KR101821593B1

KR101821593B1 - 안질환 치료제

Info

Publication number: KR101821593B1
Application number: KR1020170024083A
Authority: KR
Inventors: 문성환; 이수진; 이승찬; 배윤수; 양재욱; 허대영
Original assignee: 압타바이오 주식회사
Priority date: 2017-02-23
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2018-01-25

Abstract

본 발명은 피라졸계 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안질환 예방 또는 치료제에 관한 것이다.

Description

안질환 치료제 {Therapeutic Agent For Eye Disorder}

본 발명은 피라졸계 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 안질환 치료제에 관한 것이다.

신생혈관생성 (Angiogenesis)은 기존의 미세혈관에서 가지치기를 통해 새로운 혈관이 발아하고, 이러한 발아혈관이 증식하여 새로운 모세혈관이 생성되는 과정을 일컫는다. 신생혈관생성은 생장인자, 사이토카인 및 기타 생리학적 분자와 같은 다양한 친혈관형성성 자극 뿐만 아니라 저산소증 및 낮은 pH와 같은 기타 인자에 반응하여 생기는 고도의 조절 과정이다. 새로운 혈관을 생성하기 위한 혈관형성 케스케이드는 세포외 매트릭스 (ECM) 리모델링, 침입, 이동, 증식, 분화 및 튜브 형성과 같은 필요한 세포 과정을 조절하는 다양한 분자의 협력을 필요로 한다. VEGF, bFGF, PDGF 등과 같은 친혈관형성성 분자는 VEGFR2-Flk1/KDR과 같은 세포 표면 수용체의 자극을 통하여 내피 세포를 활성화한다. 활성화된 세포는 세포 증식 과정을 거치고, 세포 접착 분자의 발현을 증가시키며 단백질분해성 효소의 분비를 증가시키고, 세포 이동 및 침입을 증가시킨다. 증식과 침입을 증가시키기 위하여는 인테그린 멤버, 셀렉틴 및 접착을 위한 면역글로불린 유전자 수퍼 패밀리 뿐만 아니라 ECM을 분해하기 위한 매트릭스 메탈로프로테이나아제 및 세린 프로테이나아제와 같은 단백질분해성 효소를 비롯한 다수의 분명한 분자가 관여한다. 최종적으로, ECM 성분 및 가용성 인자와 상호작용하는 세포 표면 수용체로부터 유도된 생화학적 시그널의 복잡한 케스케이드가 유발되어, 루멘 형성에 이르고 성숙한 혈관으로 분화하게 된다. 또한, 신생혈관생성의 주요인자인 VEGF는 활성산소 (Reactive oxygen species; ROS)에 의한 산화스트레스에 의해 발현이 촉진되는 것으로 알려져 있다.

신생혈관생성은 인체에서 배아의 발생, 태아의 성장, 태반의 증식, 황체 형성, 조직재생, 상처 치유 시에 매우 중요한 정상적인 과정이다. 그러나, 신생혈관생성이 비정상적으로 증가하거나 정상적으로 조절되지 못하면 신생혈관생성 자체가 병인이 되는 질환들이 있다. 신생혈관과 관련된 대표적인 질병으로는 당뇨망막병증 (Diabetic Retinopathy), 미숙아 망막증 (Retinopathy of prematurity; ROP), 가령성 황반변성증 (Age-related Macular Degeneration), 각막 신혈관신생, 신생혈관녹내장, 반점의 변성, 익상편 (Pterygium), 망막색소변성증 (Retinitis Pigmentosa), 과립성 결막염 등의 안질환이 있다 [비특허문헌 1 내지 4 참조].

안구에서는 신생혈관기작이 억제되어야 하나, 이것이 잘못된 신호로 인하여 신생혈관기작이 활성화 되면 심각한 안질환을 일으키며, 이는 후천성 실명의 주요원인이 되기도 한다. 특히 망막은 다른 근육보다 산소소비량이 300 ~ 600%로 높아서 활성산소에 대한 반응이 빠르게 일어나는 기관이고, 고농도의 포도당은 활성산소의 활성화를 통해 VEGF 발현을 촉진함으로써 안구 손상의 진행 및 가속화를 유도하는 것으로 보고되고 있다.

또한, 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr virus; EBV)는 여러 신생물성 이상(neoplastic disorders)을 일으키는 바이러스로 알려져 있다. 눈의 망막에의 EBV 감염은 드물지만 실제 임상에서 만성 활동성 EBV 감염 시 합병증의 하나로 EBV에 의한 망막염이 발생한다는 보고가 있으며, 이는 혈관신생과 이에 따른 망막괴사를 동반하는 것으로 알려져 있다 [비특허문헌 5 참조].

신생혈관과 관련된 안질환의 치료법으로는 레이저 치료, 광응고술, 냉동응고술, 그리고 광역학치료가 있다. 이러한 치료법은 모두 수술에 의한 치료법으로, 약품에 의한 치료법은 아직 개발단계에 머무르고 있다. 수술에 의한 치료는 모든 환자들에게 적용하여 시술할 수 없다는 큰 제약이 있을 뿐 아니라 성공률도 낮으며 또한 그 비용이 매우 커서 사회적, 경제적 부담이 크다. 더욱이 성공적으로 수술하더라도 신혈관생성의 재발 가능성이 약 50 ~ 70%로 높다는 문제가 있다. 또한, 수술을 할 수 없는 대부분의 환자는 현재 특별한 치료약이 없는 상태에서 많은 환자들이 실명에 이르고 있다.

인간의 수명이 연장되면서 이러한 안질환은 계속적으로 증가될 것이므로 적절한 치료제 개발이 시급히 요구된다. 현재 개발 중인 안질환 치료제는 스테로이드류, MMP 억제제, 맥관형성성 (angiogenic) 성장 인자에 대한 항체 등이 대부분이나, 이들 치료제는 낮은 치료효과 및 내성발현 등의 문제가 있다.

한편, 본 발명의 안질환 치료제에 유효성분으로 포함되는 피라졸계 화합물은대한민국 등록특허 10-1280160호 (특허문헌 1) 및 대한민국 등록특허 10-1633957호 (특허문헌 2)에 개시된 화합물이다. 특허문헌 1에는 피라졸계 화합물이 파골세포로의 분화를 억제하는 활성이 있음을 확인하고 골다공증 치료제로 유용함이 개시되어 있고, 특허문헌 2에는 피라졸계 화합물이 단백뇨 감소, 사구체혈관간 세포형성의 감소, 신장 섬유화 억제하는 활성이 있음을 확인하고 신장질환 치료제로 유용함이 개시되어 있다. 하지만, 특허문헌 1 및 2를 비롯하여 어떤 문헌에도 본 발명의 안질환 치료제에 유효성분으로 포함되는 피라졸계 화합물이 안구 내 신생혈관생성 억제제로 작용한다고 개시되어 있지 않다.

대한민국 등록특허 10-1280160호 대한민국 등록특허 10-1633957호

Amal A. E. et al., Retina 11: 244-249 (1991) Constantin J. P. et al., Ophthalmology 97: 1329-1333 (1990) Jin-Hong C. et al., Current opinion in Ophthalmology 12: 242-249 (2001) Peter A. C., J of Cellular Physiology 184: 301-310 (2000) Scahaal S, Kaplan HJ et al., JAMA opthalmol, 132(7): 881-2 (2014)

본 발명자들은 특허문헌 1과 2에 개시된 피라졸계 화합물에 대하여 새로운 의약용도를 찾기 위해 지속적으로 연구하던 중, 3-페닐-4-알킬-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 모핵구조의 화합물이 신생혈관생성의 주요 인자인 VEGF의 발현을 억제하는 효과 및 활성산소 (ROS)의 생성을 억제함으로써 안구 내 신생혈관생성을 효율적으로 억제한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 3-페닐-4-알킬-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올을 모핵구조로 하는 피라졸계 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 유효성분으로 포함된 안질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

상기한 과제 해결을 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상의 화합물이 유효성분으로 함유되어 있는 안질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R은 탄소수 1 내지 10의 직쇄형 또는 분쇄형 알킬기이다)

본 발명에 따른 약학 조성물은 우수한 신생혈관 저해효과 및 시력개선 효과를 가지므로 다양한 안질환 치료제로서 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 안질환은 구체적으로 당뇨망막병증 (DR), 당뇨황반부종, 가령성 황반변성증 (Age-related Macular Degeneration), 미숙아망막병증 (ROP), 결절맥락막혈관병증 (polypoidal choroidal vasculopathy), 허혈성증식망막증 (ischemic proliferative retinopathy), 망막색소변성증 (Retinitis Pigmentosa), 원추세포 이영양증 (cone dystrophy), 증식성유리체망막증 (PVR), 망막동맥폐색증, 망막정맥폐색증, 익상편 (Pterygium), 망막염, 각막염, 결막염, 포도막염, 레버씨 시신경위축증, 망막박리, 망막색소상피박리, 신생혈관녹내장, 각막 신혈관신생, 망막 신혈관신생, 맥락막 신혈관신생 (CNV) 및 바이러스 감염으로 인한 안질환 등이 포함될 수 있다.

도 1은 인간망막색소상피세포 (ARPE19)에서 신생혈관생성 관련 단백질 발현을 억제하는 피라졸계 화합물의 효과를 나타낸다.
도 2는 인간망막미세혈관내피세포 (HRMEC)에서 신생혈관생성 관련 단백질 발현을 억제하는 피라졸계 화합물의 효과를 나타낸다.
도 3은 망막혈관내피세포 (HRMEC)의 관형성을 억제하는 피라졸계 화합물의 효과를 나타낸다.
도 4는 당뇨 망막병증 동물 모델에서, 피라졸계 화합물에 의해 신생혈관의 증가를 억제하는 효과를 나타낸다.
도 5는 당뇨 망막병증 동물 모델에서, 피라졸계 화합물에 의해 망막 내 활성산소 (ROS)의 생성을 억제하는 효과를 나타낸다.
도 6은 당뇨 망막병증 동물 모델에서, 피라졸계 화합물에 의해 망막 내 신생혈관인자의 활성을 억제하는 효과를 나타낸다.
도 7은 당뇨 망막병증 동물 모델에서 피라졸계 화합물에 의해 망막 기능이 개선되는 효과를 나타낸다.
도 8은 맥락막 신생혈관 동물 모델 (CNV)에서, 피라졸계 화합물에 의해 신생혈관의 증가를 억제하는 효과를 나타낸다.
도 9는 EBV 감염 인간망막상피세포에서, 피라졸계 화합물에 의한 세포사멸 효과를 나타낸다.
도 10은 EBV 감염 인간망막상피세포에서, 피라졸계 화합물에 의한 활성산소 (ROS)의 생성을 억제하는 효과를 나타낸다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상의 화합물이 유효성분으로 함유되어 있는 안질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

또한, 본 발명의 약학 조성물에 함유되는 피라졸계 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 알칼리금속염, 알칼리토금속염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 산성 아미노산과의 염 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은 상기 화학식 1의 유리염기에 알칼리 금속 (예컨대, 나트륨, 칼륨 등), 알칼리 토금속 (예컨대, 칼슘, 마그네슘, 바륨 등)이 결합하여 합성될 수 있다. 무기산과의 염은 상기 화학식 1의 유리염기에 무기산 (예컨대, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등)이 결합하여 합성될 수 있다. 유기산과의 염은 상기 화학식 1의 유리염기에 유기산 (예컨대, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등)이 결합하여 합성될 수 있다. 산성 아미노산과의 염은 상기 화학식 1의 유리염기에 산성 아미노산 (예컨대 글루탐산, 아스파트산 등)이 결합하여 합성될 수 있다.

보다 구체적으로, 약제학적으로 허용 가능한 염은 무기산과의 염으로서 염산염일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물은 구체적으로 예시하면 하기와 같다 :

3-페닐-4-메틸-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염;

3-페닐-4-에틸-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염;

3-페닐-4-노말프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염;

3-페닐-4-아이소프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염;

3-페닐-4-노말부틸-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염;

3-페닐-4-tert-부틸-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염;

3-페닐-4-노말펜틸-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염; 또는

3-페닐-4-노말헥실-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염.

보다 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에 함유되는 피라졸계 화합물은 3-페닐-4-노말프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 또는 이의 염산염일 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 신생혈관생성의 주요인자인 VEGF, VEGFR, Hif의 발현을 억제하는 활성을 가지고 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 활성산소 (ROS)의 생성을 촉진하는 p38, Akt 등의 인산화를 억제함으로써 안구 내 신생혈관생성을 억제하는 활성을 가지고 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 관 형성 (Tube formation)을 억제하는 활성을 가지고 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 당뇨 망막병증 모델에서 망막 내 활성산소 (ROS) 생성을 억제하고, 신생혈관인자 VEGF의 활성을 억제하는 효능을 가지고 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 당뇨 망막병증 동물 모델에서 망막 내 신생혈관생성을 억제하는 효능을 가지고 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 맥락막 신생혈관 동물 모델 (CNV)에서 신생혈관생성을 억제하는 효능을 가지고 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 신생혈관생성으로 인해 저하된 시력을 개선시키는 효능을 가지고 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염은 EBV 감염 망막상피세포에서의 세포사멸 효능을 가지고 있다.

따라서, 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염이 유효성분으로 함유되어 있는 약학 조성물은 신생혈관 억제 기전 또는 세포사멸 기전에 의한 다양한 안질환의 예방 또는 치료제로 유용하다. 상기 안질환은 구체적으로 당뇨망막병증 (DR), 당뇨황반부종, 가령성 황반변성증 (Age-related Macular Degeneration), 미숙아망막병증 (ROP), 결절맥락막혈관병증 (polypoidal choroidal vasculopathy), 허혈성증식망막증 (ischemic proliferative retinopathy), 망막색소변성증 (Retinitis Pigmentosa), 원추세포 이영양증 (cone dystrophy), 증식성유리체망막증 (PVR), 망막동맥폐색증, 망막정맥폐색증, 익상편 (Pterygium), 망막염, 각막염, 결막염, 포도막염, 레버씨 시신경위축증, 망막박리, 망막색소상피박리, 신생혈관녹내장, 각막 신혈관신생, 망막 신혈관신생, 맥락막 신혈관신생 (CNV) 및 바이러스 감염으로 인한 안질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하며, 상기 유효성분은 약학 조성물 총 충량을 기준으로 0.01 내지 10 중량% 범위로 함유될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분의 효과를 헤치지 않는 범위 내에서 담체, 희석제, 결합제, 붕해제, 윤활제, pH 조절제, 산화방지제, 용해보조제 등의 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 제형화하는데 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 첨가제의 예로는 미정질 셀룰로즈, 자일리톨, 에리스리톨, 메틸 셀룰오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 락토즈, 덱스트로오스, 수크오스, 프로필히드록시벤, 조에이트, 셀룰로오스, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 탈크, 솔비톨, 만니톨, 말티톨, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 통상의 제제화 방법에 따라 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 시럽제, 현탁제, 유제, 점적제, 액제 형태로 제형화될 수 있다.

약학 조성물을 주사제로 제형화하는 경우는 보존제, 등장화제, 무통화제, 가용화제, 완충제, 및 안정화제 등을 약학적으로 허용 가능한 희석제로 혼합하여, 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

약학 조성물을 경구 투여에 적합한 제제로 제형화하는 경우는 가용화제, 결합제, 부형제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 붕해제, 활택제 및 향료 등을 약학적으로 허용 가능한 희석제로 혼합하여, 정제, 환약, 엘릭서, 캡슐, 서스펜션, 트로키, 웨이퍼,현탁액, 및 시럽 등의 형태로 제조할 수 있다.

약학 조성물을 안구에 직접 투여하는 경우 액제(solutions), 유동엑스제(Fluidextracts), 유제(emulsions), 현탁제(suspensions) 등의 형태로 제조할 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 유효성분의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 안구 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 국소 투여, 비내 투여, 피내 투여 등이 될 수 있으며, 이것에만 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 위나 장관에서의 분해 및 흡수가 용이하도록 제조되어야 하며, 바람직하게는 주사제 형태 또는 안구에 직접 투여가 가능한 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 유효성분의 경우, 0.0001 nM 내지 1000 mM 이고, 바람직하게는 0.001 nM 내지 100 mM이며, 하루 1 ~ 3회 투여 또는 일정 기간 동안 수 회 투여할 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 합성예 및 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하고자 한다. 하기 합성예 및 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 합성예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[합성예]

본 합성예에서는 안질환 치료용 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 피라졸계 화합물을 합성하는 대표적인 제조방법을 예시한 것이다.

합성예 1. 3-페닐-4-프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올의 합성 (APX-B)

둥근 바닥 플라스크에 2-프로필-3-옥소-3-페닐프로피온산 에틸에스터 (2.52 g, 10.7 mmol)와 에탄올 10 mL을 넣은 다음, 2-히드라지노피리딘 (1.29 g, 1.18 mmol)을 에탄올 3 mL에 희석시킨 용액을 0 ℃에서 천천히 적가하였다. 3일 동안 100 ℃에서 가열 환류시켰다. 감압 증류하여 용매를 제거한 다음, 생성된 고체를 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공 건조시켜 표제화합물을 82%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 12.50 (1H, s), 8.27-8.25 (1H, m), 8.01 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.81 (1H, m), 7.69 (2H, m), 7.48-7.34 (3H, m), 7.12-7.10 (1H, m), 2.54 (2H, d, J = 7.5 Hz), 1.64 (2H, m), 0.93 (3H, t, J = 7.3 Hz); EIMS (70 eV) m/z (rel intensity) 279(M+, 37), 250(100).

합성예 2. 3-페닐-4-프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 염산염의 합성 (APX-115)

둥근 바닥 플라스크에 상기 합성예 1에서 제조한 3-페닐-4-프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 (280 mg, 1.0 mmol)을 에틸에테르 4 mL에 용해시킨 다음, 여기에 2M의 HCl이 용해된 에틸에테르 0.55 mL를 0 ℃에서 천천히 적가하였다. 상기 반응 용액으로부터 생성된 고체를 감압 여과하고 용매를 제거한 다음, 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공 건조하여 상기 표제화합물 (270 mg, 0.85 mmol)을 수득하였다.

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ 8.44 (1H, d, J = 4.2 Hz), 8.0-8.03 (2H, m), 7.66-7.64 (2H, m), 7.48-7.42 (3H, m), 7.34-7.30 (1H, m), 2.49 (2H, brs), 2.43 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.48 (2H, m), 0.48 (3H, t, J = 7.3 Hz).

[실시예]

본 실시예에서는 안질환 치료용 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 피라졸 유도체의 약리작용을 구체적으로 확인하고자 한다.

실시예 1. 인간망막색소상피세포 (ARPE19)에서의 단백질 발현 억제효능

인간망막색소상피세포 (human retinal pigment epithelial cell; ARPE19)를 무혈청 DMEM/F12 (1:1) 배지에 하루 배양한 후에, 고혈당배지 (30 mM glucose in 무혈청 DMEM/F12)로 72시간 배양하였다. 실험물질 (APX-115)을 고혈당 배지로 배양한 뒤 24시간 뒤에 처리하였다. 웨스턴 블롯을 수행하기 위하여, 각 세포로부터 분리한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리한 후, 이를 멤브레인 (Immobilion-PVDF, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮긴 후, 다양한 항체를 이용하여 4 ℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 1XTBS-T 완충액으로 10분간 3번 세척하였다. 상기 항체로는 anti-Nox2, anti-Nox4, anti-VEGF, anti-Ang1, anti-Ang-2, anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-VEGFR1, anti-HIF-1α, anti-p-p38, anti-p38, anti-p-ERK, anti-ERK, anti-p-Akt, anti-p-Stat3, anti-p-Stat5 (Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA)를 사용하였다. 적절한 항 rabbit-HRP 혹은 항 mouse-HRP 혹은 항 goat-HRP secondary 항체를 상온에서 2시간 반응시킨 후에 1XTBS-T 완충액으로 10분간 3번 세척한 후 ECL 용액 (GE Healthcare Bioscience Corp)을 사용하여 단백질의 발현을 검증하였다.

도 1은 인간망막색소상피세포 (ARPE19)에서 신생혈관생성 관련 단백질 발현에 대한 APX-115의 효과를 나타낸다. 도 1에 의하면 APX-115를 처리하였을 때 용량 의존적으로 신생혈관생성 관련 인자 (VEGF, VEGFR1, Hif-1a, NOX2, NOX4)와 신생혈관생성 촉진인자 (ERK, p38, Akt)의 발현을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 인간망막미세혈관내피세포 (HRMEC)에서의 단백질 발현 억제효능

인간망막미세혈관내피세포 (human retinal microvascular endothelial cells; HRMEC)를 무혈청 클래식 배지 (Cell Systems Corporation, Kirkland, WA, USA)에서 하루 배양한 후에, 고혈당배지 (30 mM glucose in 무혈청 클래식 배지)로 배양하면서 실험물질 (APX-115)을 48시간 처리하였다. 웨스턴 블롯을 수행하기 위하여, 각 세포로부터 분리한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리한 후, 이를 멤브레인 (Immobilion-PVDF, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮긴 후, 다양한 항체를 이용하여 4 ℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 1XTBS-T 완충액으로 10분간 3번 세척하였다. 상기 항체로는 anti-Nox2, anti-Nox4, anti-VEGF, anti-Ang1, anti-Ang-2, anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-VEGFR1, anti-HIF-1α, anti-p-p38, anti-p38, anti-p-ERK, anti-ERK, anti-p-Akt, anti-p-Stat3, anti-p-Stat5 (Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA)를 사용하였다. 적절한 항 rabbit-HRP 혹은 항 mouse-HRP 혹은 항 goat-HRP secondary 항체를 상온에서 2시간 반응시킨 후에 1XTBS-T 완충액으로 10분간 3번 세척한 후 ECL 용액 (GE Healthcare Bioscience Corp)을 사용하여 단백질의 발현을 검증하였다.

도 2는 인간망막미세혈관내피세포 (HRMEC)에서 신생혈관생성 관련 단백질 발현에 대한 APX-115의 효과를 나타낸다. 도 2에 의하면 APX-115를 처리하였을 때 용량 의존적으로 신생혈관생성 관련 인자 (VEGF, VEGFR1, Hif-1a, NOX2, NOX4)와 신생혈관생성 촉진인자 (ERK, p38, Akt)의 발현을 효과적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 인간망막미세혈관내피세포 (HRMEC)의 관형성 억제효능

눈 신생혈관에 있어서 혈관내피세포의 관형성(tube formation)은 매우 중요하다. 이에, 본 실시예에서는 인간망막미세혈관내피세포 (human retinal microvascular endothelial cells; HRMEC)를 이용한 튜빙 어세이 (Tubing assay)를 통하여 실험물질 (APX-115)의 항혈관형성 효능을 확인하였다. 망막혈관내피세포 (HRMEC)를 매트리젤 (Matrigel)이 코팅된 웰 플레이트에 분주하고, 인간 재조합 VEGF를 20 ng/mL 농도로 처리한 후에 실험물질 (APX-115)을 2 μM 처리하였다.

도 3에는 인간망막미세혈관내피세포 (HRMEC)의 관형성에 대한 APX-115의 효과를 나타낸다. 도 3에 의하면 APX-115를 처리하였을 때 대조군과 비교하여 효과적으로 관형성이 억제됨을 확인 할 수 있었다.

실시예 4. 당뇨 망막병증 동물 모델에서의 신생혈관 억제 효능

동물 모델로는 마우스에 스트렙토조토신 (Streptozotocin, 50 mg/kg)을 주사하여 당뇨가 유도된 제1형 당뇨 마우스 모델을 사용하였다. 상기 동물 모델의 안구 내로 실험물질 (APX-115)을 0.2 ㎍씩 3회에 걸쳐 직접 투여하고, 4주 후에 안락사하여 안구를 적출하였다. 적출된 안구를 10% 포르말린에 1시간 고정한 후 각막과 수정체를 분리하고 eye-cup을 차가운 ICC 완충액 (0.5% BSA, 0.2% Tween-20, 0.05% 소듐 아지드)으로 세척하였다. Isolection B4 GS-IB4, Alexa Fluor 594^?? conjugate (Thermo Fisher Scientific, USA)를 ICC 완충액을 이용하여 10 μg/mL로 제조하여 eye-cup에 넣고 하루 동안 놓아둔 후, ICC 완충액으로 3번 세척 후 마운팅 (mounting)하여 관찰하였다.

도 4는 플렛 마운트 (Flat mount)한 결과로서, 당뇨가 유도된 동물 모델군에서는 신생혈관의 증가가 확인되고 있는 반면에, APX-115 실험물질이 투여된 동물 모델군에서는 신생혈관이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 당뇨 망막병증 동물 모델에서의 망막내 ROS 생성 저해 효능

동물 모델로는 마우스에 스트렙토조토신 (Streptozotocin, 50 mg/kg)을 주사하여 당뇨가 유도된 제1형 당뇨 마우스 모델을 사용하였다. 상기 동물 모델의 안구 내로 실험물질 (APX-115)을 0.2 ㎍씩 3회에 걸쳐 직접 투여하고, 4주 후에 안락사하여 안구를 적출하였다. 적출된 안구를 25% 수크로스 (sucrose)에 1시간 담구어 전처리하였다. 그리고, 일회용 몰드 베이스에 넣어 OCT 컴파운드에 포매시킨 후 액체질소에 넣고 급속 냉동하여 블록 (block)을 제작하였다. 마이크로톰 (Microtome)을 이용하여 조직을 6 ㎛ 크기로 절단하여 슬라이드에 부착하고 디하이드로에티듐을 5 μM의 농도로 따뜻한 PBS 용액에 녹여서 만들고 30분간 37 ℃에서 반응시켰다. PBS로 2회 세척 후 30 분 동안 에어 건조한 후 수용성 봉입제로 봉입하여 형광 현미경으로 관찰하고 Image J program을 이용하여 형광값을 산출하였다.

도 5는 당뇨 망막병증 동물 모델군과 APX-115가 처리된 당뇨 망막병증 동물 모델군에서의 망막내 활성산소 (ROS)의 증가를 비교한 결과이다. 도 5에 의하면 당뇨 망막병증 동물 모델군은 망막조직에서 활성산소의 생성이 증가하였으나, APX-115 처리 동물 모델군은 망막조직에서 활성산소 (ROS)가 정상 수준으로 감소됨을 확인할 수 있다.

실시예 6. 당뇨 망막병증 동물 모델에서의 망막내 신생혈관인자 저해 효과

동물 모델로는 마우스에 스트렙토조토신 (Streptozotocin, 50 mg/kg)을 주사하여 당뇨가 유도된 제1형 당뇨 마우스 모델을 사용하였다. 상기 동물 모델의 안구 내로 실험물질 (APX-115)을 0.2 ㎍씩 3회에 걸쳐 직접 투여하고, 4주 후에 안락사하여 안구를 적출하였다. 적출된 안구로부터 각막과 수정체를 제거한 맥락막-망막 복합체에 완충 용액을 넣고 조직을 균질화하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA 단백질 어세이 키트를 이용하여 정량하고, 웨스턴 블롯 어세이를 시행하여 신생혈관에 관련된 인자(VEGF, Angiopoetin II)의 발현을 확인하였다.

도 6은 당뇨 망막병증 동물 모델군과 APX-115가 처리된 당뇨 망막병증 동물 모델군에서의 망막내 신생혈관인자의 활성 저해를 비교한 결과이다. 도 6에 의하면 APX-115 처리된 동물 모델군은 망막조직에서 신생혈관을 촉진하는 주요인자인 VEGF의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7. 당뇨 망막병증 동물 모델에서의 망막 기능 개선 효과

망막의 기능을 평가하기 위하여, 당뇨가 유도된 제 1형 당뇨 마우스 모델을 전신 마취하고 전극을 각각 피부, 꼬리 그리고 각막에 접촉시켜 망막전위도 검사를 시행하였다. 단일백색광으로 망막을 자극하여 반응값을 얻고, a파의 골에서부터 b파의 정점까지로 정한 진폭을 측정하여, 이를 망막 기능의 지표로 평가하였다.

도 7은 당뇨 망막병증 동물 모델군과 APX-115가 처리된 당뇨 망막병증 동물 모델군에서 망막전위도 검사를 시행하여 비교한 결과이다. 도 7에 의하면 당뇨 망막병증 동물 모델군은 망막전위도는 정상군에 비하여 감소하는 경향을 보였는데 반하여, APX-115 처리된 동물 모델군은 망막전위도가 회복되는 경향을 보였다.

실시예 8. 맥락막 신생혈관 동물 모델 (CNV)에서의 신생혈관 억제 효능

실험물질 (APX-115, 0.2 ㎍)과 양성대조군인 아바스틴 (Avastin, 0.5 ㎍)에 대하여 항혈관형성능을 비교하였다. 동물 모델로는 마우스의 안구에 레이저를 조사시켜 만든, 맥락막 신생혈관 동물 모델(laser induced choroidal neovascularization, CNV)을 사용하였다. 동물 모델의 안구 내로 APX-115과 아바스틴 (Avastin)을 투여하고 레이저 조사한 다음 14일이 경과된 후에, FITC-dextran을 안와후방투입 (retro orbital injection)하고 혈관을 염색하고 안구를 적출하여 플렛 마운트 (Flat mount)하였다.

도 8은 플렛 마운트 (Flat mount)한 결과로서, 맥락막 신생혈관 동물 모델에서 신생혈관이 많이 증가된 반면에, APX-115 실험물질이 투여된 동물 모델군에서는 신생혈관이 현격하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군인 아바스틴 투여군에 대비할 때, APX-115 실험물질이 투여된 동물 모델군은 보다 효과적으로 신생혈관이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, APX-115 실험물질은 맥락막에 발생되는 혈관을 효과적으로 감소시키므로, 연령관련 황반변성 치료제로 유용함을 알 수 있다.

실시예 9. EBV 감염 인간망막상피세포에서의 세포사멸 효능

인간망막색소상피세포 (ARPE19)와 EBV (Epstein-Barr virus) 감염된 인간망막상피세포 각각에 실험물질 (APX-115)을 용량 의존적으로 처리하여 48시간 배양하였다. 세포 용해물을 수거하여, 트립판 블루 염색 배제 방법 (trypan blue dye exclusion method)을 사용하여 세포수를 측정하였다.

도 9는 EBV 감염된 인간망막색소상피세포에서의 APX-115의 세포사멸 효능을 나타낸다. 도 9에 의하면 APX-115를 처리할 때 용량 의존적으로 EBV 감염 세포의 사멸을 촉진하는 효과를 확인할 수 있다. 따라서, APX-115 실험물질은 바이러스 감염에 의한 망막염 치료제로 유용함을 알 수 있다.

실시예 10. EBV 감염 인간망막상피세포에서의 ROS 저해 효과

EBV 감염 인간망막상피세포에 실험물질 (APX-115)을 용량 의존적으로 처리한 후 48시간 배양하였다. 20 μM H₂-DCF-DA 시약 (Sigma, ST. Louis, USA)을 30분간 처리한 후 세포 용해물을 수거하여 PBS 용액으로 희석하여 FACS (BD Biosciences, USA) 분석하였다.

도 10은 APX-115에 의한 EBV 감염 인간망막상피세포에서의 활성산소 (ROS) 저해 효과를 나타낸다. EBV 감염시 인간망막상피세포에서 활성산소 (ROS)가 증가함으로써 산화스트레스로 인해 신생혈관을 촉진하게 되는데, APX-115를 처리하였을 때 용량의존적으로 ROS가 감소함을 확인할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상이 유효성분으로 함유되어 있고,
당뇨망막병증 (DR), 당뇨황반부종, 가령성 황반변성증 (Age-related Macular Degeneration), 미숙아망막병증 (ROP), 결절맥락막혈관병증 (polypoidal choroidal vasculopathy), 허혈성증식망막증 (ischemic proliferative retinopathy), 망막색소변성증 (Retinitis Pigmentosa), 원추세포 이영양증 (cone dystrophy), 증식성유리체망막증 (PVR), 망막동맥폐색증, 망막정맥폐색증, 익상편 (Pterygium), 망막염, 각막염, 결막염, 포도막염, 레버씨 시신경위축증, 망막박리, 망막색소상피박리, 신생혈관녹내장, 각막 신혈관신생, 망막 신혈관신생 및 맥락막 신혈관신생 (CNV)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 안질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R은 탄소수 1 내지 10의 직쇄형 또는 분쇄형 알킬기이다)
제 1 항에 있어서,
3-페닐-4-노말프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상이 유효성분으로 함유되어 있는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 알칼리금속염, 알칼리토금속염, 무기산과의 염, 유기산과의 염 및 산성 아미노산과의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 염산염인 것을 특징으로 하는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유효성분은 약학 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 내지 10 중량% 범위로 함유된 것을 특징으로 하는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 피라졸계 화합물은 R가 탄소수 1 내지 6의 직쇄형 또는 분쇄형 알킬기인 것을 특징으로 하는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약학 조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔제, 시럽제, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형 형태로 제제화된 것을 특징으로 하는 안질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3-페닐-4-노말프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상이 유효성분으로 함유되어 있는 당뇨망막병증의 예방 또는 치료제.
3-페닐-4-노말프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상이 유효성분으로 함유되어 있는 황반변성증의 예방 또는 치료제.
3-페닐-4-노말프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상이 유효성분으로 함유되어 있는 각막 신혈관신생, 망막 신혈관신생 또는 맥락막 신혈관신생(CNV)의 예방 또는 치료제.
3-페닐-4-노말프로필-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 1종 이상이 유효성분으로 함유되어 있는 망막염, 각막염, 결막염 또는 포도막염의 예방 또는 치료제.
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