진단 (이미징)을 위해, 그리고 치료목적 (온열치료)을 위해 사용 가능한 나노 입자들, 3) 인시튜에서 생물학적으로 조작될 수 있거나 체 내의 주어진 위치에 고정된 (전통적인 고정 시스템에의 의존을 제거하는 것) 뼈나 뼈연골조직 치환체(예를 들면, 시간적인 그리고 양적-질적인 환자의 요청에 따라 특정한 인자들에 의해, 체 내에서의 이식 이후 자극되는 어떠한 경우 또는 재적재(reloaded))

Claims (19)

1. 결정 격자 내에 칼슘이온과 인산이온을 포함하는 하이드록시아파타이트로서,
   상기 결정 격자 내에서 Fe³⁺/Fe²⁺의 정량적 몰 비율 1 내지 4로 상기 칼슘이온을 부분적으로 치환하는 Fe²⁺ 이온과 Fe³⁺ 이온으로 도핑되고,
   하이드록시아파타이트 격자에서 자성인 나노 영역의 존재로 인해 34 Oe의 자기장이 인가됨으로써 측정된 0.05 내지 8 emu/g의 자성을 갖고, 3 vol% 미만의 제2 자성 상을 포함하는것을 특징으로 하는 하이드록시아파타이트.
2. 제1항에 있어서, 34 Oe의 자기장이 인가됨으로써 기록된 상기 자성이 0.1 내지 5 emu/g인 하이드록시아파타이트.
3. 제1항에 있어서, 상기 Fe³⁺/Fe²⁺의 몰 비율이 2 내지 3.5인 하이드록시아파타이트.
4. 제1항에 있어서, 2vol% 이하의 양의 제2 자성 상을 포함하는 것인 하이드록시아파타이트.
5. 제1항에 있어서, 1.5 내지 1.9 의 (Fe+Ca)/P 몰 비율을 가진 하이드록시아파타이트.
6. 제1항에 있어서, 5-30 nm의 너비와 80-150 nm의 최대 길이를 가진 나노 입자의 형태 또는 상기 나노 입자의 응집체 또는 과립의 형태인 것인 하이드록시아파타이트.
7. 제6항에 있어서, 상기 나노 입자가 2-5 nm의 구형 보이드를 포함하는 것인 하이드록시아파타이트.
8. 제1항에 있어서, 단백질, 유전자, 줄기세포, 생장인자, 혈관신생인자로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 물질을 적재하거나 또는 활성물질이나 약물을 적재하는 것인 하이드록시아파타이트.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 하이드록시아파타이트를 포함하는 생체모방 뼈 또는 뼈연골조직의 대체물질.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 의학 또는 진단용도로 사용되는 것인 하이드록시아파타이트.
11. 제10항에 있어서, 생물학적 물질 또는 약물의 캐리어 또는 방출제로서 사용되는 것인 하이드록시아파타이트.
12. 제10항에 있어서, 진단에서 조영제로서 사용되는 것인 하이드록시아파타이트.
13. 제9항에 있어서, 뼈 또는 뼈연골조직 재생용으로 사용되기 위한 것인 생체모방 뼈 또는 뼈연골조직의 대체물질.
14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 하이드록시아파타이트를 제조하는 방법으로서,
    a) Ca(II)이온을 함유하는 현탁액 또는 용액에 Fe(II)와 Fe(III) 이온을 포함하는 용액을 첨가하는 단계;
    b) 단계 a)를 수행하여 얻어진 현탁액 또는 용액에 인산이온의 용액을 첨가하는 단계;
    c) 단계 b)를 수행하여 얻어진 현탁액 또는 용액을 15℃ 내지 80℃의 온도로 가열하는 단계;
    d) 단계 c)를 수행하여 얻어진 모액으로부터 침전물을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, Ca(II)이온과 철 이온을 함유하는, 단계 a)를 수행하여 얻어진 현탁액 또는 용액에 상기 인산이온 용액을 1-3시간 동안 첨가하는 것인 방법.
16. 제14항에 있어서, 인산이온을 첨가한 후에, 5 내지 30 mol%의 Fe/Ca 몰비율을 얻을 수 있도록 철 이온의 용액을 더 첨가함으로써 칼슘이온에 대한 철 이온의 양이 조정되는 것인 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 Fe(II)와 Fe(III) 이온은 각각 FeCl₂과 FeCl₃에서 유래하는 것인 방법.
18. 제14항에 있어서, 상기 Ca(II)이온은 수산화칼슘, 질산칼슘, 아세트산칼슘, 또는 탄산칼슘으로부터 유래하는 것인 방법.
19. 제14항에 있어서, 상기 인산이온은 인산 및/또는 그 수용성 염으로부터 유래하는 것인 방법.

Images