KR101828631B1 - 라파마이신 및 미코페놀산을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있고 아토피 발병 원인이 되는 인자들의 발현 및 활성을 억제하는 효과가 있어 아토피의 증상을 효과적으로 개선 및 치료할 수 있으므로 아토피 질환의 새로운 치료제로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

라파마이신 및 미코페놀산을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물{Composition for Preventing and Treating Atopic Dermatitis Comprising Rapamycin and Mycophenolic acid}

본 발명은 아토피 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 개선된 치료제로서 라파마이신 및 미코페놀산을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피는 선진국은 물론 우리나라에서도 급속히 발병률이 증가하고 있는 질병의 하나가 되었는데, 선진국에서는 인구의 약 20%가 아토피 증상을 겪는 것으로 보고된 바 있다.

이러한 아토피의 원인은 아직까지 명확히 규명되어 있지 않지만, 통상 아토피 피부염을 앓고 있는 사람이 집 먼지, 진드기, 동물의 털, 음식물, 꽃가루 또는 곰팡이 등과 같이 외부환경의 이물질에 대해 알러지 반응을 나타내는 점과 또한 아토피 피부염이 알러지성 비염, 천식, 결막염, 장관염 등을 동반한다는 점에서 면역 체계의 교란에 의하여 발생하는 것으로 추정되고 있다.

현재 사용하고 있는 아토피 치료약 중 스테로이드계 약품은 소염 효과 및 면역 억제 효과가 우수하지만, 장기간 사용하면 바른 부위의 피부에서 피부가 위축되며, 피부 색소가 적어지고 피부가 얇아지는 등 부작용을 일으키는 문제점이 발생하고 있으며, 따라서 최근에는 기존 화학 약품의 부작용을 최소화하기 위하여, 아토피 피부염에 효과가 있는 천연 추출물을 찾고자 하는 노력이 시도되고 있다.

이러한 예로, 아토피 피부염의 개선에 고삼, 백급, 지모 및 소엽맥문동의 혼합추출물을 개시하고 있는 대한민국 특허 제0513659호, 덩굴차 추출물을 개시하고 있는 대한민국 특허 제0584039호, 하수오 추출물을 개시하고 있는 대한민국 특허 제0511494호 등을 들 수 있다.

그러나 개발 중에 있는 천연 추출물을 이용한 아토피 치료제들의 경우, 치료 효능이 미미한 문제점들이 발생되고 있어 보다 개선된 치료 효능을 갖는 새로운 아토피 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 면역억제제로 알려져 있는 라파마이신(rapamycin) 및 미코페놀산(mycophenolic acid)을 함유한 복합제가 아토피 치료 효과가 우수함을 규명하였고, 이들 2가지 성분의 최적 배합비를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 10-1070805

따라서 본 발명의 목적은 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 외용제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)은 8:2의 농도비로 혼합되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 도포용일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 ICAM-1, iNOS, IL-1beta, IL-6 및 IL-8의 발현을 억제 또는 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 외용제를 제공한다.

본 발명에 따른 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 세포에 독성을 유발시키지 않아 안정성이 있고 아토피 발병 원인이 되는 인자들의 발현 및 활성을 억제하는 효과가 있어 아토피의 증상을 효과적으로 개선 및 치료할 수 있으므로 아토피 질환의 새로운 치료제로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 TNCB(trinitrochlorobenzene)를 마우스에 처리하여 아토피가 유발된 마우스 모델을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 OVA(ovalbumin)을 마우스에 처리하여 아토피가 유발된 마우스 모델을 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 TNCB(trinitrochlorobenzene)로 아토피가 유발된 마우스를 대상으로 라파마이신, 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 복합제 및 아토피 치료제인 프로토픽을 각각 처리하여 아토피의 증상 개선 정도를 육안으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 TNCB(trinitrochlorobenzene)로 아토피가 유발된 마우스를 대상으로 라파마이신, 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 복합제 및 아토피 치료제인 프로토픽을 각각 처리한 후, 피부 손상의 변화 정도를 그래프와 막대그래프로 각각 나타낸 것으로, 염증 유도가 최고치에 다다르는 15일째에서 약제를 도포 2주 후 (29일째) skin severity score의 감소정도(계산식 : (29d-15d)/15d) 를 Vehicle 그룹 기준으로 relative fold increase로 나타낸 것이다.
도 5는 HaCaT 세포에 라파마이신, 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 복합체를 각 농도별로 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포 독성 정도를 분석한 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은 HaCaT 세포를 대상으로 라파마이신, 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 복합체 처리에 따른 TNF-alpha에 의한 염증 단백질인 ICAM-1 및 iNOS의 발현 억제 정도를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HaCaT 세포를 대상으로 라파마이신, 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 복합체 처리에 따른 TNF-alpha에 의한 염증성 사이토카인의 생성 억제 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 아토피 치료를 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제로서 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 복합제 치료제를 제공함에 그 특징이 있다.

앞서 종래기술에서도 언급한 바와 같이, 아토피는 심한 가려움증을 가지는 재발성 만성피부염으로, 어린이의 약 10 ~ 15%가 아토피성 피부염을 가지고 있으며, 90%는 5년 내 저절로 호전되는 것으로 보고되어 있다. 이러한 아토피는 성인기에는 대체로 호전되어 약 30 ~ 40%는 외관상으로 피부염이 재발되지 않으나, 나머지는 성인이 되어서도 피부 건조, 자극성 물질에 의한 피부자극, 주부습진 등의 피부염으로 어려움을 겪는 것으로 알려져 있다. 또한, 민감성 피부의 경우, 수분 보유력 및 그 회복력이 낮고, 피부 각질화, 가려움증 등이 나타나기 쉽기 때문에 아토피성 피부로 될 확률이 높다.

아토피 피부염의 정확한 병리 생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않지만 유전적 소인과 함께 면역학적, 비면역학적 기전이 관여한다고 보고 있다. 아토피 피부염의 대부분을 차지하는 외인성 아토피 피부염은 IgE와 연관된 면역 기전에 의해 발생되는데 특정 알레르겐(allergen)에 대한 즉시형 면역 반응보다는 T세포 이상에 의한 지연성 면역 반응이 관여한다는 보고들이 많다.

또한, 요즘은 B세포로 부터 IgE의 생성을 유도하는 IL-4 등 Th2 관련 사이토카인(cytokine)들이 아토피의 원인이라고 보고되고 있다(JS Kang et al., Ihhibition of atopic dermatitis by topical application of silymarin in NC/Nga mice. intl immunopharm. (2008) 8. 1475-1480).

아토피 치료를 위해 종래에는 세라마이드, 리놀레산, 식물유 또는 광물성 오일 등의 성분들, 하이드로코티손(hydrocortisone) 등의 스테로이드(steroid) 제제 또는 이들에 항균 및 항염 기능을 강화한 물질, 자외선 요법을 통한 DNA 합성 억제제, 세포 과증식 억제제, 염증 및 가려움증 억제제 등이 제안된 바 있으나, 스테로이드 제제는 표피의 성장억제나 부작용 등의 역효과를 유발할 수 있으며, 우레아 퍼록사이드 등은 피부의 과다 자극을 야기할 수 있고, 항히스타민제 등의 항생물질은 균의 내성(resistance) 및 광과민 등의 부작용을 유발할 가능성이 높은 문제점이 있다. 또한, 장기간 피부에 적용시 모세 혈관 확장증 및/또는 각질층의 두께 증가 내지 확장을 유발하는 등의 심각한 부작용을 발생시킬 염려가 있으며, 최근 아토피 완화에 많이 쓰이는 감마-리놀레산(한국특허공개 2000-0046633호)은 쉽게 산화되므로 안정성이 열등함과 아울러, 피부 자극성이 비교적 강하여 민감한 피부에는 사용하기 곤란한 등의 문제점이 있다.

이에 본 발명에서는 세포에 독성을 유발시키지 않으면서 아토피 치료 효과가 우수한 새로운 치료제를 개발하던 중, 라파마이신 및 미코페놀산을 주요성분으로 하는 복합제를 아토피 피부에 국소 도포할 경우, 효과적으로 아토피 증상이 개선 및 치료됨을 확인하였다.

따라서 본 발명에서는 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유된 유효성분인 상기 라파마이신은 칠레 이스터 섬의 토양 세균에서 추출한 물질로 1970년대에 항진균제로 처음 알려졌으며 이후 1999년에 강력한 면역억제제로 미국 FDA 승인을 받았다. 주로 장기 이식을 받은 환자들의 면역반응을 억제하기 위해 사용되었으나 악성 종양의 억제, 노화방지, 관상동맥 협착방지 등의 부가적인 효과들에 대해서 보고된 바 있다. 이외에도 최근에는 라파마이신이 항암제로서의 사용 가능성도 제기되고 있다.

또한, 본 발명의 유효성분인 미코페놀산은 1896년에 처음 단리되었고, 15년 전부터 항종양, 항바이러스 및 항암 활성을 갖는 것으로 보고된 바 있다.

본 발명자들은 아토피 치료제의 주요 성분으로 라파마이신와 미코페놀산을 선정하였는데, 이들 성분은 현재 아토피피부염 국소도포제로 사용되고 있는 프로토픽 (Tacrolimus계)와 엘리델 (pimecrolimus계)과 유사하게 T 세포 활성화를 억제하며, 비교적 안전하게 사용될 수 있는 약제로 고려되어 선정하였으며, 또한 두 가지 약제의 복합제를 국소치료제로 개발함으로써 두 약제의 효능을 더욱 증가시키고, 부작용은 최소화시킬 목적으로 선정하였다.

한편, 본 발명에서는 이러한 다양한 약리 효능을 갖는 라파마이신과 미코페놀산을 이용하여 아토피 피부염 치료제로서의 사용 가능성을 구체적인 실험을 통해 입증하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 아토피를 유발시킨 마우스 모델을 대상으로 아토피 발병 피부 부위에 라파마이신과 미코페놀산의 복합제를 피부에 도포하였더니, 아토피 피부 증상이 우수하게 개선되는 것을 확인할 수 있었고, 피부의 부푼 정도도 개선되는 것으로 나타났다.

뿐만 아니라 본 발명에서는 이 2가지 성분을 이용한 최적을 치료 효과를 도출할 수 있는 최적 배합비도 규명하였는데, 라파마이신과 미코페놀산을 8:2의 농도비로 혼합한 복합제(혼합물)이 다른 배합비로 혼합한 복합제에 비해 그 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 아토피 유발 마우스 모델을 대상으로, 라파마이신과 미코페놀산을 2:8, 5:5 및 8:2의 농도비로 혼합한 복합제를 각각 사용한 결과, 8:2의 농도비로 혼합한 군이 가장 뛰어난 치료 효과가 있는 것으로 나타났으며, 이 외에도 라파마이신과 미코페놀산을 9:1의 농도비로 혼합한 복합제에서는 8:2의 복합제에 비해 치료 효능이 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명에서는 라파마이신과 미코페놀산을 8:2의 농도비로 혼합하여 약제를 제조할 경우, 가장 효과적으로 아토피 피부염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물이 아토피를 치료하는 기작에 있어서 염증성 인자들의 발현 및 활성 억제를 통해 이루어 진다는 사실을 확인하였는데, 특히 ICAM-1, iNOS, IL-1beta, IL-6 및 IL-8의 발현을 억제 또는 감소시키는 활성을 통해 아토피 증상을 개선 및 치료함을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서 제공하는 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 포함하고 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 아토피 피부염의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말하며, 상기 조성물에 대해 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid) 5 μM ~ 100 μM 의 농도 또는 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 70 중량%로 함유될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 유효성분들의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 10mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 아토피 피부염 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 '약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있고 바람직하게는 피부에 도포할 수 있는 피부 외용제 형태로 제형화 할 수 있다..

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 피부에 도포하는 국소 도포 방법을 통해 투여할 수 있다. 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 아토피 피부염의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 물질들과 병행하여 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 준비예 >

동물모델의 준비

하기 실시예의 실험에서 사용한 마우스로는 4주령의 암컷 NC/Nga 마우스를 일본 SLC(Shizuoka, Japan) 사로부터 구입하여 사용하였고, OVA로 아토피가 유발된 마우스 모델을 제조하기 위한 마우스로는 오리엔트사(Sungnam, Korea)로부터 6주령의 암컷 BALB/c 마우스를 구입하여 사용하였다. 이들 마우스들은 반-SPF 조건인 24±1℃의 온도 및 50±10%의 습도 조건 하에서 12시간씩의 명암 주기로 사육하였다. 사료와 물은 리비툼으로 제공하였고, 상기 마우스들의 취급, 보완 및 실험을 위한 방법은 가톨릭대학교의 동물실험 관리 위원회의 규정에 의거하여 수행하였다.

시약 준비

하기 실시예에서 사용한 시약은 다음과 같다. 라파마이신, 미코페놀산 및 비히클(vehicle)은 모두 익수(한국) 사로부터 구입한 것을 사용하였고, 이외의 모든 시약은 시그마 알드리치(St. Louis, MO)로부터 구입한 것을 사용하였다.

라파마이신 및 미코페놀산 용액은 에탄올에 용해시킨 용액으로 사용하였으며, 라파마이신은 0.04~4%(w/v)의 농도가 되도록 에탄올에 용해시켜 사용하였고, 미코페놀산은 0.2~1%(w/v)의 농도가 되도록 에탄올에 용해시켜 사용하였으며, 라파마이신과 미코페놀산의 혼합용액은 라파마이신 대 미코페놀산의 농도 비가 각각 2:8(20nM: 80nM), 5:5(50nM:50nM) 및 8:2(80nM:20nM)의 비로 혼합된 용액을 제조하여 사용하였다.

또한, 비히클로는 글리세린(5%), 잔탄검(0.1%), 1,3-부틸렌 글리콜(6%), 카모버(carbomer 0.3%), 비스왁스(beeswax 2%), 세탄올(cetanol 2%), 화이트 테트롤라툼(white petrolatum 1.5%), 레시틴(lecithin 0.5%), 아라셀 165 (arlacel 165 2%), 트윈 60(0.2%), 아라셀 60 (arlacel 0.2%), 리퀴드 파라핀(6%), 디메티콘(1%), 트리에탄올라민 0.3%, 보존제 0.3% 및 잔량의 물로 구성되어 있다.

< 실시예 1>

아토피 유발 마우스 동물모델 제조

<1-1> TNCB 로 아토피 유발 마우스 모델 제조 및 본 발명의 약물 복합제 처리

상기 준비예에서, 4주령의 암컷 NC/Nga 마우스를 대상으로 트리니트로클로로벤젠을 이용하여 아토피가 유발된 마우스를 제조하였다. 보다 구체적으로 상기 마우스의 복부와 귀 부분에 에탄올/아세톤이 4:1의 부피비로 혼합된 용매에 5%로 TNCB를 첨가하여 용해시킨 용액 150ul를 피부 도포하여 자극을 유발시켰다. 일주일 후, 상기 마우스의 귀 바깥 부분을 아세톤/올리브오일이 4:1의 부피비로 혼합된 용매에 1%로 TNCB를 첨가하여 용해시킨 용액으로 이틀에 한번씩 2주 동안 도포하였고 이 과정을 2회 수행하여 아토피가 유발된 마우스를 제조하였다. 참고로 TNCB를 이용하여 아토피 마우스 모델을 제조하는 과정에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다.

이후 아토피 증상이 유발된 마우스의 귀 피부에 0.04~4%(w/v) 농도의 라파마이신, 0.2~1%(w/v) 농도의 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 농도가 각각 2;8, 5:5 및 8:2로 혼합된 각 혼합액, 비히클 및 0.03% 농도의 프로토픽(종래 아토피 치료제)를 하루에 한 번씩, 일주일에 총 5회씩 2주간 도포한 후, 아토피의 개선 정도를 관찰하였다.

<1-2> OVA 로 아토피 유발 마우스 모델 제조 및 본 발명의 약물 복합제 처리

<1-1>의 방법과는 달리 오브알부민(OVA)로 마우스를 자극시켜 아토피가 유발된 마우스를 제조하였는데, 이를 위해 오리엔트사(Sungnam, Korea)로부터 구입한 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강내로 20ug 의 OVA 및 2.25mg의 aluminum hydroxide를 1주일에 한 번씩 3주 동안 주입하였고, 3주 후 마우스의 등부위를 전기면도기를 이용하여 털을 제거한 다음, 피부층에 0.1% 농도의 OVA 100ul를 1주일에 3번 3주 동안 주입하여 아토피가 유발된 마우스 모델을 제조하였다. 이후 0.04~4%(w/v) 농도의 라파마이신, 0.2~1%(w/v) 농도의 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 농도가 각각 2;8, 5:5 및 8:2로 혼합된 각 혼합액, 비히클 및 0.03% 농도의 프로토픽(종래 아토피 치료제)를 마우스의 등 부위에 발생된 아토피 유발 부위에 도포한 후, 아토피의 개선 정도를 관찰하였다. 참고로 OVA를 이용하여 아토피 마우스 모델을 제조하는 과정에 대한 모식도를 도 2에 나타내었다.

< 실시예 2>

라파마이신 및 미코페놀산 복합제의 아토피 치료 효과 분석

상기 실시예 1에서 TNCB를 이용하여 아토피가 유발된 마우스 모델을 대상으로 본 발명의 라파마이신 및 미코페놀산 복합제를 피부에 국소도포하였을 경우, 아토피를 치료할 수 있는 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 먼저 각 실험군에 대해 마우스의 피부 손상 정도를 육안으로 관찰하였고 관찰 결과를 도 3에 나타내었고 그 정도를 정량화 하여 도 4에 그래프로 나타내었다.

본 실험에서 피부 손상 척도는 다음과 같은 기준으로 측정하였고 각각의 증상 정도에 따라 0점(증상없음), 1점(가벼운 정도)우, 2점(중간 정도), 3점(심각함)으로 측정하였다.

-홍반(출혈)

-부종(부푼정도)

-찰과(짓무름)

-건조

분석 결과, 도 3와 도 4에 나타낸 바와 같이, 아토피 유발에 의한 피부 손상 정도를 라파마이신 및 미코페놀산을 8:2의 농도비로 혼합한 경우, 가장 효과적인 치료 효과가 나타나는 것으로 관찰되었는데, 특히 도 3의 그래프 결과를 보면, 라파마이신 및 미코페놀산을 각각 처리한 경우, 이들의 성분을 2:8 및 5:5의 농도비로 혼합한 경우에 비해 8:2의 농도비로 혼합한 경우가 가장 우수한 치료 효능을 보이는 것으로 나타났고, 8:2의 농도비로 혼합한 복합제의 효능은 종래 아토피 치료제로 사용되고 있는 프로토픽(protopic)을 처리한 경우에 비해 더 우수한 효과가 있는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 라파마이신 및 미코페놀산을 8:2의 농도비로 혼합한 복합제를 아토피 치료를 위한 피부 도포용 국소 치료제로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

라파마이신 및 미코페놀산의 세포 독성 정도 분석

라파마이신 및 미코페놀산이 세포에 독성 정도가 있는지 확인하기 위해 HaCaT 세포를 대상으로 각 농도별로 이들 성분을 단독 및 복합 처리하고 MTT 분석을 통해 세포 생존율을 분석하였다. 각 성분을 농도별로 10, 100, 1000 및 5000nM의 농도로 처리한 경우와 하기 표 1에 기재된 바와 같이 이들 성분을 각각 다른 농도비로 조합하여 처리한 경우에 대해 세포 생존율을 분석하였다. 라파마이신 및 미코페놀산을 세포에 각각 또는 조합하여 처리한 후 24시간 후에 MTT 분석을 수행하였고 이러한 실험은 3번 반복수행하였으며 mean ±. S.D로 계산한 값을 그래프로 나타내었다.

분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 라파마이신 및 미코페놀산은 각각 세포에 처리한 군의 경우, 1000nM의 농도까지는 세포사멸이 거의 일어나지 않는 것으로 나타났고, 5000nM의 농도로 처리한 군에 대해서는 라파마이신 처리 시 세포 생존율이 약 70%인 것으로 나타났고, 미코페놀산은 90%인 것으로 나타났다. 또한, 이들 성분을 각각 다른 농도의 조합비로 조합한 경우 9개의 조합군 모두에 대해 거의 세포독성이 유발되지 않는다는 것을 알 수 있었다.

특히 상기 실시예에서 확인된 아토피 치료를 위한 최적 조합비인 라파마이신 대 미코페놀산의 8:2 조합군(상기 표 1에서 10번 군) 역시 거의 모든 세포가 다 생존하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 농도로 조합된 복합제는 세포에 독성을 유발시키지 않아 치료제로서 안정하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4>

라파마이신 및 미코페놀산 복합제의 염증성 인자 발현 억제효과 분석

<4-1> ICAM-1 및 iNOS 발현 억제 효과

본 발명자들은 라파마이신 및 미코페놀산의 복합체가 아토피를 치료하는데 있어서 구체적인 치료 기작으로 염증성 단백질 및 염증 인자의 발현을 억제하는 활성이 있는지를 조사하기 위해, 염증단백질로 알려진 ICAM-1 및 염증반응에 관여하는 iNOS의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하여 확인하였다.

즉, HaCaT 세포를 TNF-alpha로 자극하기 이전에 100nM의 라파마이신, 100nM의 미코페놀산, 라파마이신과 미코페놀산의 각 농도별 조합에 따른 복합제(20:80, 50:50, 80:20nM)를 상기 세포에 전처리한 후, 20ng/ml의 TNF-alpha를 각 세포에 처리한 다음, 각 세포의 세포 용해물을 수득하여 RT-PCR과 웨스턴 블럿을 수행하였다.

RT-PCR은 각 세포군의 세포들을 긁어 모은 후, 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 총 RNA를 수득하였다. 수득한RNA를 주형으로 하고 gDNA Eraser을 이용한 PrimeScriptTM RT 시약 키트(TaKaRa BIO, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하여 cDNA를 수득하였다. 이후 수득한 cDNA를 주형으로 ICAM-1, iNOS 및 GAPDH를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였고 사용한 프라이머 서열은 하기에 기재하였다. 이때 PCR 조건은 95℃의 온도에서 10초간 열변성 시킨 후, 58~60℃에서 30초간 어닐링/연장반응을 45회 반복수행하여 PCR 산물을 수득하였고 이를 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 발현 정도를 분석하였다.

-사용한 프라이머 서열-

ICAM-1

(forward) GGT GAC GCT GAA TGG GGT TCC

(reverse) GTC CTC ATG GTG GGG CTA TGA CTC

iNOS

(forward) TCC AAC CTG CAG GTC TTC GAT GC

(reverse) GGA CCA GCC AAA TCC AGT CTG C

GAPDH

(forward) CAT GGG GAA GGT GAA GGT C

(reverse) TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA

웨스턴 블럿은 ICAM-1 (Cell signaling technology사), iNOS (BD bioscience사) 및 GAPDH (Santa cruz 사)을 검출할 수 있는 항체를 사용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 수행하였다.

분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, HaCaT 세포를 TNF-alpha로 자극하였을 때, 라파마이신과 미코페놀산을 전처리 하지 않은 군의 경우, 염증 인자인 ICAM-1 및 iNOS의 발현은 TNF-alpha로 세포를 자극시키지 않은 군에 비해 증가되는 것으로 나타났다. 반면 라파마이신과 미코페놀산을 전 처리한 군의 경우, TNF-alpha에 의한 ICAM-1 및 iNOS의 발현증가가 억제되는 것으로 나타났으며, 특히 라파마이신과 미코페놀산을 80:20nM의 농도비로 혼합한 군의 경우 가장 효과적으로 발현이 억제되는 것으로 나타났다.

<4-2> 염증성 사이토카인의 발현 억제 효과

본 발명자들은 염증성 단백질인 ICAM-1 및 iNOS 이외에도 염증성 사이토카인인 IL-1beta, IL-6 및 IL-8의 발현도 억제시킬 수 있는지 확인하기 위해, 상기 <4-1>의 실험에 사용된 동일 세포군을 대상으로 IL-1beta, IL-6 및 IL-8을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 <4-1>의 실험방법과 동일하게 RT-PCR을 수행하였다.

분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 라파마이신과 미코페놀산을 전처리 하지 않은 군의 경우, 염증성 사이토카인인 IL-1beta, IL-6 및 IL-8의 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 반면, 라파마이신과 미코페놀산을 전 처리한 군의 경우, 발현증가가 억제되는 것으로 나타났으며, 라파마이신과 미코페놀산을 80:20nM의 농도비로 혼합한 군이 가장 효과적으로 발현이 억제되는 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

1. 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 8:2의 몰비로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 피부 도포용인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 ICAM-1, iNOS, IL-1beta, IL-6 및 IL-8의 발현을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 라파마이신(Rapamycin)과 미코페놀산(Mycophenolic acid)을 8:2의 몰비로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 외용제.

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