KR101822961B1 - 소독된 사람 세포 현탁액의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소독된 단세포 제조물을 포유동물 조직으로부터 제조하는 방법 및 그에 따라 제조된 제조물에 관한 것이다.

Description

소독된 사람 세포 현탁액의 제조방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF DISINFECTED HUMAN CELL SUSPENSIONS}
본 발명은 소독된 단세포 제조물의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 제조물에 관한 것이다.
간 이식은 급성 또는 만성 간부전에 있어서 가장 중요한 생명 구제방법이다. 공여체의 장기만으로 커버할 수 없는 이식 물질의 필요성을 만족하기 위해 완전한 장기이식 이외의 방법, 예를 들어 부분적 간 이식 또는 간 세포 제조물의 이식이 최근에 개발되었다.
단세포 제조물이 특히 주목되고 있는데, 왜냐하면 이들은 장기이식에 부적합한 공여체 장기로부터 얻어질 수 있기 때문이다. 간 조직으로부터 간 세포를 얻기 위해서는 콜라게나제를 함유하는 완충액 하나와 EDTA를 함유하는 완충액 하나를 사용하는 2단계 관류방법이 알려져 있다(Berry and Friend, 1969, The Journal of Cell Biology, Vol. 43, 506-520 페이지). 이 방법에서 각각의 세포들은 콜라게나제를 함유하는 완충액으로 간 조직을 관류하여 조직 컴플렉스로부터 효소적으로 유리된다.
얻어진 단세포 제조물은 의약이므로 각각의 경우에서 미생물 살균성이 보장되어야 한다. 그러나, 약 70 내지 80%의 제조물에서는 그렇지 못하며, 오염이 일반적으로 장기 수송 배지에 이미 존재하기 때문으로, 이것은 일반적으로 공여체의 장기 물질 또는 조직 물질에서 기인한다. 그러나, 사람 공여체 장기만큼 가치있는 제품으로 미생물로 오염되지 않은 이식가능한 조직 또는 세포 제조물의 대량 수율을 얻는 것이 바람직하다. 가열, 오토클레이브(autoclave) 또는 조사(irradiation) 같은 통상적인 오염 제거방법은 세포의 생존성을 유지할 수 없게 만들며, 따라서 조직을 소독하는데 사용할 수 없다.
마찬가지로, 항생제를 사용하여 조직의 오염을 제거하는 방법도 이미 알려져 있다. 이것은, 예를 들어 각막 이식물 보관(US 4,695,536) 또는 심장판막 이식물의 오염제거(WO 92/12632 및 EP 0　889　690)를 위해 개발되었다. 이 방법에서 사용된 항생제 조성물에 대한 노출 시간은 24시간 내지 수 주 동안 보관까지의 범위이다. 그러나, 24시간의 노출 시간조차도 간처럼 고도로 민감한 조직에 적합하지 않을 수 있다. 또한, 이 방법에서는 단지 표면만 오염제거된다. 조직과 세포에 대한 항생제를 포함하는 오염제거 방법의 또다른 요건은 사용된 방법과 제제들이 간 세포의 수득 또는 그의 세포 품질과 생존성에 부정적 영향을 주지 않고, 품질 조절에 사용된 살균성 검증 시스템에 적합하여야 한다.
그러므로, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 문제는 상기한 단점을 극복한 조직의 온화하고 효과적인 오염제거, 즉 소독을 위한 방법, 특히 조직의 보다 효과적이고 더욱 신속한 소독을 특별히 온화한 조건 하에서 보장하며, 특히 여기에 함유된 조직 또는 세포가 고도로 민감한, 즉 예를 들어 간에서 유래하는 경우에도 조직 또는 세포의 생존성을 동시에 유지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 문제는 독립항에 따른 교시로 해결된다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 따라서 다음 단계들을 포함하는 소독된 제조물, 특히 포유동물 조직, 특히 사람 조직에서 유래한 단세포 제조물의 제조방법에 관한 것이다: a) 포유동물 조직을 액상 항생제 조성물로 관류하고, b) 조직의 효소처리를 수행하여 특별히 단세포 현탁액을 얻고, c) 소독된 제조물, 특히 단세포 제조물, 즉 세포가 더이상 조직 컴플렉스에 존재하는 것이 아니라 개별적인 세포 또는 임의로 세포 클러스터 또는 더작은 세포 응집물로서 서로에게서 단리된 제조물을 얻는다. 따라서, 본 발명은 소독된 제조물, 특히 단세포 제조물, 바람직하게 단세포 현탁액을 조직, 즉, 예를 들어 포유동물, 특히 사람의 세포 컴플렉스 또는 장기로부터 생체외 공정으로 제조할 수 있는 방법을 유리하게 제공한다. 본 발명에 따르면, 정밀한 살균성 시험에 특히 적합한 세포 제조물을 유리하게 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 얻어진 제조물의 살균성과 관련한 고도의 정밀성을 제공하는 살균성 시험을 할 수 있다.
본 발명은, 예를 들어 살아있거나 죽은 포유동물, 특히 사망 직후의 포유동물에서 유래할 수 있는 제공된 포유동물 조직으로 진행한다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 포유동물은 사람 또는 동물, 예를 들어 가축 또는 실험 동물, 특히 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 양, 염소, 원숭이, 영장류, 조류 또는 설치류를 의미한다.
공여체 포유동물에서 취하여 본 발명의 방법으로 제공된 조직, 특히 세포 컴플렉스 또는 장기를 본 발명의 출발물질로 사용한다. 본 발명은 이렇게 제공된 조직을 항생제 조성물과 접촉시키고, 바람직하게 조직, 특히 장기에 내재된 혈관계를 사용하여 관류하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 항생제 조성물을 사용한 조직의 관류 동안 또는 그 이후에 조직을 효소 처리하고, 이 과정에서 조직 컴플렉스를 해체하여 단세포 현탁액을 얻는 것을 제공한다. 이 방법에서, 항생제 조성물은 특별히 효과적인 방법으로 그에 따라 항생물적으로 처리될 수 있고, 이렇게 소독된 단세포를 함유한다.
본 발명과 관련하여, 단세포 제조물 또는 단세포 현탁액은, 특히 세포가 개별적으로 존재하고 서로 영구적인 물리적 접촉이 없는 제조물 또는 현탁액을 의미한다. 다른 구체예에서, 단세포 제조물 또는 단세포 현탁액은 또한 존재하는 세포 대부분, 특히 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과 세포가 서로 분리되어 있고 서로 영구적인 물리적 접촉이 없으며, 100%로 합산한 세포의 나머지가 세포 클러스터, 크거나 작은 세포 응집물, 및 완전히 해체되지 않은 조직 컴플렉스의 잔류물 형태로 존재하는 것을 의미한다.
본 발명과 관련하여, 관류란, 특히 조직 관류, 다시 말해서 중공(hollow) 장기 또는 혈관, 특히 조직에 함유된 혈관을 통과하는, 액체, 즉 본 항생제 조성물의 유동을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 관류는 인큐베이션의 특히 바람직한 타입이다.
본 발명과 관련하여, 조직은 세포의 응집 컴플렉스, 특히 동일한 기능 및/또는 형태학을 가지는 것, 특히 또한 장기, 예를 들어 간, 장기 일부, 조직 컴플렉스 또는 (특히 간에서 유래한)섹션 물질, 특히 간 섹션 물질을 의미한다. 본 발명에 따르면, 사용된 조직은 간 조직, 예를 들어 전체 간 또는 그의 일부, 예를 들어 간 섹션 물질이다. 본 발명에 따라 제조된 단세포 현탁액은 바람직하게 간 세포 현탁액이다.
특히 바람직한 일 구체예에서, 공정 단계 a)를 공정 단계 b)와 함께, 즉 동시에 또는 일시적으로 오버래핑(overlapping)하는 방법으로 수행하는 것을 제공하며, 즉 관류가 항생제 조성물, 즉 바람직하게 적어도 하나의 관류 완충액에 함유된 항생제 조성물을 사용하여 수행되며, 여기에서 동시에 적어도 하나의 관류 완충액이 조직의 효소 처리를 위한 적어도 하나의 효소를 함유하여 단세포 현탁액을 얻는다. 그러나, 바람직하게 적어도 하나의 관류 완충액에 함유된 효소가 없는 항생제 조성물을 사용하여 먼저 관류를 수행한 다음, 단계 b)에 따라 무항생제 효소 처리를 수행하는 것이 또한 바람직하며, 여기에서 조직 컴플렉스가 해체되고 단계 a)에서 사용된 조직의 단세포를 수득하여 완전히 소독된 단세포가 공정 단계 c)에서 얻어진다.
본 발명에 따르면, 또한 사용된 조직의 표면을 본 발명에 따른 관류 전에 항생제 조성물, 바람직하게 본 발명에 따라 사용된 항생제 조성물로 세정하는, 특히 상기 조직을 관류하지 않고, 즉 표면의 기본적 오염제거를 수행하는 것을 임의의 공정 단계로 제공할 수 있다. 이를 위한 인큐베이션 시간은 바람직하게 단지 5 내지 60분, 바람직하게 5 내지 45분, 특히 바람직하게 5 내지 30분이다. 이처럼 짧은 인큐베이션 시간으로 관류에서 보다 더 높은 항생제 농도가 임의로 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 표면의 세정은 또한 단계 a) 및/또는 b) 동안에도 수행될 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는, 단세포 현탁액을 얻기 위한 조직의 효소 처리는, 바람직하게 수용액, 특히 완충액, 특히 바람직한 구체예에서는 액상 항생제 조성물 중에 있는 적어도 하나 또는 바람직하게 적어도 두 개의 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 효소 처리에 사용된 효소는 조직 컴플렉스를 해체하고, 특히 세포/세포 접촉물과 세포/세포외 매트릭스 접촉물을 용해할 수 있으며, 세포를 손상하거나 파괴하지 않으면서 단세포 현탁액을 이들에서 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 구체예에서, 특히 적합한 효소는 콜라게나제, 프로테이나제(proteinase) 및 이들의 혼합물이다. 본 발명과 관련하여, 프로테이나제는 또한 프로테아제 (protease)를 의미한다.
바람직하게, 콜라게나제와 프로테아제, 특히 중성 프로테아제의 혼합물은 효소 활성비로 1 유니트의 콜라게나제 대 40 내지 60, 바람직하게 50 유니트의 프로테아제이다.
그러므로, 각 관류에 있어서는 바람직하게 약 2000 내지 4000 Wuensch 유니트의 콜라게나제와 함께 100,000 카제인 유니트 또는 400 내지 2500 클로스트리디오펩티다제(clostridiopeptidase) I 유니트가 사용된다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 일 구체예에서, 조직은 따라서 바람직하게 적어도 하나의 관류 완충액에 함유되고 조직을 단세포로 해체하는 적어도 하나의 효소, 특히 a) 적어도 하나의 콜라게나제, 또는 b) 적어도 하나의 콜라게나제 및 적어도 하나의 프로테이나제, 특히 중성 프로테이나제를 함유하는 항생제 조성물로 생체외로 관류된다. 이렇게 하여 조직 컴플렉스에서 개별 세포를 소독 및 탈리하여 소독된 단세포 제조물을 얻는다. 선택적으로, 또다른 바람직한 구체예에서, 콜라게나제 또는 콜라게나제와 프로테이나제는 적어도 하나의 항생물질 활성제, 바람직하게 항생물질 활성제들과 별도로 적어도 하나의 관류 완충액, 바람직하게 인산염/HEPES 완충액, 별도의 용매, 예를 들어 완충액에 함유될 수 있으며, 항생물질 관류 단계와는 별도로, 즉 차후에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용된 항생제 조성물은 액체 형태, 예를 들어 용액 또는 현탁액, 바람직하게 수용액 또는 현탁액, 특히 바람직하게 적어도 하나의 관류 완충액으로 존재한다.
특히 바람직한 일 구체예에서, 액상 항생제 조성물은 적어도 1종, 바람직하게 적어도 2종, 특히 적어도 3종, 바람직하게 적어도 4종 이상의 상이한 항생제를 포함한다. 이들은 β-락탐 항생제의 비페니실린(non-penicillin), 아미노글리코시드, 글리코펩티드 항생제 및 폴리펩티드 항생제로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 항생제 조성물은 사용된 효소 처리, 특히 콜라게나제 또는 프로테이나제 처리에 대해 부정적 또는 저해 효과를 나타내지 않는다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 항생제 조성물은 콜라게나제와 프로테이나제 없이 제공될 수 있다.
항생제 조성물, 특히 본 발명에 따라 바람직하게 사용된 항생제 조합물은 유리하게 단리된 세포의 활력(vitality) 및 형태학에 부정적 효과를 갖지 않는 것을 특징으로 한다.
적어도 하나의 항생제, 특히 항생제들은 본 발명에 따른 조성물에 박테리아 같은 미생물, 바람직하게 공여체의 장기 수송 배지에서 발생하는 것들의 생장, 증식 및/또는 활력이 실질적으로 감소되거나 저해되지만 조직 또는 세포의 활력은 실질적으로 유지되는 양으로 함유된다.
본 발명과 관련하여, 항생제 조성물이란 항생제 효능을 갖는 물질 조성물을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 항생제 효능이란 미생물, 특히 박테리아, 구체적으로 그람 양성 및 그람 음성 호기성 및 혐기성 박테리아, 진균, 원생동물(protozoa) 또는, 포자 또는 배아 같은 이들의 생식 산물에 대한 유해 효과, 특히 항미생물 유해 효과, 예를 들어 사멸, 번식 저해, 번식 감소, 생장 저해 또는 생장 감소, 특히 사멸 효과를 의미한다. 특히 바람직하게, 항생제 조성물은 포유동물 공여체 조직 또는 장기 내 또는 상에서, 또는 그의 수송 매질에서 발생하는 미생물에 대해 특히 효과적이다.
본 발명과 관련하여, 항생제 효능은 따라서 바람직하게 미생물을 사멸하는, 즉 항생제 조성물이 살미생물 효과, 바람직하게 살균 효과를 가지는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 일 구체예에서 항생제 효능은 살미생물 효과와 반드시 연관될 필요는 없으며, 미생물이 단지 그의 생체기능, 예를 들어 생장, 대사, 또는 번식에 대하여 제한되는, 즉 미생물생육저지(microbiostatic), 특히 정균(bacteriostatic) 효과가 발생하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 항생제 효능이란 용어는 또한 바람직하게 소독 효과를 의미하며, 즉 항생제 조성물이 특히 바람직하게 소독 효과를 가지는, 다시 말해서 사용된 물질, 예를 들어 조직 및/또는 세포가 살아있는 미생물이 없는, 바람직하게 전혀 없거나 거의 완전하게 없거나 미생물을 사멸하는 것을 의미한다. 소독이란 배아, 즉 미생물의 조기 발생단계의 제거 또는 사멸뿐만 아니라 미생물의 영구적 형태 또는 미생물의 감염 부분을 포함하는 미생물의 다른 모든 발달단계의 제거 또는 사멸을 포함한다. 소독은 또한, 특히 1 유니트의 소독 제품 내에서 번식 미생물의 잔류 함량이 최대 10-6 콜로니 형성 유니트인 정도의 번식 미생물 수의 상당한 감소를 의미한다. 본 발명과 관련하여, 소독은 또한 오염제거를 의미한다.
특히 바람직한 일 구체예에서, 액상 항생제 조성물은 적어도 하나의 관류 완충액에 함유된다.
그러므로, 본 발명은 바람직하게 적어도 하나의 관류 완충액 중의 β-락탐 항생제의 비페니실린, 아미노글리코시드, 글리코펩티드 항생제 및/또는 폴리펩티드 항생제를 포함하는, 바람직하게 이들로 구성되는 항생제 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 사용된 항생제 조성물은 포유동물 조직과 포유동물 세포, 바람직하게 사람 조직, 장기 또는 장기 일부, 및 사람 세포, 특히 간 조직 및 간 세포의 생체외 소독에 적합한, 특히 적합하며 이를 위한 것이다. 단리된 조직은 자연적인 혈관 시스템을 사용하여 본 발명에 따라 사용된 항생제 조성물로의 관류에 의해 소독된다. 그 결과, 내부 조직 및 접근이 곤란한 조직을 포함한 전체 조직, 및 그 표면의 미생물이 소독된다. 죽어가는 환자에서 박테리아는 다양한 정도로 장벽(intestinal wall)을 통과하고, 따라서 제거될 장기의 문맥계(portal sysmtem)에 의해 관류로 세척될 수 있으므로 특별히 간의 경우에 있어서 이것은 특히 중요하다. 역행 오염 또한 생리학적으로 장내 세균총과 열린 접점 내에 있는 담도계를 통해 발생할 수 있다. 최적의 작업기술에도 불구하고 이러한 오염은 그리하여 결코 완전하게 방지되지 않아서 본 발명에 따라 사용된 항생제 조성물을 사용한 온화하고 효과적인 오염제거가 특히 필수적이다. 또한, 이러한 "내부" 오염은 일부 환경에서 수송 배지의 병원균을 초기에 검출할 수 없지만 조직 물질의 효소 해리 과정에서만 방출하는 상황을 유도할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따른 항생제 조성물을 사용한 관류에 의한 단리된 조직의 소독은 이러한 "내부" 오염의 조기 제거를 유리하게 유도한다. 따라서, 항생제를 첨가하지 않으면, 오염된 수송 배지를 사용한 간 장기로부터 제조된 간 세포 제조물의 거의 100%가 마찬가지로 오염된다. 그러나, 본 발명에 따른 오염제거에 의해 65% 이상 소독된 간 세포 제조물이 제조될 수 있다.
바람직하게, 조직은 적어도 한 단계의 관류, 바람직하게, 두 단계, 세 단계, 네 단계 이상의 관류, 예를 들면 세 단계로 관류된다. 바람직한 일 구체예에서, 각각의 경우 3 내지 5 리터의 항생제 함유 및/또는 콜라게나제/프로테이나제 함유 관류 완충액, 바람직하게 인산염/HEPES 완충액이 각 관류 단계에 사용된다. 특히 바람직하게, 3단계 관류의 경우에 3종의 관류 완충액 모두, 바람직하게 처음 EGTA- 또는 EDTA-함유 인산염/HEPES 완충액 및 다음 두 번 인산염/HEPES 완충액이 항생제를 함유하고 콜라게나제/프로테이나제는 바람직하게 최종 관류 단계에서만 사용된다. 또한 3단계 관류의 경우에 처음 두 번 관류 완충액만 항생제를 함유하고 콜라게나제/프로테이나제는 최종 관류 단계에서 항생제가 없는 관류 완충액으로 사용되는 것이 특히 바람직하다.
특히 바람직한 일 구체예에서, 항생제 조성물은 적어도 두 개 관류 완충액, 특히 두 개 관류 완충액, 특히 또는 즉 적어도 하나의 EGTA- 또는 EDTA-함유 인산염/HEPES 완충액과 적어도 하나의 인산염/HEPES 완충액 또는 다른 적합한 완충액 용액에 함유된다.
관류, 즉 조직 물질을 통과하기 위해 사용된 관류 완충액은 바람직하게 인산염/HEPES (2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐)-에탄설폰산) 완충액이나, 또한 EGTA (에틸렌 글리콜-비스-(아미노에틸에테르)-N,N'-테트라아세트산)- 또는 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)-함유 인산염/HEPES 완충액이다. 사용된 관류 완충액은 바람직하게 7 내지 8, 특히 바람직하게 7.3 내지 7.8, 특히 7.5의 생리적 pH를 가진다.
특히 바람직한 일 구체예에서, 관류 시간과 효소 처리시간은 모두 각각 10 내지 360분, 바람직하게 20 내지 240분, 특히 30 내지 120분이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 조직의 관류와 효소 처리는 바람직하게 함께 발생하며, 특히 10 내지 360분, 바람직하게 20 내지 240분, 특히 30 내지 120분 동안 지속된다.
특히 바람직한 다른 구체예에서, 관류와 효소 처리를 위한 온도는 9 내지 39 ℃, 바람직하게 10 내지 37 ℃, 특히 25 내지 37 ℃이다. 바람직한 일 구체예에서, 관류 및, 가능하면 효소 처리 동안, 항생제 관류 조성물 및 관류된 장기의 온도는 특히 바람직하게 10 ℃ 미만, 예를 들어 4 ℃ 내지 10 ℃ 범위의 출발온도에서 30 ℃ 내지 39 ℃ 범위, 예를 들어 37 ℃의 최종 온도까지 증가한다.
본 발명의 특히 바람직한 일 구체예에서, 사용된 항생제 조성물은 a) 적어도 하나의 콜라게나제 또는 b) 적어도 하나의 콜라게나제 및 적어도 하나의 프로테이나제, 특히 중성 프로테이나제를 함유한다. 콜라게나제 또는, 콜라게나제 및 프로테이나제가 존재하기 때문에 조직 물질이 인큐베이션, 특히 관류 동안 해리되어 단세포 현탁액이 얻어질 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 또한 조직을 소독하는 방법 또는 소독된 포유동물 세포 제조물을 생체외에서 제조하는 방법을 제공하며, 여기에서 a) 포유동물 조직을 본 발명에 따른 항생제 조성물로 적합한 조건 하에서, 특히 적합한 지속기간 동안 적합한 온도에서 관류하고; b) 조직으로부터 단세포 현탁액을 제조하는 효소 처리를 일시적 오버래핑 방법, 즉 적어도 주어진 지속기간 동안 동시에 또는 순차적으로 수행하여; c) 소독된 세포 제조물을 얻는다.
본 발명의 특히 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 방법으로 얻어진 소독된 세포 제조물을 추후에 적어도 1회, 예를 들어 1, 2, 3회, 또는 그 이상의 세척단계(들), 단리단계(들), 또는 둘 다를 수행하는 것을 제공하여 사용된 항생제, 효소, 또는 이들 모두의 농도를 감소하거나 얻어진 제조물에서 이들을 완전하게 또는 거의 완전하게 제거한다. 특히 바람직하게, 공정 단계 b) 이후, 예를 들어 공정 단계 c) 전후에 1회 이상의 세척단계를 바람직하게 무항생제 세척 완충액을 사용하여 수행한다. 이렇게 하여 본 발명에 따른 방법에 사용된 항생제와 효소가 완전하게 또는 거의 완전하게 제거되는 상황을 유리하게 유도하며, 얻어진 단세포 제조물은 차후의 살균시험에 적합하다.
바람직한 일 구체예에서, 얻어진 소독된 세포 제조물은 보관을 위해 저온보존하는 것이 제공될 수 있다. 이를 위하여 제조물은 저온보존(cryopreservation)에 적합한 배지에서 적합한 저온에 보관된다.
유리하게, 본 발명에 따른 방법으로 더 높은 세포 수율(얻어진 세포의 총 수), 더 높은 특이적 세포 수율(사용된 간 조직 그람 당 세포의 수), 및 단리 및 소독된 간 세포의 더 높은 활력(현탁액 중 살아있는 세포의 비율)을 상당히 빠른 시간 내에 얻을 수 있음을 본 발명에 따라 입증할 수 있다.
본 발명에 따라 적용된 항생제 조성물을 사용하여 소독된 단세포 제조물, 특히 바람직하게 세포 현탁액, 예를 들어 특히 간 세포에서 이전에 얻을 수 없었던 배양배지 중의 세포 현탁액을, 예를 들어 이식가능하지만 이러한 용도에 적합하지 않은 공여체 장기로부터, 특히 신속하고 온화하며 효과적인 방법으로 유리하게 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 수행된 항생제 처리가, 즉 동시에 또는 순차적으로 수행되는 효소 처리, 특히 콜라게나제 및/또는 프로테이나제 처리를 손상하지 않고, 게다가 또한 차후에 수행된 살균성 검사에 대해 부정적 효과를 나타내지 않는 이점이 있다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 항생제 조성물은 따라서 조직으로부터 소독된 세포 현탁액의 제조에 적합하며, 다시 말해서 조직 또는 장기 컴플렉스에 존재하는 배지 중의 단세포가 아니다. 단리된 포유동물 조직 또는 단리된 장기를 관류하는데 있어서, 본 발명에 따라 사용되고 적어도 하나의 관류 완충액에 함유된 항생제 조성물은 조직 또는 장기의 크기에 바람직하게 조절된 부피로 사용된다. 이러한 부피는 당업자들에게 알려진 바와 같이 실험적으로 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 소독된 세포 제조물, 즉 세포, 세포 현탁액 또는 포유동물에서 유래한 단세포 현탁액에 관한 것으로, 이들은 본 발명의 방법 중 하나로 제조되었다.
본 발명의 또다른 유리한 구체예는 종속항으로부터 분명해질 수 있다.
본 발명을 다음 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하였다. 실시예는 한정으로서가 아니라, 본 발명의 이점을 더욱 상세히 설명하고 특정 실시예를 기초로 예시하기 위한 것이다.
실시예
실시예 1: 항생제 및 효소 동시처리에 의한 소독된 간 세포 현탁액의 제조
A. 실행
소독된 간 세포 현탁액을 간으로부터 제조하기 위하여 다음 항생제 조성물을 제조하였다:
항생제를 언급된 모든 관류 완충액에 이하의 농도로 첨가하였다:
항생제 농도
MEROPENEM 0.2 mg/ml
VANCOMYCIN 0.05 mg/ml
전체 장기이식에 부적합한 다수 공여체 간 장기를 먼저 30분 동안 실온에서 5 L의 항생제 함유 인산염/HEPES 완충액으로 표면 세정한 다음, 하기한 용량의 항생제 함유 완충액(pH 7.25 - 7.45)으로 3 단계 관류하였다:
1. 5 L의 EDTA 함유 인산염/HEPES 완충액, 관류 10　분, 20 - 40 ℃;
2. 5 L의 인산염/HEPES 완충액, 관류 10　분, 25 - 40 ℃;
3. 3 L의 콜라게나제/프로테아제 함유 인산염/HEPES 완충액, 관류 24　분, 25 - 40 ℃
콜라게나제/프로테아제 농도: 2000 Wuensch 유니트의 콜라게나제 I 및 400 내지 2500 유니트의 프로테아제(clostridiopeptidase I) 조합물.
효소- 및 항생제-함유 완충액으로의 관류 시간은 총 44분이었다. 사용된 간의 자연적인 혈관 시스템을 관류에 사용하였다.
관류하는 동안, 관류된 장기와 주위 환경의 온도를 서서히 <10 ℃에서 37 ℃(실온과 40 ℃ 사이의 완충액 온도)로 상승시켰다.
조직에서 단리한 후, 세포를 항생제 농도가 사용된 항생제 농도의 1/1000 미만이 될 때까지 항생제가 없는 완충액으로 여러 번 세척하였다.
살균성 검사를 위한 샘플을 장기가 전달된 수송 배지와 저온보존한 후의 소독된 세포 현탁액으로부터 채취하였다.
B. 결과
다음 미생물, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii를 수송 배지에서 검출하였고, 여기에서 미생물 생장이 표시될 때까지 자동 인큐베이션하는 동안 소요된 시간, 소위 "time to positivity"는 1.67 h이었다.
본 발명에 따라 소독된 세포 현탁액에서 미생물은 저온 보존 이후, 심지어 14일의 인큐베이션 이후에도 검출되지 않았다.
살균성 시험은 제조된 세포 현탁액으로 항생제가 없는 완충액을 사용한 충분한 횟수의 세척 단계 후에 수행할 수 있다.
실시예 2: 순차적인 항생제 및 효소 처리를 사용한 소독된 간 세포 현탁액의 제조
A. 실행
전체 장기이식에 부적합한 다수 공여체 간 장기를 먼저 8분 동안 실온에서 이중 항생제 농도를 가지는 5 L의 인산염/HEPES 완충액을 사용하여 표면 세정한 다음, 두 단계에서 항생제 함유 완충액으로, 추가 일 단계에서 콜라게나제 함유 및 항생제가 없는 완충액을 하기한 용량으로 관류하였다(pH 7.25 - 7.45):
1. 10 L의 EDTA 함유 인산염/HEPES 완충액, 관류 68　분, 20 - 40 ℃;
2. 5 L의 인산염/HEPES 완충액, 관류 10　분, 25 - 40 ℃;
3. 3 L의 콜라게나제/프로테아제 함유 및 항생제가 없는 인산염/HEPES 완충액, 관류 24　분, 25 - 40 ℃
콜라게나제/프로테아제 농도: 2000 Wuensch 유니트의 콜라게나제 I 및 400 내지 2500 유니트의 프로테아제(clostridiopeptidase I) 조합물.
효소- 및 항생제-함유 완충액으로의 관류 시간은 총 102분이었다. 사용된 간의 자연적인 혈관 시스템을 관류에 사용하였다.
관류하는 동안, 관류된 장기와 주위 환경의 온도를 서서히 <10 ℃에서 37 ℃(실온과 40 ℃ 사이의 완충액 온도)로 상승시켰다.
조직에서 단리한 후, 세포를 항생제 농도가 사용된 항생제 농도의 1/1000 미만이 될 때까지 항생제가 없는 완충액으로 여러 번 세척하였다.
살균성 검사를 위한 샘플을 장기가 전달된 수송 배지와 저온보존한 후의 소독된 세포 현탁액으로부터 채취하였다.
B. 결과
Staphylococcus Aureus를 수송 배지에서 검출할 수 있었다. 미생물 생장이 표시될 때까지 자동 인큐베이션하는 동안 소요된 시간, 소위 "time to positivity"는 3.85 h이었다.
본 발명에 따라 소독된 세포 현탁액에서 미생물은 저온 보존 이후, 심지어 14일의 인큐베이션 이후에도 검출되지 않았다.
살균성 시험은 제조된 세포 현탁액으로 항생제가 없는 완충액을 사용한 충분한 횟수의 세척 단계 후에 수행할 수 있다.

Claims (12)

  1. a) 포유동물 조직을 적어도 하나의 항생제를 포함하고 적어도 하나의 관류 완충액에 함유된 효소가 없는 액상 항생제 조성물로 관류하는 단계,
    b) 단계 a)로부터 수득한 관류된 조직을 무항생제 효소처리를 수행하여 단세포 현탁액을 얻는 단계, 및 그 결과로
    c) 단계 b)로부터 단세포 현탁액 형태의 소독된 제조물을 수득하는 단계를 포함하며,
    단계 b)에 따른 효소처리가 단계 a) 이후에 발생하는, 포유동물 조직으로부터 소독된 제조물을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조직이 간 조직인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 효소처리가 콜라게나제 및/또는 프로테이나제(proteinase) 처리인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 공정 단계 a)의 관류시간이 30 내지 120 분이고 온도가 관류하는 동안 상승되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 액상 항생제 조성물이 적어도 두 개의 관류 완충액, 즉 적어도 하나의 EGTA- 또는 EDTA-함유 인산염/HEPES 완충액과 적어도 하나의 인산염/HEPES 완충액에 함유되는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조직의 표면이 공정 단계 a) 이전에 액상 항생제 조성물로 세정되는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 무항생제 세척 완충액을 사용하는 적어도 1회의 세척 단계가 공정 단계 b) 이후에 수행되는 방법.
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