KR101781169B1 - 녹차다당체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차다당체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 a) 용매를 이용하여 녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하는 단계; b) 상기 a)단계의 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 열수 추출하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 열수 추출물로부터 한외여과 및 에탄올 침전 반응으로 녹차다당체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차다당체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조한 녹차다당체를 함유하는 화장료 조성물은 우수한 피부 미백, 보습 및 주름 개선 효과를 나타낸다.

Description

녹차다당체의 제조방법{Method for preparing polysaccharide of green tea}

본 발명은 녹차다당체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 a) 용매를 이용하여 녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하는 단계; b) 상기 a)단계의 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 열수 추출하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 열수 추출물로부터 한외여과 및 에탄올 침전 반응으로 녹차다당체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차다당체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법을 이용하면 녹차다당체를 대량으로 생산할 수 있다.

기존에는 녹차의 주성분 중의 하나인 카테킨류(epicatechin, epigallocatechin, epicatechingallate 및 epigallocatechingallate)의 항종양, 항산화, 항균, 중금속 해독, 혈압 상승 억제 작용 등에 대해 많이 보고되어왔다. 최근에는 녹차 내의 카테킨류 이외에 약리활성 성분들을 규명하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 한국 특허출원 제10-1997-0077010호에서는 녹차로부터 추출한 폴리페놀의 광노화 억제작용이 보고되었으며, 이는 자외선 방어제로 사용 가능하다. 또한, 이성질체로서 신규 물질인 갈로카테킨갈레이트의 추출 방법에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다(한국 특허출원 제10-2006-0066207호). 그리고 녹차 추출물을 함유한 피부 외용제가 피부 노화 시 유발되는 피부의 주름 및 탄력을 개선시킬 수 있음이 연구되었다(한국 특허출원 제10-2005-0016451호). 이는 녹차에 함유된 폴리페놀 성분이 자유 라디칼을 소거하거나 또는 항산화 관련 피부 내 방어인자의 활성을 높여 피부주름을 개선하고 피부탄력을 증진시킬 수 있기 때문이다.

또한, 녹차에 존재하는 성분 중에서 수용성 다당체는 면역기능, 항 혈액응고, 항암, 항HIV 및 혈당강하 작용 등이 있다고 알려져 있다. 녹차 잎에서 분리 정제한 녹차다당체는 피부 여드름 간균과 아토피 황색 포도상 구균의 인체 세포 결합을 저해하는 활성을 갖고 있으며, 헬리코박터 파이로리의 인체 숙주 세포 결합을 저해하는 저해능이 있다(한국 특허출원 제10-2005-0016451호 및 제10-2005-0135186). 상기 선행 문헌에서는 녹차다당체를 분리하기 위해 이온교환 및 젤 여과 크로마토그래피 방법을 사용하였다. 이온교환 및 젤 여과 크로마토그래피 방법은 너무 많은 시간이 소요되며, 대량 생산을 위한 기술이 확보되지 않았기 때문에 경제성의 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 보다 경제성이 높은 녹차다당체의 제조방법을 찾고자 연구한 결과, a) 용매를 이용하여 녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하는 단계; b) 상기 a)단계의 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 열수 추출하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 열수 추출물로부터 한외여과 및 에탄올 침전 반응으로 녹차다당체를 분리하는 단계를 이용하여 녹차다당체를 제조하면 제조 시간이 짧고 대량생산이 가능해 경제성이 우수할 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 제조한 녹차다당체를 함유하는 화장료 조성물은 우수한 피부 미백, 보습 및 주름 개선 효과를 나타내는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 우수한 경제성을 갖는 녹차다당체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 녹차다당체를 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 미용 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 용매를 이용하여 녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하는 단계; b) 상기 a)단계의 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 열수 추출하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 열수 추출물로부터 한외여과 및 에탄올 침전 반응으로 녹차다당체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 방법으로 제조된 녹차다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따라 녹차다당체를 제조하면 제조 시간을 단축시킬 수 있으며 대량 생산이 가능하기 때문에 경제성이 우수할 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 제조된 녹차다당체를 함유하는 화장료 조성물은 피부 자극이 없고, 우수한 피부 미백, 보습 및 주름 개선 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 녹차다당체의 세포 독성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 녹차다당체의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 녹차다당체의 매트릭스 메탈로프로테아제-1 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 a) 용매를 이용하여 녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하는 단계; b) 상기 a)단계의 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 열수 추출하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 열수 추출물로부터 한외여과 및 에탄올 침전 반응으로 녹차다당체를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 녹차다당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 녹차다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 녹차다당체는 녹차(camellia sinensis)에서 유래되는 식물분류학상 산차목(theales), 산차속(camellia)에 속하는 목본성 상록수로 면역기능, 항방사성, 항혈액응고, 항암, 항HIV, 혈당강하작용 등이 보고되어 있다. 또한, 녹차다당체는 세포 독성이 없어 피부 자극을 유도하지 않을 뿐만 아니라, 멜라닌의 생성 및 MMP-1 발현을 억제하고 피부 보습력을 증가시키므로 피부 미백, 보습 및 주름 개선에 우수한 효과를 나타낸다.

하기에서 녹차 다당체를 제조하는 방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.

a) 용매를 이용하여 녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하는 단계

녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하기 위해서 용매 추출 방법을 사용한다. 추출 용매로는 헥산, 에탄올 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 화장료 적용시 잔존량으로 야기될 수 있는 독성 문제를 방지하기 위해서 에탄올을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

녹차 분말에 상기 용매를 넣고 상온에서 충분히 교반한 후, 원심분리를 통해 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀이 용해되어 있는 용매를 제거한다. 얻어진 녹차 잔사를 건조하면 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀이 함유되지 않은 녹차를 얻을 수 있다.

b) 상기 a)단계의 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 열수 추출하는 단계

상기에서 제조된 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 추출하기 위해 열수 추출시킨다. 열수 추출은 30~40℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 이는 40℃ 초과시 고온으로 인하여 열변성이 생길 수 있으며, 30℃미만일 경우는 다당체가 충분히 추출되지 않기 때문이다. 또한, 열수 추출 시간은 6~8시간이 바람직하다. 이는 8시간 초과시 미생물에 의한 오염이 발생할 수 있고, 6시간 미만이면 다당체가 충분히 추출되지 않기 때문이다. 열수 추출하여 얻어진 추출액은 여과 기기를 이용하여 여과한 후 감압 농축한다.

c) 상기 b)단계의 열수 추출물로부터 한외여과 및 에탄올 침전 반응으로 녹차다당체를 분리하는 단계

상기 b)단계의 열수 추출물에서 다당체만을 분리하기 위해서 한외여과 및 에탄올 침전 반응을 수행한다. 다당체는 다당류(polysaccharide) 부분이 약 60~65% 존재하며, 단백질(protein) 부분이 약 8~9% 존재한다. 이 두 부분이 아미노산-당(amino acid-sugar) 결합에 의하여 연결되어 있으며, 나머지는 유리 단백질로서 존재한다. 따라서 다당체는 10만 내지 30만 달톤(dalton)의 분자량을 갖고 있으며, 이는 유리 단백질의 분자량보다 훨씬 큰 값이다. 이러한 분자량의 차이를 이용하여 한외여과를 수행함으로써 녹차다당체를 분리할 수 있다. 또한, 한외여과는 연속식 공정으로서 저분자량 물질의 분리 및 여과액의 농축을 동시에 진행할 수 있을 뿐만 아니라, 공정이 상온에서 이루어지기 때문에 열변성의 문제가 발생하지 않는다는 장점을 갖는다.

이어서, 상기 한외 여과 농축액에 에탄올을 서서히 가해 에탄올 침전 반응을 진행한다. 이때, 에탄올의 첨가 속도는 100~200ml/min이 바람직하고, 200ml/min를 초과하면 최종 생성 입자의 크기가 너무 커지거나 뭉칠 수 있다. 에탄올 침전 반응이 완료되면 에탄올을 제거하고, 얻어진 녹차다당체를 40~50℃에서 진공 건조하면 파우더 형태의 녹차다당체를 얻을 수 있다.

본 발명의 녹차다당체는 화장료 조성물로 제형화될 수 있으며, 우수한 피부 미백, 보습 및 주름 개선 효과를 나타낸다. 본 발명의 녹차다당체 함유 화장료 조성물은 그 제형이 특별히 한정되지 않지만, 유연화장수, 영양화장수, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 바디로션, 바디크림, 바디오일 또는 바디 에센스의 형태로 제형화될 수 있다. 각 제형의 화장료 조성물은 상기 녹차다당체 이외의 다른 성분들을 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

또한, 본 발명의 녹차다당체는 화장료 조성물 총 중량에 대해서 0.1 중량%~20 중량%의 양으로 함유되는 것이 바람직하다. 이는 그 함량이 20 중량%를 초과할 경우에는 상분리 등의 제형 안정성에 영향을 끼칠 수 있으며, 0.1 중량% 미만일 경우에는 제형 내의 피부 효능을 기대하기 어렵기 때문이다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 녹차다당체의 제조

건조 녹차잎을 분쇄하고 체질 및 분급 처리하여 제조된 녹차 분말(d50=100 ~ 1000㎛) 10kg을 95% (v/v) 에탄올 150리터에 분산하고 상온에서 교반하였다. 제조된 혼합액을 원심분리하여 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀이 제거된 녹차 잔사를 회수하였다. 회수된 잔사는 상기 용매 추출 공정을 1회 반복한 후에 건조하였다.

상기 용매 추출 공정으로 엽록소 및 저분자량 폴리페놀을 제거한 녹차 분말에 물 125리터를 첨가하고 35℃에서 7시간 동안 교반하여 열수 추출을 진행하였다. 얻어진 녹차다당체 추출액은 필터프레스기기를 이용하여 여과 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10이 되도록 62℃에서 감압 농축하였다.

이어서, 상기 녹차다당체 농축액을 한외여과(분자량 CUT OFF: 30,000달톤)하여 저분자량의 유리 단백질을 제거하고, 최종 한외 여과 농축액의 5배 부피의 에탄올을 100ml/min의 속도로 서서히 가해 에탄올 침전반응을 진행했다. 침전된 녹차다당체를 45℃에서 진공 건조하여 파우더 형태의 녹차다당체 250g을 얻었다.

[시험예 1] 세포 독성 실험

인간 각질형성세포주인 HaCaT 세포를 96웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 1*10⁴ 개씩 심어서(seeding) 24시간 동안 배양하였다. 각 웰에 인산염 완충 식염수(Phosphate Buffered Saline;PBS) 100㎕을 넣어 1회 세척하고 1, 10, 50, 100ppm의 녹차다당체가 함유된 배지로 갈아주고 48시간 동안 배양하였다. 웰 당 WST-1 용액(Roche Diagnostic GmbH. Germany)을 배지에 1/10의 농도로 희석하여 처리한 후, 37℃에서 2시간 동안 배양하고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(CTL)은 시료를 용해시키기 위한 용매로서 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide)를 사용하였다. 각 데이터 값은 대조군으로 보정하였고, 그 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에서 알 수 있듯이, 본 발명의 녹차다당체는 대조군과 유사한 수준의 세포 생존률을 보이므로 사용된 농도 범위에서 세포 독성이 없으며 피부 자극을 유도하지 않는다.

[시험예 2] 멜라닌의 생성 억제 효과

녹차 산성 다당체의 세포 내에서 멜라닌 합성 억제 효능을 비교하기 위하여 멜라닌 생성 억제물질로 알려진 알부틴을 사용하였다. 먼저, Melan A Cell 을 24웰 플레이트의 각 웰에 3*10⁴개씩 심고, 다음날 각각의 웰에 알부틴(arbutin) 10, 50, 100ppm과 녹차다당체 1, 10, 50, 100ppm을 세 번씩 반복하여 처리하였다. 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 상기와 동일한 방법으로 알부틴 및 녹차다당체를 다시 처리하였다. 3일간 배양하고 세포를 인산염 완충 식염수로 세척한 후, 1N NaOH용액으로 생성된 멜라닌을 녹이고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(CTL)은 시료를 용해시키기 위한 용매로서 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide)를 사용하였다. 각 데이터 값은 대조군으로 보정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있듯이, 녹차다당체는 농도 증가에 따라 멜라닌 생성을 억제하며, 녹차다당체의 IC50은 50ppm으로 알부틴과 유사한 수준으로 멜라닌 생성을 억제함을 나타냈다. 상기 IC50은 첨가한 시료에 의해 흡광도가 50% 감소했을 때의 시료 농도이다.

[시험예 3] UV에 의한 MMP-1의 발현 억제 효능

자외선에 의해 증가되는 매트릭스 메탈로프로테아제-1(Matrix metalloprotease-1; MMP-1) 발현의 억제 효과를 확인하기 위하여, 섬유아세포(p6)를 12웰 플레이트의 각 웰에 0.75*10⁵개씩 심고 24시간 동안 기아 상태(starvation)로 한 후에, 인산염 완충 식염수로 세척하고 UV(40mJ)를 조사하였다. 이어서, 레티노익산(Retinoic Acid; RA)(양성 대조군) 10μM, 녹차다당체 1, 10, 50ppm을 48시간 동안 두 번씩 처리하고, 배지 중에 유리된 MMP-1의 양은 키트(Amersham, RPN2610)를 사용하여 측정하였다. 각 데이터 값은 대조군으로 보정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 알 수 있듯이, 본 발명의 녹차다당체는 농도가 증가함에 따라 MMP-1의 발현을 억제하였다. 특히, 50 ppm의 농도에서는 자외선을 조사하지 않은 군과 동일한 수준으로 MMP-1의 발현을 억제하였다.

[시험예 4] 인체에서의 피부 보습력 증가

본 발명의 녹차다당체를 함유하는 화장료 조성물의 피부 보습력 증가 효과를 알아보기 위하여, 하기 표 1의 조성을 갖는 영양화장수 제형의 제형예 1 및 비교예 1을 제조하였다.

성분	제형예 1 (중량%)	비교예 1 (중량%)
정제수	잔량	잔량
녹차다당체 (실시예 1)	0.5	-
밀납	4.0	4.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5	1.5
유동파라핀	0.5	0.5
Montana 202 (제조사: Seppic)	5.0	5.0
글리세린	3.0	3.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1	0.1
트리에탄올아민	0.2	0.2

피부건조증을 나타내는 50-60대의 성인 남녀 50명을 2개조로 나누어 상기에서 제조한 제형예 1 및 비교예 1을 주고, 매일 2회씩 4주에 걸쳐 안면에 도포하도록 하였다. 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)으로 코니오미터를 이용하여 피부수분량을 측정하여 기본값으로 하고, 1주, 2주, 4주 경과 후 및 도포 중지 후 2주 경과(총 6주 경과) 후의 피부수분량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 실험 결과는 실험 시작 전에 측정한 코니오미터 값을 기준으로 하여 일정기간 처리한 후의 피부수분량 증가율을 표시한 수치이다.

시험물질	피부수분량 증가율 (%)
	1주 경과	2주 경과	4주 경과	도포 중지 후 2주 경과
제형예 1	32	42	45	39
비교예 1	29	33	34	15

상기 표 2에서 보여지는 바와 같이, 녹차다당체를 함유하는 제형예 1은 녹차다당체를 포함하지 않은 비교예 1보다 피부수분량이 증가되었다. 또한, 제형예 1는 도포를 중지한 후 2주 경과 시(총 6주 경과)에도 도포하고 1~2주 경과했을 시점과 유사한 피부수분량을 나타냈기 때문에, 제형예 1의 도포를 중지할 경우에도 일정 기간 동안 피부수분량을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (10)

1. a) 용매를 이용하여 녹차 분말에서 엽록소 및 저분자량의 폴리페놀을 제거하는 단계; b) 상기 a)단계의 녹차 잔사로부터 수용성 활성성분을 열수 추출하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 열수 추출물로부터 분자량 컷오프 (cut-off)가 30,000 달톤인 한외여과로 저분자량의 유리 단백질을 제거한 다음, 저분자량의 유리 단백질이 제거된 열수 추출물에서 에탄올 침전 반응으로 분자량이 10만 내지 30만 달톤인 녹차다당체를 분리하는 단계를 포함하는 화장료용 녹차다당체의 제조방법으로서,
   상기 b)단계의 열수 추출 온도는 30 내지 40℃이고,
   상기 b)단계의 열수 추출 시간은 6 내지 8시간이며,
   상기 c)단계의 에탄올 침전 반응 시 에탄올의 첨가 속도가 100 내지 200ml/min인 것을 특징으로 하는 화장료용 녹차다당체의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 a)단계의 용매는 헥산, 에탄올 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료용 녹차다당체의 제조방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항 또는 제 2항의 제조방법에 의해 제조된 화장료용 녹차다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 녹차다당체를 조성물 총 중량에 대해서 0.1중량% 내지 20 중량%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
8. 제 6항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 피부 미백용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
9. 제 6항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 피부 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
10. 제 6항에 있어서, 상기 화장료 조성물이 피부 주름개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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