KR101759751B1 - 항-관절염 활성을 갖는 플렉트란더스 암보이니쿠스 분획물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 50%-95% 알코올 용액 또는 용매로서 헥산 및/또는 에틸 아세테이트를 사용하여 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour.) 스프렝의 미정제 추출물을 용리시킴으로써, 수득되는 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour.) 스프렝의 추출물을 제공한다.

Description

항-관절염 활성을 갖는 플렉트란더스 암보이니쿠스 분획물 {PLECTRANTHUS AMBOINICUS FRACTION HAVING ANTI-ARTHRITIS ACTIVITY}

본 발명은 식물 추출물 특히, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Plectranthus amboinicus) (Lour.) 스프렝 (Spreng)의 분획물에 관한 것이다.

관절염은 가장 흔한 자가면역 질환이다. 이러한 질환의 특징은 관절의 부정렬 및 불구를 초래하는 뼈의 진행성 미란을 갖는 활액 조직의 염증이다. 관절염의 지속성은, 국소적일 뿐만 아니라 전신적인 면역 이상이 주로 염증유발 반응 및 염증 세포 및 염증 물질 예컨대, CD4⁺ T 세포, B 세포 및 염증 사이토카인의 과다 생성을 나타낸다는데 있다. 이들 모두는 관절 조직의 장기간 파괴를 초래한다. 일반적으로, 비공지의 외인성 병원균에 의한 숙주의 감염은 T 세포를 활성화시켜 관절염의 진행을 개시하여, 다중 반응 예컨대, 모노사이트, 마크로파아지의 활성화를 유도하고, 직접적으로 활액 및 내피 세포의 증식, 및 염증 사이토카인, 프로테아제 및 항체의 생성을 직접적으로 자극하는 것으로 간주된다. 또한, 염증 사이토카인은 관절염 질환 진행과 관련이 있다. 예를 들어, TNF-α는 프로스타글란딘 E, 콜라게나아제 및 다른 사이토카인 예컨대, 인터루킨-1 (IL-1) 및 인터루킨-6 (IL-6)의 생성을 자극함으로써 염증유발 사이토카인 캐스케이드에서 주요 역활을 수행한다. TNF-α 및 IL-1β는 또한, 매트릭스 메탈로프로테아나아제의 분비를 자극하고, 콘드로사이트, 마크로파아지, 활맥막 섬유아세포 및 파골세포를 포함하는 관절의 다중 조직에 직접 작용하여 관절 파괴를 초래한다. 한편, IL-6은 추가로 관절 조직에서 염증 세포를 추가로 증가시키고, 파골 세포의 증식을 자극하고, IL-1β의 역할을 강화시킬 수 있다. 전반적으로, 염증유발 사이토카인 IL-1β. TNF-α, IL-6 및 IL-17 사이의 실질적인 크로스-토크 (cross-talk)는 관절 파괴, 연골세포 억제 및 관절염에서 퇴행 조직의 복구에 대한 장애를 유도하는데 근본이 된다. 따라서, 전통적인 면역억제제 및 비스테로이드성 항염증 약물 이외에, 현재 임상 대부분은 특히, 상기 언급된 염증 인자 또는 세포를 겨냥하는 생물학적 안타고니스트 예컨대, TNF-α 및 IL-6 안타고니스트를 개발하고, 관절 손상을 저하시키거나 예방하고 기능을 유지시키는 것이다. 그러나, 이러한 치료법은 침습성이며, 그 후 효력이 약화된다. 게다가, 관절염 환자중 절반 이상은 전통적인 관절염 약물 및 생물학적 제제의 조합물에 반응적이지 않다. 따라서, 새롭고, 편리하고 안전하고 효과적인 치료법을 개발하는 것이 중요하다.

주로 말레이시아, 브라질, 중국 및 인도에 분포하는 다년생 허브인 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Plectranthus amboinicus) (Lour.) 스프렝 (Spreng)은 꿀풀과 (Labiatae family)에 속하며, 이는 일명 아가스타츄 루고사 (Agastache rugosa), 리시마치아 카필리페스 헴슬 (Lysimachia capillipes Hemsl), 스페아민트 (Spearmint), 파초올리 (Patchouly), 인디안 페퍼민트 (Indian peppermint) 또는 포고스테몬 카블린 (Pogostemon Cablin)으로 불린다. 플렉트란더스 암보이니쿠스는 두껍고, 대생이며, 넓은 달걀모양이며, 끝이 둥글거나 매우 날카로운 작은 크기의 톱니모양의 잎을 갖는다. 허브는 약 15 내지 30cm 높이이며, 미세한 털로 덮여있고, 강한 자극성의 냄새를 갖는다. 역사학적 기록에 따르면, 플렉트란더스 암보이니쿠스는 감기를 예방하고, 면역성을 강화시키고, 귀 종기, 염증 및 열과 같은 증상을 저하시키는 효능을 갖는 중국 약재의 한 유형이다. 전통적인 중국 약재로서, 이는 항염증제, 구풍제이며, 해독제로서 작용하며, 열, 편도선염, 후두염, 폐렴, 오한 및 열, 두통, 흉부와 복부의 메스꺼움, 구토, 설사, 약한 위, 찬 비장 등과 같은 증상을 완화시킨다. 플렉트란더스 암보이니쿠스의 생쥬스는 또한, 찰과상, 창상, 화상, 벌레물린데, 원인불명의 종창, 부스럼 및 통증, 귀 염증, 인후통, 부푼 포이즌 (poison), 타박상 등에 효과적이다. 또한, 미생물에 의해 초래되는 피부 문제 예컨대, 지루성 피부염, 습진, 여드름, 알레르기, 건조한 피부, 모낭염에 상당한 효과가 있으며, 피부 미백, 피로 회복 및 다양한 피부 백선의 제거에 매우 효과적이다.

대만 특허 출원 092135016에는 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour) 스프렝의 미정제 추출물을 제조하는 방법으로서, (a) 식물 잎을 압축시켜 쥬스를 수득하는 단계; (b) 단계 (a)의 쥬스에 알코올을 첨가하여 최종 알코올 농도가 70-80%가 되게 하고, 저온에서 방치하는 단계; (c) 단계 (b)의 알코올-함유 쥬스의 pH를 pH5.0-7.0으로 조절한 후, 저온에서 방치하는 단계; (d) 단계 (c)의 알코올 함유 쥬스의 불순물을 제거하기 위해 여과시키는 단계; (e) 단계 (d)에서 생성된 순수한 쥬스를 증류시키고 농축시켜 증류물을 수집하고, 이러한 증류물의 pH 값을 pH5.0-7.0으로 조절하는 단계; 및 (f) 단계 (e)의 증류물을 진공 여과하여 플렉트란더스 암보이니쿠스의 암갈색의 개끗한 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 방법이 기술되어 있다.

대만 특허 출원 093134346에는 분자량이 50kD 보다 큰 암 및/또는 종양 치료에 효과적인 플렉트란더스 암보이니쿠스 잎의 수 추출물을 제공한다.

대만 특허 출원 086118191에는 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)에 의한 감염을 예방하고 치료할 수 있는 포고스테몬 카블린 (Pogostemon cablin) 또는 아가스차체 루고사 (Agastache rugosa)의 수 추출물의 유형을 기술하고 있다. 이러한 추출물의 제조는 90.5% 에탄올, 4.5% 메탄올 및 5.0% 이소프로판올로 이루어진 시약에 의한 용출을 포함한다.

또한, 대만 특허 출원 096145943 즉, 대만 발명 특허 I-335225는 또한, 피부 질환을 치료하고, 상처 치료 즉, 당뇨병 환자의 상처 치료를 증진하기 위한 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour.) 스프렝의 추출물을 제공하고 있다. 이 특허문에 기재된 발명은 고체-액체 분리 (교반 분리) 및 특정 공정의 조합의 이용을 특징으로 하며, 이는 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물에서 흡착 수지 (예를 들어, 디아이온 (DIAION))의 교반 및 각 분리 단계에서 다양한 용매를 사용함으로써 이러한 추출물의 다양한 분획물 분리를 포함한다.

또한, 대만 특허 출원 095134243 즉, 발명 특허 I320714에는 류마티스 관절염 치료 효능이 있는 플렉트란더스 암보이니쿠스 벤스 (Benth)의 수 추출물이 기재되어 있다. 이러한 추출물은 적합한 양의 고-극성 용매에 소킹 (soaking)되고, 여과되고, 로터리 농축기에 의해 감압하에 농축되고, 용매중에 희석된 후, 칼럼에 의해 분리된다. 선택적으로, 높은 극성 내지 낮은 극성 (고-극성 용매, 중간 고-극성 용매, 중-극성 용매, 및 저-극성 용매로서 명명됨)의 다양한 용매의 네개 세그먼트가 용리를 위해 연속 사용될 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 예상치 못한 높은 항-염증 활성을 나타내는 플렉트란더스 암보이니쿠스 추출물을 제조하는 개선된 공정에 기초한다. 특히, 이러한 추출물은 50%~95% 알코올 용액에 의한 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour.) 스프렝의 미정제 추출물의 용리 또는 정상 크로마토그래피에 의해 제조된다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 HPLC 패턴을 약 320nm의 파장으로 검출시 보존 시간 약 45분에서 시르스마리틴 (Cirsmaritin)의 흡수 피크를 가짐을 특징으로 하는, 항염증 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 제공한다.

본 발명의 일 구체 예에서, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물은 하기를 특징으로 한다: 상기 추출물은 50%-95% 알코올 용액 바람직하게는, 70%-95% 알코올 용액, 더욱 바람직하게는 약 95% 알코올 용액을 이용하여 플렉트란더스 암보이니쿠스의 미정제 추출물을 용리함으로써 수득되었다. 본 발명의 실시예에서, 알코올 용액은 에탄올이다.

본 발명의 또 다른 구체 예에서, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물은 제 1 용매로서 헥산을 사용하고, 제 2 용매로서 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 정상 크로마토그래피에서 플렉트란더스 암보이니쿠스의 미정제 추출물을 용리시킴으로써 수득된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 용매중에 플렉트란더스 암보이니쿠스의 식물 또는 건조 분말을 추출하여 미정제 추출물을 수득하고, 생성된 미정제 추출물을 50%-95% 알코올 용액을 이용하여 크로마토그래피에 의해 용리시켜 항-관절염 활성이 풍부한 추출물을 분리하는 것을 포함하여, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체 예에 따르 면, 70%-95% 알코올 용액, 더욱 바람직하게는 약 95% 알코올 용액을 이용하여 생성된 미정제 추출물을 용리시켜 항-관절염 활성이 풍부한 추출물을 분리하는 것이 바람직하다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 용매중에 플렉트란더스 암보이니쿠스의 식물 또는 건조 분말을 추출하여 미정제 추출물을 수득하고, 제 1 용매로서 헥산을 사용하고, 제 2 용매로서 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 정상 크로마토그래피에 의해 생성된 미정제 추출물을 용리시키는 것을 포함하여, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일부 구체 예에서, 항-관절염 활성이 풍부한 생성된 추출물은 에틸 아세테이트, 에틸 아세테이트/메탄올 및/또는 메탄올과 같은 용매에 의해 추가로 용리될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 관절염을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 유효량의 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료를 위한 약제 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나 이상의 구체 예의 상세한 내용은 하기에 기술되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 수개의 구체예의 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 자명할 것이다.

하기 요약 및 본 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 숙지할 경우 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명의 설명을 위한 목적으로서, 현재 바람직한 도면 구체예를 제시한다. 그러나, 본 발명은 도시된 바람직한 구체 예에 의해 제한되는 것은 아님을 이해해야 한다.
도면:
도 1은 13, 20, 21, 27, 37 및 39분의 보존 시간에서 6개의 흡수 피크를 갖는 200nm 파장하에 검출된 ON-024의 HPLC 패턴이다.
도 2는 13분의 보존 시간에서 카페익산 (Caffeic acid)의 흡수 피크, 27분에서의 로즈마린산 (Rosmarinic acid)의 흡수 피크 및 35분에서 흡수 피크를 갖는, 320nm 파장하에 검출된 ON-024의 HPLC 패턴이다.
도 3은 45분의 보존시간에서 흡수 피크 및 55분의 보존시간에서 카르바크롤 (Carvacrol)의 흡수 피크를 갖는, 200nm 파장하에 검출된 ON-025의 HPLC 패턴이다.
도 4는 39-43분의 보존시간에서 8개 흡수 피크 및 45분에서 시르스마리틴의 흡수 피크를 갖는, 320nm 파장하에 검출된 ON-025의 HPLC 패턴이다.
도 5는 45분의 보존시간에서 시르스마리틴의 흡수 피크를 가지며, 55분에서 카르바크롤의 흡수 피크를 갖는, 200nm 파장하에 검출된 ON-066의 HPLC 패턴이다.
도 6은 45분의 보존시간에서 시르스마리틴의 흡수 피크를 가지며, 62분에서 살비게닌의 흡수 피크를 갖는, 320nm 파장하에 검출된 ON-066의 HPLC 패턴이다.
도 7은 55분의 보존시간에서 카르바크롤의 흡수 피크를 갖는, 200nm 파장하에 검출된 ON-080의 HPLC 패턴이다.
도 8은 18-21분의 보존 시간에서 3개의 흡수 피크를 가지며, 37-41분에서 3개의 흡수 피크를 가지며, 43-45분에서 2개의 흡수 피크를 가지며, 45분에서 시르스마리틴의 흡수 피크를 가지며, 50-54분에서 4개의 흡수 피크를 가지며, 62분에서 살비게닌의 흡수 피크를 갖는, 320nm 파장에서 검출된 ON-080의 HPLC 패턴이다.

발명의 상세한 설명

다르게 정의되어 있지 않은 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충 되는 경우, 본 발명에 따른 정의에 따른다.

본원에 사용된 바와 같은, 단수형은 분명히 다르게 언급되어 있지 않은 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "샘플"은 다수의 이러한 샘플들 및 당해분야에 공지된 이의 등가물들을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, "예방하는" 또는 "예방하기 위한"은 일반적으로, 작용 또는 진행이 중단되는 다양한 정도를 나타낸다. 예방은 정도를 감소시키거나 효과적으로 중단시키거나 이 둘 모두를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 상태를 개선시키는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유효량"은 치료에서 치료학적 이점을 제공할 수 있는 다른 약제와 함께 또는 단독의 본 발명의 조성물 또는 약제학적 조성물의 성분의 양을 나타낸다.

본 발명은 약 320nm의 파장에서 HPLC 패턴의 검출시 약 45분의 보존 시간에서 시르스마리틴의 흡수 피크를 가짐을 특징으로 하는 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 제공한다. 이는 미정제 추출물을 50%-95% 알코올 용액으로 용리시키거나 정상 크로마토그래피에 의해 수득될 수 있다. 생성된 용리물은 항-관절염 활성이 풍부하다는 점에서 플렉트란더스 암보이니쿠스의 공지된 추출물과 구별되며, 따라서, 관절염을 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명에 있어서, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 50%-95% 알코올 용액을 이용하여 본원에 기술된 바와 같은 미정제 추출물을 용리시킴으로써 분리시킬 경우, 도 3에 도시된 바와 같이, HPLC 패턴을 약 200nm 파장에서 검출시 약 55분의 카르바크롤의 흡수 피크 및 약 45분의 보존 시간에서 흡수 피크가 관찰된다; 도 4에 도시된 바와 같이, HPLC 패턴을 약 320nm 파장에서 검출시 39-43분의 보존 시간에서 8개의 흡수 피크 및 약 45분에서 시르스마리틴의 흡수 피크가 관찰된다.

본 발명에 있어서, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 본원에 기술된 바와 같이, 70%-95% 알코올 용액을 사용하여 미정제 추출물을 용리시킴으로써 분리하는 경우, 도 5에 도시된 바와 같이, HPLC 패턴을 약 200nm 파장에서 검출시 약 45분의 보존 시간에서 시르스마리틴의 흡수 피크 및 약 55분의 보존 시간에서 카르바크롤의 흡수 피크가 관찰되며; 도 6에 도시된 바와 같이, HPLC 패턴을 약 320nm 파장에서 검출시 약 45분의 보존 시간에서 시르스마리틴의 하나의 흡수 피크 및 약 62분의 보존 시간에서 살비게닌의 하나의 흡수 피크가 관찰된다.

본 발명에 있어서, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 정상 크로마토그래피에 의해 분리하는 경우, 도 7에 도시된 바와 같이, HPLC 패턴을 약 200nm 파장에서 검출시 약 55분의 보존 시간에서 카르바크롤의 하나의 흡수 피크가 관찰되며; 도 8에 도시된 바와 같이, HPLC 패턴을 약 320nm 파장에서 검출시 18-21분의 보존 시간에서 3개의 흡수 피크, 37-41분의 보존 시간에서 3개의 흡수 피크, 43-45분에서 2개의 흡수 피크, 약 45분에서 시르스마리틴의 하나의 흡수 피크, 약 50-54분에서 4개의 흡수 피크, 및 약 62분에서 살비게닌의 하나의 흡수 피크가 관찰된다.

본 발명에서, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물은 용매중에 플렉트란더스 암보이니쿠스의 식물 또는 건조 분말을 추출하여 미정제 추출물을 수득하는 단계, 및 생성된 미정제 추출물을 50%-95% 알코올 용액을 이용하여 크로마토그래피에 의해 용리시켜 항-관절염 활성이 풍부한 추출물을 분리하는 단계를 포함하여, 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 70%-95% 알코올 용액, 또는 더욱 바람직하게는, 약 95% 알코올 용액에 의해 본원에 기술된 바와 같은 미정제 추출물을 용리시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 용리를 위한 알코올 용액은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체 예에서, 에탄올이 사용된다.

용매중에 플렉트란더스 암보이니쿠스의 식물 또는 건조 분말을 추출하여 미정제 추출물을 수득하고, 제 1 용매로서 헥산을 사용하고 제 2 용매로서 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 정상 크로마토그래피에서 상기 생성된 미정제 추출물을 용리시킴을 포함하여, 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명의 구체 예에서, 용매 "헥산/에틸 아세테이트"중의 헥산 대 에틸 아세테이트의 부피 비는 1:1이다.

본 발명에 있어서, 추출될 플렉트란더스 암보이니쿠스는 생 또는 건조된 식물을 포함하나 이에 제한되지 않는 요망에 따른 임의의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 분말형태의 식물을 추출한다. 식물의 미정제 추출물은 예를 들어, 알코올 용액을 포함하나 이에 제한되지 않는 용매중에 용리시키는 임의의 공지된 공정에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 일 구체 예에 따르면, 약 95% 에탄올 용액이 사용된다.

본 발명의 일 구체 예에 따르면, 미정제 추출물을 수득하는데 약 95% 에탄올 용액이 사용될 수 있으며, 항-관절염 활성이 풍부한 추출물을 용리시키고 분리하기 위해 70%-95% 에탄올 용액이 크로마토그래피에 추가로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체 예에서, 약 95% 에탄올 용액이 미정제 추출물을 수득하는데 사용될 수 있으며, 헥산이 항-관절염 활성이 풍부한 추출물을 용리시키고 분리하기 위해 정상 크로마토그래피에 추가로 사용될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 추출 공정은 다른 적합한 농축 또는 정제 공정 예를 들어, 건조 농축, 감압 농축 및 냉동-건조로 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 관절염을 앓고 있는 쥐를 사용한 시험에 의해, 본 발명의 추출물의 항-관절염 활성이 풍부함이 입증된다. 따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 추출물을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 관절염을 예방 또는 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본 발명은 또한, 본원에 기술된 바와 같은 항-관절염 활성이 풍부한 치료학적 유효량의 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약제 조성물을 제공한다.

관절염 치료를 위한 본 발명의 약제 조성물중의 항-관절염 활성이 풍부한 추출물의 유효량은 0.5-10g/일이다.

치료를 위한 가장 적합한 경로 및 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 용량은 치료될 증상의 특성 및 상태, 치료할 환자의 연령 및 일반적 물리적 상태, 투여 경로 및 이전 실시된 치료법에 좌우될 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 조성물 제조에 사용될 수 있으며, 당업자에 의해 널리 공지된 희석제, 부형제, 허용되는 제제 등을 나타낸다.

본 발명의 조성물은 의학적으로 허용되는 경로 예컨대, 경구, 비경구 예를 들어, 근내, 정맥내, 피하내, 복강내, 트랜스더멀, 직장 또는 흡입에 의해, 또는 질, 안구 또는 코 경로를 통해 전달될 수 있다. 비경구로 전달되는 약제 조성물은 요망에 따라, 비제한적으로, 용액, 현탁액, 에멀젼 및 사용 직전 용매중에 용해되거나 현탁될 수 있는 고형의 주입가능한 조성물의 형태일 수 있다. 주입용 용액은 희석제중에 하나 이상의 활성제를 용해시키거나, 현탁시키거나 에멀션화시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 희석제중의 일부 예로는 주입용 증류수, 염수, 미네랄 오일, 알코올 및 이의 조합이 있다. 주입용 용액은 안정화제, 용매, 현탁제, 에멀션화제, 스무딩 제제 (smoothing agent), 완충제, 보종제 등을 함유할 수 있다. 주입용 용액은 최종 정제 단계에서의 멸균 또는 멸균 단계에 의해 제조된다. 본 발명의 약제 조성물은 예를 들어, 냉동 건조에 의해 멸균의 고형 제조물로서 제조될 수 있으며, 멸균의 주입용 물 또는 기타 멸균 희석액에서 용해되거나 사용 직전 멸균될 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 또한, 고체 또는 액체 형태로 경구 전달될 수 있다. 고체 조성물은 정제, 필, 캡슐, 분말, 과립 등을 포함한다. 경구용 조성물은 또한, 가글 및 로젠지를 포함한다. 캡슐은 경질 및 연질 캡슐을 포함한다. 이러한 경구의 고체 조성물에서, 하나 이상의 활성 화합물은 단독으로, 또는 희석제, 킬레이트화제, 붕해제, 윤활제, 안정화제 및 조용매와 함께 사용되어 공지된 방법에 따라 제조물을 형성시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 경구 액체 조성물은 약제학적으로 허용되는 액체 용액, 현탁액, 에멀션, 시럽, 약용주 등을 포함한다. 이러한 조성물에서, 하나 이상의 활성 화합물은 균일한 희석제 (예를 들어, 정제수, 에탄올 또는 이의 조합물)에서 용해되거나, 현탁되거나 에멀션화될 수 있다. 이러한 희석제를 제외하고, 상기 조성물은 습윤제, 현탁제, 에멀션화제, 감미제, 향미제, 스파이시스, 보존제, 완충제 등을 함유할 수 있다.

하기 특정 예는 단지 설명을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 어려움 없이 당업자는 본원의 기재에 기초하여 본 발명을 활용할 수 있을 것이다. 본원에 언급된 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 이용되었다.

제조 실시예

실시예 1. 50%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물

예비 추출:

적당량의 건조된 플렉트란더스 암보이니쿠스를 95% 에탄올 용액에서 추출하여 제 1 여과물을 수득하였다. 그 후, 제 1 여과물을 여과하여 잔류물을 추가로 수득하고, 이를 다시 95% 에탄올 용액중에 추출시켜 제 2 여과물을 수득하였다. 이어서, 제 1 및 제 2 여과물을 혼합하고, 감압하에 이의 원래 부피의 1/20로 농축시켜 농축액을 수득하였다.

칼럼 크로마토그래피:

생성된 농축액을 HP-20 칼럼으로 분리하였다. 간단하게는, 농축액을 전체적으로 RO 수와 혼합된 농축액을 칼럼에 어플라이 (apply)한 후, 칼럼 부피의 네 배되는 칼럼 RO 수를 통과시켜 제 1 용리물을 수집하였다. 그 후, 칼럼 부피의 네 배되는 1:1 (v/v)의 RO 수와 95% 에탄올로 이루어진 용액으로 칼럼을 추가로 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 그 후, 제 2 용리물을 감압하에 농축시켜 ON-024로 명명한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물 즉, 0%-50% 에탄올 용액으로 추출된 대조군 샘플을 수득하였다.

그 후, 칼럼 부피의 네 배되는 95% 에탄올 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 3 용리물을 수집한 후, 이를 감압하에 농축시키고 냉동 건조하여 ON-025로 명명한 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물, 즉 50%-95% 에탄올 용액으로 분리된 추출물을 수득하였다.

추가로, 에틸 아세테이트로 칼럼을 통과시켜 제 4 용리물을 수집한 후, 이를 감압하에 농축시키고 냉동 건조시켜 에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란더스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 2. 50%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물

칼럼 크로마토그래피:

실시예 1의 예비 추출에서 제조된 바와 같은 생성된 농축액을 HP-20 칼럼으로 분리하였다. 간단하게는, RO 수와 완전하게 혼합된 농축액을 칼럼에 어플라이한 후, 칼럼 부피의 2배되는 RO 수를 칼럼을 통해 통과시켜 제 1 용리물을 수집하였다. 그 후, 1:1 (v/v)의 RO 수와 95% 에탄올로 이루어진, 칼럼 부피의 2배가 되는 용액으로 칼럼을 추가로 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 그 후, 제 2 용리물을 감압하에 농축시키고 냉동 건조시켜 ON-022로 명명된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 생성시켰다.

후속하여, 칼럼 부피의 2배가 되는 95% 에탄올 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 3 용리물을 수집한 후, 이를 감압하에 농축시키고, 건조시켜 ON-023으로서 명명된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물 즉, 50%-95% 에탄올 용액으로 분리된 추출물을 생성시켰다.

추가로, 후속적으로 칼럼 부피의 2배가 되는 에틸 아세테이트로 칼럼을 통과시켜 제 4 용리물을 수집한 후, 이를 감압하에 농축시키고 건조시켜 에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 3. 70%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물

실시예 1의 예비 추출에 의해 제조된 바와 같은 생성된 농축액을 HP-20 칼럼으로 분리하였다. 간단하게는, RO 수와 완전하게 혼합시킨 농축액을 칼럼에 어플라이한 후, 칼럼 부피의 4배가 되는 RO 수로 칼럼을 통과시켜 제 1 용리물을 수집하였다. 그 후, 3:7 (V/V)의 RO 수와 95% 에탄올로 이루어진 칼럼 부피의 4배가 되는 용액으로 칼럼을 추가로 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 제 2 용리물을 감압하에 농축시키고 냉동 건조시켜 ON-065로서 명명된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 4배가 되는 95% 에탄올 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 3 용리물을 수집한 후, 이를 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-066으로 명명된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물 즉, 70%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물을 생성시켰다.

추가로, 칼럼 부피의 4배가 되는 에틸 아세테이트로 칼럼을 통과시켜 제 4 용리물을 수집한 후, 이를 감압하에 농축시키고 건조시켜, 에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 4. 정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물

예비 추출:

적당량의 건조된 플렉트란투스 암보이니쿠스를 95% 에탄올 용액에서 추출하여 제 1 여과물을 수득하였다. 그 후, 제 1 여과물을 여과하여 잔류물을 수득한 후, 95% 에탄올 용액에서 다시 추출하여 제 2 여과물을 수득하였다. 후속하여, 제 1 및 제 2 여과물을 혼합하고, 감압하에 농축하여 농축액을 생성시켰다. 이러한 농축액을 실리카 겔과 혼합한 후, 감압하에 농축하고 건조하여 겔에 부착된 미정제 추출물 ("CE-겔")을 생성시켰다.

칼럼 크로마토그래피:

건조된 플렉트란투스 암보이니쿠스와 동일 중량의 실리카 겔로 헥산 사용에 의한 칼럼을 충전시킨 후, 충전된 칼럼을 상기 제조된 바와 같은 CE-겔로 추가로 커버링하였다. 칼럼 부피의 6배가 되는 헥산으로 칼럼을 용리시켜 제 1 용리물을 수득한 후, 이를 감압하에 농축하고 건조시켜 ON-078로서 명명된, 헥산에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

후속하여, 1:1 (v/v)의 칼럼 부피의 6배가 되는 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 수득된 제 2 용리물을 감압하에 농축하고 건조시켜 ON-079로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

추가로, 칼럼 부피의 6배가 되는 에틸 아세테이트로 칼럼을 통과시켜 제 3 용리물을 수집하였다. 생성된 제 3 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-083으로서 명명된, 에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

1:1 (v/v)의 칼럼 부피의 6배가 되는 에틸 아세테이트/메탄올 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 4 용리물을 추가로 수집하였다. 생성된 제 4 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜, ON-084로서 명명된, 에틸 아세테이트/메탄올에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 4배가 되는 메탄올로 칼럼을 통과시켜 최종 용리물을 수집하였다. 생성된 최종 용리물을 감압하에 농축하고 건조시켜, ON-085로서 명명된 메탄올에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 5. 정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출

칼럼 크로마토그래피를 실시예 4에 기술된 바와 같이 수득하여 ON-078을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 2배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 생성된 제 2 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜, ON-080으로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

추가로, 칼럼 부피의 4배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 후속적으로 통과시켜 제 3 용리물을 수득하였다. 생성된 제 3 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜, ON-092로서 명명한 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

최종 용리물을 칼럼 부피의 6배가 되는 에틸 아세테이트로 칼럼을 추가로 통과시킴으로써 수집하였다. 생성된 최종 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-083으로서 명명된 에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 6. 정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물

실시예 4에 기술된 바와 같이 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 ON-078을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 2배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 생성된 제 2 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-080으로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

추가로, 칼럼 부피의 2배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 후속 통과시켜 제 3 용리물을 수득하였다. 생성된 제 3 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-081으로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

칼럼 부피의 2배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 후속 통과시켜 제 4 용리물을 수득하였다. 생성된 제 4 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-082로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

칼럼 부피의 6배가 되는 헥산으로 칼럼을 후속 통과시켜 제 5 용리물을 수득하였다. 생성된 제 5 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-083으로서 명명된, 헥산에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

칼럼 부피의 6배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/메탄올 용액으로 칼럼을 후속 통과시켜 제 6 용리물을 수득하였다. 생성된 제 6 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-084로서 명명된, 헥산/메탄올에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

칼럼 부피의 4배가 되는 메탄올로 칼럼을 후속 통과시켜 최종 용리물을 수득하였다. 생성된 최종 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-085로서 명명된, 메탄올에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 7. 정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물

실시예 4에 기술된 바와 같이 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 ON-078을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 6배가 되는 9:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 칼럼 부피의 6배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 3 용리물을 수집하였다. 생성된 제 3 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-086으로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 8. 정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물

실시예 4에 기술된 바와 같이 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 ON-078을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 6배가 되는 8:2 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 생성된 제 2 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-087로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

칼럼 부피의 6배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 후속 통과시켜 최종 용리물을 수집하였다. 생성된 최종 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-088로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 9. 정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물

실시예 4에 기술된 바와 같이 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 ON-078을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 6배가 되는 7:3 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 생성된 제 2 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-089로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

칼럼 부피의 6배가 되는 1:1 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 후속 통과시켜 최종 용리물을 수집하였다. 생성된 최종 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-090으로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

실시예 10. 정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물

실시예 4에 기술된 바와 같이 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 ON-078을 수득하였다.

후속하여, 칼럼 부피의 6배가 되는 6:4 (v/v)의 헥산/에틸 아세테이트 용액으로 칼럼을 통과시켜 제 2 용리물을 수집하였다. 생성된 제 2 용리물을 감압하에 농축시키고 건조시켜 ON-091로서 명명된, 헥산/에틸 아세테이트에 의해 분리된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물을 수득하였다.

본 발명자들은 추가로, ON-024 (0%-50% 에탄올 용액으로 분리된 추출물), ON-025 (50%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물), ON-066 (70%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물) 및 ON-080 (정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물)의 추출물을 200nm 및 320nm 파장하에서 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석하였다. 그 결과, ON-024의 HPLC 패턴은 ON-025 (50%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물), ON-066 (70%-95% 에탄올 용액에 의해 분리된 추출물) 및 ON-080 (정상 크로마토그래피에 의해 분리된 추출물)의 패턴과 상이한 것으로 밝혀졌다.

(1) 200nm 파장에서 검출시 ON-024의 HPLC 패턴은 13, 20, 21, 27, 37 및 39분의 보존 시간에서 6개의 흡수 피크를 나타내었으며 (도 1); 320nm 파장에서 검출시, 13분의 보존 시간에서 카페익산의 흡수 피크, 27분의 보존 시간에서 로즈마린산의 흡수 피크, 및 35분에서 흡수 피크를 나타내었다 (도 2).

(2) 200nm 파장에서 검출시 ON-025의 HPLC 패턴은 45분의 보존 시간에서 흡수 피크 및 55분에서 카르바크롤의 흡수 피크를 나타내었으며 (도 3); 320nm 파장에서 검출시, 39-43분의 보존 시간에서 8개의 흡수 피크 및 45분에서 시르스마리틴의 흡수 피크를 나타내었다 (도 4).

(3) 200nm 파장에서 검출시 ON-066의 HPLC 패턴은 45분의 보존 시간에서 시르스마리틴의 흡수 피크 및 55분에서 카르바크롤의 흡수 피크를 나타내었으며 (도 5); 320nm 파장에서 검출시, 45분의 보존 시간에서 시르스마리틴의 흡수 피크 및 62분에서 살비게닌의 흡수 피크를 나타내었다 (도 6).

(4) 200nm 파장에서 검출시 ON-080의 HPLC 패턴은 55분의 보존 시간에서 카르바크롤의 흡수 피크를 나타내었으며 (도 7); 320nm의 파장에서 검출시 18-21분의 보존 시간에서 3개의 흡수 피크, 37-41분에서 3개의 흡수 피크, 43-45분에서 2개의 흡수 피크, 45분에서 시르스마리틴의 흡수 피크, 50-54분에서 4개의 흡수 피크, 및 62분에서 살비게닌의 흡수 피크를 나타내었다 (도 8).

효능 실시예

실시예 1. 완전 프로인트 항원 보강제-유도된 관절염을 갖는 동물 모델

170±10g의 6마리의 암컷 루이스 랫트 그룹을 사용하였다. 완전 프로인트 항원 보강제 (CFA) 즉, 치사된 마이코박테리움 부티리컴 (Mycobacterium butyricum)의 잘 분쇄된 현탁액 (0.1ml의 라이트 미네랄 오일중의 0.3mg)을 오른쪽 뒷발의 발바닥 영역에 단일 용량으로 주입하였다 (1일로 나타냄). CFA의 주입 1시간 전에, 500mg/kg의 시험 화합물 또는 비히클 (1% 카르복시메틸셀룰로오스, 10mL/kg)을 위관영양법 (oral gavage) (PO)에 의해 동물에 투여하였다. 투여는 5일 연속으로 일일 2회 수행하였다. 왼쪽 뒷 발의 부피는 0일 (CFA 처리 전), 14일, 18일 및 21일에 체적변화유량계로 측정하였다. 그 후, 각 처리군의 최종 부풀어 오름을 비히클 처리 군과 비교하여, 억제율로 나타내었다. 비히클 처리군과 비교하여 발 부피가 30% 이상 억제된 것을 현저한 항-관절염 활성이 있는 것으로 간주되었다. 각 그룹에 투여된 추출물 및 상응하는 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

표 1. 대조군과 비교한 억제 활성

"*"는 현저한 항-관절염 활성을 나타낸다.

실시예 2. 항염증 활성

실험

(A) 세포 배양

건강한 성인 공여체의 혈액으로부터의 말초혈액단핵구 (PBMC)를 희석하고 실온에서 30분 동안 600g에서 피콜-파크 (Ficoll-Paque) (FP) 구배 원심분리 (Amersham Biosciences)에 의해 분리하였다. 분리된 PBMC를 인산염 완충된 염수로 세척하고, 10% 가열 불활성화된 소태 혈청 (FBS)에 재현탁시키고, 본원에 기술된 바와 같이 추출물의 항관절염 활성을 평가하기 위해 웰 당 2.0x10⁵ 세포의 밀도로 96-웰 배양 플레이트에 시딩하였다.

(B) PHA-유도된 PBMC 증식의 억제

PHA 유도된 PBMC 증식을 본 발명의 다양한 추출물의 항염증 활성을 평가하기 위한 기술적 플랫폼으로서 사용하였다. 인간 PBMC를 5㎍/mL의 최종 농도의 PHA와 최종 농도 0-90㎍/ml의 플렉트란투스 암보이니쿠스의 다양한 추출물을 3일 동안 공동배양하였다. PHA (5㎍/mL)에 의한 자극 전에 덱사메타손 (DEX)으로 처리된 PBMC를 파지티브 대조군 샘플로서 실험에 포함시켰다. 5% CO₂를 함유하는 습한 공기하에 37℃에서 3일 동안 세포를 인큐베이션 시킨 후, MTT (메틸 티아졸릴 테트라졸륨, MTT) 분석을 수행하여 PBMC의 증식율을 평가하였다. PHA 처리되지 않은 PBMC를 네거티브 대조군 샘플로서 사용하였다. 각 웰의 흡광도를 540nm 파장하에 광전비색계에 의해 검출하였다. 색 강도 (color intensity)는 세포 증식의 정도와 비례하였으며; 따라서, 각 추출물의 억제 활성을 계산하는데 이용될 수 있다. 3개의 독립된 실험을 수행하였으며, MTT 분석에 의해 측정된 데이타는 IC₅₀으로서 나타내었다.

표 2 및 3에 도시된 바와 같이, 본 발명에 의해 제공된 플렉트란투스 암보이니쿠스의 추출물은 모두 용량 의존적 방식으로 PHA에 의해 유도된 림프구의 증식을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 세포에 대한 추출물의 세포 독성 (PHA 비처리시)은 MTT 분석에 의해 또한 측정될 수 있다. 그 결과, ON-023 (40㎍/ml)은 세포 독성 없는 PHA-유도된 림프구 증식에 대한 완전한 억제 활성을 나타내었으며; 그 반대로, ON-022 (40㎍/ml)은 PHA-유도된 림프구 증식에 대한 단지 부분적 억제 활성 (~50%)을 나타내었다.

표 2. PHA-유도된 PMBC 증식에 대한 다양한 추출물의 억제 (데이타는 MTT 분석에 의해 측정됨)

표 3. PHA-유도된 PMBC 증식에 대한 다양한 추출물의 억제 (데이타는 MTT 분석에 의해 측정되고, IC₅₀으로서 나타냄).

(C) PHA-유도된 사이토카인의 생성 및 측정

3일째에, 세포 상청액을 수집하고, 나누고 분석 때까지 -20℃에서 보관하였다. 상청액중의 TNF-α, 인터루킨 IL-6, IFN-γ 및 IL-5의 양을 제조업자의 지시에 따라 콴티킨 ELISA 키트 (Quantikine ELISA kits: R & D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 측정하였다.

PHA에 의해 유도되거나 자연적으로 방출되는 배양 배지중의 사이토카인의 수준은 표 4에 나타내었다. PBMC로부터 PHA-유도된 사이토카인 생성에 대한 각 추출물의 효과는 표 5-8에 도시되어 있다. 이러한 결과는 본 발명의 추출물의 항염증 효과를 입증해준다.

표 4. PBMC로부터의 TNF-α, IL-6, IFN-γ 및 IL-5 (pg/mL)의 PHA 유도된 방출

표 5. PBMC로부터의 PHA-유도된 TNFα 방출에 대한 다양한 추출물의 억제

표 6. PBMC로부터의 PHA-유도된 IL-6 방출에 대한 다양한 추출물의 억제

표 7. PBMC로부터의 PHA-유도된 IFN-γ 방출에 대한 다양한 추출물의 억제

표 8. PBMC로부터의 PHA-유도된 IL-5 방출에 대한 다양한 추출물의 억제

Claims (23)

1. 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Plectranthus amboinicus) (Lour.) 스프렝 (Spreng)의 추출물로서,
   (a) 건조된 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour.) 스프렝을 알코올 용액으로 추출하여 미정제 추출물을 수득하는 단계 및
   (b) 상기 미정제 추출물을 제1 용매로서 헥산 및 제2 용매로서 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 정상 크로마토그래피에 의해 용리시켜 상기 제2 용매로부터 용리물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 추출물.
2. 항-관절염 활성이 풍부한 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour.) 스프렝의 추출물을 제조하는 방법으로서,
   알코올 용매중에서 건조된 플렉트란더스 암보이니쿠스 (Lour.) 스프렝을 추출하여 미정제 추출물을 수득하고,
   상기 생성된 미정제 추출물을 제 1 용매로서 헥산 및 제 2 용매로서 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 정상 크로마토그래피에 의해 용리시켜 제2 용매에 의해 항-관절염 활성이 풍부한 추출물을 분리하는 것을 포함하는 방법.
3. 치료학적 유효량의 제 1항에 따른 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 관절염 치료용 약제 조성물.
4. 치료학적 유효량의 제 2항에 따른 방법에 의해 제조된 추출물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 관절염 치료용 약제 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 알코올 용액이 95% 에탄올인, 추출물.
6. 제 2항에 있어서, 상기 알코올 용액이 95% 에탄올인, 방법.
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