CN106853264A - 超顺磁性纳米纤维膜支架材料、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超顺磁性纳米纤维膜支架材料，所述支架材料包括：作为支架主体的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的70~99%，且用于形成聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为0.1‑6；铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的1~30%。本发明得到的超顺磁性纳米纤维膜支架材料与一般的骨组织工程材料相比，无细胞因子掺入，避免了其负载及释放的复杂问题。本发明工艺利用静电纺丝方法，获得纤维膜性材料，具有良好的生物相容性及骨向诱导潜能。
Description
技术领域
本申请涉及骨组织工程技术领域，具体而言，涉及一种超顺磁性纳米纤维膜支架材料及其制备方法和应用。
背景技术
创伤、骨髓炎、骨肿瘤、骨囊肿等手术切除引起的大段骨缺损，严重影响了人体骨组织的生理功能，是目前骨科临床最常见、最棘手的问题之一。当前对于合适的骨替代物的需求正与日俱增，骨修复再生材料及其相关医疗领域在全球市场从2000年的200亿美元上升至2011年的600亿美元，并逐年增加。自体骨是骨缺损治疗的金标准，具有良好的组织相容性、骨诱导和骨传导性能，但是容易出现供骨区疼痛、感染、创伤增加，获取量受限制。异体骨移植存在免疫排斥反应，并且可能携带有潜在的病原体，如HIV病毒、肝炎病毒等。设计和开发新型人工骨修复材料具有重要的应用价值和社会意义。
骨组织工程是指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞，经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支架（scaffold）或称细胞外基质（extracellular matrix，ECM）上，这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞在预制形态的三维支架上生长，然后将这种细胞杂化材料（hybridmaterial）植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。
骨修复材料的生物学性能不仅与化学组成有关，而且还取决于孔结构、孔径大小和孔隙率。研究表明，相互贯通的大孔结构有利于骨细胞及骨组织的生长，以及营养物质的输送。当孔径小于5μm时，无骨组织长入多孔支架中；当孔径大于25μm时，纤维管状组织开始渗透到多孔支架中；当孔径大于50μm时，可以观察到组织矿化；当孔径大于75μm时，矿化组织会深入到孔深处500μm；当孔径大于100μm时，生物骨矿化深入到孔深1000μm处，骨被确认重建。孔隙率在40wt％～60wt％及以上，力学性能在10MPa或更高比较有利于密质组织生长。
自然骨是复杂的生物矿化系统之一，无机成分主要是羟基磷灰石，约占总质量的65％；有机成分主要是I型胶原纤维，约占总质量的34％，其余为水。羟基磷灰石属于P63/m空间群，具有优良的生物活性、生物相容性和生物降解性等优点，在骨修复、药物载体等领域中具有广阔的应用前景。 植入体内后，羟基磷灰石能在短时间内与人体的软硬组织形成紧密结合。 然而，单纯的羟基磷灰石多孔支架的力学强度低、脆性大，不适用于承重部位的骨缺损修复。模仿自然骨的化学组成和孔结构制备羟基磷灰石/高分子多孔支架。羟基磷灰石多孔支架中填充壳聚糖、胶原蛋白、胶原蛋白及聚乳酸等生物活性高分子材料不仅可以提高生物学性能，而且还可以改善力学性能。
传统的骨组织工程技术一般需要利用细胞因子，在制备支架过程中会将细胞因子预先载入支架材料中，这样的方式就降低了细胞因子的可控性，细胞因子的有效负载和可控释放都限制了细胞因子的生物学效应。基于以上原因，本发明因此而来。
发明内容
本申请旨在提供一种超顺磁性纳米纤维膜支架材料，以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于所述支架材料包括：
作为支架主体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的70~99%，且用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为0.1-6；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的1~30%。
进一步的技术方案是，所述支架材料相互交织成多孔网状结构，所述铁掺杂的羟基磷灰石被覆于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）内。
进一步的技术方案是，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~99%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的1~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~97%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的3~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~95%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的5~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~93%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的7~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~90%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的10~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的85%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的15%。优选的，支架材料中PLGA占所述支架材料总重量的85.71%，Fe-HA占所述支架材料总重量的14.39%。
进一步的技术方案是，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的1~20%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的5~15%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的7~15%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的8~13%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的8~12%。
进一步的技术方案是，用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为0.1-6；
优选的，用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为1~5；
优选的，用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为2~4；
优选的，用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为3。
进一步的技术方案是，所述铁掺杂的羟基磷灰石呈现为针状晶体，宽为5-20nm，长为50-80nm；其中铁富集相的大小为5-10nm。
进一步的技术方案是，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量在5~20万；优选的，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5~15万；优选的，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10万；优选的，超顺磁性纳米纤维膜支架材料的水接触角在50~85°；优选的，超顺磁性纳米纤维膜支架材料的水接触角在60~75°；优选的，超顺磁性纳米纤维膜支架材料的水接触角在55~85°；优选的，超顺磁性纳米纤维膜支架材料的水接触角在55~80°。
本发明的另一目的在于提供一种所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料的制备方法，其特征在于，
所述方法包括以下步骤：
（1）以氢氧化钙和磷酸为原料，混入铁盐，经中和反应后生成铁掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒；
（2）将铁掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒混入含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的电纺溶液中，经静电纺丝方法，获得超顺磁性纳米纤维膜支架材料。
本发明的又一目的在于提供一种所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料在骨质诱导材料方面的应用。
本发明的又一目的在于提供一种牙齿支架，所述支架包含所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料。
采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：
1、本发明得到的超顺磁性纳米纤维膜支架材料与一般的骨组织工程材料相比，无细胞因子掺入，避免了其负载及释放的复杂问题。
2、本发明工艺利用静电纺丝方法，获得纤维膜性材料，具有良好的生物相容性及骨向诱导潜能。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1示出了本申请一种典型实施方式提出的Fe-HA的透射电镜图，其中a、低倍放大下Fe-HA形貌，Fe-HA呈针状晶体，大小各异，宽约5-20nm，长约50-80nm。b、高倍放大下Fe-HA形貌，可见磷酸钙晶体中散在少量黑色圆点（箭头处），大小约5-10nm。
图2示出了本申请一种典型实施方式提出的Fe-HA、PLGA及PLGA/Fe-HA的X衍射分析图谱，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA； c、Fe-HA；d、标准HA图谱。* 表示磁铁矿对应的峰值。
图3 示出了本申请一种典型实施方式提出的PLGA及PLGA/Fe-HA膜的形貌及元素构成分析结果，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA.
图4 示出了本申请一种典型实施方式提出的PLGA及PLGA/Fe-HA膜的水接触角，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA；c、*** 表示p<0.001。a为PLGA的水接触角检测图，水接触角为117.2±1.04°；b为掺入Fe-HA纳米颗粒后PLGA/Fe-HA的水接触角检测图，水接触角为68.5±2.32°；c对两者进行统计学分析，发现p<0.0001。
图5示出了本申请一种典型实施方式提出的合成材料的磁化强度-磁场强度曲线，其中a、Fe-HA，实线；b、PLGA/Fe-HA，虚线。a实线为Fe-HA纳米颗粒的磁滞回线，其磁化强度随着外界磁场的引入而增加，随着外界磁场去除而消失，矫顽力较低为1.088Gs，Fe-HA纳米颗粒的饱和磁化强度为7.61emu/g；b虚线为电纺膜PLGA/Fe-HA的磁滞回线，其饱和磁化强度可达到1.19emu/g。
图6示出了本申请一种典型实施方式提出的RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面的粘附与形貌。当共培养1天后，可见细胞呈梭形粘附于支架表面（a，d），形态无明显差异。到达第3天时（b，e），细胞逐渐伸展，表面伸出伪足与纤维相连。细胞在支架表面生长7天时（c，f），细胞之间发生融合，连接成片，细胞表面有细胞外基质分泌。当将细胞-支架共培养置于300Gs静磁场作用下时，当共培养1天后，可见细胞生长状态与前基本相同（g，i），在3天时（h，k）较无磁场组细胞数量多，生长快，到7天时同样可以融合成片（i，l）。
图7示出了本申请一种典型实施方式提出的RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面增殖情况。
图8示出了本申请一种典型实施方式提出的PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面受静磁场作用RMSCs骨化分化因子表达。a中，在3天时，四个组的ALP活性均比较低，彼此间无差异，随着共培养时间延长，7天时ALP活性有大幅提高，并且外加静磁场的引入都上调ALP活性（p<0.05），比较PLGA/Fe-HA支架与PLGA支架，ALP活性同样明显上调（p<0.05）。在共培养14天时，检测ALP活性仍有进一步上升，但两支架材料间无明显差异（p>0.05）。b中可见PLGA/Fe-HA支架随着外加静磁场引入，OPN表达量明显上调（p<0.05），在同一静磁场作用下，PLGA/Fe-HA支架表面OPN表达与PLGA相比有明显上调（p<0.05）。c中，Runx2表达情况与OPN基本相同，外加静磁场引入上调了两种支架表面的Runx2表达量（p<0.05），但两者间无明显差异（p>0.05）。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个部件或者模块或特征与其他部件或者模块或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了部件或者模块在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的部件或者模块被倒置，则描述为“在其他部件或者模块或构造上方”或“在其他部件或者模块或构造之上”的部件或者模块之后将被定位为“在其他部件或者模块或构造下方”或“在其他部件或者模块或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该部件或者模块也可以其他不同方式定位（旋转90度或处于其他方位），并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
正如背景技术所介绍的，现有技术中的骨缺损修复技术均是集中在制备支架过程中会将细胞因子预先载入支架材料中，这种方式具有细胞因子的可控性不能保证，细胞因子的有效负载和可控释放均难以有效控制等难题。
本发明提出了一种超顺磁性纳米纤维膜支架材料，使用磁性纳米颗粒，即利用磁性纳米颗粒与磁场间的磁力作用促进组织再生。经实验证实，磁性材料表面的成骨细胞在外界磁场协同作用下具有较强的成骨反应，体内实验也表明磁性纳米颗粒与磁场间的协同作用可有效加速新骨形成的进程。这些结果都说明磁性纳米颗粒具有一定的骨向诱导潜能。另外，由于裸露的磁性纳米颗粒比如四氧化三铁存在一定的细胞毒性，且应用及操作不便，本发明采用静电纺丝技术制备具有骨向诱导潜能的超顺磁性纳米纤维膜PLGA/Fe-HA，通过无序堆叠可以形成孔隙率高、比表面积大的支架结构，另一优势在于可方便地将无机材料和有机材料结合起来，通过纤维包裹纳米颗粒，避免裸露的纳米颗粒。
本申请一种典型的实施方式中，如图1~8所示，提出了一种磁性纤维膜性材料，即超顺磁性纳米纤维膜支架材料PLGA/Fe-HA，可以作为一种具有骨向诱导潜能的临床应用型生物材料。
在一些实施例中，本发明的超顺磁性纳米纤维膜支架材料，所述支架材料包括：
作为支架主体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的70~99%，且用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为0.1-6；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的1~30%。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA是生物相容的并且生物可降解的、乳酸与乙醇酸的共聚物，并且多种形式的PLGA可以通过乳酸:乙醇酸的比率来表征。乳酸可以是 L-乳酸、D-乳酸或D，L-乳酸。可以通过改变乳酸-乙醇酸的比率调整PLGA的降解速率。在一些实施例中，PLGA可以通过约85:15、约75:25、约60:40、约50:50、约40:60、约25:75、或约 15:85的乳酸:乙醇酸比率来表征。在一些实施例中，作为支架主体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）中乳酸与乙醇酸单体的比率，可以根据不同参数如吸水量和/或聚合物降解动力学等进行优化。
在一个实施例中，可以将PLGA的分子量(或例如，如聚合物的不同嵌段的分子量的比率)针对骨向诱导或者铁掺杂的羟基磷灰石或者工艺进行优化。例如，聚合物的分子量可以影响颗粒降解速率(如当生物可降解聚合物的分子量可以被调节时)、溶解度、吸水量。例如，该聚合物的分子量(或例如，如共聚物的不同嵌段的分子量的比率)可以被调节，这样使得该颗粒在正被骨向诱导的受试者中在合理的一段时期(范围是从几小时至1-2周、 3-4周、5-6周、7-8周等)内生物降解。所披露的颗粒可以例如包括PEG和PL(G)A的二嵌段共聚物，其中，例如该 PLGA可以具有数均分子量为约5，000至约20，000、或约5，000-100，000，例如约20，000-70，000，例如约15，000-50，000；例如约50，000-200，000。
实施例1 铁掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒的制备和表征
（1）铁掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒的制备
称取25g Ca(OH)2溶解于200mL水中，转移至1000mL三口烧瓶中，磁力搅拌并加热至60℃。称取6.37g FeCl2·4H2O溶解于37.5mL水中，称取8.39g FeCl3·6H2O溶解于37.5mL水中，将两溶液作为Fe2+和 Fe3+离子的来源同时加入Ca(OH)2悬浊液中后，再缓慢滴加磷酸溶液（22.2g磷酸溶于150mL水中），持续加热及搅拌，2h滴完。反应产物继续加热搅拌1h后结束反应，置于室温下老化24h，以900rpm的速度离心获得沉淀，用蒸馏水清洗沉淀3次，冷冻干燥并在150nm下筛分。
（2）铁掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒的表征
透射电子显微镜(TEM)观察纳米颗粒的形貌及粒径；用粉末X射线衍射（XRD，CuKα 扫描速度 5°/min)测定样品的结晶状况；用用Lakeshore 7407振动样品磁强计对合成纳米颗粒的磁学性能进行检测。
如图1所示为Fe-HA的透射电镜图，其中a、低倍放大下Fe-HA形貌，可见Fe-HA是一种针状晶体，大小各异，宽约5-20nm，长约50-80nm。b、高倍放大下Fe-HA形貌，可见磷酸钙晶体中散在少量黑色圆点，大小约5-10nm，进一步放大下可见铁的富集相分布在白色的HA晶体中；从XRD结果可以看到少量Fe3O4的存在，但大部分为Fe-HA，其中Fe离子置换晶格中的Ca离子。。
实施例2 超顺磁性纳米纤维膜支架材料的制备和表征
（1）磁性纤维膜性材料的制备
采用由75%乳酸和25%羟基乙酸单体聚合而成的分子量为10万的PLGA（polylactic-co-glycolic acid）（75/25）作为支架材料的主体成份，以氯仿（CHCl3）和二甲基甲酰胺（DMF）按体积比为1:1混合作为溶剂，以18%PLGA（w/v）配制电纺溶液，电纺溶液制备过程中，掺入3% Fe-HA（w/v）获得混合电纺溶液，将制好的电纺溶液注入10mL注射器中，置于注射泵调控器内并控制电纺溶液的流速为2.5mL/h ，注射器尖端连接平头毛细针头（内径0.34mm），将高压电源一端连接在针头上，一端连接在铝箔覆盖的接收板上，其间接收距离为15cm，设置纺丝电压为17kV，整个纺丝过程约为4h以获得纳米纤维膜材料。
（2）磁性纤维膜性材料的表征
1）扫描电子显微镜(SEM)观察及元素构成检测
剪取约1cm2的膜材料用黑色导电胶固定于测试使用的铜盘上，将表面进行喷金处理以提高材料的导电性。采用Siron扫描电子显微镜观察PLGA，PLGA/Fe-HA的表面形貌以及纤维直径，采用能量色散X射线光谱分析仪检测两种材料的元素构成。结果如图2所示。
图2为PLGA及PLGA/Fe-HA膜的形貌及元素构成分析 a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA.图3a（左侧）为18% PLGA（w/v）的SEM图，图中电纺纤维光滑连续，互相交织形成多孔网状结构，未见到明显的串珠样结构；纤维直径大体上较为一致。图3b（左侧）为加入Fe-HA后的电纺膜SEM图，可见Fe-HA颗粒均匀分布于纤维膜上，Fe-HA颗粒明显包裹于纤维表面。右侧图对两材料的元素构成进行分析，检测了C、O、Ca、P、Fe等元素的比例，发现在PLGA/Fe-HA膜内部明显存在Ca、P、Fe元素，这与SEM结果保持一致。
2）X射线衍射分析：将膜材料剪取约5mm2用X射线衍射仪进行检测，管电压为40kV，管电流为40mA，在铜耙射线下从2θ=10°进行到70°。结果如图3所示。
图3为Fe-HA、PLGA及PLGA/Fe-HA的X衍射分析图谱，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA；c、Fe-HA；d、标准HA图谱。*表示磁铁矿对应的峰值。对不同材料进行X射线衍射分析，对其晶型及结晶度进行分析，结果如图2所示。标准HA图谱(PDF#09-0432)，Fe-HA的XRD图谱中在2θ＝25.9°(002)，31.8°(211)，32.9°(300)，49.5°(213)位置出现HA的特征衍射峰，表明形成物为HA晶体。比较两者发现在2θ＝30.0°(220)，35.5°(311)位置出现峰，这些峰对应的晶相为磁铁矿，说明形成物中有部分磁铁矿晶体形成。图2a中在16°左右出现一馒头峰，为PLGA特征表现，在图2b中相同位置也有出现，说明电纺得到的支架材料中Fe-HA的晶体结构未发生明显变化，但结晶度有所减弱。
3）材料的亲/疏水性能检测
将PLGA，PLGA/Fe-HA材料剪成1cm2大小，并平铺于玻璃板上，采用上海中晨数字技术设备有限公司的接触角测量仪检测去离子水对膜的接触角，使用微量加样针滴加去离子水，水滴直径约为4mm，每个样品取3个测试点，取其平均值。结果如图4所示。
图4 为PLGA及PLGA/Fe-HA膜的水接触角，其中a、PLGA；b、PLGA/Fe-HA； c、*** 表示p<0.001。支架材料的亲水性能对细胞的粘附有一定的影响，实验中通过对材料的水接触角进行检测，来反映其亲水性能。图4a为PLGA的水接触角检测图，水接触角为117.2±1.04°，当掺入Fe-HA纳米颗粒后，材料的水接触角减小为68.5±2.32°（图4b），图4c对两者进行统计学分析，发现p<0.0001，表明Fe-HA可以提高材料的亲水性能。
4）PLGA/Fe-HA膜的磁学性能分析
为保证样品不超过振动杆样品室的尺寸，取10mg PLGA/Fe-HA膜材料剪成2-3mm的小块，置于振动杆样品室内，进行检测，记录数据。结果如图5所示。
图5为合成材料的磁化强度-磁场强度曲线，其中a、Fe-HA，实线； b、PLGA/Fe-HA，虚线。对合成材料的磁学性能检测结果如图5所示，图5a实线为Fe-HA纳米颗粒的磁滞回线，其磁化强度随着外界磁场的引入而增加，随着外界磁场去除而消失，矫顽力较低为1.088Gs，表现出了超顺磁性的特性。Fe-HA纳米颗粒的饱和磁化强度为7.61emu/g，图5b虚线为电纺膜PLGA/Fe-HA的磁滞回线，同样具有超顺磁性的特性，饱和磁化强度可达到1.19emu/g。说明电纺过程并不会影响材料的超顺磁性。
实施例3 磁性纤维膜性材料的生物相容性及骨向诱导潜能
（1）扫描电镜观察支架表面细胞形貌
将PLGA、PLGA/Fe-HA膜剪成直径为14mm的圆形，使其能够放置于24孔细胞培养板的底部。实验分为四组，分别为PLGA、PLGA/Fe-HA、PLGA+SMF、PLGA/Fe-HA+SMF。75%乙醇浸泡30min，紫外线照射1.5h灭菌后，以PBS清洗支架膜3次，在每个孔内加入500μLDMEM中37℃孵育过夜。取第3代RMSCs，以5×104个/孔的数量接种于支架表面，每3天换液。培养1d、3d、7d后，将膜用PBS清洗2次，浸泡于2.5%戊二醛固定，进入制样过程：将膜转入0.18M蔗糖冲洗液，4℃放置2h，以1%锇酸固定2h，梯度乙醇脱水（30%、50%、70%、90%、95%、100%）10min×3，乙酸异戊醋室温置换20min，二氧化碳临界点干燥，喷金处理，SEM下观察。
图6为RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面的粘附与形貌。在细胞-支架共培养的最初阶段（共培养1天），可见细胞呈梭形粘附于支架表面（a，d），形态无明显差异。随着培养时间延长，到达第3天时（b，e），细胞逐渐伸展，表面伸出伪足与纤维相连。细胞在支架表面生长7天时（c，f），细胞之间发生融合，连接成片，细胞表面有细胞外基质分泌。这说明两种材料均具有较好的生物相容性，适合细胞粘附与生长。当将细胞-支架共培养置于300Gs静磁场作用下时，可见细胞生长状态与前基本相同，在3天时（h，k）较无磁场组细胞数量多，生长快，到7天时同样可以融合成片（i，l）。对比静磁场作用下两种材料表面的细胞，发现3天时，PLGA/Fe-HA支架表面细胞（k）可以跨越纤维进入支架内部生长。
（2） CCK-8试剂盒检测细胞在材料表面增殖情况
将PLGA、PLGA/Fe-HA膜剪成直径为7mm的圆形，使其能够放置于96孔细胞培养板的底部。实验分为四组，分别为PLGA、PLGA/Fe-HA、PLGA+SMF、PLGA/Fe-HA+SMF。材料接种细胞前的处理与前相同。取第3代RMSCs，以1500个/孔的数量接种于支架表面，每3天换液。培养1d、3d、5d、7d后，将膜用PBS清洗2次，更换新鲜培养基100μL，每个孔加入10μL WST-8，置于37℃环境下孵育2h。将孵育后的溶液吸取至新的96孔板中，用酶联免疫检测仪在450nm波长下测定吸光度值，SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析。
图7为RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面增殖情况。随着培养时间延长，细胞呈现稳定增殖趋势，说明两种材料对于细胞生长无明显毒性。但在同一培养时间，两种材料及磁场作用对细胞增殖无明显差异。
（3）碱性磷酸酶试剂盒检测细胞ALP活性
将PLGA、PLGA/Fe-HA膜剪成直径为35mm的圆形，使其能够放置于6孔细胞培养板的底部。实验分组为PLGA、PLGA/Fe-HA、PLGA+SMF、PLGA/Fe-HA+SMF。材料接种细胞前的处理与前相同。取第3代RMSCs，以1.2×105个/孔的数量接种于支架表面，每3天换液。分别在培养3d、7d、14d时，采用200μL NP-40裂解液裂解细胞，离心获得上清，用于碱性磷酸酶的检测。按试剂盒说明书设定p-nitrophenol标准品用量（分别为4、8、16、24、32和40μL），样品加入量为25μL，加入一定量显色底物，摇床辅助混匀，37℃孵育35min，每孔加入100μL反应终止液终止反应，此时，标准品或有碱性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的黄色。在405nm波长下测定吸光度值，SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析。
（4）实时荧光定量聚合酶链反应检测材料表面细胞骨化分化情况
细胞按1.2×105个/孔的数量接种于6孔板支架表面，培养7d后，提取 各组样品的总RNA，取等量的RNA为模板，逆转录获得cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，反应体系为20μL：2×SYBR Green supermix 10μL，Forward and reverse primers 2μL，DNAtemplate 2μL，H2O 6μL。反应程序为：Stage 1：变性，95℃，10min；Stage 2：扩增40个循环），95℃，15s；60℃，60min；Stage 3：溶解曲线反应（自动生成）。利用StepOne软件采用2-ΔΔCT方法分析实验组与对照组。检测成骨相关基因（OPN，Runx2，）的表达，以β-actin作为内参照。
图8为PLGA和PLGA/Fe-HA支架表面受静磁场作用RMSCs骨化分化因子表达。RMSCs在PLGA和PLGA/Fe-HA表面的骨化分化相关因子表达如图8所示。细胞-支架共培养3，7，14天后，比较ALP活性的改变（图8a）。在3天时，四个组的ALP活性均比较低，彼此间无差异，随着共培养时间延长，7天时ALP活性有大幅提高，并且外加静磁场的引入都上调ALP活性（p<0.05），比较PLGA/Fe-HA支架与PLGA支架，ALP活性同样明显上调（p<0.05）。在共培养14天时，检测ALP活性仍有进一步上升，但两支架材料间无明显差异（p>0.05）。
为了分析RMSCs骨化分化情况，用q-PCR检测了细胞-支架共培养7天时OPN和Runx2的表达量。b是四组OPN表达情况，可见PLGA/Fe-HA支架随着外加静磁场引入，OPN表达量明显上调（p<0.05），在同一静磁场作用下，PLGA/Fe-HA支架表面OPN表达与PLGA相比有明显上调（p<0.05）。Runx2表达情况与OPN基本相同，外加静磁场引入上调了两种支架表面的Runx2表达量（p<0.05），但两者间无明显差异（p>0.05）。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于所述支架材料包括：
作为支架主体的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的70~99%，且用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为0.1-6；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的1~30%。
2.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于，
所述支架材料相互交织成多孔网状结构，所述铁掺杂的羟基磷灰石被覆于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）内。
3.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~99%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的1~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~97%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的3~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~95%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的5~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~93%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的7~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的80~90%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的10~20%；
优选的，所述支架材料包括：
聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），占所述支架材料总重量的85%；
铁掺杂的羟基磷灰石，占所述支架材料总重量的15%。
4.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于，
所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的1~20%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的5~15%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的7~15%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的8~13%；
优选的，所述铁掺杂的羟基磷灰石中铁的掺杂量为铁掺杂的羟基磷灰石总重量的8~12%。
5.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于，
用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为0.1-6；
优选的，用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为1~5；
优选的，用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为2~4；
优选的，用于形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体与羟基乙酸单体摩尔比为3。
6.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于，
所述铁掺杂的羟基磷灰石呈现为针状晶体，宽为5-20nm，长为50-80nm；其中铁富集相的大小为5-10nm。
7.根据权利要求1所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料，其特征在于，
聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量在5~20万；优选的，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为5~15万；优选的，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10万；优选的，超顺磁性纳米纤维膜支架材料的水接触角在50~85°；优选的，超顺磁性纳米纤维膜支架材料的水接触角在55~85°；优选的，超顺磁性纳米纤维膜支架材料的水接触角在55~80°。
8.一种权利要求1~7任意一项所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料的制备方法，其特征在于，
所述方法包括以下步骤：
（1）以氢氧化钙和磷酸为原料，混入铁盐，经中和反应后生成铁掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒；
（2）将铁掺杂的羟基磷灰石纳米颗粒混入含有聚乳酸-羟基乙酸共聚物的电纺溶液中，经静电纺丝方法，获得超顺磁性纳米纤维膜支架材料。
9.一种权利要求1～7任意一项所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料在骨质诱导材料方面的应用。
10.一种牙齿支架，所述支架包含权利要求1～7任意一项所述的超顺磁性纳米纤维膜支架材料。
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