KR101842793B1 - 헤스페레틴 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 - Google Patents

헤스페레틴 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 헤스페레틴 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규 헤스페레틴 유도체는 종래 헤스페레틴 자체보다 3배나 더 높은 항암활성을 나타내므로 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

헤스페레틴 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물{Novel hesperetin derivatives, preparation method thereof, and composition for anticancer comprising the same as active ingredient}
본 발명은 신규한 헤스페레틴 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10만 명 이상이 진단되고, 약 6만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
암이란 "제어되지 않은 세포성장"으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다.
학문적으로는 신생물(neoplasia)이라고도 불린다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다. 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분하기도 한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거쳐 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지는 않았으나, 적어도 80~90%가 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다.
암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자(oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 요인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다. 암은 혈액암과 고형암으로 크게 분류되며, 폐암, 위암, 유방암, 구강암, 간암, 자궁암, 식도암, 피부암 등 신체의 거의 모든 부위에서 발생한다. 이들 악성종양을 치료하기 위해 사용하는 방법들 중 수술이나 방사선 요법을 제외한 화학요법제를 총칭하여 항암제라고 하며, 주로 핵산의 합성을 저해하여 항암활성을 나타내는 물질이 대부분이다. 화학요법제는 크게 대사길항제(antimetabolites), 알킬화제(alkylating agents), 유사분열억제제(antimitotic drugs), 호르몬제 (hormones) 등으로 분류되며, 암세포의 증식에 필요한 대사과정을 저해하는 대사길항제로는 엽산유도체(methotrexate), 퓨린유도체(6-mercaptopurine, 6-thioguanine), 피리미딘유도체(5-fluorouracil, Cytarabine) 등이 있으며, DNA의 구아닌 등에 알킬기를 도입하여 DNA의 구조를 변형시키고 사슬 절단을 시켜 항암효과를 발휘하는 알킬화제로는 니트로겐 머스타드계 화합물(chlorambucil, cyclophosphamide), 에틸렌이민계 화합물(thiotepa), 알킬설포네이트계 화합물 (busulfan), 니트로소우레아계 화합물(carmustine), 트리아젠계 화합물 (dacarbazine)이 있다. 분열시기 특이성 약물로서 유사분열을 차단하여 세포분열을 억제하는 유사분열억제제에는 악티노마이신 D(actinomycin D), 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신과 같은 항암성항암제, 빈크리스틴, 빈블라스틴과 같은 식물알칼로이드, 탁산환을 포함하는 유사분열 저해제인 탁소이드 등이 포함된다. 이외에 부신피질호르몬이나 프로게스테론과 같은 호르몬제와 시스플라틴 같은 백금함유 화합물이 항암제로서 사용되고 있다.
화학요법제의 가장 큰 문제는 약제 내성으로써, 항암제에 의한 초기의 성공적인 반응에도 불구하고 결국에는 치료가 실패하게 되는 주요 요인이다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.
한편, 대장암은 대장에서 세포가 비정상적으로 성장하여 다른 조직으로 침투하거나 퍼져나가는 질환이다. 우리나라 사람들의 식생활이 서구화되어 감에 따라 근래에 발병율이 증가하는 암으로 사망자 수로 볼 때 4위에 이르고 있다. 내시경에 의한 조기 발견을 통한 수술이 가장 좋은 치료법이기는 하나 발견이 늦어지는 경우가 많아서 다른 고형암과 마찬가지로 화학요법이 필요한 실정으로 좀 더 효과적인 치료제 개발을 위한 연구가 활발하다.
한편, 헤스페리딘인 헤스페레틴-7-O-루티노시드는 오렌지, 레몬. 라임 및 그레이프프루트(grapefruit)를 포함하는 감귤류에서 널리 발견되며, 헤스페리딘-6-O-α-L-람노실-β-D-글루코시다아제에 의해 아글리콘, 헤스페레틴, 및 이당류인 루티노스로 대사 작용된다[Neher B.D., et al., Appl Microbiol Biotechnol;100:3061-3070 (2016)]. 헤스페레틴은 단순포진 바이러스 1형(herpes simplex virus type 1), 폴리오바이러스 1형(poliovirus type 1), 파라인플루엔자 바이러스3형(parainfluenza virus type 3), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)를 포함하는 바이러스의 세포내 복제를 감소시키고[Kaul T.N.,et al., J Med Virol;15:71-79 (1985)], 트립신-활성화된 포스포릴라아제 키나아제를 활성화시킨다[Kyriakidis S.M.,et al., Biochim Biophys Acta;871:121-129 (1986)]. 또한, 헤스페레틴은 베타-헥소사미니다아제의 수용체-매개된 세포내섭취(endocytosis)[Vladutiu G.D.,et al., Life Sci;39:717-726 (1986)] 및 미엘로퍼옥시다아제 방출[BA T.H.,et al., Chem Biol Interact;73:323-335 (1990)]을 저해한다. 또한, 헤스페레틴 자체는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 실험에서 많은 암에 대하여 아폽토시스(apoptosis)를 유도함으로써 항암 활성을 나타냄이 보고되었다[Wu D.,et al.,Tumour Biol;37:3451-3459 (2016)].
그러나, 더욱 강력한 신규 항암제의 개발은 여전히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 천연물로부터 유래된 새로운 종류의 항암제를 개발하기 위하여 연구하던 중, 새로운 헤스페레틴 유도체를 합성하고, 상기 헤스페레틴 유도체가 종래 헤스페레틴 자체보다 3배나 더 높은 항암활성을 나타내므로 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
공개특허공보 10-2014-0050952
본 발명의 목적은 신규 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 헤스페레틴 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 신규 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016101779343-pat00001
(상기 화학식 1에서,
R은 -CO-A, -CO-R2 또는 -CO-A-R2이고;
R'는 H, -CO-A, -CO-R2 또는 -CO-A-R2이며;
상기 A는 C1~C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 알케닐 또는 알케닐알킬이고;
상기 R2는 비치환, 또는 C1~C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1~C4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 치환된 페닐이다).
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
헤스페레틴을 용매에 용해시킨 용액에 트리에틸아민을 첨가하고, 추가로 R-C(=O)Cl 또는 R'-C(=O)Cl을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 제1항의 헤스페레틴 유도체의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112016101779343-pat00002
(상기 반응식 1에서, R 및 R'은 화학식 1에서 정의된 바와 같다)
나아가, 본 발명은 신규 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 신규 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 헤스페레틴 유도체는 종래 헤스페레틴 자체보다 3배나 더 높은 항암활성을 나타내므로 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 12개의 헤스페레틴 유도체 및 헤스페레틴 화합물을 상이한 농도(0, 5, 10, 20, 및 40 μM)로 대장암 세포주에 처리한 결과, 대장암 세포주의 증식에 대한 저해 활성을 나타내는 클론형성능 장기 생존 분석 사진이다.
도 2는 본 발명의 12개의 헤스페레틴 유도체 및 헤스페레틴 화합물의 대장암 세포주에 대한 반수-최대 세포 저해 농도(GI50)를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5B) 및 헤스페레틴 화합물을 상이한 농도(0, 20, 40, 80, 및 100 μM)로 대장암 세포주에 처리한 결과, 대장암 세포주의 증식에 대한 저해 활성을 나타내는 CCK-8을 사용한 세포 생존율 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5B) 및 헤스페레틴 화합물의 FITC-표지된 아넥신(annexin) V를 사용한 아폽토시스 분석 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5B) 및 헤스페레틴 화합물의 면역블롯 분석 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5B) 및 헤스페레틴 화합물의 JNK-활성화 활성을 비교한 면역블롯 분석 사진이다.
도 7은 LigPlot 프로그램을 이용하여 분석된 893-2H96 복합체의 결합 사이트에 참여한 잔기들을 나타낸다.
도 8은 LigPlot 프로그램을 이용하여 분석된 헤스페리틴-2H96 복합체의 결합 사이트에 참여한 잔기들을 나타낸다.
도 9는 LigPlot 프로그램을 이용하여 분석된 헤스페레틴 유도체(K-5B)-2H96 복합체의 결합 사이트에 참여한 잔기들을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 비교예의 헤스페레틴-2H96 복합체를 포함한 JNK1 결합 사이트의 3D 이미지를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5B)-2H96 복합체를 포함한 JNK1 결합 사이트의 3D 이미지를 나타낸다.
도 12는 LigPlot 프로그램을 이용하여 분석된 BIRB796-3NPC 복합체의 결합 사이트에 참여한 잔기들을 나타낸다.
도 13은 LigPlot 프로그램을 이용하여 분석된 헤스페레틴-3NPC 복합체의 결합 사이트에 참여한 잔기들을 나타낸다.
도 14는 LigPlot 프로그램을 이용하여 분석된 헤스페레틴 유도체(K-5B)-3NPC 복합체의 결합 사이트에 참여한 잔기들을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 비교예의 헤스페레틴-3NPC 복합체를 포함한 JNK2 결합 사이트의 3D 이미지를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5B)-3NPC 복합체를 포함한 JNK2 결합 사이트의 3D 이미지를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
화합물
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
Figure 112016101779343-pat00003
상기 화학식 1에서,
R은 -CO-A, -CO-R2 또는 -CO-A-R2이고;
R'는 H, -CO-A, -CO-R2 또는 -CO-A-R2이며;
상기 A는 C1~C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 알케닐 또는 알케닐알킬이고;
상기 R2는 비치환, 또는 C1~C4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1~C4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 치환된 페닐이다.
바람직하게는,
R은
Figure 112016101779343-pat00004
,
Figure 112016101779343-pat00005
,
Figure 112016101779343-pat00006
,
Figure 112016101779343-pat00007
,
Figure 112016101779343-pat00008
,
Figure 112016101779343-pat00009
,
Figure 112016101779343-pat00010
,
Figure 112016101779343-pat00011
또는
Figure 112016101779343-pat00012
이고,
R'는 H,
Figure 112016101779343-pat00013
,
Figure 112016101779343-pat00014
,
Figure 112016101779343-pat00015
,
Figure 112016101779343-pat00016
,
Figure 112016101779343-pat00017
,
Figure 112016101779343-pat00018
, 또는
Figure 112016101779343-pat00019
이다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 헤스페레틴 유도체의 구체적인 화합물은 하기와 같다.
(1) 헤스페레틴-3',7-디벤조에이트;
(2) 헤스페레틴-7-벤조에이트;
(3) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메톡시벤조에이트);
(4) 헤스페레틴-3',7-디-(2-페닐아세테이트);
(5) 헤스페레틴-7-(부트-2-에노에이트);
(6) 헤스페레틴-3',7-디부티레이트;
(7) 헤스페레틴-7-부티레이트;
(8) 헤스페레틴-7-피발레이트;
(9) 헤스페레틴-3',7-디신나메이트;
(10) 헤스페레틴-3',7-디-(2-메틸벤조에이트);
(11) 헤스페레틴-7-(2-메틸벤조에이트); 및
(12) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메틸벤조에이트).
약학적으로 허용 가능한 염
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 유도체를 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1의 유도체 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체, 광학 이성질체 등을 모두 포함한다.
제조방법
본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
헤스페레틴을 용매에 용해시킨 용액에 트리에틸아민을 첨가하고, 추가로 R-C(=O)Cl 또는 R'-C(=O)Cl을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 제1항의 헤스페레틴 유도체의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure 112016101779343-pat00020
상기 반응식 1에서, R 및 R'은 화학식 1에서 정의된 바와 같다.
구체적으로, 불활성 기체 분위기하에서 용매에 헤스페레틴을 용해시킨 용액에 트리에틸아민을 첨가하여 실온에서 8-15분 정도 반응시킨 후, 산 염화물(R-C(=O)Cl 또는 R'-C(=O)Cl)을 첨가하여 실온에서 8-15분 정도 반응시킴으로써 화학식 1의 화합물을 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 헤스페레틴은 시판되는 것을 구입하거나, 공지의 방법에 의해 합성하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 용매는 t-부탄올, 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, CH2Cl2, 헥산, 디메틸포름아미드(DMF), 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤, 클로로벤젠 등을 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 아민의 첨가량은 헤스페레틴 1당량 당 2당량 정도 첨가하는 것이 바람직하며, 산 염화물은 헤스페레틴 1당량 당 1.2~2.4 당량 정도 첨가하는 것이 바람직하다.
반응 후 생성된 생성물은 세척, 농축, 에틸 아세테이트 추출, 건조, 컬럼 크로마토 그래피 등의 추가 단계를 통하여 정제할 수 있으며, NMR 및 HR/MS 등을 통하여 구조 및 물리화학적 특성을 분석할 수 있다.
약학적 조성물
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 화학식 1로 표시되는 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 대장암 세포주에 대하여 종래 헤스페레틴보다 3배 이상 세포 생존율을 감소시키고, 아폽토시스를 유발하여 우수한 암 억제 효과를 나타내었다(도 2 및 표 2 참조).
따라서, 본 발명에 따른 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적인 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 암을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 대장암에 대한 항암효과를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001-100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01-35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07-7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7-2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
건강기능식품 조성물
본 발명은 상기 헤스페레틴 유도체를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 이때, 상기 건강기능식품 조성물은 20 내지 90 % 고농축액이거나 분말이거나 과립형태일 수 있으며, 식품첨가제의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 중 임의의 어느 한 형태를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 대장암에 대한 항암효과를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 헤스페레틴 유도체를 포함하는 것 이외에, 항암 활성을 상승 또는 보강할 수 있도록 함암 활성이 있다고 알려진 공지의 천연물 또는 화합물을 포함할 수 있고, 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등을 더 포함할 수 있다.
상기 감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
상기 풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다.
바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등의 형태의 것들이 이용될 수 있다.
또한, 생리 활성 물질로서는 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다. 이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 건강기능식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.
또한, 사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.
또한, 사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.
또한, 사용될 수 있는 산미료로서는 구연산, 말산(사과산), 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 건강기능식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
또한, 사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강억제제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 > 헤스페레틴 유도체의 제조
시판되는 헤스페레틴(INDOFINE Chemical Company, Hillsborough Township, NJ, USA)과 대응하는 산 염화물(R-C(=O)Cl 또는 R'-C(=O)Cl)을 사용하여 3'- 및/또는 7-위치에 치환기를 포함하는 12개의 헤스페레틴 유도체를 합성하였다.
구체적으로, 아르곤 분위기하에서 열 건조된 둥근바닥 플라스크에 헤스페레틴(1 당량) 및 아세톤을 채웠다. 이 용액에, 갓 증류된 트리에틸아민(2 당량)을 아르곤 분위기하에서 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 10분 동안 교반시킨 후, 대응하는 산 염화물(R-C(=O)Cl 또는 R'-C(=O)Cl; 1.2-2.4 당량)을 빠르게 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 10분 동안 교반한 다음 증류수로 퀀칭하였다. 이 수용성 혼합물을 CH2Cl2으로 추출하고, 유기 추출물을 모은 후 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 조 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물을 얻었다.
제조된 헤스페레틴 유도체의 구조와 이름 및 질량분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112016101779343-pat00021
유도체 R R' Mass
( calcd /found) 		이름
헤스페레틴
( hesperetin ) 		H H - 3',5,7-trihydroxy-4'-methoxyflavanone
K-1a
( 실시예 1)
Figure 112016101779343-pat00022
Figure 112016101779343-pat00023
 511.1393/511.1382 hesperetin-3',7-dibenzoate
K-1b
( 실시예 2)
Figure 112016101779343-pat00024
 H 407.1131/407.1136 hesperetin-7-benzoate
K-2
( 실시예 3)
Figure 112016101779343-pat00025
Figure 112016101779343-pat00026
 571.1604/571.1616 hesperetin-3',7-di-(4-methoxybenzoate)
K-3
( 실시예 4)
Figure 112016101779343-pat00027
Figure 112016101779343-pat00028
 539.1706/539.1734 hesperetin-3',7-di-(2-phenylacetate)
K-4
( 실시예 5)
Figure 112016101779343-pat00029
 H 371.1131/371.1132 hesperetin-7-(but-2-enoate)
K-5a
( 실시예 6)
Figure 112016101779343-pat00030
Figure 112016101779343-pat00031
 443.1706/443.1688 hesperetin-3',7-dibutyrate
K-5b
( 실시예 7)
Figure 112016101779343-pat00032
 H 373.1287/373.1264 hesperetin-7-butyrate
Y-1b
( 실시예 8)
Figure 112016101779343-pat00033
 H 387.1444/387.1422 hesperetin-7-pivalate
Y-2
( 실시예 9)
Figure 112016101779343-pat00034
Figure 112016101779343-pat00035
 563.1706/563.1724 hesperetin-3',7-dicinnamate
Y-3a
( 실시예 10)
Figure 112016101779343-pat00036
Figure 112016101779343-pat00037
 539.1706/539.1702 hesperetin-3',7-di-(2-methylbenzoate)
Y-3b
( 실시예 11)
Figure 112016101779343-pat00038
 H 421.1287/421.1264 hesperetin-7-(2-methylbenzoate)
Y-4a
( 실시예 12)
Figure 112016101779343-pat00039
Figure 112016101779343-pat00040
 539.1706/539.1712 hesperetin-3',7-di-(4-methylbenzoate)
NMR 및 HR/MS 실험으로부터 얻은 12개의 헤스페레틴 유도체의 스펙트럼 데이터를 하기에 정리하였다.
< 실시예 1> 헤스페레틴 -3',7- 디벤조에이트 (K-1a)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.96 (s, 1H, 5-OH), 8.13 (dd, 2H, H-2'', H-6'', J = 1.8, 7.8 Hz), 8.10 (dd, 2H, H-2''', H-6''', J = 1.8, 7.8 Hz), 7.76 (ddd, 2H, H-4'', H-4''', J = 1.8, 7.8, 7.8 Hz), 7.61 (dd, 2H, H-3''', H-5''', J = 7.8, 7.8 Hz), 7.60 (dd, 2H, H-3'', H-5'', J = 7.8, 7.8 Hz), 7.479 (dd, 1H, H-6', J = 2.3, 9.1 Hz), 7.475 (d, 1H, H-2', J = 2.3 Hz), 7.25 (d, 1H, H-5', J = 9.1 Hz), 6.57 (d, 1H, H-8, J = 2.1 Hz), 6.53 (d, 1H, H-6, J = 2.1 Hz), 5.71 (dd, 1H, H-2, J = 2.9, 12.9 Hz), 3.79 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.49 (dd, 1H, H-3, J = 12.9, 17.2 Hz), 2.92 (dd, 1H, H-3, J = 2.9, 17.2 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.9 (C-4), 164.0 (C-3' δ), 163.5 (C-7 δ), 162.3 (C-5), 162.1 (C-9), 158.1 (C-7), 151.2 (C-4'), 139.3 (C-3'), 134.3 (C-4'''), 134.1 (C-4''), 130.7 (C-1'), 129.8 (C-2'', C-2''', C-6'', C-6'''), 129.0 (C-3'', C-3''', C-5'', C-5'''), 128.6 (C-1''), 128.5 (C-1'''), 125.8 (C-6'), 121.7 (C-2'), 112.9 (C-5'), 106.0 (C-10), 103.0 (C-6), 101.9 (C-8), 78.1 (C-2), 56.0 (4'-OCH3), 42.2 (C-3).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 511.1393; 실험값: 511.1382.
< 실시예 2> 헤스페레틴 -7- 벤조에이트 (K-1b)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.98 (s, 1H, 5-OH), 9.14 (s, 1H, 3'-OH), 8.10 (dd, 2H, H-2''', H-6''', J = 1.4, 7.4 Hz), 7.75 (ddd, 1H, H-4''', J = 1.4, 7.4, 7.4 Hz), 7.60 (dd, 2H, H-3''', H-5''', J = 7.4, 7.4 Hz), 6.96 (d, 1H, H-2', J = 1.9 Hz), 6.95 (d, 1H, H-5', J = 8.3 Hz), 6.91 (dd, 1H, H-6', J = 1.9, 8.3 Hz), 6.53 (d, 1H, H-8, J = 2.1 Hz), 6.52 (d, 1H, H-6, J = 2.1 Hz), 5.59 (dd, 1H, H-2, J = 3.0, 12.6 Hz), 3.78 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.39 (dd, 1H, H-3, J = 12.6, 17.2 Hz), 2.85 (dd, 1H, H-3, J = 3.0, 17.2 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 198.1 (C-4), 163.7 (C-7 δ), 162.3 (C-5), 162.2 (C-9), 158.1 (C-7), 148.1 (C-4'), 146.5 (C-3'), 134.3 (C-4'''), 130.7 (C-1'), 130.0 (C-2''', C-6'''), 129.0 (C-3''', C-5'''), 128.5 (C-1'''), 117.9 (C-6'), 114.2 (C-2'), 112.0 (C-5'), 106.0 (C-10), 102.8 (C-6), 101.9 (C-8), 78.7 (C-2), 55.7 (4'-OCH3), 42.4 (C-3).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 407.1131; 실험값: 407.1136.
< 실시예 3> 헤스페레틴 -3',7-디-(4-메톡시벤조에이트) (K-2)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.96 (s, 1H, 5-OH), 8.07 (d, 2H, H-2'', H-6'', J = 9.0 Hz), 8.04 (d, 2H, H-2''', H-6''', J = 9.0 Hz), 7.45 (dd, 1H, H-6', J = 2.1, 8.4 Hz), 7.43 (d, 1H, H-2', J = 2.1 Hz), 7.22 (d, 1H, H-5', J = 8.4 Hz), 7.11 (d, 2H, H-3'', H-5'', J = 9.0 Hz), 7.10 (d, 2H, H-3''', H-5''', J = 9.0 Hz), 6.53 (d, 1H, H-8, J = 2.1 Hz), 6.49 (d, 1H, H-6, J = 2.1 Hz), 5.69 (dd, 1H, H-2, J = 2.6, 13.0 Hz), 3.87 (s, 3H, 4''-OCH3), 3.86 (s, 3H, 4'''-OCH3), 3.78 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.48 (dd, 1H, H-3, J = 13.0, 17.1 Hz), 2.89 (dd, 1H, H-3, J = 2.6, 17.1 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.9 (C-4), 164.0 (C-7 δ), 163.8 (C-4'''), 163.7 (C-3' δ), 163.3 (C-4''), 162.3 (C-5), 162.1 (C-9), 158.3 (C-7), 151.4 (C-4'), 139.4 (C-3'), 132.3 (C-2''', C-6'''), 132.1 (C-2'', C-6''), 130.7 (C-1'), 125.8 (C-6'), 121.8 (C-2'), 120.7 (C-1'''), 120.5 (C-1''), 114.4 (C-3'', C-5'', C-3''', C-5'''), 112.8 (C-5'), 105.9 (C-10), 103.0 (C-6), 102.0 (C-8), 78.2 (C-2), 56.0 (4'-OCH3), 55.70 (4'''-OCH3), 55.66 (4''-OCH3), 42.2 (C-3).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 571.1604; 실험값: 571.1616.
< 실시예 4> 헤스페레틴 -3',7-디-(2-페닐아세테이트) (K-3)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.93 (s, 1H, 5-OH), 7.40 (dd, 1H, H-6', J = 2.1, 8.6 Hz), 7.37 (d, 4H, H-2'', H-3'', H-5'', H-6'', J = 7.0 Hz), 7.36 (d, 4H, H-2''', H-3''', H-5''', H-6''', J = 7.0 Hz), 7.295 (dd, 2H, H-4'', H-4''', J = 7.0, 7.0 Hz), 7.292 (d, 1H, H-2', J = 2.1 Hz), 7.17 (d, 1H, H-5', J = 8.6 Hz), 6.37 (d, 1H, H-8, J = 2.0 Hz), 6.35 (d, 1H, H-6, J = 2.0 Hz), 5.65 (dd, 1H, H-2, J = 2.9, 13.1 Hz), 3.958 (s, 2H, H-3' δ), 3.955 (s, 2H, H-7 δ), 3.77 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.44 (dd, 1H, H-3, J = 13.1, 17.1 Hz), 2.85 (dd, 1H, H-3, J = 2.9, 17.1 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.8 (C-4), 169.4 (C-3' δ, C-7 δ), 162.3 (C-5), 162.1 (C-9), 158.0 (C-7), 151.2 (C-4'), 139.3 (C-3'), 133.9 (C-1'', C-1'''), 130.7 (C-1'), 129.5 (C-2''', C-6'''), 129.4 (C-2'', C-6''), 128.5 (C-4'''), 128.3 (C-4''), 127.0 (C-3''', C-5'''), 126.6 (C-3'', C-5''), 125.7 (C-6'), 121.4 (C-2'), 112.9 (C-5'), 105.9 (C-10), 102.7 (C-6), 101.7 (C-8), 78.1 (C-2), 56.0 (4'-OCH3), 42.2 (C-3), 39.9 (C-3' δ, C-7 δ).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 539.1706; 실험값: 539.1734.
< 실시예 5> 헤스페레틴 -7-( 부트 -2- 에노에이트 ) (K-4)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.94 (s, 1H, 5-OH), 9.14 (s, 1H, 3'-OH), 7.13 (dq, 1H, H-7 δ, J = 6.9, 15.5 Hz), 6.942 (d, 1H, H-5', J = 8.3 Hz), 6.941 (d, 1H, H-2', J = 1.9 Hz), 6.89 (dd, 1H, H-6', J = 1.9, 8.3 Hz), 6.36 (d, 1H, H-8, J = 2.0 Hz), 6.34 (d, 1H, H-6, J = 2.0 Hz), 6.09 (dd, 1H, H-7 δ, J = 1.7, 15.5 Hz), 5.55(dd, 1H, H-2, J = 2.8, 12.6 Hz), 3.77 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.35 (dd, 1H, H-3, J = 12.6, 17.2 Hz), 2.81 (dd, 1H, H-3, J = 2.8, 17.2 Hz), 1.93 (dd, 3H, H-7 δ, J = 1.7, 6.9 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 198.1 (C-4), 163.2 (C-7 δ), 162.23 (C-5), 162.19 (C-9), 158.0 (C-7), 148.9 (C-7 δ), 148.1 (C-4'), 146.5 (C-3'), 130.7 (C-1'), 121.1 (C-7 δ), 117.9 (C-6'), 114.2 (C-2'), 112.0 (C-5'), 105.9 (C-10), 102.7 (C-6), 101.7 (C-8), 78.7 (C-2), 55.7 (4'-OCH3), 42.4 (C-3), 18.0 (C-7 δ).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 371.1131; 실험값: 371.1132.
< 실시예 6> 헤스페레틴 -3',7- 디부티레이트 (K-5a)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.92 (s, 1H, 5-OH), 7.39 (dd, 1H, H-6', J = 2.1, 8.5 Hz), 7.28 (d, 1H, H-2', J = 2.1 Hz), 7.18 (d, 1H, H-5', J = 8.5 Hz), 6.36 (d, 1H, H-8, J = 2.1 Hz), 6.34 (d, 1H, H-6, J = 2.1 Hz), 5.65 (dd, 1H, H-2, J = 2.9, 13.1 Hz), 3.78 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.44 (dd, 1H, H-3, J = 13.1, 17.2 Hz), 2.85 (dd, 1H, H-3, J = 2.9, 17.2 Hz), 2.543 (t, 2H, H-3' δ, J = 7.3 Hz), 2.539 (t, 2H, H-7 δ, J = 7.3 Hz), 1.67 (tq, 2H, H-3' δ, J = 7.3, 7.3 Hz), 1.63 (tq, 2H, H-7 δ, J = 7.3, 7.3 Hz), 0.98 (t, 3H, H-3' δ, J = 7.3 Hz), 0.95 (t, 3H, H-7 δ, J = 7.3 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.8 (C-4), 171.0 (C-3' δ), 170.8 (C-7 δ), 162.2 (C-5), 162.1 (C-9), 158.1 (C-7), 151.2 (C-4'), 139.3 (C-3'), 130.6 (C-1'), 125.6 (C-6'), 121.5 (C-2'), 112.8 (C-5'), 105.8 (C-10), 102.8 (C-6), 101.8 (C-8), 78.1 (C-2), 56.0 (4'-OCH3), 42.2 (C-3), 35.3 (C-7 δ), 35.0 (C-3' δ), 18.0 (C-3' δ), 17.7 (C-7 δ), 13.3 (C-3' δ, C-7 δ).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 443.1706; 실험값: 443.1688.
< 실시예 7> 헤스페레틴 -7- 부티레이트 (K-5b)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.94 (s, 1H, 5-OH), 9.11 (s, 1H, 3'-OH), 6.943 (d, 1H, H-5', J = 8.3 Hz), 6.940 (d, 1H, H-2', J = 2.1 Hz), 6.89 (dd, 1H, H-6', J = 2.1, 8.3 Hz), 6.33 (d, 1H, H-8, J = 2.0 Hz), 6.32 (d, 1H, H-6, J = 2.0 Hz), 5.55 (dd, 1H, H-2, J = 2.9, 12.6 Hz), 3.78 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.36 (dd, 1H, H-3, J = 12.6, 17.1 Hz), 2.82 (dd, 1H, H-3, J = 2.9, 17.1 Hz), 2.54 (t, 2H, H-7 δ, J = 7.3 Hz), 1.63 (tq, 2H, H-7 δ, J = 7.3, 7.3 Hz), 0.95 (t, 3H, H-7 δ, J = 7.3 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 198.0 (C-4), 170.8 (C-7 δ), 162.22 (C-5), 162.17 (C-9), 158.0 (C-7), 148.1 (C-4'), 146.5 (C-3'), 130.7 (C-1'), 117.8 (C-6'), 114.1 (C-2'), 112.0 (C-5'), 105.9 (C-10), 102.7 (C-6), 101.7 (C-8), 78.6 (C-2), 55.7 (4'-OCH3), 42.3 (C-3), 35.3 (C-7 δ), 17.7 (C-7 δ), 13.3 (C-7 δ).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 373.1287; 실험값: 373.1264.
< 실시예 8> 헤스페레틴 -7- 피발레이트 (Y-1b)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.93 (s, 1H, 5-OH), 9.14 (s, 1H, 3'-OH), 6.94 (d, 1H, H-5', J = 8.2 Hz), 6.93 (d, 1H, H-2', J = 2.1 Hz), 6.88 (dd, 1H, H-6', J = 2.1, 8.2 Hz), 6.32 (d, 1H, H-8, J = 2.1 Hz), 6.30 (d, 1H, H-6, J = 2.1 Hz), 5.56 (dd, 1H, H-2, J = 2.9, 12.5 Hz), 3.77 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.35 (dd, 1H, H-3, J = 12.5, 17.2 Hz), 2.83 (dd, 1H, H-3, J = 2.9, 17.2 Hz), 1.27 (s, 9H, H-7 δ).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 198.0 (C-4), 175.6 (C-7 δ), 162.3 (C-5), 162.2 (C-9), 158.5 (C-7), 148.1 (C-4'), 146.5 (C-3'), 130.7 (C-1'), 117.8 (C-6'), 114.1 (C-2'), 112.0 (C-5'), 105.9 (C-10), 102.6 (C-6), 101.7 (C-8), 78.6 (C-2), 55.7 (4'-OCH3), 42.3 (C-3), 38.7 (C-7 δ), 26.6 (C-7 δ).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 387.1444; 실험값: 387.1422.
< 실시예 9> 헤스페레틴 -3',7- 디신나메이트 (Y-2)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.96 (s, 1H, 5-OH), 7.86 (d, 1H, H-3' δ, J = 16.0 Hz), 7.85 (d, 1H, H-7 δ, J = 16.0 Hz), 7.81 (dd, 2H, H-2''', H-6''', J = 1.8, 7.2 Hz), 7.79 (dd, 2H, H-2'', H-6'', J = 1.8, 7.2 Hz), 7.46 (dd, 4H, H-3'', H-3''', H-5'', H-5''', J = 7.2, 7.2 Hz), 7.452 (ddd, 2H, H-4'', H-4''', J = 1.8, 7.2, 7.2 Hz), 7.445 (dd, 1H, H-6', J = 2.1, 8.6 Hz), 7.39 (d, 1H, H-2', J = 2.1 Hz), 7.22 (d, 1H, H-5', J = 8.6 Hz), 6.89 (d, 1H, H-7 δ, J = 16.0 Hz), 6.85 (d, 1H, H-3' δ, J = 16.0 Hz), 6.48 (d, 1H, H-8, J = 2.0 Hz), 6.45 (d, 1H, H-6, J = 2.0 Hz), 5.69 (dd, 1H, H-2, J = 2.7, 13.0 Hz), 3.80 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.48 (dd, 1H, H-3, J = 13.0, 17.2 Hz), 2.89 (dd, 1H, H-3, J = 2.7, 17.2 Hz).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.9 (C-4), 164.3 (C-7 δ), 164.0 (C-3' δ), 162.3 (C-5), 162.1 (C-9), 158.1 (C-7), 151.4 (C-4'), 147.2 (C-3' δ), 146.7 (C-7 δ), 139.2 (C-3'), 133.8 (C-1'''), 133.7 (C-1''), 131.1 (C-4''), 131.0 (C-4'''), 130.7 (C-1'), 128.8 (C-3'', C-3''', C-5'', C-5'''), 128.7 (C-2'', C-2''', C-6'', C-6'''), 125.8 (C-6'), 121.7 (C-2'), 116.8 (C-3' δ), 116.7 (C-7 δ), 112.8 (C-5'), 105.9 (C-10), 102.9 (C-6), 101.8 (C-8), 78.2 (C-2), 56.0 (4'-OCH3), 42.2 (C-3).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 563.1706; 실험값: 563.1724.
< 실시예 10> 헤스페레틴 -3',7-디-(2-메틸벤조에이트) (Y-3a)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.98 (s, 1H, 5-OH), 8.05 (dd, 1H, H-6''', J = 1.9, 7.5 Hz), 8.03 (dd, 1H, H-6'', J = 1.9, 7.5 Hz), 7.57 (ddd, 2H, H-4'', H-4''', J = 1.9, 7.5, 7.5 Hz), 7.406 (d, 1H, H-3'', J = 7.5 Hz), 7.397 (dd, 1H, H-5'', J = 7.5, 7.5 Hz), 7.396 (d, 1H, H-3''', J = 7.5 Hz), 7.387 (dd, 1H, H-5''', J = 7.5, 7.5 Hz), 7.48 (d, 1H, H-2', J = 2.0 Hz), 7.47 (dd, 1H, H-6', J = 2.0, 8.9 Hz), 7.25 (d, 1H, H-5', J = 8.9 Hz), 6.58 (d, 1H, H-8, J = 2.0 Hz), 6.54 (d, 1H, H-6, J = 2.0 Hz), 5.71 (dd, 1H, H-2, J = 2.6, 12.9 Hz), 3.82 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.50 (dd, 1H, H-3, J = 12.9, 17.2 Hz), 2.91 (dd, 1H, H-3, J = 2.6, 17.2 Hz), 2.58 (s, 3H, 2'''-CH3), 2.57 (s, 3H, 2''-CH3).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.9 (C-4), 164.8 (C-7 δ), 164.3 (C-3' δ), 162.3 (C-5), 162.1 (C-9), 158.2 (C-7), 151.3 (C-4'), 140.4 (C-2''), 139.4 (C-2'''), 139.3 (C-3'), 133.2 (C-4''), 133.0 (C-4'''), 131.91 (C-3'''), 131.86 (C-3''), 130.91 (C-1'), 130.74 (C-6''), 130.68 (C-6'''), 128.3 (C-1'''), 127.8 (C-1''), 126.3 (C-5'', C-5'''), 125.8 (C-6'), 121.8 (C-2'), 112.9 (C-5'), 106.0 (C-10), 103.1 (C-6), 102.1 (C-8), 78.2 (C-2), 56.1 (4'-OCH3), 42.2 (C-3), 21.2 (2''-CH3), 21.1 (2'''-CH3).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 539.1706; 실험값: 539.1702.
< 실시예 11> 헤스페레틴 -7-(2- 메틸벤조에이트 ) (Y-3b)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.98 (s, 1H, 5-OH), 9.15 (s, 1H, 3'-OH), 8.04 (dd, 1H, H-6''', J = 1.6, 7.5 Hz), 7.57 (ddd, 1H, H-4''', J = 1.6, 7.5, 7.5 Hz), 7.40 (d, 1H, H-3''', J = 7.5 Hz), 7.39 (dd, 1H, H-5''', J = 7.5, 7.5 Hz), 6.96 (d, 1H, H-2', J = 1.7 Hz), 6.95 (d, 1H, H-5', J = 8.2 Hz), 6.91 (dd, 1H, H-6', J = 1.7, 8.2 Hz), 6.52 (d, 1H, H-8, J = 2.1 Hz), 6.51 (d, 1H, H-6, J = 2.1 Hz), 5.58 (dd, 1H, H-2, J = 2.7, 12.5 Hz), 3.78 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.38 (dd, 1H, H-3, J = 12.5, 17.2 Hz), 2.84 (dd, 1H, H-3, J = 2.7, 17.2 Hz), 2.57 (s, 3H, 2'''-CH3).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 198.1 (C-4), 164.3 (C-7 δ), 162.3 (C-5), 162.2 (C-9), 158.1 (C-7), 148.1 (C-4'), 146.6 (C-3'), 140.4 (C-2'''), 133.3 (C-4'''), 131.9 (C-3'''), 130.9 (C-1'), 130.7 (C-6'''), 127.9 (C-1'''), 126.3 (C-5'''), 117.9 (C-6'), 114.2 (C-2'), 112.0 (C-5'), 106.0 (C-10), 103.0 (C-6), 102.0 (C-8), 78.7 (C-2), 55.7 (4'-OCH3), 42.4 (C-3), 21.2 (2'''-CH3).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 421.1287; 실험값: 421.1264.
< 실시예 12> 헤스페레틴 -3',7-디-(4-메틸벤조에이트) (Y-4a)
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 11.96 (s, 1H, 5-OH), 8.01 (d, 2H, H-2'', H-6'', J = 8.8 Hz), 7.99 (d, 2H, H-2''', H-6''', J = 8.8 Hz), 7.47 (dd, 1H, H-6', J = 2.0, 8.3 Hz), 7.45 (d, 1H, H-2', J = 2.0 Hz), 7.404 (d, 2H, H-3'', H-5'', J = 8.8 Hz), 7.396 (d, 2H, H-3''', H-5''', J = 8.8 Hz), 7.23 (d, 1H, H-5', J = 8.3 Hz), 6.55 (d, 1H, H-8, J = 2.1 Hz), 6.51 (d, 1H, H-6, J = 2.1 Hz), 5.70 (dd, 1H, H-2, J = 2.7, 13.0 Hz), 3.78 (s, 3H, 4'-OCH3), 3.49 (dd, 1H, H-3, J = 13.0, 17.1 Hz), 2.90 (dd, 1H, H-3, J = 2.7, 17.1 Hz), 2.42 (s, 3H, 4''-CH3), 2.41 (s, 3H, 4'''-CH3).
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 197.8 (C-4), 163.9 (C-3' δ), 163.6 (C-7 δ), 162.2 (C-5), 162.1 (C-9), 158.2 (C-7), 151.3 (C-4'), 144.9 (C-4'''), 144.6 (C-4''), 139.3 (C-3'), 130.7 (C-1'), 130.0 (C-2'', C-2''', C-6'', C-6'''), 129.8 (C-3'', C-3''', C-5'', C-5'''), 129.5 (C-1'', C-1'''), 125.8 (C-6'), 121.7 (C-2'), 112.8 (C-5'), 105.9 (C-10), 102.9 (C-6), 101.9 (C-8), 78.1 (C-2), 56.0 (4'-OCH3), 42.1 (C-3), 21.2 (4''-CH3, 4'''-CH3).
HRMS (m/z): (M+H)+에 대한 이론값: 539.1706; 실험값: 539.1712.
< 실험예 1> 헤스페레틴 유도체의 대장암 세포주에 대한 저해 효과
종래 보고된 방법[Hoffman R.M., J Clin Lab Anal;5:133-143 (1991)]을 따라 장기간 클론형성능 분석(long-term clonogenic assay)을 수행하였다. 처리한지 7일 후, 세포를 7일 동안 본 발명의 헤스페레틴 유도체(0, 5, 10, 20 및 40 μM)로 처리하였고, 이후 0.1% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다. HCT116 인간 대장암 세포주에 대한 헤스페레틴 및 이의 12개의 유도체의 세포독성을 시험하였다. 농도계(MultiGuage, Fujifilm, Japan)를 이용하여 클론형성도에 대한 본 발명의 유도체의 저해 활성을 측정하였고, SigmaPlot 소프트웨어(SYSTAT, Chicago, IL, USA)를 이용하여 GI50 값을 계산하였다.
그 결과를 도 1, 2 및 표 2에 나타내었다.
유도체 GI50(μM)
헤스페레틴 36.1
실시예 1(K-1a) 46.0
실시예 2(K-1b) 16.5
실시예 3(K-2) 35.7
실시예 4(K-3) 63.9
실시예 5(K-4) 16.9
실시예 6(K-5a) 13.2
실시예 7(K-5b) 12.0
실시예 8(Y-1b) 31.5
실시예 9(Y-2) 21.0
실시예 10(Y-3a) 48.7
실시예 11(Y-3b) 22.9
실시예 12(Y-4a) 71.7
도 1은 5가지 상이한 농도 (0, 5, 10, 20, 및 40 μM)에서 12개의 헤스페레틴 유도체 및 헤스페레틴을 사용한 클론형성 장기 생존 분석 결과를 나타내는 사진이며, 도 2는 본 발명의 12개의 헤스페레틴 유도체 및 헤스페레틴 화합물의 대장암 세포주에 대한 반수-최대 세포 저해 농도(GI50)를 나타내는 그래프이다.
도 1, 도 2 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 헤스페레틴 유도체의 GI50 값은 13.2에서 71.7 μM 사이의 범위였다. 헤스페레틴의 GI50이 36.1 μM인 반면, 유도체 K-5b는 12.0 μM인 최고 낮은 GI50을 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 헤스페레틴 유도체는 종래 헤스페레틴보다 암세포주 상에서 3배나 더 높은 저해 효과를 나타내었으므로, 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 2> 인간 암 세포주에 대한 세포독성 평가
본 발명에 따라 제조된 화합물의 암 세포주에 대한 세포독성 평가를 다음과 같이 수행하였다.
구체적으로 단기간 세포 생존율 분석(short-term cell viability assay)을 위해, HCT116 세포를 96-웰 플레이트(5 × 103 세포/웰)에 씨딩하고, 헤스페레틴 또는 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5b)(10, 20, 40, 80, 및 100 μM)로 24 시간 동안 처리하였다. Cell Counting Kit-8(CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포 생존율을 측정하였다. Emax Endpoint ELISA 마이크로 플레이트 리더기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 세포 생존율 분석에 대한 상세한 절차는 이전에 보고된 방법[Shin S.Y.,et al., Bioorg Med Chem;21:7018-7024 (2013)]에 따라 수행하였다.
통계 분석은 일원(one-way) 분산 분석 (ANOVA)을 이용하여 수행하였고, 이후 GraphPad Prism 소프트웨어, 버젼 7.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 시닥 다중 비교 시험(Sidak’s multiple comparisons test)을 수행하였다. 0.05 미만의 p값이 통계적으로 유의미한 것으로 고려되었다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 오차 바(Error bar)는 평균 ± SD (n = 9)을 나타내며, Ns는 유의미하지 않음을 나타낸다. 비히클(vehicle) 처리와 비교하여 *p < 0.05; **p < 0.001; ***p < 0.0001이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 80 μM 농도에서 K-5b가 헤스페레틴보다 더 효율적으로 세포 생존율을 감소시킴을 나타내었는데, 헤스페레틴은 대략 15%까지 세포 생존율을 감소시킨 반면, K-5b는 세포 생존율을 대략 50%까지 감소시켰다.
따라서, 본 발명에 따른 헤스페레틴 유도체는 암 세포주에 대하여 유의적인 저해활성을 나타냄으로써 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
< 실험예 3> 아폽토시스 ( apoptosis ) 분석
원형질 막의 내부층 안에 있는 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS)은 아폽토시스 동안 세포의 외부 표면에 전위된다는 것이 보고되었다 (21). K-5b가 PS의 전위를 유도하는지 알아보기 위해, 아폽토시스 분석을 수행하였다.
구체적으로, HCT116 세포를 헤스페레틴 또는 본 발명의 일 실시예의 헤스페레틴 유도체(K-5b)(각 50 μM)로 24 시간 동안 처리하였고, 이후 제조사(ChemoMetec, Allerød, Denmark)의 지시에 따라 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-결합된 아넥신(annexin) V 및 10 μg/mL 프로피디움 아이오디드(propidium iodide; PI)과 함께 배양하였다. annexin V- 대 PI-양성 세포의 형광 세기를 NucleoCounter NC-300 이미지 세포분석기 (ChemoMetec)로 분석하였다. 상기 아폽토시스 분석에 대한 상세한 절차는 이전에 보고된 방법[Shin S.Y.,Bioorg Med Chem;22:1809-1820 (2014)]에 따라 수행하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 산포도(상단 패널)는 FITC-annexin V 강도 대 PI의 강도를 나타낸다. 각 사이토그램(cytogram)에서 하단 좌측 사분면(PI- 및 FITC-이중-음성)은 생존 세포를 나타낸다. 하단 우측 사분면(PI-음성, FITC-양성)은 조기 자멸된 세포를 나타내는 반면, 상단 우측 사분면(PI- 및 FITC-이중-양성) 늦게 자멸 및 사멸된 세포를 나타낸다. 히스토그램(Histograms)(하단 패널)은 세포 계수의 FITC-annexin V 강도(%)를 나타낸다. M1은 살아있는 세포이고 M2는 죽은 세포를 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, K-5b 처리 후 10에서 44%까지 FITC-양성 비율이 증가한 반면, 헤스페레틴 처리 후에는 거의 효과가 관찰되지 않았음을 나타내며, 이는 K-5b가 헤스페레틴과 비교할 때 아폽토시스를 효율적으로 유도함을 시사한다.
< 실험예 4> 면역블롯 ( Immunoblot ) 분석
카스파아제는 아폽토시스의 진행에 필수적인 역할을 하는 엔도프로테아제(endoproteases)의 패밀리이다. 불활성 프로-카스파아제는 분해에 의해 활성화된다. 카스파아제가 헤스페레틴 유도체에 유도된 아폽토시스에 참여하는지 확인하기 위해, 카스파아제의 분해를 면역블롯을 통해 분석하였다.
면역블롯 분석을 종래 공지된 방법[Shin S.Y.,Bioorg Med Chem;21:4250-4258 (2013)]에 따라 수행하였다.
구체적으로, HCT116 세포를 상이한 시간 동안(0, 12, 및 24 시간) 헤스페레틴 또는 본 발명에 따른 헤스페레틴 유도체(K-5b)(각 50 μM)로 처리하였다. 전체 세포 용해물을 제조하여 분해된(cleaved) 카스파아제-9, 분해된 카스파아제-3, 및 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제 (PARP)에 대한 항체를 이용하여 면역블롯을 수행하였다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 디히드로지나아제(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH) 항체를 내부대조군으로서 사용하였다. 분해된 카스파아제-9, 분해된 카스파아제-3, 분해된 카스파아제-7, PARP, 및 포스포-JNK (Thr183/Tyr185)에 특이적인 항체들을 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 얻었다. GAPDH 항체를 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 얻었다. 향상된 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 검출 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 신호를 증폭시켰다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 헤스페레틴 유도체(K-5b)를 처리한 후, 카스파아제-9 및 카스파아제-3은 시간 의존적으로 분해하는 것으로 나타났다. 또한, 활성화된 카스파아제-3에 대한 공지 기질인 PART 또한 K-5b 처리에 의해 효과적으로 분해되었다. 이들 데이터는 K-5b가 헤스페레틴과 비교할 때 카스파아제-매개된 아폽토시스를 효율적으로 촉진함을 시사한다.
< 실험예 5> JNK의 웨스턴 블롯 분석
본 발명에 따른 합성된 12개의 유도체는 공통적인 특성인 헤스페레틴 모이어티를 가지고, C-7 및 C-3'에 상이한 치환기를 포함한다. 왜 C-7 및 C-3'에 있는 상이한 치환기가 인간 암 세포주에 대한 세포독성에 있어서 변화를 유발하는지 설명하기 위해, 상기 세포 내의 헤스페레틴에 의해 표적된 단백질을 조사하였다
스트레스-활성화된 단백질 키나아제로도 잘 알려진 JNK 단백질은 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 (MAPK) 패밀리의 멤버이다. JNK 단백질은 3개의 이성질체인 JNK1 (MAPK8), JNK2 (MAPK9), 및 JNK3 (MAPK10)을 포함한다. JNK1 및 JNK2는 거의 모든 세포 내에서 흔히 발견되지만, JNK3은 주로 뇌, 심장 및 고환에서 발현된다[Bode A.M., Dong Z. Mol Carcinog;46:591-598 (2007)]. 상기 JNK 단백질은 항-자멸사 B- 세포 림프종 2 단백질(anti-apoptotic B-cell lymphoma 2 protein)의 비활성화 및 종양 억제 단백질의 활성화를 통해 항암 약물-유도된 아폽토시스를 조절하는 중추 역할을 한다[Fuchs S.Y., Adler V., Pincus M.R., Ronai Z. Proc Natl Acad Sci U S A;95:10541-10546 (1998)].
유방 암 세포에서 헤스페레틴이 JNK 경로의 활성화를 통해 아폽토시스를 유도함이 보고되었다[Palit S., Kar S., Sharma G., Das P.K., J Cell Physiol;230:1729-1739 (2015)]. 따라서, 무엇에 의해 K-5b가 아폽토시스를 유발하는지 메커니즘을 이해하기 위해, K-5b가 JNK를 활성화시키는지 시험했다.
구체적으로 HCT116 세포를 상이한 농도의 헤스페레틴 또는 K-5b로 처리하고, 이후 JNK 인산화 상태를 웨스턴 블롯을 이용하여 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 12 시간 처리 후 헤스페레틴은 JNK1 및 JNK2의 인산화를 조금 증가시켰다. 대조적으로, K-5b는 1 시간 이내에 JNK1 및 JNK2의 인산화를 효율적으로 증가시켰고, 인산화 상태는 12 시간 처리까지 지속되었다. 이러한 발견은 K-5b가 헤스페레틴보다 JNK1 및 JNK2를 더욱 효율적으로 자극함을 증명한다.
< 실험예 6> 인실리코 도킹( In silico docking)
K-5b, 헤스페레틴, JNK1, 및 JNK2 간의 분자 결합 모드를 설명하기 위해, 인실리코 도킹(in silico docking) 실험을 수행하였다.
헤스페레틴의 3차원(3D) 구조를 PubChem 화합물 데이터베이스 (PubChem ID: CID72281)로부터 얻었다. 인텔 코어 2 Quad Q6600 (2.4 GHz) 리눅스 PC에 설치된 Sybyl 7.3 프로그램 (Tripos, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 아세틸헤스페레틴의 3D 구조 (PubChem ID: CID69636311)로부터 K-5b의 구조를 변형시켰다. 단백질 데이터 뱅크(Protein 데이터 Bank; PDB) 내에 축적된 30개의 JNK의 3D 구조 중에서, 2H96.pdb이 가장 많은 수의 잔기들(7-182 및 186-364)을 포함하기 때문에 선택되었다[Zhao H.,et al., J Med Chem;49:4455-4458 (2006)]. JNK2의 두 결정 구조가 3NPC.pdb 및 3E7O.pdb으로써 PDB에 축적되어 있다. 이중, 3NPC.pdb가 많은 수의 잔기들(9-13, 15-202, 205-249, 및 252-363) 때문에 인실리코 도킹을 위해 선택되었다[Kuglstatter A.,et al., Bioorg Med Chem Lett;20:5217-5220 (2010)]. 상기 인실리코 도킹을 위한 상세한 절차는 이전에 보고된 방법을 따라 수행하였다[Shin S.Y.,Bioorg Med Chem;21:4250-4258 (2013)].
JNK1의 3D 결정 구조인 2H96.pdb은 4개의 폴리펩티드 사슬(A, B, F, 및 G)로 구성된다. 사슬 F 및 G는 JNK1-상호작용 단백질 1이고, 사슬 A 및 B는 JNK1의 헤테로다이머(heterodimer)이다. 사슬 A 및 B 모두 JNK1의 단백질 키나아제 도메인을 포함한다. 인간 JNK1이 427개의 잔기로 구성되어 있기 때문에, 2H96.pdb의 범위는 85%이다. 사슬 A를 인실리코 도킹에 선택하였는데, 왜냐하면 사슬 A가 사슬 B보다 하나 더 많은 잔기를 포함하기 때문이다. 먼저, 2H96.pdb의 아포단백질(apo-2H96)을 Sybyl 프로그램에 의해 얻었다. 용액 구조를 얻기 위해, 상기 아포단백질을 에너지 최소화시켰다. 최소화된 구조와 결정 구조의 비교는 이들의 근평균평방편차(root mean square deviation)가 0.39 Å였음을 나타내었다. 플렉서블 도킹 (flexible docking) 진행을 30번 반복하여 30개의 단백질-리간드 복합체가 형성되었다.
기질-결합 사이트는 이전 보고서[Yanagisawa M.,et al., Mol Nutr Food Res;56:1783-1793 (2012)]에서 결정되었고, LigPlot 프로그램을 이용하여 분석되었다[Kramer B., et al., Proteins;37:228-241 (1999)]. 2H96.pdb는 이의 기질로서 5-시아노-N-(2,5-디메톡시벤질)-6-에톡시피리딘-2-카르복사미드(893으로 명명됨)를 포함하였다. 리간드를 도킹시킴으로써, 893이 apo-2H96 내에 있는 30개의 복합체를 얻었다. 이들의 결합에너지는 -13.55에서 -12.44 kcal/mol의 범위였다. 결합에너지 및 결합 형태를 기초로 하여, 두번째 복합체가 선택되었다. 이의 LigPlot 분석은 8개의 소수성 상호작용(Ile32, Leu110, Met111, Ala113, Asn114, Gln117, Ser155, 및 Val158) 및 1개의 수소 결합 (H-bond, Asp112)을 나타내었다(도 7).
마찬가지로, 헤스페레틴을 아포-2H96 내로 도킹함으로써 형성된 결합에너지가 -12.98 내지 -12.13 kcal/mol의 범위를 가지는 30개의 복합체 중, 첫번째 복합체가 가장 낮은 결합에너지 및 결합상태를 나타내었다. LigPlot 분석에 의해 10개의 소수성 상호작용 (Ile32, Gly33, Gly35, Gly38, Val40, Val58, Ile86, Glu109, Leu110, 및 Leu168) 및 1개의 H-결합(Met111)이 관찰되었다(도 8). 세 잔기 Ile32, Leu110, 및 Met111는 893-2H96 및 헤스페레틴-2H96 복합체 모두에서 발견되었다. 하지만, 헤스페레틴이 N-말단에 결합하는 반면, 리간드 893는 JNK1의 두번째 나선(helix)에 결합한다. K-5b에 대해서 동일한 도킹 진행이 수행되었고, 형성된 복합체의 결합에너지는 -9.98 내지 -5.98 kcal/mol의 범위였다. 헤스페레틴과 JNK1 간의 결합에너지가 K-5b과 JNK1 간의 결합에너지보다 낮으므로, 왜 K-5b가 헤스페레틴보다 JNK1를 더욱 효율적으로 자극하는 지의 이유는 결합에너지를 근거로 설명될 수 없다. 첫번째 K-5b-2H96 복합체의 LigPlot 분석은 9개의 소수성 상호작용 (Ile32, Lys55, Ile86, Met108, Leu110, Asp112, Ser155, Val158, 및 Leu168) 및 2개의 H-결합 (Val40 및 Met111)을 나타내었다(도 9). 헤스페레틴-2H96 및 K-5b-2H96 복합체 모두에서 6개 잔기는 공통적이었다. 헤스페레틴-2H96 복합체를 이웃하는 잔기의 수는 K-5b-2H96 복합체를 이웃하는 잔기의 수와 동일하다. 하지만, 전자는 하나의 H-결합을 형성하고, 후자는 2개의 H-결합을 형성한다. 헤스페레틴-2H96 복합체의 결합 사이트의 3D이미지를 PyMOL 프로그램 (PyMOL Molecular Graphics System, version 1.0r1, Schrodinger, LLC, Portland, OR, USA)을 이용하여 생성하고, K-5b-2H96 복합체와 비교하였다 (도 10 및 11). K-5b의 부티레이트 기는 Lys55 및 Ser155와 소수성 상호작용을 형성하나, 이는 헤스페레틴-2H96 복합체에서는 관찰되지 않았다. LigPlot 분석 및 PyMOL에 의해 생성된 3D 이미지로부터 얻은 결과는 왜 K-5b가 헤스페레틴보다 JNK1을 더 효율적으로 자극하는지 이유를 설명해줄 것이다.
JNK1과 유사하게, JNK2과 K-5b 또는 헤스페레틴 간의 분자 결합 모드가 인실리코 도킹을 이용하여 설명되었다. PDB에 축적된 JNK2의 두 결정 구조 중에서, 3NPC.pdb가 선택되었는데, 왜냐하면 이의 3D 구조가 3E7O.pdb보다 더 많은 잔기를 포함하기 때문이다. 3NPC는 동일한 수의 잔기를 포함하는 두 폴리펩티드 사슬(A 및 B)로 구성되고, 사슬 A가 인실리코 도킹에 선택되었다. 아포-3NPC의 최소화된 구조와 3NPC.pdb의 결정 구조의 비교는 이들의 근평균평방편차(root mean square deviation)가 0. 29 Å였음을 나타내었다. 3NPC.pdb는 1-(5-tert-부틸-2-p-톨릴-2h-피라졸-3-일)-3-[4-(2-모르폴린-4-일-에톡시)-나프탈렌-1-일]-우레아(BIRB796로 명명됨)를 포함한다. BIRB796, 헤스페레틴, 및 K-5b에 대하여 도킹 진행이 수행되었다. 이들의 결합에너지는 각각 -33.75 내지 -22.02, -18.43 내지 -6.18, 및 -11.31 내지 -4.72 kcal/mol의 범위였다. LigPlot을 이용하여 결합 사이트에 참여한 잔기들을 분석하였다. BIRB796-3NPC 복합체는 15개의 소수성 상호작용 (Glu37, Val40, Ala53, Lys55, Arg69, Arg72, Leu77, Ile85, Ile86, Met108, Glu109, Leu110, Leu142, Leu168, 및 Phe170) 및 3개의 H-결합 (Glu73, Met111, 및 Asp169)을 나타내었다 (도 12). 헤스페레틴-3NPC 복합체는 9개의 소수성 상호작용 (Glu73, Leu76, Leu77, Ile86, Met108, Ile147, Leu168, Phe170, 및 Leu172) 및 2개의 H-결합 (Lys55 및 Asp169)을 나타내었다 (도 13). K-5b-3NPC 복합체는 11개의 소수성 상호작용 (Val40, Ala53, Glu73, Leu76, Leu77, Val80, Ile86, Met108, Leu142, Leu168, 및 Leu172) 및 2개의 H-결합 (Lys55 및 Asp169)을 나타내었다 (도 14). 소수성 상호작용에 참여하는 Glu73, Leu76, Leu77, Ile86, Met108, Leu168, 및 Leu172를 포함하는 7개의 잔기 및 H-결합을 형성하는 2개의 잔기가 헤스페레틴-3NPC 및 K-5b-3NPC 복합체 모두에서 발견되었다. K-5b-3NPC 복합체에서 관찰된 더 많은 잔기들이 결합에너지를 낮추는 데에 기여할 것이다. PyMOL 프로그램을 이용하여 생성된 헤스페레틴-3NPC 복합체의 결합사이트의 3D 이미지를 K-5b-3NPC 복합체와 비교하였다 (도 15 및 16). K-5b의 부티레이트기가 Val40 및 Ala53과 소수성 상호작용을 형성하고, 이는 헤스페레틴-3NPC 복합체에는 관찰되지 않았다. K-5b-3NPC 복합체의 결합에너지가 헤스페레틴-3NPC 복합체에 비해 좋지는 않았으나, LigPlot 분석으로부터 얻은 결합 형태 및 PyMOL에 의해 생성된 3D 이미지는 K-5b가 헤스페레틴보다 효율적으로 JNK2를 자극하는지 이유로 설명될 것이다.
약제의 제조예
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<약제 제조예 1> 산제의 제조
화학식 1의 화합물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<약제 제조예 2> 정제의 제조
화학식 1의 화합물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<약제 제조예 3> 캡슐제의 제조
화학식 1의 화합물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<약제 제조예 4> 주사제의 제조
화학식 1의 화합물 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<약제 제조예 5> 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조
화학식 1의 화합물 1.0 g
아세트산나트륨 0.3 g
메틸파라벤 0.1 g
프로필파라벤 0.02 g
염화나트륨 적량
HCl 또는 NaOH pH 조정 적량
정제수 적량
통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 mL당 화학식 1의 화합물 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.
<약제 제조예 6> 액제의 제조
화학식 1의 화합물 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
건강기능식품의 제조예
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태의 건강기능식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강기능식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<건강기능식품 제조예 1> 건강기능식품의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<건강기능식품 제조예 2> 건강 기능 음료의 제조
화학식 1로 표시되는 화합물 100 mg
구연산 100 mg
올리고당 100 mg
매실농축액 2 mg
타우린 100 mg
정제수를 가하여 전체 500 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. (1) 헤스페레틴-3',7-디벤조에이트;
    (3) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메톡시벤조에이트);
    (4) 헤스페레틴-3',7-디-(2-페닐아세테이트);
    (5) 헤스페레틴-7-(부트-2-에노에이트);
    (6) 헤스페레틴-3',7-디부티레이트;
    (7) 헤스페레틴-7-부티레이트;
    (8) 헤스페레틴-7-피발레이트;
    (9) 헤스페레틴-3',7-디신나메이트;
    (10) 헤스페레틴-3',7-디-(2-메틸벤조에이트);
    (11) 헤스페레틴-7-(2-메틸벤조에이트); 및
    (12) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메틸벤조에이트);로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
    헤스페레틴을 용매에 용해시킨 용액에 트리에틸아민을 첨가하고, 추가로 R-C(=O)Cl 또는 R'-C(=O)Cl을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 생성하는 단계를 포함하는 제3항의 헤스페레틴 유도체의 제조방법.
    [반응식 1]
    Figure 112017129514183-pat00058

    (상기 반응식 1에서,
    상기 화학식 1의 화합물은,
    (1) 헤스페레틴-3',7-디벤조에이트;
    (3) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메톡시벤조에이트);
    (4) 헤스페레틴-3',7-디-(2-페닐아세테이트);
    (5) 헤스페레틴-7-(부트-2-에노에이트);
    (6) 헤스페레틴-3',7-디부티레이트;
    (7) 헤스페레틴-7-부티레이트;
    (8) 헤스페레틴-7-피발레이트;
    (9) 헤스페레틴-3',7-디신나메이트;
    (10) 헤스페레틴-3',7-디-(2-메틸벤조에이트);
    (11) 헤스페레틴-7-(2-메틸벤조에이트); 및
    (12) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메틸벤조에이트);로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다).
  5. 제4항에 있어서,
    상기 용매는 t-부탄올, 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, CH2Cl2, 헥산, 디메틸포름아미드(DMF), 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤 및 클로로벤젠으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 헤스페레틴 유도체의 제조방법.
  6. (1) 헤스페레틴-3',7-디벤조에이트;
    (3) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메톡시벤조에이트);
    (4) 헤스페레틴-3',7-디-(2-페닐아세테이트);
    (5) 헤스페레틴-7-(부트-2-에노에이트);
    (6) 헤스페레틴-3',7-디부티레이트;
    (7) 헤스페레틴-7-부티레이트;
    (8) 헤스페레틴-7-피발레이트;
    (9) 헤스페레틴-3',7-디신나메이트;
    (10) 헤스페레틴-3',7-디-(2-메틸벤조에이트);
    (11) 헤스페레틴-7-(2-메틸벤조에이트); 및
    (12) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메틸벤조에이트);로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피 투여제, 또는 좌제의 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. (1) 헤스페레틴-3',7-디벤조에이트;
    (3) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메톡시벤조에이트);
    (4) 헤스페레틴-3',7-디-(2-페닐아세테이트);
    (5) 헤스페레틴-7-(부트-2-에노에이트);
    (6) 헤스페레틴-3',7-디부티레이트;
    (7) 헤스페레틴-7-부티레이트;
    (8) 헤스페레틴-7-피발레이트;
    (9) 헤스페레틴-3',7-디신나메이트;
    (10) 헤스페레틴-3',7-디-(2-메틸벤조에이트);
    (11) 헤스페레틴-7-(2-메틸벤조에이트); 및
    (12) 헤스페레틴-3',7-디-(4-메틸벤조에이트);로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 헤스페레틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대장암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2012. Vol. 22, pp. 7194-7197*
International Journal of Pharmacy and Pharmacetucal Sciences. 2015. Vol. 7, Issue 2, pp. 485-488*

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