KR101784451B1 - 뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 대한 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NRP1(Neuropilin 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 및 이의 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 대한 항체 및 이의 용도 {Antibodies Against NRP1 and Uses Thereof}
본 발명은 NRP1(Neuropilin 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 및 이의 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뉴로필린(NRP)은 NRP1과 NRP2를 포함하며, 이는 신경세포에서 최초로 발견되었다. NRP1은 약 923개의 아미노산으로 구성되고, NRP2는 약 926개의 아미노산으로 구성되며, 이들은 공통적으로 유사한 도메인 구조를 가지면서, 전체적으로 44%의 아미노산 상동성을 가진다고 알려져 있다.
NRP1은 축삭 유도를 조절하기 위해 플렉신 보조-수용체와 작용하는, 세마포린 3A 리간드에 결합하는 수용체로 알려져 있다. 이후, NRP1은 혈관 내피 성장인자(VEGF) 리간드 패밀리의 구성원에 결합하여 혈관 발생을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
혈관계의 발생을 통해 수 많은 생리적 과정과 병리적 과정이 진행된다. 종양과 같이 활동적으로 성장하는 조직에는 적절하게 혈액이 공급되어야 한다. 이들 조직은 일반적으로 새로운 혈관 형성과 유지를 증진시켜 주는 전-혈관신생 인자를 생성시킴으로써 혈관신생을 통해 혈액을 공급한다. 혈관 형성은 단순한 과정은 아니나, 다음 단계들을 통해 이루어진다: a) 내피세포 (EC)가 기존의 내피세포로부터 증식되거나 분화되는 단계; b) 내피세포가 이동하고 유착하여 코드 (cord)-유사 구조를 형성시키는 단계; c) 혈관 코드가 세관형성을 진행하여 중앙에 내강이 있는 혈관을 형성시키는 단계; d) 기존의 코드나 혈관에 싹이 나기 시작하여 이차 혈관을 형성시키는 단계; e) 원시 혈관총이 추가의 재형성과 재생을 진행하는 단계; 및 f) 내피 주변 세포를 동원하여 내피 관에 넣어, 혈관에 대한 유지 및 조정 기능을 제공하는 단계 (이러한 세포에는, 작은 모세혈관의 경우에는 혈관주위세포, 큰 혈관의 경우에는 평활근 세포, 및 심장 내의 심근 세포가 포함된다).
NRP1은 다양한 종류의 인간 종양 세포주 및 인간 종양(교모세포종, 성상세포종, 신경교종, 신경아세포종, 고환암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 폐암, 유방암, 식도암 및 전립선암 등)에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, VEGF 및 세마포린의 암세포의 증식, 생존 및 이동에 미치는 영향에 관련된다고도 알려져 있다. 또한, NRP1의 발현 정도에 따라 암 진행 정도가 증가하거나, 암환자의 예후가 좋지 않은 것으로 알려져 있다.
종양 성장의 경우, 혈관신생은 과형성물에서 신생물로 전이되는데 있어 결정적이고, 종양의 성장과 전이에 대한 영양을 제공하는데 있어서도 결정적인 역할을 할 수 있다. 신생혈관형성으로 인해 종양 세포는 정상 세포와 비교해서 성장 이점과 증식 자율성을 획득할 수 있게 된다. 종양은 통상적으로, 이용 가능한 모세혈관 층으로부터의 거리 때문에 수 입방 밀리미터 크기로만 증식할 수 있는 단일 비정상 세포로서 시작하고, 추가의 성장과 전염없이 장기간 동안 '잠복' 상태로 정체될 수 있다. 이어서, 몇몇 종양 세포는 혈관신생 표현형으로 전환되어 내피 세포를 활성화시켜, 새로운 모세혈관으로 증식 및 성숙된다. 이와 같이 새로이 형성된 혈관은 원발성 종양을 지속적으로 성장시킬 수 있게 해줄 뿐만 아니라 전이성 종양 세포를 전파하고 재집락화시킬 수 있다.
이와 관련하여, NRP1을 과발현하는 암을 치료하기 위하여, NRP1에 높은 친화력으로 결합하여 암세포의 성장을 저해할 수 있는 항-NRP1 항체가 요구된다.
치료용 항체시장은 연평균 11.8%로 성장해 2017년에 899억달러에 이를 것으로 추정되며 이 중 항암치료제가 가장 큰 비중을 차지하고 있다. 현재 260개의 생명공학 기업이 약 700개 치료용 항체에 대한 개발을 진행 중에 있으며 이 중 220개의 항체가 임상실험 중에 있다.(Gabilondo and Larrick,2000) 지난 15년간 암세포에 특이적으로 발현이 높거나 돌연변이 된 항원을 표적으로 다양한 항체가 개발되었고 혈액암과 고형암 환자들에게 투여되었다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 다양한 암에서 발현되는 것으로 알려진 NRP1에 결합하여 세포 내로 내재화(internalizing)되는 항암 치료용 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 NRP1에 높은 친화력으로 결합하고 세포 내로 내재화되는 항-NRP1 항체를 개발하고, 이러한 항-NRP1 항체가 암세포의 이동을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 NRP1에 대한 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NRP1(Neuropilin 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 세포 표면에 발현된 NRP1 에 결합하여 세포 내로 내재화되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 암세포의 표면에 발현된 NRP1에 결합한 후 세포 내로 내재화되는 항-NRP1 항체 및 이의 의약용도를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 항체는 NRP1을 발현하는 암세포의 침윤과 전이를 억제한다.
(ⅲ) 본 발명의 항체는 단독으로 또는 항체-약물 접합체(antibody drug conjugate) 형태로 암의 치료에 이용될 수 있으며, NRP1은 암세포의 표면에 과발현되는 분자이므로 본 발명의 항체-약물 접합체를 사용하면 정상세포에는 최소한의 영향을 주면서 암세포만을 선택적으로 타겟팅할 수 있다.
도 1은 NRP1을 과발현하는 환자 유래 세포의 FACS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 항-NRP1 scFv 항체 단편의 동정을 위한 파지 디스플레이 선별 과정을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 인간 NRP1에 결합하는 41종의 scFv 항체 단편들의 결합력을 나타낸 것이다.
도 4는 scFv 항체 단편의 생산을 위한 파지미드 벡터의 구성도이다.
도 5는 정제된 각 scFv 항체 단편의 쿠마시 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 3종의 항-NRP1 scFv 항체들의 NRP1에 대한 결합력을 보여주는 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 3종의 항-NRP1 항체 단편들의 농도에 따른 NRP1에 대한 결합력을 보여주는 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 SPR 분석을 통한 3종의 항-NRP1 scFv 항체들의 KD 값을 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 NRP1 과발현 환자 유래 세포에 대한 항-NRP1 scFv 항체 단편의 결합능을 보여주는 FACS 분석결과이다.
도 10a 내지 10c는 3종의 항-NRP1 scFv 항체들의 내재화 기능을 보여주는 공초점 레이저 주사현미경 사진이다.
도 11은 U87MG 세포주를 이용한 항-NRP1 scFv 항체 단편들의 세포이동 억제 효과를 보여주는 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 3종의 항 NRP1 IgG항체에 대한 생산 순도를 나타낸 결과이다.
도 13은 3종의 항 NRP1 IgG항체에 대한 endotoxin test 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 ELISA를 이용한 항 NRP1 IgG의 KD 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 3종의 항 NRP1 IgG의 인간 NRP1에 대한 특이적인 결합능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 Live cell imaging를 이용한 암세포 특이적인 내재화 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 Live cell imaging를 이용한 정상세포 내재화 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 FACS를 이용한 암세포 특이적인 내재화 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 교모세포종 subcutaneous model에서의 IRCR-101(3H10) 내재화 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 IRCR-101(3H10)의 암세포 특이적 결합능을 나타낸 결과이다.
도 21은 교모세포암 xenograft model에서 암특이적 NRP1에 대한 IRCR-101(3H10)의 결합능을 나타낸 결과이다.
도 22는 교모세포종 patient sample에서 암특이적 NRP1에 대한 IRCR-101(3H10)의 결합능을 나타낸 결과이다.
도 23은 교모세포종 세포주 U87MG와 환자유래세포를 이용한 세포이동능 억제 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 교모세포종 subcutaneous model에서의 IRCR-101(3H10)의 신생혈관 생성 억제 효과 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 IRCR-101처리시 관련 신호인자 변화 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 교모세포암 orthotopic model에서 IRCR-101의 분포 확인 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 Male, Female Monkey TMA 분석 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, NRP1(Neuropilin 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 세포 표면에 발현된 NRP1에 결합하여 세포 내로 내재화되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 발명자들은 다양한 암에서 발현되는 것으로 알려진 NRP1에 결합하여 세포 내로 내재화(internalizing)되는 항암 치료용 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 NRP1에 높은 친화력으로 결합하고 세포 내로 내재화하는 항-NRP1 항체를 제조하고, 이러한 항-NRP1 항체가 암세포의 이동을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서 본 발명의 항-NRP1 항체가 암세포 표면에 발현된 NRP1에 결합된 후, 세포 내로 내재화됨을 확인하였다(도 10a 내지 10c 참조). 세포 표면의 NRP1에 결합하여 해당 부위의 하위 신호전달을 차단하는 항체와 달리, 본 발명의 항체는 세포 표면의 NRP1에 결합하여 세포 내로 들어가기 때문에, NRP1과 관련된 모든 신호전달을 차단할 수 있어 더 큰 치료효과를 기대할 수 있다.
본 명세서의 "뉴로필린" 또는 NRP는 집합적으로 뉴로필린-1 (NRP1), 뉴로필린-2 (NRP2) 및 그들의 이소형 및 변이체를 포함한다. 뉴로필린은 120 내지 130 kDa 비-티로신 키나제 수용체이다. 다수의 NRP-1 및 NRP-2 스플라이스 변이체 및 가용성 이소형이 있다. 뉴로필린의 기본 구조는 5개 도메인을 포함한다: 3개의 세포외 도메인 (a1a2, b1b2 및 c), 막관통 도메인 및 세포질성 도메인. a1a2 도메인은 2개의 디설파이드 브릿지를 형성하는 4개의 시스테인 잔기를 일반적으로 함유하는 보체 성분 Clr 및 Cls (CUB)와 상동성이다. b1b2 도메인은 응고 인자 V 및 VIII와 상동성이다. c 도메인의 중앙부는 메프린 (meprin), A5 및 수용체 티로신 포스파타제 μ 단백질과의 상동성 때문에 MAM으로서 명명된다. a1a2 및 b1b2 도메인은 리간드 결합에 책임이 있는 반면, c 도메인은 동종-이량체화 또는 이종-이량체화에 있어 결정적이다.
"뉴로필린-1 매개 생물학적 활성"은 뉴로필린-1이 실질적 역할을 하는 생리적 또는 병리학적 상태를 의미한다. 예를 들어, 배아 신경계 발생 또는 신경 세포 재생 동안의 액손 안내, 혈관형성 (혈관 재형성 포함), 종양 생성 및 종양 전이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 NRP1에 특이적으로 결합하는 항-NRP1 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 NRP1에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 및 경쇄 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: 서열번호 1 또는 7의 서열을 가지는 CDR(complementarity determining region)H1, 서열번호 2 또는 8의 서열을 가지는 CDRH2, 및 서열번호 3, 9 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4 또는 10의 서열을 가지는 CDRL1, 서열번호 5, 11 및 14로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 CDRL2, 및 서열번호 6, 12 및 15로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역.
하나의 실시예에서, 본 발명은 다음의 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
(ⅰ) 서열번호 1 내지 3의 서열 각각을 가지는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 4 내지 6의 서열 각각을 가지는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
(ⅱ) 서열번호 7 내지 9의 서열 각각을 가지는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 10 내지 12의 서열 각각을 가지는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
(ⅲ) 서열번호 7, 8 및 13의 서열 각각을 가지는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 10, 14 및 15의 서열 각각을 가지는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 28 내지 서열번호 33의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나의 서열을 가지는 중쇄 골격 영역 (FR)을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
이 때, 서열번호 28의 서열을 가지는 중쇄 FR1, 서열번호 29 또는 서열번호 30의 서열을 가지는 중쇄 FR2, 서열번호 31 또는 서열번호 32의 서열을 가지는 중쇄 FR3, 서열번호 33의 서열을 가지는 중쇄 FR4를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 34 내지 서열번호 42의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나의 서열을 가지는 경쇄 FR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
이 때, 서열번호 34 내지 서열번호 36 중 어느 하나의 서열을 가지는 경쇄 FR1, 서열번호 37 내지 서열번호 39 중 어느 하나의 서열을 가지는 경쇄 FR2, 서열번호 40 또는 서열번호 41의 서열을 가지는 경쇄 FR3, 서열번호 42의 서열을 가지는 경쇄 FR4를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다:
(ⅰ) 서열번호 16의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 서열을 가지는 경쇄 가변영역; (ⅱ) 서열번호 18의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 19의 서열을 가지는 경쇄 가변영역; 또는 (ⅲ) 서열번호 20의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 서열을 가지는 경쇄 가변영역.
보다 구체적으로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함한다:
(ⅰ) 서열번호 16의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 서열을 가지는 경쇄 가변영역(4F12 항체);
(ⅱ) 서열번호 18의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 19의 서열을 가지는 경쇄 가변영역 (1A03 항체); 또는
(ⅲ) 서열번호 20의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 서열을 가지는 경쇄 가변영역 (3H10 항체).
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메 인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항 체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 NRP1을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-NRP1 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유 할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위 중 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 22, 24 또는 26일 수 있으며, 경쇄 가변영역을 코딩하는 코딩하는 핵산은 서열번호 23, 25 또는 27일 수 있다.
본 발명의 핵산은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 약물을 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다. NRP1은 암세포의 표면에서 과발현되는 분자이므로, 본 발명의 항체에 약물을 추가적으로 결합시킨 항체-약물 접합체를 사용하면, 정상세포에는 최소한의 영향을 주면서 암세포만을 선택적으로 타겟팅할 수 있다.
상기 약물에는 화학물질, 방사성핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소, 생물작용제 및 효소 저해물질 등이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 항암제와 직접 혹은 간접적으로 결합될 수 있고, 상기 항암제의 예로는 아시바이신, 아클라루비신, 아코다졸, 아크로나이신, 아도젤레신, 알라노신, 알데스루킨, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미노글루테티미드, 아모나파이드, 암플리겐, 암사크린, 안드로겐스, 안구이딘, 아피디콜린 글리시네이트, 아사레이, 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 바실러스 칼메테-구에린(BCG), 베이커스 안티폴, 베타-2-디옥시티오구아노신, 비스안트렌 HCl, 블레오마이신 설페이트, 불서판, 부티오닌 설폭시민, BWA773U82, BW 502U83/HCl, BW 7U85 메실레이트, 세라세미드, 카르베티머, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 클로로퀴녹살린-설포나미드, 클로로조토신, 크로모마이신 A3, 시스플라틴, 클라드리빈, 코르티코스테로이드, 코리너박테리움 파르붐, CPT-11, 크리스나톨, 사이클로사이티딘, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 사이템베나, 다비스 말리에이트, 데카르바진, 닥티노마이신, 다우노루바이신 HCl, 디아자유리딘, 덱스라족산, 디언하이드로 갈락티톨, 디아지쿠온, 디브로모둘시톨, 디데민 B, 에틸디티오카르바메이트, 디클라이코알데하이드, 다이하이드로-5-아자사이틴, 독소루비신, 에치노마이신, 데다트렉세이트, 에델포신, 에플롤니틴, 엘리옷스 용액, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 에스트라머스틴 포스페이트, 에스트로겐, 에타니다졸, 에티오포스, 에토포사이드, 파드라졸, 파자라빈, 펜레티나이드, 필그라스팀, 피나스테라이드, 플라본 아세트산, 플록스유리딘, 플루다라빈 포스페이트, 5'-플루오로우라실, Fluosol™, 플루타미드, 갈륨 나이트레이트, 겜사이타빈, 고세레린 아세테이트, 헤프설팜, 헥사메틸렌 비스아세트아미드, 호모하링토닌, 하이드라진 설페이트, 4-하이드록시안드로스테네디온, 하이드로지우레아, 이다루비신 HCl, 이포스파미드, 4-이포메아놀, 이프로플라틴, 이소트레티노인, 류코보린 칼슘, 류프로라이드 아세테이트, 레바미솔, 리포좀 다우노루비신, 리포좀 포집 독소루비신, 로머스틴, 로니다민, 마이탄신, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 멜팔란, 메노가릴, 메르바론, 6-머캅토푸린, 메스나, 바실러스 칼레테-구에린의 메탄올 추출물, 메토트렉세이트, N-메틸포름아미드, 미페프리스톤, 미토구아존, 마이토마이신-C, 미토탄, 미톡산트론 하이드로클로라이드, 모노사이트/마크로파지 콜로니-자극 인자, 나빌론, 나폭시딘, 네오카르지노스타틴, 옥트레오타이드 아세테이트, 오르마플라틴, 옥살리플라틴,파크리탁셀, 팔라, 펜토스타틴, 피페라진디온, 피포브로만, 피라루비신, 피리트렉심, 피록산트론 하이드로클로라이드, PIXY-321, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 프로게스틴스, 파이라조푸린, 라족산, 사르그라모스팀, 세무스틴, 스피로게르마늄, 스피로무스틴, 스트렙토나이그린, 스트렙토조신, 술로페너르, 수라민 소듐, 타목시펜, 탁소레레, 테가푸르, 테니포사이드, 테레프탈아미딘, 테록시론, 티오구아닌, 티오테파, 티미딘 인젝션, 티아조푸린, 토포테칸, 토레미펜, 트레티노인, 트리플루오페라진 하이드로클로라이드, 트리플루리딘, 트리메트렉세이트, TNF(tumor necrosis factor), 우라실 머스타드, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 빈데신, 비노렐빈, 빈졸리딘, Yoshi 864, 조루비신, 사이토신아라비노시드, 에토포시드, 멜파란, 탁소텔 및 탁솔 등을 들 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 제11항의 항체-약물 접합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 NRP1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항체-약물 접합체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 NRP1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-NRP1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 항-NRP1 항체는 NRP1을 발현하는 암세포의 이동을 억제할 수 있다(도 11 참조). 이와 같이 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 NRP1에 높은 친화도로 결합하여 NRP1을 과 발현하는 암세포의 이동을 억제할 수 있으므로, 항체 단독 또는 항체-약물 접합체 형태로 암의 예방 및 치료에 사용 가능하다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암의 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
상기 조성물에 적용되는 질환인 암은 NRP1을 과발현하는 암이고, 예를 들어 교모세포종, 성상세포종, 신경교종, 신경아세포종, 고환암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 폐암, 유방암, 식도암 및 전립선암 등일 수 있다.
"NRP1을 과발현하는 암"은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교하여 유의적으로 더 높은 수준으로 NRP1을 암 세포표면에 갖고 있는 암을 의미한다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하기 위한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 NRP1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 항체-약물 접합체를 처리하여 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 환자 유래 세포를 이용한 내재화(internalizing) 항체 동정
항-NRP1 항체 단편 동정 위한 세포 패닝(cell panning)에 필요한 세포를 선별하기 위해 사업단(삼성서울병원 난치암연구사업단)에서 보유하고 있는 환자 유래 세포들 중, NRP1의 발현수준이 높은 세포들을 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 방법으로 선별하였다. 이들 중 가장 많이 표면에 NRP1을 발현하는 환자 유래세포를 세포 패닝에 이용하였다. 환자 유래세포의 FACS 분석결과는 도 1에 명시되어 있다.
기존에 제작된 합성 scFv 항체 단편 파지 라이브러리(Yang et al., Mol. Cells. 27:225-235, 2009)를 이용하여 인간 NRP1에 결합하는 scFv 항체 단편을 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 동정하였다. 대장균 숙주 ER2537 내에 도입 되어 있는 파지미드(phagemid) 벡터를 파지(phage) 형태로 회수하기 위해 4개의 하위 라이브러리 샘플을 각 400 ㎖의 배양배지(SB/암피실린/2% 글루코오스)에서 2시간 동안 배양하였다. O.D 600에서 흡광도가 0.5-0.7 정도되면 5000 g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 400 ㎖의 2차 배양배지(SB/암피실린) 내에부유시킨 다음, 1012 pfu(plaque forming unit)의 헬퍼 파지(VCSM13)를 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 그 다음 카나마이신 항생제(헬퍼 파지 내 도입된 항생제 유전자)를 70 ㎍/㎖ 첨가한 후 30℃에서 밤샘 배양을 하여 파지 라이브러리가 숙주세포 외로 분비될 수 있도록 하였다. 이어 원심분리를 통해 얻은 배양물을 PEG(polyethylene glycol) 용액을 이용해 파지 형태만 침전시켜 파지 라이브러리를 얻었다.
이렇게 얻어진 파지 라이브러리와 NRP1 발현이 높은 환자 유래 세포(4 X 106)를 섞어 총 5 ㎖ NBA(neurobasal medium)에 넣고, 4℃의 회전기에 고정시킨 후 1-2시간 동안 360도로 회전시켰다. 그 다음 환자 유래세포에 결합하지 않은 파지입자들을 제거하기 위해 300 g에서 5분간 원심분리하여 세포를 분리 시킨 후 다시 5 ㎖ NBA를 넣는 세척 과정을 진행하였다. 이 과정을 4차례 반복하였고, 마지막 과정에서는 미리 37℃의 인큐베이터에 둔 NBA 5 ㎖를 사용하여 환자 유래세포와 파지들을 T 플라스크에 넣어 37℃에서 30분간 배양시켜 세포 표면에 붙은 파지입자들이 내재화(internalization)을 통해 세포 내로 들어가게 유도하였다.
그 다음 15 ㎖ 튜브(conical tube)에 옮긴 후 300 g에서 5분간 원심분리시켜 세포를 분리시킨 후, 이 과정을 차가운 PBS(Phosphate buffered saline) 5 ㎖을 넣는 세척 과정을 6번 반복하여 수행하고, 세포 패닝 회차가 거듭될수록 이 과정의 횟수를 증가시켰다. 이후, 0.1 M 글리신(pH 2.2) 5 ㎖를 넣고, 상온에서 5분간 두어세포 표면에 있는 파지입자들을 세포 표면으로부터 분리시켰다. 이후, 300 g에서 5분간 원심분리시켜 세포만 분리시켜 0.5 ㎖ 100 mM TEA를 넣고, 이를 e-튜브에 옮겨 상온에서 15분간 두었다. 다음으로, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리시켜 세포 찌꺼기를 분리하여 세포 안에 있는 파지 입자들이 있는 상층액을 따서 1 ㎖ 2M Tris(pH 8)와 섞어 중화시킨 후, 미리 키워놓은 ER2537이 들어있는 8.5 ㎖의 배양배지(SB)에 넣고, 37℃에서 120 rpm으로 배양시켜 파지입자들을 대장균 숙주인 ER2537에 감염시켰다. 이후, 3,000 rpm으로 15분간 원심분리시켜 가라앉은 ER2537을 배양배지(SB) 500 ㎕로 섞은 후, 15 cm 배양배지에 도말하여 배양 후 5㎖의 SB 배양배지(50% 글리세롤)를 첨가하여 콜로니들을 회수 및 보관(-80℃)하였다. 이어 반복되는 세포 패닝 회차를 진행하기 위해 보관된 전 회차 파지 용액 중 1 ㎖를 취해 파지 입자 증폭 작업을 수행하였다. 숙주세포인 ER2537에 배양 후 헬퍼 파지를 넣어 회수된 파지입자들은 PEG 침전을 통해 분리하였고, 이를 다음 회차 패닝 때도 동일하게 사용하였다. 3회차 패닝을 수행하였고, 이러한 세포 패닝 과정은 도 2에 나타내었다. 회차가 거듭될수록 패닝 전 대비 후의 파지입자의 비율이 증가됨을 확인하였고, 이는 세포 패닝을 거쳐 내재화된 파지입자들이 증폭됨을 의미하며, 이의 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1] 환자 유래 세포를 이용한 세포 패닝
Figure 112015118230960-pat00001

실시예 2. 항-NRP1 scFv 후보 선별을 위한 ELISA 및 서열 분석
3회차 세포 패닝에서 회수된 파지 입자들을 숙주세포(ER2537) 감염을 통해 배양배지에서 콜로니로 확인하였다. 이 콜로니들을 취하여 200 ㎕ SB/암피실린 배양배지가 담긴 96-웰 플레이트에 접종 후 37℃ 2-3시간 동안 배양하였다.
그 다음, scFv-pⅢ 단백질 발현 유도를 위해 각 웰에 최종농도 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하고 30℃에서 밤샘 배양하였다. 배양한 플레이트는 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 배양세포 주변세포질(periplasm) 내에 있는 파지입자를 회수하기 위해 각 웰 당 40 ㎕의 TES 용액(20% w/v 수크로오스, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 넣고, 4℃에서 30분 동안 정치함으로써 세포를 용해시켰다. 이후 60 ㎕의 0.2X TES 용액을 처리하여 4℃에서 30분 동안 두어 삼투압으로 세포를 분해시킨 다음, 플레이트를 3,000 rpm 15분간 원심분리시켜 상층액의 scFv-pⅢ 단백질을 얻었다.
미리 준비한 인간 NRP1 단백질이 코팅된 96-웰 플레이트에 얻은 상층액 중 25 ㎕를 각 해당 웰에 첨가한 후 1시간 동안 실온에서 결합시킨 다음, TBST와 증류수를 이용해 6번 세척하였다. 이후, scFv-pⅢ 의 HA tag에 결합할 수 있는 HRP가 결합된 항-HA 항체를 이용해 1시간 동안 실온에서 결합시킨 후, 다시 TBST(0.1% Tween20)와 증류수를 이용해 6번 세척하였다. TMB 용액을 이용한 발색반응을 유도한 후 H2SO4 용액으로 발색반응을 멈추고, O.D 450 nm에서 그 값을 측정하였다.
총 분석된 클론 수는 384개였고, 이 중 41개의 클론(결합능배수 > 2)이 인간 NRP1에 대한 높은 결합능을 보였다(도 3). 대조군으로는 BSA 용액이 사용되었으며, 이 41개 클론 중 재확인 ELISA를 통해서 결합능이 높은 10개의 클론들을 선택하였다. 이후, 10개의 클론들로부터 파지미드를 회수한 다음 DNA 서열분석을 진행하였고, 총 6개의 다른 서열을 지닌 클론들을 선별하였다. 1C08과 동일한 서열인 3H10을 제외하고는 각 다른 서열을 지닌 클론들이 선별되었고, 최종적으로 3H10, 1A03 및 4F12 클론을 항-NRP1 scFv 후보로 선택하였다. 3H10, 1A03 및 4F12 클론의 아미노산 서열을 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112015118230960-pat00002

실시예 3. 항-NRP1 scFv 생산 및 NRP1 결합능 확인
파지미드의 기본 구성은 도 4에서 확인할 수 있으며, 위의 실시예에서 사용된 숙주세포 ER2537의 경우 phage pⅢ 앞에 위치한 전사억제 코돈(amber codon(UAG))을 억제하기 때문에 scFv 단독 발현이 불가능하다. 따라서 비억제 숙주(non-suppressor strain)인 발현균주(TOP10F')를 이용하여 파지미드를 발현균주내로 형질도입 하였다. 이후, DNA 서열분석을 통해 각 파지미드가 돌연변이 없이 도입된 발현균주를 확인하였고, 이 발현균주를 콜로니로 취한 다음 LB/암피실린 배양배지 3 ㎖에 접종 후 37℃에서 밤샘 배양하였다. 이후, 밤샘 배양시킨 배양액 3 ㎖은 400 ㎖ 배양배지(SB/암피실린)로 옮겨 O.D 600에서 0.5-0.7이 될 때까지 배양하였고, 최종 농도 1 mM IPTG를 첨가하여 30℃에서 밤샘 배양하였다. 배양액은 원심분리 후 TES 용액 40 ㎖을 이용하여 발현숙주를 용해시킨 후, O.2X TES 60 ㎖을 투입해 세포주변질 내 파지입자를 회수하였고, 회수한 상층액은 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 여과된 용액 내에 존재하는 scFv 단백질은 His-tag 정제를 위해 Ni-NTA bead(Qiagen)1 ㎖이 첨가되어 상온에서 1시간 결합되었고, 이후 중력 컬럼(gravity column, Bio-rad)에 패킹되어 200 mM 이미다졸 용액을 통해 회수하였다. 각 클론의 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색(coomassie blue staining)을 통해 scFv 해당 크기인 약 28 kDa을 확인하였다(도 5).
정제된 scFv를 이용해 ELISA를 진행하여 표적 NRP1에 대한 결합능이 존재하는지 확인하였다. ELISA(3번 반복)로 200 ng NRP1 단백질을 코팅한 96웰과 대조군인 BSA 200 ng을 코팅한 96웰에 각 클론 당 5 ㎍/㎖ 수준으로 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 이후, 0.1% TBST를 이용해 3회 세척한 다음 HRP가 결합된 HA 항체를 1시간 동안 처리하고, 다시 한 번 세척한 후 TMB 용액으로 5분간 정치시켰다. 그리고, 2M 황산용액으로 발색반응을 정지시킨 후 OD 값을 측정하였다.
측정 결과, NRP1에 결합하지 않는 12B scFv에 비해 1A03, 3H10 및 4F12 scFv는 NRP1에 대한 특이적인 결합능을 보였다(도 6).
다음으로, 인간 NRP1에 대한 각 항체 단편의 농도에 따른 결합능을 측정하기 위하여, 각각 200 ng의 NRP1 또는 BSA가 코팅된 96웰에 각 scFv를 2,000ng/㎖, 1,000 ng/㎖, 500 ng/㎖, 250 ng/㎖, 125 ng/㎖, 62.5 ng/㎖, 31.25 ng/㎖ 또는 15.62 ng/㎖ 농도로 처리하여 OD 값 변화를 분석하였다. NRP1에 대한 결합능에 있어, 12B scFv의 경우에는 농도 변화에 따른 OD 값의 변화가 없는 반면, 1A03, 3H10 및 4F12 scFv의 경우에는 고농도로 갈수록 BSA 대비 NRP1에 결합한 scFv가 증가함을 OD 값 변화를 통해 확인할 수 있었다(도 7).
3종의 scFv 항체 단편의 NRP1 단백질에 대한 결합능의 세기를 수치화를 통해 정확하게 알아보고자 표면 플라스몬 공명(SPR, surface Plasmon resonance) 장비인 biacore T100을 이용해 ka와 kd 값을 통한 최종적인 KD 값을 얻었다. KD 값은 kd 값을 ka 값으로 나눈 값으로 낮을수록 해당 물질에 대한 결합능이 크다. 분석 결과, 4F12 scFv의 경우 KD(M) 값이 73.60 X 10-9로 가장 낮았고, 이어 1A03 scFv는 89.40 X 10-9의 KD(M) 값을 나타냈으며, 3H10 scFv는295.4 X 10-9의 KD(M) 값을 나타내었다(도 8).
실시예 4. NRP1 과발현 세포주를 이용한 항-NRP1 scFv 결합능 확인
인간 NRP1 단백질에 대한 결합능을 ELISA로 확인한 뒤 실제 세포막에 존재하는 NRP1에 결합하는지 알아보기 위하여, NRP1 발현이 높은 환자 유래세포를 이용하여 FACS 분석을 하였다. 각 scFv 당 5 X 105개의 환자 유래세포와 4℃에서 대략 1시간 결합시킨 후 FACS 용액 1㎖로 3번 세척하였다. 이후 붉은색 형광(PE; phycoerithrin)이 결합된 HA 항체를 1 ㎍ 처리하고 4℃에서 30분간 결합시켰다. 이어 FACS 용액 1 ㎖로 3번 세척한 뒤 FACS Calibur™ 시스템을 통해 분석하였다.
분석 결과, PE가 결합된 HA 항체와 12B를 처리한 세포에 비해 1A03, 3H10 및 4F12 등 3종의 scFv 항체 단편은 모두 NRP1이 과발현된 세포주에 특이적으로 결합하였다(도 9).
실시예 5. 항-NRP1 scFv의 NRP1 과발현 암세포 내 투과능 확인
3종의 항-NRP1 항체 단편의 경우 세포 내 투과성을 세포면역형광염색법으로 확인하였다. 챔버 슬라이드에 PD-라이신 용액을 넣어 상온에서 1-2시간 동안 코팅시켰다. 이후, 용액을 제거한 후 슬라이드를 건조시켰다. 다음으로, 5 X 104개의 환자 유래세포가 들어있는 NBA 용액 200 ㎕를 슬라이드에 처리한 후, 37℃에서 4-5시간 동안 배양하여 슬라이드에 고정시켰다. 다음으로 NBA 용액을 제거하고, 4% 파라포름알데하이드를 넣어 4℃에서 10분간 고정시켰다. 이후 PBS로 3번 세척과정을 거친 후, 0.1% Triton X-100을 처리한 세포투과도 증진 작업을 수행했다. 이후, NRP1 단백질의 염색을 위해 항-인간 NRP1 항체(R&D)와 동시에 항-NRP1항체 단편을 처리하여 37℃에서 15/30/60분으로 나누어 결합시켰다. PBS로 3번 세척과정을 거친 후 비특이적인 결합을 막기 위해 1% BSA 용액으로 실온에서 1시간정도 블로킹하였다. 2차 항체로는 NRP1 단백질을 보기 위하여 녹색 형광(Alexa-Fluor 488)이 표지된 염소 항-생쥐 항체(Invitrogen)를 처리하였고, 항-NRP1 항체 단편을 보기위한 항-HA 항체(Santacruz biotechnology)를 처리하고 상온에서 1시간 결합시켰다. 마지막으로 핵을 염색하기 위한 DAPI 염색을 수행한 후 최종 세척 후 유리 덮개를 슬라이드 위에 고정시킨 다음, 공초점 레이저 주사현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 3종의 항-NRP1 항체 단편 모두에서, 15분과 30분에서는 표면에 붙은 항-NRP1 항체 단편과 세포 내로 삽입된 항-NRP1 항체 단편들이 섞여 있었지만 60분 정도 경과하였을 때는 거의 대부분의 항-NRP1 항체 단편들이 세포 내로 투과하여 삽입된 것을 확인할 수 있었다(도 10a 내지 10c). 특히, 1A03과 3H10보다는 4F12 항체 단편이 상대적으로 세포 투과성이 시간 변화에 따라 두드러지게 나타났다(도 10a). 이러한 결과는, 본 발명의 항체를 특정 단백질 발현 억제를 위한 물질 또는 치료/진단용 화학약물 등을 암세포 내로 전달시킬 목적으로 이용할 수 있음을 보여준다.
실시예 6. NRP1 과발현 암세포주에 대한 scFv 항체 단편의 암세포 이동 억제능 확인
동정한 1A03, 3H10 및 4F12 scFv 항체 단편의 암세포 이동 억제를 통한 항암 능력을 검정하기 위하여, 세포이동 분석법을 수행하였다. 실험은 NRP1이 높게 발현되어 있다고 알려진 U87MG 세포주(교모세포종)를 사용하였고, 트랜스웰(Corning)에 PLO(Poly-L-Ornithine)을 넣어 실온에서 30분간 코팅 시킨 후 자연 건조시켰다. 이후, 100 ㎕의 성장인자가 빠진 DMEM 배양액에 5 X 104개의 U87MG 세포와 3종의 항-NRP1 scFv 항체 단편 50 ㎍/㎖를 담아 트랜스웰에 넣었고, 밑의 웰에는 10% FBS(Fetal bovine serum)를 포함한 DMEM 배양액 600 ㎕를 넣고, 37℃에서 밤샘 배양했다. 이후, 12웰에 메탄올, 헤마톡시린(Hematoxylin), 에오신(Eosin) 600 ㎕를 트랜스웰 당 하나씩 준비한 후 트랜스웰을 메탄올에 1분간 둔 후 헤마톡시린에 5분에 두어 핵을 염색하였다. 그 다음, 물로 세척한 후 물기를 없애고, 에오신에 30초간 두어 세포질을 염색시킨 다음, 다시 물로 세척하여 면봉으로 트랜스웰 안쪽으로 깨끗하게 닦았다.
도 11을 보면 헤마톡실린에 의해 핵은 검푸르게 염색되었고, 에오신에 의해 세포질은 붉게 염색되었다. 도 11에 나타난 바와 같이, 항-NRP1 scFv 항체 단편을 처리하지 않은 대조군을 100% 세포이동 되었다고 보았을 때, 1A03 항체 단편을 넣은 세포의 경우에는 41%, 3H10 항체 단편의 경우에는 46%, 4F12 항체 단편의 경우에는 29%의 세포이동을 보였다. 이러한 결과는, 3종의 항-NRP1 항체 단편들을NRP1의 발현이 높은 교모세포종, 폐암, 췌장암 등의 항암치료제로서 사용할 수 있음을 보여준다.
실시예 7. 항 NRP1 scFv에서 항 NRP1 IgG 로의 transform
항-NRP1 항체단편을 IgG 형태로 형태 전환을 위해 NRP1 scFv의 중쇄서열과 경쇄서열의 유전자를 Expi 293F 발현시스템(life technologies)을 이용해 형질주입 하였다. 배양액에 있는 NRP1 IgG를 얻기 위해 ㅔKTA 단백질 정제 시스템과 Amicon 원심분리 필터를 이용해 정제를 하였고, 생산량은 IRCR-101(3H10)은 120mg/L, IRCR-102(1A03)은 66mg/L, IRCR-103(4F12)는 15mg/L이였다. 정제한 항 NRP1 항체의 순도를 확인하기 위해 고속액체 크로마토그래피를 도입하였다. IgG의 크기가 150kD이므로 마커 피크에서 16.388분에서 나오는 물질에 해당한다. 3종의 NRP1 항체 (IRCR-101,102,103)가 이 피크에서 검출되었고, 순도는 99.5, 99.4, 99.5%에 해당하였다(도 12). 생산된 3종의 NRP1 항체의 endotoxin 수치를 알아보기 위해 Limulus Amebocyte Lysate (LAL) QCL-1000™ kit을 이용하였다. 분석한 결과 3종의 항체는 0.5-3.1EU/mg 정도로 치료용 단백질의 endotoxin 정상수치에 해당되었다(도 13).
3종의 NRP1 항체를 이용하여 인간 NRP1에 대한 결합력을 ELISA와 SPR analysis를 통해 분석해본 결과 1A03, 3H10, 4F12 순서로 결합력이 강함을 확인하였다. 특히 4F12 의 경우 현재 치료용 항체 수준의 결합력인 0.6nM 의 KD값을 가졌다(도 14). 인간 NRP1과 비슷한 구조를 지닌 다른 단백질과 비교함으로써 인간NRP1에 대한 특이적 결합력을 분석해본 결과 3개의 NRP1 항체 모두 인간 NRP1에만 결합함을 확인하였다(도 15).
실시예 8. 암세포와 정상세포를 이용해 암 특이적인 내재화 (Internalization) 및 결합력 확인
pHrodoㄾ Red Microscale Labeling Kit (Thermo #p35363 )를 이용하여 3종의 항 NRP1 IgG가 암세포와 정상세포에서 내재화(internalization)되는 양상을 비교하였다. 위 kit의 원리는 항체에 발색시료를 conjugate시켜 해당 항체가 세포 밖에 있으면 발색이 되지 않는 반면, 세포 내로 들어가 주위 환경이 산성화되면 발색하는 원리를 이용해 해당 항체의 세포 내재화를 확인할 수 있다. 3종의 NRP1 IgG에 conjugate시켜 환자유래 암세포와 정상세포인 HUVEC세포를 이용해 internalization 양상을 비교해본 결과, 환자유래 암세포에서 20분 경과 때부터 내재화된 항체가 관찰되기 시작했다(도 16). 반면 정상세포인 HUVEC세포에서는 IRCR-103은 2시간 경과 내재화된 항체가 관찰되기 시작했고, IRCR-101, IRCR-102 항체는 내재화된 항체가 발견되지 않았다. 이에 IRCR-101, IRCR-102 항체는 암세포 특이적인 내재화를 보임을 확인하였다(도 17).
정상세포와 암세포에 대한 4℃ 결합조건과 37℃ (Internalizing temperature)에서의 결합을 비교하여 FACS로 분석하였다. IRCR-101, IRCR-102 두 항체는 4℃조건에서 정상세포와 암세포에서의 내재화가 일어나지 않기 때문에 시간이 지남에 세포표면의 항체 양이 증가하거나 변화가 거의 없었다. 반면37℃ 조건에서는 암세포에서만 내재화가 되어 세포 표면의 항체 양이 시간에 따라 줄어듬을 확인할 수 있었다. 반면 IRCR-103항체는 37℃ 조건에서 정상세포와 암세포에서 내재화가 일어나 세포 표면의 항체 양이 시간에 따라 줄어듬을 확인하였다(도 18). 이로써 live cell imaging과 FACS분석을 통해 IRCR-101, IRCR-102 항체의 암특이적 내재화 기능을 확인하였다.
교모세포종 subcutaneous model에서 Control IgG, IRCR-101, IRCR-102를 정맥주사를 통해 주입한 후 20시간 후 sacrifice하여 cell dissociation을 통해 single cell로 분리 후 FACS를 통해 암세포에 대한 내재능을 비교해보았다. Permeabilization을 통해 암세포 내로 internalizing된 항체만을 선별한 결과 control IgG 대비 IRCR-101, IRCR-102는 5-6배 높은 MFI (Mean fluorescence intensity) 값을 나타냈다. 앞서 In vitro에서와 같이 In vivo 모델에서도 암세포 특이적인 내재능을 확인하였다(도 19).
4℃의 결합조건에서 IRCR-101과 기존 NRP1항체를 이용하여 정상세포와 암세포에 대한 결합력 차이를 비교해보았다. 같은 농도 처리시 기존 NRP1항체는 암세포 대비 정상세포에 더 큰 결합력을 보이는 반면 IRCR-101은 암세포 특이적인 결합력을 보임을 확인하였다(도 20).
In vivo model에서도 재현되는지 확인하기 위해 교모세포종 xenograft에서 얻은 암조직을 이용해 IHC(Immunohistochemistry)와 IF(Immunofluorescence)로 분석해보았다. 기존 NRP1항체는 정상내피세포로 구성된 혈관에 결합력을 보이는 반면, IRCR-101은 정상내피세포에 결합하지 않았다(도 21). 이는 교모세포종 환자조직에서도 동일하게 관찰되었다(도 22).
실시예 9. 암세포 이동과 신생혈관 성장 억제 확인
교모세포종 세포주인 U87MG와 환자유래세포를 이용하여 3종의 NRP1항체가 암세포 이동을 억제하는지 확인하였다. 각 항체 처리 후 24시간 동안 37℃에서 배양시킨 뒤 확인해본 결과 IRCR-101, IRCR-102의 경우 두 세포 모두에서 50%이상 암세포 이동을 억제하였고, IRCR-103은 환자유래세포에서 40%정도 암세포 이동을 억제시켰다 (도 23).
교모세포종 subcutaneous model에서 IRCR-101을 정맥주사를 통해 2주간 주입한 후 CD31변화를 통해 신생혈관 생성에 영향을 주는지 알아보았다. 대조군 대비 CD31가 현저히 줄어듬을 알 수 있었고, 혈관 수와 혈관 굵기 모두 감소하였다. 따라서 IRCR-101은 교모세포종에서 세포이동능과 더불어 In vivo 모델에서 신생혈관 생성을 억제함을 확인하였다 (도 24).
IRCR-101처리시 관련 신호전달 물질의 변화를 알아보기 위해 15, 30, 120분에 NRP1, AKT, ERK변화를 Immunoblotting을 통해 살펴보았다. NRP1의 경우 30분째 완전히degradation되어 보이지 않는 것을 확인하였고, AKT와 ERK는 인산화된 AKT와ERK가 줄어듦으로써 이와 관련된 신호기작을 억제함을 확인하였다 (도 25).
실시예 10. In vivo모델에서 IRCR-101 분포확인과 Monkey TMA분석
교모세포암 orthotopic model에서 IRCR-101에 형광물질을 표지한 후 이를 정맥주사로 주입하여 시간경과에 따른 형광세기 변화를 관찰하였다. 15min, 1hr, 1day, 2day를 관찰한 결과 1day때 tumor 위치와 일치하는 부위에서 강하게 형광이 발색하였고 3day까지 동일 위치에서 형광이 발색함을 확인하였다 (도 26).
IRCR-101의 side-effect를 알아보고자 기존 NRP1 항체와 함께 male, female Monkey TMA (Tissue microArray)를 실행하였다. 분석결과 대부분의 정상적인 장기조직에서 IRCR-101항체가 기존의 NRP1항체보다 결합이 낮거나 거의 없는 것을 확인했다. 따라서 정상조직에 결합력이 낮거나 거의 없는 것으로 보아 임상시험 시 IRCR-101의 side-effect는 낮을 것이라 예측된다 (도 27).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Antibodies against NRP1 and Uses thereof <130> 1657 <150> KR 14/0171949 <151> 2014-12-03 <160> 42 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of 4F12 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of 4F12 <400> 2 Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of 4F12 <400> 3 Ala Lys Arg Lys Thr Arg Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of 4F12 <400> 4 Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of 4F12 <400> 5 Ala Asn Asn 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of 4F12 <400> 6 Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu Asn Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of 1A03 or 3H10 <400> 7 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of 1A03 or 3H10 <400> 8 Ile Ser Pro Gly Ser Ser Asn Lys 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of 1A03 <400> 9 Ala Arg Arg Lys Lys Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of 1A03 or 3H10 <400> 10 Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp 1 5 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of 1A03 <400> 11 Ser Asp Asn 1 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of 1A03 <400> 12 Gly Ala Trp Val Ala Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of 3H10 <400> 13 Ala Arg Arg Lys Tyr Met Phe Asp Tyr 1 5 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of 3H10 <400> 14 Ser Asp Ser 1 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of 3H10 <400> 15 Ala Ser Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 16 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 4F12 <400> 16 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Lys Thr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 4F12 <400> 17 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 18 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 1A03 <400> 18 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Pro Gly Ser Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Lys Lys Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 1A03 <400> 19 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Pro Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Val Ala Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 20 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 3H10 <400> 20 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Pro Gly Ser Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Lys Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 3H10 <400> 21 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 22 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 4F12 <400> 22 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctctcctg gtagtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaacgtaag 300 actaggttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 23 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 4F12 <400> 23 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcggag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataattctg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctaataata agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct gcttgggatt ctagcctgaa tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 24 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 1A03 <400> 24 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttattata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctctcctg gtagtagtaa taaatattac 180 gctgattctg tacaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaaggaag 300 aagtcgttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 25 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 1A03 <400> 25 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gcccttcatc taatattggc aataatgatg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg ctcccaaact cctcatctat tctgataata atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggttg ctagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 26 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of 3H10 <400> 26 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttattata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctctcctg gtagtagtaa taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaaggaag 300 tatatgttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 27 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of 3H10 <400> 27 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataatgatg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cacccaaact cctcatctat tctgatagta atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatt ctagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 28 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03, 3H10 & 4F12 Hv FR1 <400> 28 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03 & 3H10 Hv FR2 <400> 29 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 15 Ala <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4F12 Hv FR2 <400> 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03 Hv FR3 <400> 31 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 32 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3H10 & 4F12 Hv FR3 <400> 32 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03, 3H10 & 4F12 Hv FR4 <400> 33 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03 Lv FR1 <400> 34 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Pro 20 25 <210> 35 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3H10 Lv FR1 <400> 35 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser 20 25 <210> 36 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4F12 Lv FR1 <400> 36 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser 20 25 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03 Lv FR2 <400> 37 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3H10 Lv FR2 <400> 38 Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4F12 Lv FR2 <400> 39 Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 40 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03 & 3H10 Lv FR3 <400> 40 Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala 20 25 30 Asp Tyr Tyr Cys 35 <210> 41 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4F12 Lv FR3 <400> 41 Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala 20 25 30 Asp Tyr Tyr Cys 35 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A03, 3H10 & 4F12 Lv FR4 <400> 42 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10

Claims (15)

  1. NRP1(Neuropilin 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 서열번호 1 내지 3의 서열 각각을 가지는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 4 내지 6의 서열 각각을 가지는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    서열번호 7 내지 9의 서열 각각을 가지는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 10 내지 12의 서열 각각을 가지는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    서열번호 7, 8 및 13의 서열 각각을 가지는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 10, 14 및 15의 서열 각각을 가지는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 28 내지 서열번호 33의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나의 서열을 가지는 중쇄 골격 영역 (FR)을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제 1 항에 있어서,
    서열번호 34 내지 서열번호 42의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나의 서열을 가지는 경쇄 골격 영역 (FR)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (ⅰ) 서열번호 16의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 17의 서열을 가지는 경쇄 가변영역;
    (ⅱ) 서열번호 18의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 19의 서열을 가지는 경쇄 가변영역; 또는
    (ⅲ) 서열번호 20의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 서열을 가지는 경쇄 가변영역.
  9. 제 1 항, 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  10. 제9항의 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터로 형질전환된 세포.
  12. 다음 단계를 포함하는 NRP1(Neuropilin 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제11항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  13. 제 1 항, 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 약물이 접합된 접합체.
  14. 제 1 항, 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 암은 교모세포종, 성상세포종, 신경교종, 신경아세포종, 고환암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 폐암, 유방암, 식도암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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