BR112013003484B1 - Processo para a preparação de suspensões de células humanas desinfetadas. - Google Patents

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Abstract

processo para a preparação de suspensões de células humanas desinfetadas. a presente invenção se refere a um processo para a produção de preparados de células individuais desinfetadas a partir de tecidos de mamíferos e aos preparados deste modo produzidos.

Description

DESCRIÇÃO [0001] A presente invenção se refere a um processo para a produção de preparados de células individuais desinfetadas e aos preparados deste modo produzidos.
[0002] Os transplantes de fígado são as intervenções mais importantes para a salvação de vidas no caso de uma falência aguda ou crônica do fígado. Para se satisfazer a necessidade de material de transplante que não pode ser coberta somente por meio de doação de órgãos, foram desenvolvidos nos últimos anos métodos alternativos a um transplante completo do órgão, por exemplo, o transplante parcial do fígado ou o transplante de preparados de células hepáticas.
[0003] Os preparados de células individuais são de interesse particular, pois eles podem ser obtidos de órgãos doados que não são adequados para o transplante do órgão em si. Para se obter hepatócitos a partir de tecidos hepáticos, é conhecido um método de perfusão de duas etapas, que emprega um tampão contendo colagenase e um tampão contendo EDTA (Berry e Friend, 1969, The Journal of Cell Biology, Vol. 43, páginas 506-520). No referido método, as células individuais são extraídas enzimaticamente do conjunto tecidual através da perfusão do tecido hepático com o tampão contendo colagenase.
[0004] Como os preparados de células individuais obtidos representam medicamentos, a esterilidade microbiana deve ser garantida em cada caso. Isto, no entanto, não é o
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2/23 caso em aproximadamente 70 a 80% dos preparados, uma vez que a contaminação geralmente já existe no meio de transporte do órgão, originando-se esta contaminação em geral do material do órgão ou material do tecido do doador. No caso de um material tão valioso como o constituído por órgãos humanos de doadores é desejável, no entanto, se obter com um grande rendimento preparados de tecidos ou de células transplantáveis não contaminadas por micróbios. Processos convencionais de descontaminação, como aquecimento, autoclave ou irradiação, tornam impossível a manutenção da viabilidade das células e, portanto, não podem ser usados para desinfetar o tecido.
[0005] Da mesma forma, também são conhecidos processos para a descontaminação de tecidos por meio de antibióticos. Eles foram desenvolvidos, por exemplo, para o armazenamento de transplantes de córnea (US 4,695,536) ou para a descontaminação de transplantes de válvulas cardíacas (WO 92/12632 e EP 0 889 690). Os tempos de exposição às composições antibióticas empregadas em tais processos variam de 24 horas até um armazenamento por muitas semanas. Mesmo um tempo de exposição de 24 horas, no entanto, é inadequado para tecidos extremamente sensíveis, como o fígado. Além disso, a descontaminação com estes processos é somente superficial. Outra exigência dos processos de descontaminação à base de antibióticos para tecidos e células consiste no fato de que os processos assim como os agentes empregados nos mesmos não devem ter uma influência negativa nem sobre a obtenção das células hepáticas nem sobre a qualidade das células e viabilidade das mesmas, e devem ainda
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3/23 ser compatíveis com o sistema de verificação de esterilidade empregado para o controle de qualidade.
[0006] Portanto, o problema técnico que serve de base para a presente invenção consiste na obtenção de processos para uma descontaminação, isto é, uma desinfecção branda e eficaz dos tecidos, processos estes que superam os inconvenientes citados acima, garantindo, particularmente, uma desinfecção mais eficaz e mais rápida do tecido em condições particularmente brandas, conservando-se ao mesmo tempo a viabilidade do tecido ou das células, mesmo quando este tecido ou as células nele contidas forem altamente sensíveis, isto é, por exemplo, como as que se originam do fígado.
[0007] O problema técnico que serve de base para a presente invenção é solucionado pelos ensinamentos contidos nas reivindicações independentes. Em uma concretização particularmente preferida, a presente invenção se refere, portanto, a um processo para a produção de preparados desinfetados, em particular preparados de células individuais, provenientes dos tecidos de mamíferos, em particular tecidos humanos, compreendendo as seguintes etapas de processo: a) perfusão do tecido obtido de mamíferos com uma composição antibiótica líquida, b) realização de um tratamento enzimático do tecido, em particular para a obtenção de uma suspensão de células individuais, e c) obtenção dos preparados desinfetados, em particular preparados de células individuais, isto é, preparados em que as células não se encontram mais dentro de um conjunto tecidual, mas isoladas umas das outras como células
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4/23 individuais ou, opcionalmente, como agrupamentos de células ou agregados celulares menores. A presente invenção, portanto, vantajosamente fornece um processo com o qual preparados desinfetados, em particular preparados de células individuais, preferivelmente suspensões de células individuais, podem ser preparados a partir dos tecidos, isto é, por exemplo, de conjuntos de células ou órgãos, de mamíferos, particularmente de seres humanos, em um processo in vitro. De acordo com a invenção, é vantajosamente possível obter um preparado de células que se presta particularmente adequado para um teste de esterilidade confiável. O procedimento de acordo com a presente invenção permite, portanto, um teste de esterilidade que proporciona um alto grau de confiabilidade para a esterilidade dos preparados obtidos.
[0008] A presente invenção parte dos tecidos fornecidos de mamíferos, que podem se originar, por exemplo, de mamíferos vivos ou mortos, particularmente de mamíferos que acabaram de morrer. Em uma modalidade particularmente preferida, subentendem-se como mamíferos seres humanos ou animais, por exemplo, animais de criação ou de laboratório, em particular porcos, vacas, cavalos, cães, gatos, ovelhas, cabras, macacos, primatas, aves ou roedores.
[0009] O tecido, em particular complexos celulares ou órgãos, extraído de mamíferos doadores e, deste modo, providos para a presente invenção, é empregado como material de partida na presente invenção. A presente invenção prevê que o tecido deste modo fornecido seja colocado em contato com uma composição antibiótica e seja perfundido,
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5/23 empregando-se, preferivelmente, o sistema vascular próprio do tecido, tal como do órgão. A presente invenção prevê, ainda, que o tecido seja submetido a um tratamento enzimático tanto durante ou após sua perfusão com a composição antibiótica, no decorrer deste tratamento o conjunto tecidual é dissolvido e uma suspensão de células individuais é obtida. Deste modo, a composição antibiótica contém células individuais que podem ser, deste modo, tratadas antibioticamente de um modo particularmente eficaz, e, assim, desinfetadas.
[0010] Em conexão com a presente invenção, uma preparação de células individuais ou uma suspensão de células individuais deve ser entendida como significando, em particular, uma preparação ou suspensão na qual as células existem individualmente e sem contato físico permanente entre si. Em uma concretização adicional, uma preparação de células individuais ou como uma suspensão de células individuais também deve ser entendida como significando aquela em que a proporção predominante das células que estejam presentes, em particular mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90% ou mais de 95% das células, seja formada por células separadas entre si e sem nenhum contato físico permanente entre si e que o restante das células até 100% se encontre na forma de aglomerados de células, agregados celulares menores ou maiores e resíduos dos conjuntos teciduais que não tenham se dissolvido completamente.
[0011] Em conexão com a presente invenção fica subentendido como perfusão, em particular, uma perfusão de
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6/23 tecido, isto é, a passagem de um líquido, isto é, a presente composição antibiótica, através de um órgão oco, ou dos vasos, em particular vasos sanguíneos, contidos no tecido. Em conexão com a presente invenção, uma perfusão representa um tipo particularmente preferido de incubação.
[0012] Em conexão com a presente invenção, subentende-se como tecido um conjunto coeso de células, tendo, em particular, a mesma função e/ou morfologia, em particular, também, um órgão, tal como um fígado, uma parte de órgão, um conjunto tecidual ou um material de dissecação, em particular obtido do fígado, tal como um material de dissecação do fígado. De acordo com a presente invenção, o tecido empregado é tecido hepático, por exemplo, um fígado completo ou uma parte dele, por exemplo, um material de dissecação do fígado. As suspensões de células individuais preparadas de acordo com a presente invenção são, de preferência, suspensões de células hepáticas.
[0013] Em uma concretização particularmente preferida, é previsto se conduzir a etapa de processo a) em conjunto, isto é, simultaneamente ou com sobreposição temporal, com a etapa de processo b), isto é, a perfusão é realizada usando uma composição antibiótica, de preferência presente em pelo menos um tampão de perfusão, em que simultaneamente pelo menos um tampão de perfusão contém pelo menos uma enzima para o tratamento enzimático do tecido para a obtenção de uma suspensão de células individuais. Entretanto, também é preferido realizar a perfusão inicialmente com uma composição antibiótica isenta de enzimas, que está preferivelmente contida em pelo menos um
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7/23 tampão de perfusão, procedendo-se em seguida a um tratamento enzimático isento de antibióticos, de acordo com a etapa b), durante a qual o conjunto tecidual é dissolvido e as células individuais do tecido empregado na etapa a) são obtidas, de modo que, na etapa c) são obtidas células individuais completamente desinfetadas.
[0014] De acordo com a presente invenção, também pode ser fornecida em uma etapa de processo opcional a rinsagem da superfície do tecido utilizado antes da perfusão de acordo com a invenção, com uma composição antibiótica, de preferência com a composição antibiótica empregada de acordo com a presente invenção, em particular sem perfusão do referido tecido, realizando, portanto uma descontaminação superficial primária. Neste caso o tempo de incubação leva, de preferência, somente de 5 a 60 minutos, de preferência de 5 a 45 minutos, sendo especialmente preferido de 5 a 30 minutos. Caso se queira, no caso de um tempo de incubação pequeno, também pode ser empregada uma concentração de antibiótico maior do que durante a perfusão. Em uma concretização da presente invenção, a rinsagem superficial também pode ser conduzida durante as etapas de processo a) e/ou b).
[0015] O tratamento enzimático do tecido previsto pela presente invenção para a obtenção de uma suspensão de células individuais emprega, de preferência, pelo menos uma, ou, de preferência, pelo menos duas enzimas que se encontram em uma solução preferivelmente aquosa, em particular em uma solução tamponada, tal como, em uma concretização preferida, em uma composição antibiótica líquida. As enzimas empregadas
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8/23 para o tratamento enzimático são capazes de desfazer o conjunto tecidual, em particular de dissolver os contatos célula/célula e célula/matriz extracelular, e produzir a partir daí, uma suspensão de células individuais sem danificar ou destruir as células. Em uma concretização preferida de acordo com a presente invenção, são particularmente adequadas as enzimas colagenases, proteinases e misturas das mesmas. Em conexão com a presente invenção, uma proteinase é subtendida também como sendo uma protease.
[0016] Preferência é dada às misturas de colagenase e protease, em particular proteases neutras, em uma relação de atividade enzimática de 1 unidade de colagenase para 40 a 60, de preferência, 50 unidades de protease.
[0017] Portanto, para cada perfusão são empregadas, de preferência, aproximadamente 2000 a 4000 unidades Wünsch de colagenase em combinação com 100.000 unidades de caseína, ou com 400 a 2500 unidades de clostridiopeptidase I.
[0018] Em uma concretização particularmente preferida do processo da presente invenção, o tecido é, portanto, perfundido ín vitro com a composição antibiótica, contida, de preferência, em pelo menos um tampão de perfusão, e que contém pelo menos uma enzima para a dissolução do tecido em células individuais, em particular, contendo a) pelo menos uma colagenase ou b) pelo menos uma colagenase e pelo menos uma proteinase, em particular uma proteinase neutra. Isto leva à desinfecção e à separação de células individuais do conjunto tecidual e, assim, à obtenção de preparados de células individuais desinfetados.
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Alternativamente, em outra concretização preferida, a colagenase (ou a colagenase e a proteinase) pode estar contida separadamente do pelo menos um ingrediente ativo antibiótico, de preferência dos ingredientes ativos antibióticos, no pelo menos um tampão de perfusão, de preferência um tampão fosfato-HEPES, em um solvente separado, por exemplo, um tampão, e pode ser empregada separadamente da etapa de perfusão com antibiótico, isto é, subsequentemente a ela.
[0019] De acordo com a presente invenção, a composição antibiótica empregada de acordo com a presente invenção se encontra na forma líquida, por exemplo, como uma solução ou suspensão, preferivelmente como uma solução ou suspensão aquosa, sendo particularmente preferido que se encontre em pelo menos um tampão de perfusão.
[0020] Em uma concretização particularmente preferida, a composição antibiótica líquida compreende pelo menos um, de preferência pelo menos dois, em particular pelo menos três, de preferência pelo menos quatro ou mesmo mais antibióticos diferentes. Estes podem ser selecionados do grupo que consiste das não penicilinas dos antibióticos βlactâmicos, aminoglicosídeos, antibióticos glicopeptídeos e antibióticos polipeptídeos.
[0021] Em uma concretização preferida, a composição antibiótica empregada de acordo com a presente invenção não apresenta nenhum efeito negativo ou inibitório sobre o tratamento enzimático empregado, em particular o tratamento com colagenase ou proteinase.
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10/23 [0022] Em uma concretização preferida da presente invenção, pode ser previsto que a composição antibiótica seja isenta de colagenases e proteinases.
[0023] A composição antibiótica, em particular uma combinação antibiótica que é preferivelmente usada de acordo com a invenção, é vantajosamente caracterizada pelo fato de não ter nenhum efeito negativo sobre a vitalidade e a morfologia das células isoladas.
[0024] O pelo menos um antibiótico, em particular os antibióticos, se encontram na composição de acordo com a presente invenção em quantidades que fazem com que o crescimento, a multiplicação e/ou a viabilidade dos microrganismos, tais como bactérias, preferivelmente aquelas que ocorrem nos meios de transporte dos órgãos de doadores, sejam substancialmente reduzidos ou inibidos, permanecendo substancialmente intacta a viabilidade do tecido ou das células.
[0025] Em conexão com a presente invenção, deve ser entendida como significando uma composição de substâncias que possui eficácia antibiótica. Em conexão com a presente invenção, compreende-se como uma eficácia antibiótica um efeito deletério, em particular um efeito deletério antimicrobiano, tal como morte, inibição de reprodução, redução da reprodução, inibição do crescimento ou redução do crescimento, em particular um efeito destruidor sobre os microrganismos, em particular bactérias, e especificamente ambas as bactérias aeróbias e anaeróbias gram-positivas e gram-negativas, fungos, protozoários ou produtos de reprodução dos mesmos, tais como esporos ou germes. É
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11/23 particularmente preferido que a composição antibiótica seja particularmente eficaz contra os microrganismos que ocorrem dentro ou sobre os tecidos ou órgãos de doadores mamíferos ou nos meios de transporte dos mesmos.
[0026] Em conexão com a presente invenção, uma eficácia antibiótica é, portanto, preferivelmente entendida como significando que os microrganismos são destruídos, isto é, que a composição antibiótica tem um efeito microbicida, de preferência bactericida. De acordo com a presente invenção, em uma concretização da invenção, a eficácia antibiótica não precisa estar necessariamente associada com um efeito microbicida, mas pode também significar que os microrganismos estão meramente limitados em suas funções vitais, por exemplo, o seu crescimento, metabolismo ou reprodução, isto é, ocorre um efeito microbiostático, em particular um efeito bacteriostático.
[0027] Em conexão com a presente invenção, o termo eficácia antibiótica é compreendido com sendo também, de preferência, um efeito de desinfecção, isto é, a composição antibiótica possui particularmente de modo preferencial um efeito desinfetante, isto é, ela livra os materiais empregados, por exemplo, tecidos e/ou células, de microrganismos vivos, de preferência totalmente ou quase totalmente, ou mata os referidos microrganismos. A desinfecção engloba não somente a remoção ou morte dos germes, isto é, dos estágios precoces de desenvolvimento de um microrganismo, como também de todos os outros estágios de desenvolvimento dos microrganismos, inclusive suas formas definitivas ou partes infecciosas dos microrganismos. Uma
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12/23 desinfecção também deve ser entendida como uma redução significativa do número de microrganismos reprodutíveis, em particular que o teor residual de microrganismos reprodutíveis em uma unidade do produto desinfetado seja no máximo 10-6 unidades formadoras de colônia. Em conexão com a presente invenção, uma desinfecção significa também uma descontaminação.
[0028] Em uma concretização particularmente preferida, a composição antibiótica líquida se encontra em pelo menos um tampão de perfusão.
[0029] Portanto, a presente invenção se refere a um processo no qual é empregada uma composição antibiótica que compreende, de preferência consiste de antibióticos não penicilinas do grupo das β-lactamas, aminoglicosídeos, antibióticos de glicopeptídeos, e/ou antibióticos de polipeptídeos, de preferência em pelo menos um tampão de perfusão. A composição antibiótica empregada de acordo com a presente invenção é adequada, em particular adequada e destinada, para a desinfecção in vitro de tecidos de mamíferos e de células de mamíferos, de preferência de tecidos, órgãos ou componentes de órgão humanos e de células humanas, em particular de tecido hepático e células hepáticas. A desinfecção do tecido isolado é obtida pela perfusão com a composição antibiótica empregada de acordo com a presente invenção, utilizando-se o sistema vascular natural. Deste modo, atinge-se uma desinfecção microbiana do tecido integral, incluindo o tecido interno e o tecido de difícil acesso e não somente da sua superfície. Isto é particularmente importante, especialmente no caso do fígado,
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13/23 uma vez que em pacientes terminais as bactérias percorrem as paredes intestinais em diferentes graus e, assim, são possivelmente lavadas pela perfusão através do sistema porta do órgão a ser retirado. Também pode ocorrer uma contaminação retrógrada através do sistema de dutos biliares, que se encontra fisiologicamente em contato direto com a flora intestinal. Apesar de técnicas operacionais ótimas, tal contaminação, portanto, nunca será totalmente impedida e faz com que seja particularmente necessária uma descontaminação branda e eficaz com a composição antibiótica empregada de acordo com a presente invenção. Além disso, tal contaminação “interna” em certas circunstâncias pode fazer com que os patógenos no meio de transporte não possam ser inicialmente detectados, sendo, então somente liberados durante a dissociação enzimática do material tecidual. Uma desinfecção do tecido isolado por perfusão com a composição antibiótica de acordo com a presente invenção faz, portanto, vantajosamente com que se eliminem precocemente tais contaminações “internas”. Assim, sem o acréscimo de antibióticos, praticamente 100% dos preparados de células hepáticas produzidos a partir de fígado usando meio de transporte contaminado são, desta forma, contaminados. Entretanto, em virtude da descontaminação de acordo com a presente invenção, os preparados de células hepáticas desinfetados em mais de 65% puderam ser preparados.
[0030] É preferível que o tecido seja perfundido em pelo menos uma etapa de perfusão, de preferência em duas, três, quatro ou mais etapas de perfusão, por exemplo, em três etapas. Em uma concretização preferida podem ser
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14/23 empregados em cada caso para cada etapa de perfusão de 3 a 5 litros de tampão de perfusão contendo antibiótico e/ou contendo colagenase/proteinase, de preferência um tampão fosfato/HEPES. É particularmente preferido no caso de três etapas de perfusão que todos os três tampões de perfusão, de preferência, primeiro em um tampão fosfato/HEPES contendo EGTA ou EDTA e em seguida em duas vezes um tampão fosfato/HEPES, contenham antibióticos, sendo preferivelmente empregado a colagenase/proteinase somente na última etapa de perfusão. Também é particularmente preferido, no caso de três etapas de perfusão, que somente os dois primeiros tampões de perfusão contenham antibióticos e que a colagenase/proteinase seja empregada na última etapa de perfusão em um tampão de perfusão isento de antibióticos.
[0031] Em uma concretização particularmente preferida, a composição antibiótica se encontra em pelo menos dois tampões de perfusão, em particular em dois tampões de perfusão, em particular ou a saber pelo menos um tampão fosfato/HEPES contendo EGTA ou EDTA e pelo menos um tampão fosfato/HEPES ou outras soluções tampão adequadas.
[0032] Os tampões de perfusão que são empregados para a perfusão, isto é, para a passagem pelo material tecidual, consistem preferivelmente nos tampões fosfato/HEPES (ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)-etanossulfônico), mas também nos tampões fosfato/HEPES contendo EGTA (ácido etilenoglicol-bis(aminoetil éter)-N,N,-tetracético) ou EDTA (ácido etileno-diamino-tetracético). Os tampões de perfusão empregados apresentam, preferivelmente, um pH fisiológico de
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15/23 a 8, sendo especialmente preferido de 7,3 a 7,8, em particular 7,5.
[0033] Em uma concretização particularmente preferida, tanto o tempo de perfusão como o tempo de tratamento enzimático são cada um de 10 a 360 minutos, de preferência de 20 a 240 minutos, em particular de 30 a 120 minutos. Em uma concretização particularmente preferida, a perfusão e o tratamento enzimático do tecido ocorrem preferivelmente ao mesmo tempo, em particular durante um período de 10 a 360 minutos, de preferência de 20 a 240 minutos, em particular de 30 a 120 minutos.
[0034] Em uma concretização adicional particularmente preferida, a temperatura tanto para a perfusão como também para o tratamento enzimático é de 9 a 39°C, de preferência de 10 a 37°C, em particular de 25 a 37°C. Em uma concretização preferida, durante a perfusão e eventualmente durante o tratamento enzimático, a temperatura da composição antibiótica de perfusão e do órgão perfundido é aumentada, sendo particularmente preferido que o seja de uma temperatura inicial na faixa de abaixo de 10°C, por exemplo, de 4°C a 10°C, até uma temperatura final na faixa de 30°C a 39°C, por exemplo 37°C.
[0035] Em uma concretização particularmente preferida da presente invenção, a composição antibiótica empregada contém a) pelo menos uma colagenase ou b) pelo menos uma colagenase e pelo menos uma proteinase, em particular uma proteinase neutra. Devido à presença de colagenase ou de colagenase e proteinase, uma dissociação do material tecidual é alcançada durante a incubação, em
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16/23 particular perfusão, e, dessa forma, as suspensões de células individuais podem ser obtidas.
[0036] Em uma concretização preferida, a presente invenção também propõe um processo para a desinfecção de um tecido ou para a produção de um preparado desinfetado de células de mamíferos in vitro, em que a) o tecido de mamíferos é perfundido com uma composição antibiótica de acordo com a presente invenção em condições adequadas, em particular durante um período adequado e a uma temperatura adequada; b) é realizado um tratamento enzimático para preparar uma suspensão de células individuais a partir do tecido, de maneira temporalmente em sobreposição, isto é, pelo menos de forma simultânea para uma dada duração, ou subsequentemente; e c) um preparado de células desinfetadas é obtido.
[0037] Em uma concretização particularmente preferida da presente invenção, é previsto se fazer com que os preparados de células desinfetados obtidos por meio do processo de acordo com a presente invenção sejam submetidos subsequentemente a pelo menos uma, por exemplo uma, duas, três, ou mais etapa(s) de lavagem, etapa(s) de isolamento ou ambas, que reduz(em) a concentração dos antibióticos, enzimas ou ambos que são utilizados, ou que elimina(m) estes completamente ou quase completamente dos preparados obtidos. É particularmente preferível que, subsequentemente à etapa de processo b), por exemplo antes ou depois da etapa de processo c), seja realizada uma ou mais etapas de lavagem, preferivelmente com um tampão de lavagem isento de antibióticos. Isto leva vantajosamente à situação em que os
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17/23 antibióticos e enzimas empregados no processo da presente invenção sejam completamente ou quase completamente eliminados, e que os preparados de células individuais obtidos sejam adequados para um teste de esterilidade subsequente.
[0038] Em uma concretização preferida, pode ser previsto se fazer com que os preparados de células desinfetadas obtidos sejam criopreservados para fins de conservação. Para tal finalidade, os preparados são armazenados em um meio adequado para criopreservação a uma temperatura baixa adequada.
[0039] Vantajosamente, foi possível mostrar de acordo com a invenção que, em virtude do processo de acordo com a presente invenção, puderam ser alcançados um maior rendimento celular (número total de células obtidas), um maior rendimento de células específicas (número de células por grama de tecido hepático utilizado) e uma maior vitalidade das células hepáticas isoladas desinfetadas (proporção de células vivas em suspensão) dentro de um tempo consideravelmente mais rápido.
[0040] O uso da composição antibiótica empregada de acordo com a presente invenção permite vantajosamente que os preparados de células individuais desinfetados, em particular, preferivelmente, as suspensões de células em, por exemplo, meio de cultura, que não eram previamente obteníveis, em particular a partir de células hepáticas, sejam obtidos de uma maneira particularmente rápida, suave e eficaz a partir de, por exemplo, órgãos de doadores que
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18/23 estejam disponíveis para transplante, mas não sejam adequados para essa finalidade.
[0041] O procedimento de acordo com a presente invenção apresenta a vantagem de que o tratamento com antibióticos que é realizado não prejudica um tratamento enzimático, em particular um tratamento com colagenase e/ou com proteinase, que é realizado tanto simultaneamente ou subsequentemente a ele e, além disso, tampouco influencia negativamente sobre os testes de esterilidade que são subsequentemente realizados. Em uma concretização particularmente preferida, as composições antibióticas empregadas de acordo com a presente invenção são, portanto, adequadas para a produção de suspensões de células desinfetadas a partir de tecidos, isto é, não de células individuais no meio que se encontram em conjuntos teciduais ou de órgãos. Para a perfusão do tecido de mamífero isolado ou do órgão isolado, a composição antibiótica que é utilizada de acordo com a invenção e que está contida em pelo menos um tempão de perfusão, é usada em volumes que são preferivelmente adaptados às dimensões do tecido ou do órgão. Estes volumes podem ser determinados empiricamente, conforme é do conhecimento das pessoas versadas na técnica.
[0042] A presente invenção também se refere aos preparados de células desinfetadas, isto é, às células, suspensões de células ou a suspensões de células individuais provenientes de mamíferos, que foram preparadas de acordo com um dos processos da presente invenção.
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19/23 [0043] Outras concretizações vantajosas da presente invenção serão evidentes a partir das reivindicações dependentes.
[0044] A invenção será explicada em mais detalhes nos exemplos que seguem. Os exemplos não devem ser entendidos como limitantes, devendo, pelo contrário, que as vantagens da invenção sejam explicadas com mais detalhes e sejam ilustradas por meio de exemplos específicos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Preparação de suspensões de células hepáticas desinfetadas com um tratamento simultâneo com antibióticos e com enzimas.
A. Execução [0045] Para a preparação de suspensões de células hepáticas desinfetadas a partir de um fígado, foi preparada a seguinte composição antibiótica:
[0046] Os antibióticos foram adicionados nas seguintes concentrações a todos os tampões de perfusão dados:
ANTIBIÓTICO CONCENTRAÇÃO
MEROPENEM 0,2 mg/ml
VANCOMICINA 0,05 mg/ml
[0047] Um fígado de doador múltiplo inadequado para um transplante total do órgão foi inicialmente rinsado na superfície com 5 l de tampão fosfato/HEPES contendo antibiótico durante 30 minutos à temperatura ambiente, sendo, em seguida, perfundido em três etapas com os seguintes volumes de tampões contendo antibióticos, pH 7,25-7,45:
1. 5 l de tampão fosfato/HEPES contendo EDTA: perfusão 10 min.; 20-40°C;
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20/23
2. 5 l de tampão fosfato/HEPES; perfusão 10 min.; 254 0°C;
3. 3 l de tampão fosfato/HEPES contendo colagenase/ protease; perfusão 24 min.; 25-40°C.
[0048] Concentração de colagenase/protease: combinação de 2000 unidades Wünsch de colagenase I e 400 a 2500 unidades de protease (clostridiopeptidase I).
[0049] O tempo de perfusão com os tampões contendo enzima e antibióticos foi de 44 minutos no total. Para a perfusão foi utilizado o sistema natural de vasos sanguíneos do fígado empregado.
[0050] Durante a perfusão a temperatura do órgão perfundido e do ambiente circundante foi lentamente aumentada de <10°C para 37°C (temperatura de tampão entre a temperatura ambiente e 40°C).
[0051] Após serem isoladas do tecido, as células foram lavadas várias vezes com tampão isento de antibiótico até a concentração de antibiótico estar abaixo de 1/1000 da concentração de antibiótico empregada.
[0052] Uma amostra para o controle de esterilidade foi extraída tanto do meio de transporte no qual o órgão foi fornecido como também da suspensão de células desinfetadas depois da criopreservação.
B. Resultados [0053] Os seguintes microrganismos foram detectados no meio de transporte: Enterobacter cloacae, Acínetobacter baumannii, em que o tempo tomado durante a incubação automática, até ter sido determinado o crescimento
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21/23 microbiano, o tempo denominado “Tempo para positividade”, foi de 1,67 horas.
[0054] Na suspensão de células desinfetadas de acordo com a presente invenção não foi detectada a presença de germes após a criopreservação, mesmo depois de 14 dias de incubação.
[0055] Depois de um número suficiente de etapas de lavagem com tampão isento de antibióticos pode ser realizado um teste de esterilidade com as suspensões de células produzidas.
Exemplo 2: Preparação de suspensões de células hepáticas desinfetadas com tratamento sequencial com antibióticos e com enzimas
A. Execução [0056] Um fígado de um multidoador inadequado para o transplante total de órgão foi inicialmente rinsado na superfície com 5 l de tampão fosfato/HEPES com um concentração de antibióticos dobrada durante 8 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, perfundido em duas etapas com tampões contendo antibióticos e, em uma etapa adicional, com tampão contendo colagenase e isento de antibióticos nos seguintes volumes, pH 7,25-7,45:
1. 10 l de tampão fosfato/HEPES contendo EDTA; perfusão 68 min.; 20 - 40°C;
2. 5 l de tampão fosfato/HEPES; perfusão 10 min.; 25 - 40°C;
3. 3 l de tampão fosfato/HEPES contendo colagenase/protease e isento de antibiótico; perfusão 24 min.; 25 - 40°C.
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22/23 [0057] Concentração de colagenase/protease: combinação de 2000 unidades Wünsch de colagenase I e 400 a 2500 unidades de protease (clostridiopeptidase I).
[0058] O tempo de perfusão com os tampões contendo enzimas e antibióticos foi de 102 minutos no total. Para a perfusão, foi utilizado o sistema de vasos sanguíneos natural do fígado empregado.
[0059] Durante a perfusão, a temperatura do órgão perfundido e do ambiente circundante foi lentamente aumentada de <10°C até 37°C (temperatura de tampão entre a temperatura ambiente e 40°C).
[0060] Após serem isoladas do tecido, as células foram lavadas várias vezes com tampão isento de antibiótico até a concentração de antibiótico estar abaixo de 1/1000 da concentração de antibiótico empregada.
[0061] Uma amostra para o controle de esterilidade foi extraída tanto do meio de transporte no qual o órgão foi fornecido como também da suspensão de células desinfetadas depois da criopreservação.
B. Resultados [0062] Staphylococcus aureus foi capaz de ser detectado no meio de transporte. O tempo durante a incubação automática até ter sido determinado o crescimento microbiano, o tempo denominado “Tempo para positividade”, foi de 3,85 horas.
[0063] Na suspensão de células desinfetadas de acordo com a presente invenção não foi detectada a presença de germes após a criopreservação, mesmo depois de 14 dias de incubação.
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23/23 [0064] Depois de um número suficiente de etapas de lavagem com tampão isento de antibióticos pode ser realizado um teste de esterilidade com as suspensões de células produzidas.

Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para a preparação e obtenção de preparados de células desinfetadas a partir de tecidos de mamíferos caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas de processo:
    a) perfusão dos tecidos provenientes de mamíferos com uma composição antibiótica líquida isenta de enzimas que compreende pelo menos um antibiótico e que está contida em pelo menos um tampão de perfusão,
    b) realização de um tratamento enzimático isento de antibióticos do tecido para a obtenção de uma suspensão de células individuais, e
    c) obtenção dos preparados de células desinfetadas, em que o tratamento enzimático de acordo com a etapa b) ocorre após a etapa a).
  2. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido consiste em tecido hepático.
  3. 3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tratamento enzimático é um tratamento com colagenase e/ou proteinase.
  4. 4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tempo de perfusão na etapa de processo a) é de 30 a 120 minutos e a temperatura é aumentada durante a perfusão, em que a temperatura inicial é entre 4°C e 10°C e a temperatura final é na faixa de 30°C e 39°C.
    Petição 870190008054, de 24/01/2019, pág. 33/35
    2/2
  5. 5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição antibiótica líquida está contida em pelo menos dois tampões de perfusão, a saber, pelo menos um tampão HEPES/fosfato contendo EGTA ou EDTA e pelo menos um tampão HEPES/fosfato.
  6. 6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a superfície do tecido é rinsada com uma composição antibiótica líquida antes da etapa de processo a).
  7. 7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma etapa de lavagem utilizando um tampão de lavagem isento de antibiótico é realizada após a etapa de processo
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