SU1578192A1

SU1578192A1 - Способ выращивани клеток печени

Info

Publication number: SU1578192A1
Application number: SU884416107A
Authority: SU
Inventors: Людмила Александровна Осипова; Татьяна Анатольевна Алексеева; Надежда Ивановна Немлий; Анатолий Иосифович Быкорез; Сергей Викторович Михаловский; Михаил Владимирович Абрамов
Original assignee: Институт проблем онкологии им.Р.Е.Кавецкого
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1988-04-26
Publication date: 1990-07-15

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл выращивани культур клеток печени, пригодных дл трансплантации в цел х коррекции печеночной недостаточности. Цель изобретени - повышение эффективности прикреплени , роста и функционировани клеток. Дл культивировани изолированных клеток печени используют носитель из нетканного распущенного углеродного сорбента, покрытого коллагеном или полилизином. Толщина носител в пределах 3-10 мм, а объем сорбционных пор углеродного сорбента по бензолу 0,5-0,8 см 3/г. Выращивают клетки в глубинных услови х. Использование способа увеличивает в 6-10 раз количество культивируемых гепатоцитов, а выращиваемые на матрице гепатоциты функционируют как дифференцированные клетки печени.

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано дл выращивани культур клеток печени , пригодных дл трансплантации в цел х коррекции печеночной недостаточности .

Цель изобретени - повышение эффективности прикреплени , роста и функционировани клеток.

Носитель представл ет собой углеродный сорбент низкой емкости (объем сорбционных пор по бензолу 0,5- 0,8 см5/г), структурированный в виде войлока толщиной 3-10 мм. Носитель стерилизуют кип чением в дистиллированной воде, пропитывают 0,02% раствором коллагена или полилизина , высушивают в вакуумном сушильном шкафу стерильно, хран т при 4°С з среде дл культивировани .

Клетки выделенные из печени млекопитающих энзиматическим методом, суспендируют в питательной среде в концентрации 10 млн/мл, нанос т капл ми на предварительно увлажненный питательной средой носитель.

Подготовленную таким образом матрицу с клетками перенос т на чашки Петри, выдерживают 15-20 мин СОд,- инкубаторе, добавл ют питательную среду в избытке и продолжают культивирование в атмосфере с 5-7% СО с ежедневной сменой среды.Неприкре- пившкес клетки удал ют с первой сменой среды. Увеличение площади поверхности за счет применени объСП

-vl

00

со

емных волокнистых материалов позвол ет повысить полезную площадь культивировани без увеличени обще.го объема аппаратуры, а также улучшить кооперативное взаимодействие культивируемых клеток печени. При этом особое значение имеет покрытие волокнистых материалов коллагеном или полилизином, улучшающим адгезию ге- патоцитов, а также емкость углеродного сорбента и толщина структурированной матрицы.

Способ иллюстрируетс следующими примерами.

Пример 1. Клетки печени выдел ют в стерильных услови х из ткани печени крысы последовательно проточной перфузией раствором: 0,027 М цитрат натри , 0,9%-ный хлористый натрий , 0,05%-на глюкоза, 5 мг/л гепарин (рН 7,35), затем рециркул цией 0,05%-ной коллагеназы на растворе Хенкса. Из суспензии изолированных клеток печени гепатоциты осаждают центрифугированием 50g 3 мин, суспендируют в среде дл культивировани в концентрации 10 млн/мл. Среда дл культивировани имеет следующий состав: среда Игла 10%-ный гид- ролизат лактальбумина, 20%-на сыворотка крупного рогатого скота, антибиотики (по 100 мкг/мл среды пенициллина и стрептомицина).

Матрицу готов т следующим образом

Углеродный сорбент с объемом сорб- ционных пор по бензолу 0,5 см3/г, структурированный в виде войлока, толщиной 3 мм стерилизуют кип чением в дистиллированной воде, пропитывают 0,02%.-ным раствором коллагена , высушивают в стерильных услови х в вакуумном сушильном шкафу при 37 С. Перед нанесением клеток матрицы перенос т в сосуды дл культивировани (чашки Петри), увлажн ют средой дл культивировани , избыток которой удал ют с помощью фильтровальной бумаги .

Суспензию гепацитов нанос т на марицу с помощью пипетки капл ми из расчета 100 мкл на 10 мг сорбента, выдерживают 15-20 мин при 37°С в С0Ј-инкубаторе, после чего в сосуды дл культивировани добавл ют избыток среды и продолжают инкубацию в подход щих услови х. Среду мен ют обычным способом ежедневно. Об эффективности прикреплени гепатоцитов су

0

5

0

5

0

5

40

45

50

55

д т по количеству открепившихс клеток, вы вл емых в среде на 2-3-тьи сутки после нанесени .

Количество неприкрепившихс клеток в % от числа нанесенных составл ет соответственно на 2-е и 3-й сутки культивировани 10,5 и 0,9%. В данном варианте на 1 мг матрицы культивируют 6,5-7,5x10 гепатоцитов. Микроскопирование разъединенных на отдельные волокна матриц показывает, что гепатоциты растут хорошо, часть из них прикреплена непосредственно к волокнам, а основна масса клеток растет в виде агрегатов различных размеров в межволоконном пространстве .

Пример 2. Услови проведени эксперимента такие же, как и в примере 1, но матрицу готов т следующим образом: стерилизованный кип чением войлочный сорбент с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см3/г, толщиной 3 мм пропитывают 0,02%-ным раствором полилизина и высушивают стерильно в вакуумном сушильном щка- фу при 37°С. Количество клеток, не прикрепившихс при нанесении и вы вленных в среде дл культивировани на 2-е и 3-й сут, составл ет соответственно 8,5 и 1% от числа нанесенных .

В данном варианте на 1 мг матрицы , покрытой полилизином, культивируют 7-8 х 10 гепатоцитов.

Пример 3. Услови проведени эксперимента соответствуют примеру 1, а в качестве матрицы используют углеродный сорбент с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см3/г, (структурированный в виде войлока толщиной 3 мм, но без предварительного покрыти Коллагеном или полилизином.

При этом количество клеток, вы вленных в среде дл культивировани на 2-е и 3-й сут после нанесени , составл ют соответственно 32 и 35% от числа нанесенных. Следовательно , данный вариант матрицы , не покрытой коллагеном или полилизином, непригоден дл культивировани гепатоцитов.

Пример 4. Услови проведени эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением толщины матрицы, составл ющей 5 мм и объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см3/г. Количество гепатоцитов, не прикрепившихс при

515

нанесении и вы вленных в среде дл культивировани , составл ет соответственно 8 и 3% от числа нанесенных . В данном варианте на 1 мг матрицы , представл ющей собой структурированный в виде войлока толщиной 5 мм углеродный сорбент, культивируют 7,5- 8,5 х 10 гепатоцитов.

Пример 5. Услови проведени эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением толщины матрицы , составл ющей 8-10 мм, из углеродного сорбента с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см3/г. При этом количество гепатоцитов, не прикрепившихс при нанесении и вы вленных в среде дл культивировани на 2-е и 3-й сут культивировани , составл ет соответственно 12 и 19% от числа нанесенных, а количество культивируемых гепатоцитов 5,5-6,0 х 10 на 1 кг матрицы.

Пример 6. Услови проведени эксперимента, как в примере 1, за исключением того, что углеродный сорбент , используемый в качестве матрицы , обладает объемом сорбционных пор по бензолу 0,8 см3/г и толщиной 3 мм. Количество неприкрепившихс при нанесении и вы вленных в среде дл культивировани гепатоцитов составл ет на 2-е и 3-й сут культивировани . 5,5 и 0% от числа нанесенных. В дан- ном варианте на 1 мг матрицы культивируют 9-10 х 10 гепатоцитов.

Пример 7. Услови проведени эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением того, что углеродный сорбент, используемый в качестве матрицы, обладает объемом сорбционных пор по бензолу 1,2 см3/г и толщиной 3 мм. Количество не прикрепившихс при нанесении и вы вленных в среде дл культивировани ге

0

5

0

1

5

0

5

0

926

патоцитов составл ет 23,5, в последующем также отмечаетс открепление значительного числа клеток.

Таким образом, использование углеродных сорбентов низкой емкости,структурированных в виде войлока толщиной 3-10 мм, покрытого предварительно коллагеном или полилиэином, позвол ет осуществить прикрепление и глубинное культивирование значительного количества изолированных клеток печени в малом объеме носител . Количество клеток печени, культивируемых по предлагаемому способу, в 6-10 раз выше, чем в известных способах, основанных на выращивании клеток на плоских или сферической формы подложках . Культивируемые на матрицах гепатоциты могут быть трансплантированы в брюшную полость сингенным животным с экспериментальной желтухой , что позвол ет также оценить жизнеспособность и функциональную активность высокодифференцированных клеток печени, растущих на матрицах , по коррекции печеночной недостаточности у животных-рецепиентов.

Claims

Формула изобретени

Способ выращивани клеток печени путем глубинного культивировани в питательной среде, отличающийс тем, что, с целью повышени эффективности прикреплени , роста и функционировани клеток, культивирование ведут на матрицах толщиной в 3-10 мм, выполненных из не- тканого распушенного углеродного сорбента с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5-0,8 см3/г, предварительно покрытого коллагеном или полилизином.