CN103124493A - 用于制备消毒的人类细胞悬浮液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于由来自哺乳动物的组织制备经消毒的单细胞制剂的方法以及如此制备的制剂。

Description

用于制备消毒的人类细胞悬浮液的方法

本发明涉及用于制备消毒的单细胞制剂的方法以及如此制备的制剂。

在急性或慢性肝衰竭的情况中，肝移植是最重要的拯救生命的措施。为了应对仅通过供体器官难以满足的对移植材料的需求，近年来已发展了替代整体器官移植的方法，例如部分肝移植或肝细胞制剂的移植。

特别有吸引力的是单细胞制剂，因为其可由不适于器官移植的供体器官获得。为了由肝组织获得肝细胞，已知一种两步灌注法，其使用含胶原酶的缓冲剂和含EDTA的缓冲剂（Berry und Friend,1969,The Journal of Cell Biology,Vol.43,Seiten506-520）。在该方法中，通过用含胶原酶的缓冲剂灌注肝组织，由组织团（Gewebeverband）酶促释放单个的细胞。

因为所得的单细胞制剂是药品，所以在任何情况下必须确保微生物无菌。但在大约70-80％的制剂中，情况并非如此，因为在器官的运输介质中大都已存在污染，该污染通常源自供体的器官材料或组织材料。然而，对于像人类供体器官这么有价值的产品，希望以高收率制得不含微生物污染的、可移植的组织制剂或细胞制剂。传统的去污方法（如加热、高压消毒或辐照）无法保持细胞的活力，因此不能用于组织的消毒。

借助于抗生素用于组织去污的方法同样是已知的。例如，已开发了用于角膜移植物的贮藏的方法（US4,695,536）或心脏瓣膜移植物的去污的方法（WO92/12632和EP0889690）。在这些方法中使用的抗生素组合物的作用时间范围为从24小时到贮藏数周。然而，即使24小时的作用时间也并不适于诸如肝脏的高度敏感的组织。此外，在这些方法中，去污仅在表面上发生。对基于抗生素的对组织和细胞的去污方法的另一个要求在于，该方法以及在该方法中使用的物质不能对肝细胞的获得及其细胞质量和活力有不良影响，且必须与用于质量控制的无菌检测系统是相容的。

因此，作为本发明的基础的技术问题在于提供克服了上述缺点的、温和而有效地对组织进行去污（即，消毒）的方法，特别是，甚至当其中含有的组织或细胞非常敏感时（即，例如源于肝脏时），也在特别温和的条件下（特别是在保持这些组织或细胞的活力的同时）确保更有效且更快速地对组织进行消毒的方法。

通过独立权利要求的教导解决了本发明所述的技术问题。因此，在特别优选的实施方式中，本发明涉及用于由来自哺乳动物（尤其是人类）的组织制备经消毒的制剂（尤其是单细胞制剂）的方法，其包括下列工艺步骤：a）用液体抗生素组合物灌注来自哺乳动物的组织；b）对该组织进行酶促处理，以便尤其得到单细胞混悬液；和c）得到经消毒的制剂，尤其是单细胞制剂，即这样的制剂：其中细胞不再存在于组织团中，而是彼此分离为单个的细胞或任选地作为细胞簇或更小的细胞团聚体存在。因此，本发明以有利的方式提供了这样的方法，根据该方法可以由哺乳动物，尤其是人类的组织（即例如细胞团或器官）在体外的方法中制备经消毒的制剂，尤其是单细胞制剂，优选单细胞悬浮液。有利的是，根据本发明可以获得特别良好地适用于有说服力的无菌测试的细胞制剂。因此根据本发明的方法允许以高说服力提供所得制剂的无菌性的无菌度测试。

本发明起始于所提供的来自哺乳动物的组织，所述组织可以来自例如活的或死的哺乳动物，特别是新近才死的哺乳动物。在特别优选的实施方式中将哺乳动物理解为人类或动物，例如家畜或实验动物，尤其是猪、奶牛、马、狗、猫、绵羊、山羊、猴子、灵长类动物、鸟类或啮齿动物。

取自供体哺乳动物的和如此提供用于本发明的组织，尤其是细胞团或器官，在本发明中作为起始原料使用。本发明优选使用组织自身的血管系统，特别是器官自身的血管系统，使如此提供的组织与抗生素组合物接触并灌注。本发明还在用抗生素组合物灌注组织期间或随后，对所述组织进行酶促处理，在此期间，组织团解体并获得单细胞悬浮液。以这种方式实现了单个的细胞存在于抗生素组合物中，因此能够特别有效地进行抗生素处理并由此消毒。

在本发明的上下文中，将单细胞制剂或单细胞悬浮液尤其理解为这样的制剂或悬浮液，在其中细胞单独地存在且彼此之间没有永久的物理接触。在另一个实施方式中，也将单细胞制剂或单细胞悬浮液理解为大多数存在的细胞（尤其是多于50％，多于60%，多于70%，多于80%，多于90%或多于95%的细胞）彼此分离且彼此之间没有永久的物理接触地存在，且合计到100%的其余细胞以细胞簇、更小或更大的细胞团聚体和未完全解体的组织团残余物的形式存在。

在本发明的上下文中，将灌注尤其理解为组织灌注，也就是说使液体，即特别是本发明的抗生素组合物流过中空的器官或包含于组织中的管，特别是血管。在本发明的上下文中，灌注是孵育的一种特别优选的实施方案。

在本发明的上下文中，将组织理解为连续的、特别是相同的功能和/或形态学的细胞的团，特别也是器官（例如肝脏）、器官部分、组织团或尤其是来自肝脏的切片材料，尤其是肝脏切片材料。根据本发明，所使用的组织是肝组织，例如整个肝脏或其部分，例如肝脏切片材料。根据本发明制备的单细胞悬浮液优选是肝细胞悬浮液。

在一个特别优选的实施方式中，将工艺步骤a）与工艺步骤b）一起（即，同时或时间上重叠地）进行，即用优选存在于至少一种灌注缓冲液中的抗生素组合物进行灌注，其中在至少一种灌注缓冲液中同时存在有至少一种酶，所述酶用于对组织进行酶促处理以获得单细胞悬浮液。但是也优选，首先用无酶的，优选存在于至少一种灌注缓冲液中的抗生素组合物进行灌注，并随后根据步骤b）进行酶促无抗生素的处理，在此期间使组织团解体并得到用于步骤a）的组织的单细胞，从而在步骤c）中得到完全消毒的单细胞。

根据本发明，也可以在一个可选的工艺步骤中进行如下操作：在根据本发明进行灌注之前，用抗生素组合物（优选根据本发明所用的抗生素组合物）淋洗所用的组织的表面，尤其是不灌注该组织，即进行初步的表面去污。在这种情况下，孵育时间优选仅为5-60分钟，优选5-45分钟，特别优选5-30分钟。在如此短的孵育时间的情况下，也可以任选地使用比灌注期间更高的抗生素浓度。在本发明的一个实施方式中，也可以在工艺步骤a）和/或b）期间进行表面淋洗。

根据本发明提供的用于获得单细胞悬浮液的组织的酶促处理优选使用至少一种或优选至少两种酶，所述酶优选存在于水性溶液中，特别是被缓冲的溶液中，尤其是在优选实施方式中存在于液体抗生素组合物中。用于酶促处理的酶能够解体组织团，尤其是溶解细胞-细胞接触和细胞-细胞外基质接触，并由此制备单细胞悬浮液而不损伤或破坏细胞。在根据本发明优选的实施方式中，特别适合的酶是胶原酶、蛋白酶及其混合物。在本发明的上下文中，也将蛋白酶（Proteinase）理解为蛋白质酶（Protease）。

优选胶原酶和蛋白酶（尤其是中性蛋白酶）的混合物，其中，酶的活性比例为1单位胶原酶对40-60（优选50）单位蛋白酶。

因此，每次灌注优选使用约2000-4000Wünsch单位的胶原酶与100,000干酪素单位或与400-2500梭状杆菌肽酶I单位结合。

因此，在根据本发明的方法的一个特别优选的实施方式中，将组织在体外用优选存在于至少一种灌注缓冲液中的抗生素组合物灌注，所述抗生素组合物包含用于将组织解体成单细胞的至少一种酶，尤其包含a）至少一种胶原酶或b）至少一种胶原酶和至少一种蛋白酶，尤其是中性蛋白酶。这产生消毒作用，并将单个细胞由组织团分离，并由此得到经消毒的单细胞制剂。或者，在另一个优选的实施方式中，所述胶原酶或所述胶原酶与蛋白酶可以与至少一种灌注缓冲液（优选磷酸盐-HEPES缓冲液）中的至少一种抗生素活性物质（优选多种抗生素活性物质）分开存在于合适的溶剂（例如缓冲液）中，且可以与抗生素灌注步骤分开使用，即随后使用。

根据本发明，所述根据本发明使用的抗生素组合物以液体形式存在，例如作为溶液或悬浮液存在，优选作为水性溶液或悬浮液存在，特别优选存在于至少一种灌注缓冲液中。

在特别优选的实施方式中，所述液体抗生素组合物包含至少一种（优选至少两种，尤其是至少三种，优选至少四种或更多种不同的）抗生素。它们可以选自由β-内酰胺抗生素、氨基糖苷类、糖肽类抗生素和多肽类抗生素的非青霉素组成的组。

在优选的实施方式中，根据本发明使用的抗生素组合物对所使用的酶促处理（尤其是胶原酶处理或蛋白酶处理）没有不利的或抑制性作用。

在本发明的一个优选实施方式中，抗生素组合物不含有胶原酶和蛋白酶。

根据本发明优选使用的抗生素组合物（尤其是抗生素组合）的有利的特点在于，其对于分离的细胞的活力和形态没有不利影响。

根据本发明的组合物中包含的所述至少一种抗生素（尤其是多种抗生素）的量使得微生物（如细菌，优选出现在供体器官的运输培养基中的那些细菌）的生长、繁殖和/或活力被显著降低或抑制，而组织或细胞的活力基本上被保持。

在本发明的上下文中，将抗生素组合物理解为显示抗生活性的物质组合物。在本发明的上下文中，将抗生活性理解为对微生物（尤其是细菌，具体地，即革兰氏阳性和革兰氏阴性的好氧和厌氧细菌、真菌、原生动物或其繁殖产物，如孢子或芽孢）的有害作用，尤其是抗微生物的有害作用，如杀灭、抑制繁殖、减少繁殖、抑制生长或减少生长，尤其是杀灭的作用。特别优选的是对存在于哺乳动物供体组织或器官之中或之上，或存在于其运输培养基中的微生物特别有效的抗生素组合物。

因此，在本发明的上下文中，优选将抗生活性理解为杀灭微生物，即抗生素组合物起杀微生物作用，优选杀菌作用。根据本发明，在本发明的一个实施方式中，抗生活性不必然与杀微生物作用相关，而是也可以意味着仅在其重要的生理功能，例如生长、代谢或繁殖方面，限制微生物，也就是说产生抑微生物作用，尤其是抑菌作用。

在本发明的上下文中，优选也将术语抗生活性理解为消毒作用，即该抗生素组合物以特别优选的方式起消毒作用，也就是说使所使用的材料（例如组织和/或细胞）不含有活的微生物，优选完全或几乎完全不含有活的微生物，或将其杀灭。在此，所述消毒不仅包括去除或杀灭芽孢（即微生物的早期生长阶段），而且也包括去除或杀灭微生物的所有其它生长阶段和状态阶段，包括其持续形式（Dauerformen）或微生物的感染部分（

 Teilen）。也将消毒理解为可繁殖的微生物的数目显著减少，尤其是一单位消毒物质（Desinfekionsgut）的可繁殖的微生物的残余含量为最高10^-6菌落形成单位。在本发明的上下文中，也将消毒理解为去污。

在特别优选的实施方式中，液体抗生素组合物存在于至少一种灌注缓冲液中。

因此，本发明涉及一种方法，其中使用抗生素组合物，所述抗生素组合物包含下述物质（优选由下述物质组成）：在优选至少一种灌注缓冲液中的β-内酰胺抗生素、氨基糖苷类、糖肽类抗生素和多肽类抗生素的非青霉素。根据本发明使用的抗生素组合物适合（尤其适合和确定）用于体外消毒哺乳动物组织和哺乳动物细胞，优选人类组织、器官或器官部分和人类细胞，尤其是肝组织和肝细胞。通过用根据本发明使用的抗生素组合物灌注来实现分离的组织的消毒，其中利用天然的血管系统。由此实现整个组织（包括内部组织和难于进入的组织）的微生物消毒，且不仅是其表面的微生物消毒。这尤其在肝脏的情况中特别重要，因为在濒临死亡的病患中，细菌不同程度地穿过肠壁，并因此可能经待摘除的器官的门静脉系统通过灌注冲洗掉。同样地，可以经由生理上与肠道菌群开放接触的胆管系统出现逆行性污染。尽管优化了操作技术，但在这里这种污染从未得以完全避免，且使得特别有必要使用根据本发明所使用的抗生素组合物温和而有效地去污。此外，这样的“内部”污染在某些情况下可能导致病原体最初在运输培养基中是不能检测到的，而仅在酶促解离组织材料的过程中才被释放。因此，通过用根据本发明的抗生素组合物灌注以对分离的组织进行消毒，有利地导致早期消除这样的“内部”污染。因此，如果不添加抗生素，则用被污染的运输培养基由肝脏器官制成的肝细胞制剂几乎100%地同样被污染。但是，通过根据本发明的去污，能够制备超过65%被消毒的肝细胞制剂。

优选在至少1个灌注步骤中，优选在2个、3个、4个或更多个灌注步骤中，例如在3个步骤中灌注组织。在优选的实施方式中，每个灌注步骤可以使用各3-5升含抗生素和/或含胶原酶/蛋白酶的灌注缓冲液，优选磷酸盐-HEPES缓冲液。特别优选的是，在三步灌注步骤中使用所有三种灌注缓冲液（优选首先使用一种含EGTA或含EDTA的磷酸盐-HEPES缓冲液，且随后两次使用磷酸盐-HEPES缓冲液）均含有抗生素，其中优选仅在最后一个灌注步骤中使用胶原酶/蛋白酶。还特别优选的是，在三步灌注步骤中，仅前两种灌注缓冲液含有抗生素，且在最后一步灌注步骤中在无抗生素的灌注缓冲液中使用胶原酶/蛋白酶。

在一个特别优选的实施方式中，抗生素组合物存在于至少两种灌注缓冲液中，尤其是两种灌注缓冲液中，尤其是或者即至少一种含EGTA或含EDTA的磷酸盐-HEPES缓冲液和至少一种磷酸盐-HEPES缓冲液或其它合适的缓冲溶液中。

用于灌注（即流过组织材料）的灌注缓冲液优选为磷酸盐-HEPES（2-(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基)-乙磺酸）缓冲液，以及含EGTA（乙二醇-双-(氨基乙基醚)-N,N’-四乙酸）或含EDTA（乙二胺四乙酸）的磷酸盐-HEPES缓冲液。所使用的灌注缓冲液优选具有7-8（特别优选7.3-7.8，尤其是7.5）的生理pH值。

在特别优选的实施方式中，灌注时间和酶促处理时间均各自为10-360分钟，优选20-240分钟，尤其是30-120分钟。在一个特别优选的实施方式中，优选一起进行组织的灌注和酶促处理，尤其是持续10-360分钟，优选20-240分钟，尤其是30-120分钟的时间。

在另一个特别优选的实施方式中，用于灌注和用于酶促处理的温度均为9-39℃，优选10-37℃，尤其是25-37℃。在一个优选的实施方式中，在灌注期间和任选地在酶促处理期间，升高抗生素组合物和被灌注器官的温度，特别优选从低于10℃，例如4℃-10℃范围的起始温度到30℃-39℃范围，例如到37℃的最终温度。

在本发明的一个特别优选的实施方式中，所使用的抗生素组合物包含a）至少一种胶原酶或b）至少一种胶原酶和至少一种蛋白酶，尤其是中性蛋白酶。由于胶原酶或胶原酶与蛋白酶的存在，在孵育（尤其是灌注）期间实现组织材料的解离并因此可以获得单细胞悬浮液。

在优选的实施方式中，本发明还提供了用于在体外对组织进行消毒的方法或用于在体外制备经消毒的哺乳动物细胞制剂的方法，其中a）在合适的条件下，尤其是在合适的温度下持续合适的时间，用根据本发明的抗生素组合物灌注哺乳动物的组织；b）时间重叠地，即至少在一定的时间内同时地，或者紧接着，进行酶促处理，以便由组织制备单细胞悬浮液，和c）得到消毒的细胞制剂。

在本发明的一个特别优选的实施方式中，随后使借助于根据本发明的方法得到的经消毒的细胞制剂经受至少一步，例如一步、两步、三步或更多步洗涤步骤、分离步骤或两者，这降低所用的抗生素、酶或此二者的浓度，或者完全或几乎完全由所得的制剂去除。尤其优选的是，在工艺步骤b）之后，例如在工艺步骤c）之前或之后，优选用无抗生素的洗涤缓冲液进行一步或多步洗涤步骤。这有利地导致将在根据本发明的方法中所用的抗生素和酶完全或几乎完全去除，且所得的单细胞制剂适合用于随后的无菌度测试。

在优选的实施方式中，可以将所得的经消毒的细胞制剂低温贮存用于保藏。为此，将制剂在合适的低温下贮存于适合于低温贮存的介质中。

根据本发明可有利地显示，通过根据本发明的方法，可以在显著更快的时间内实现更高的细胞产率（获得的总细胞数），更高的比细胞产率（每克所使用的肝组织的细胞数），以及分离的经消毒的肝细胞的更高的活力（悬浮液中活细胞的比例）。

利用根据本发明所使用的抗生素组合物有利地使得能够特别快速、温和且有效地由例如提供用于移植，但却不适合用于该目的的供体器官获得迄今不能获得（尤其是不能由肝细胞获得）的经消毒的单细胞制剂，尤其优选在例如培养基中的细胞悬浮液。

根据本发明的方法具有下述优点：所进行的抗生素处理不妨碍同时或随后进行的酶促处理，尤其是胶原酶处理和/或蛋白酶处理，并且此外对随后进行的无菌度检查没有不利影响。在特别优选的实施方式中，根据本发明所用的抗生素组合物因此适用于由组织制备经消毒的细胞悬浮液，即在介质中没有存在于组织团或器官团中的单细胞。为了灌注分离的哺乳动物组织或分离的器官，以优选地调整以适合于组织或器官大小的体积使用根据本发明所用的存在于至少一种灌注缓冲液中的抗生素组合物。如本领域技术人员已知的，这可以凭经验确定。

本发明还涉及经消毒的细胞制剂，也就是说通过本发明的方法之一制备的来自哺乳动物的细胞、细胞悬浮液或单细胞悬浮液。

本发明其它有利的实施方案由从属权利要求得出。

本发明将在以下的实施例中进行进一步解释。这些实施例不应被理解为限制性的，而是应进一步解释本发明的优点并借助于具体实施例来说明。

实施例

实施例1：用同时进行的抗生素处理和酶促处理制备消毒的肝细胞悬浮液

A.实施方法

为了由肝脏制备消毒的肝细胞悬浮液，制备下述抗生素组合物：

将抗生素以如下浓度加入所有提及的灌注缓冲液中：

抗生素	浓度
		美罗培南	0.2mg/ml
万古霉素	0.05mg/ml

首先，在室温下用5L含抗生素的磷酸盐-HEPES缓冲液对不适合用于整体器官移植的多供体肝器官进行表面淋洗30分钟，并且随后在三个步骤中将其用以下体积的pH7.25–7.45的抗生素缓冲液灌注：

1.5L含EDTA的磷酸盐-HEPES缓冲液；灌注10min；20–40°C；

2.5L磷酸盐-HEPES缓冲液；灌注10min；25–40°C；

3.3L含胶原酶/蛋白酶的磷酸盐-HEPES缓冲液；灌注24min；25–40°C

胶原酶/蛋白酶浓度：2000Wünsch单位的胶原酶I和400-2500单位蛋白酶（梭状杆菌肽酶I）的组合。

用含酶和含抗生素的缓冲液灌注的时间总共为44min。利用所使用的肝脏的天然的血管体系来灌注。

在灌注期间，将被灌注的器官和环境的温度缓慢地从<10℃升高到37℃（缓冲液温度在室温和40℃之间）。

在其与组织分离后，多次用无抗生素的缓冲液洗涤细胞直至抗生素浓度小于所使用的抗生素浓度的1/1000。

从运送器官的运输培养基中和从低温贮藏后的消毒细胞悬浮液中取出用于无菌度检查的样品。

B.结果

在运输培养基中检出下述微生物：阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii），其中在自动孵育期间，直至察觉到微生物生长的时间，所谓的“阳性反应时间”为1.67h。

在低温贮藏之后，即使在培育14天之后也未在根据本发明消毒的细胞悬浮液中检测到芽孢。

在用无抗生素的缓冲液进行足够数目的洗涤步骤之后，用制备的细胞悬浮液进行无菌测试。

实施例2：用顺序进行的抗生素处理和酶促处理制备消毒的肝细胞悬浮液

A.实施方法

首先，在室温下用5L具有两倍抗生素浓度的磷酸盐-HEPES缓冲液对不适合用于整体器官移植的多供体肝器官进行表面淋洗8分钟，并且随后以下述体积在两个步骤中用含抗生素的缓冲液灌注和在另一个步骤中用含胶原酶且不含抗生素的缓冲液灌注，上述缓冲液均为pH7.25–7.45：

1.10L含EDTA的磷酸盐-HEPES缓冲液；灌注68min；20–40°C；

2.5L磷酸盐-HEPES缓冲液；灌注10min；25–40°C；

3.3L含胶原酶/蛋白酶且不含抗生素的磷酸盐-HEPES缓冲液；灌注24min；25–40°C

胶原酶/蛋白酶浓度：2000Wünsch单位的胶原酶I和400-2500单位蛋白酶（梭状杆菌肽酶I）的组合。

用含酶和含抗生素的缓冲液灌注的时间总共为102min。利用所使用的肝脏的天然的血管体系来灌注。

在灌注期间，将被灌注的器官和环境的温度缓慢地从<10℃升高到37℃（缓冲液温度在室温和40℃之间）。

在其与组织分离后，多次用无抗生素的缓冲液洗涤细胞直至抗生素浓度小于所使用的抗生素浓度的1/1000。

从运送器官的运输培养基中和从低温贮藏后的消毒细胞悬浮液中取出用于无菌检查的样品。

B.结果

在运输培养基中可检出金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）。在自动孵育期间，直至察觉到微生物生长的时间，所谓的“阳性反应时间”为3.85h。

在低温贮藏之后，即使在培育14天之后也未在根据本发明消毒的细胞悬浮液中检测到芽孢。

在用无抗生素的缓冲液进行足够数目的洗涤步骤之后，用制备的细胞悬浮液进行无菌度测试。

Claims (12)

1.用于由哺乳动物的组织制备经消毒的制剂的方法，其包括以下工艺步骤：

a)用液体抗生素组合物灌注来自哺乳动物的组织，

b)对所述组织进行酶促处理以获得单细胞悬浮液，和

c)得到经消毒的制剂。

2.根据权利要求1的方法，其中所述组织是肝组织。

3.根据权利要求1或2之一的方法，其中所述步骤b）的酶促处理与步骤a）同时进行。

4.根据权利要求1或2之一的方法，其中所述步骤b）的酶促处理在步骤a）之后进行。

5.根据权利要求1-4之一的方法，其中所述酶促处理是胶原酶处理和/或蛋白酶处理。

6.根据权利要求1-5之一的方法，其中在工艺步骤a）中的灌注时间为30-120min，且在灌注期间使温度升高。

7.根据前述权利要求之一的方法，其中所述液体抗生素组合物包含至少一种胶原酶和/或至少一种蛋白酶。

8.根据权利要求1-7之一的方法，其中所述液体抗生素组合物存在于至少一种灌注缓冲液中并具有至少一种抗生素。

9.根据权利要求1-8之一的方法，其中所述液体抗生素组合物存在于至少两种灌注缓冲液中，即至少一种含EGTA的磷酸盐-HEPES缓冲液或含EDTA的磷酸盐-HEPES缓冲液和至少一种磷酸盐-HEPES缓冲液。

10.根据前述权利要求之一的方法，其中在工艺步骤a）之前用液体抗生素组合物淋洗所述组织的表面。

11.根据前述权利要求之一的方法，其中在工艺步骤b）之后进行至少一个洗涤步骤，用不含抗生素的洗涤缓冲液进行洗涤。

12.根据权利要求1-11之一的方法制备的消毒的哺乳动物细胞制剂。