JP2021187769A

JP2021187769A - 免疫制御用組成物

Info

Publication number: JP2021187769A
Application number: JP2020093510A
Authority: JP
Inventors: 真行野口; Masayuki Noguchi; 知倫渡邉; Tomomichi Watanabe; 健史澤野; Takeshi Sawano
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2021-12-13

Abstract

【課題】新規な免疫制御用組成物を提供することを課題とする。【解決手段】キンミズヒキ抽出物及び／又はキンミズヒキ抽出物の濃縮物を有効成分として含有する免疫制御用組成物。【選択図】図１

Description

本発明は、免疫制御用組成物に関する。

キンミズヒキ（金水引、学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａ）は、バラ科キンミズヒキ属の多年草で漢方薬に利用される。生薬名は仙鶴草である。キンミズヒキの花期の地上部の茎葉には、精油とタンニンを含んでおり、そのうちの主成分となるタンニンは、細胞組織を引き締める収斂作用があることが知られている。また、水で煮出した水性エキスには、胆嚢の働きを助ける利胆作用があるといわれている。根には、タンニンのほか、フェノール性配糖体、アグリモノリド、フィトステロール、バニル酸、タキシフォリンなどが含まれることが知られている。

近年キンミズヒキの薬理効果が注目されている。特許文献１にはキンミズヒキ抽出成分を有効成分とする神経活性化用組成物が記載されている。
特許文献２には、キンミズヒキ抽出物を含有するエンドペプチダーゼ阻害剤および発毛抑制剤が記載されている。
特許文献３には、キンミズヒキ抽出物を含有するドーパオキシダーゼ活性抑制剤及び美白剤が記載されている。
特許文献４には、キンミズヒキ抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤及びアレルゲン賦活剤が記載されている。
しかしキンミズヒキ抽出物が免疫応答、特にＴ細胞の分化や機能を制御する報告はなされていない。

Ｔ細胞が免疫応答において主要な役割を示す細胞であることは周知である一方、Ｔ細胞の異常が自己免疫疾患を含む種々の病態に陥ることも知られる。従って、Ｔ細胞の分化や機能を制御することは、正常な生体の恒常性維持ができるばかりでなく、Ｔ細胞が原因の各種疾患の予防や治療に広く有効であると考えられている。免疫応答は非自己（特に有害な病原体など）を排除するために重要な生体防御機構であるものの、過剰な応答により自己を攻撃することになる。そのために、免疫系には免疫応答を抑制制御する様々なしくみが備わっていることが知られている。例えば、免疫応答が終わる際には大部分の抗原特異的免疫細胞はアポトーシスと呼ばれるプログラムされた細胞死が誘導され、あるいは制御性Ｔ細胞と呼ばれる免疫反応を抑制する免疫細胞が働くことが知られている。このようにして過剰に発現した、Ｔ細胞の活性を抑制することで免疫が制御されることがよく知られている。

特開２０１８−８８８８号公報特開２０１１−１９０２１４号公報特開２０１０−１９５７３１号公報特開２００８−１７４５２９号公報

本発明者らは、Ｔ細胞の分化を研究する過程で、様々な植物抽出物のスクリーニングを行い、Ｔ細胞の分化や機能を抑制又は変化させ、あるいは増強して、免疫を制御する抽出物を見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は、新規な免疫制御用組成物を提供することを課題としている。

すなわち、本発明の構成は以下のとおりである。
（１）キンミズヒキ抽出物及び／又はキンミズヒキ抽出物の濃縮物を有効成分として含有する免疫制御用組成物。
（２）免疫制御が、Ｔ細胞の機能を抑制することによってなされるものである（１）に記載の免疫制御用組成物。
（３）免疫制御が、Ｔ細胞であるＴｈ１、Ｔｈ９、Ｔｈ１７から選択されるいずれか１以上の細胞の分化及び／又は活性を抑制するものである（１）又は（２）に記載の免疫制御用組成物。

本発明により、新規な免疫制御用の組成物が提供される。
本発明の組成物は、Ｔ細胞のＴｈ１、Ｔｈ９、Ｔ１７への分化及び／又は活性化を抑制して免疫を制御する。それによって、本発明の組成物は、Ｔ細胞のＴｈ１、Ｔｈ９、Ｔ１７への分化、Ｔｈ１、Ｔｈ９、Ｔ１７の活性化又は異常な機能亢進が関与する疾患の治療に有効性を示す。

ナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞に分化させる系において、キンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物がＴｈ１細胞への分化を抑制し、ＩＦＮ−γ産生を抑制することを示すグラフである。ナイーブＴ細胞をＴｈ９細胞に分化させる系において、キンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物がＴｈ９細胞への分化を抑制し、ＩＬ−９産生を抑制することを示すグラフである。ナイーブＴ細胞をＴｈ１７細胞に分化させる系において、キンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物がＴｈ１７細胞への分化を抑制し、ＩＬ−１７産生を抑制することを示すグラフである。

本願明細書において、「免疫制御」とは、免疫担当細胞たるＴ細胞に働きかけることで、その分化や機能を抑制、又は変化させ、あるいは増強させることをいう。

＜キンミズヒキ抽出物及び／又はキンミズヒキ抽出物の濃縮物＞
キンミズヒキ（学名：Ａｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａ）は、バラ科キンミズヒキ属の多年草であり、本州、四国、九州などの林の縁、原野、路傍に生息しており、容易に入手可能である。別名、龍牙草ともいう。本発明において、キンミズヒキは、漢方生薬、民間療法薬、健康食品（ハーブティー）原料として市販されている乾燥物を使用することができる。全草を乾燥させたものは、仙鶴草の生薬名で市販されている。これを使用することもできる。
また自生あるいは栽培されたもの、全草を採取し、そのまま、又はこれを自然乾燥又は加熱乾燥させたものを細切し、約１０倍量の水または、含水濃度０〜８０％（ｖ／ｖ）エタノールに３〜５日間浸漬して室温で抽出するか、あるいは還流冷却器を付して５０〜８０℃で５〜２４時間抽出し、ろ過してキンミズヒキ抽出液を回収する。
この抽出液を精製せず、ロータリーエバポレーターなどの減圧真空乾燥装置、又は凍結乾燥装置によって、水及びエタノールを除去したものをキンミズヒキ抽出物とする。またこのキンミズヒキ抽出物を再度エタノールなどの溶媒に溶解後、珪藻土ろ過等のろ過手段で不溶解性物を除去し、さらにエタノールなどの溶媒を除去して精製したキンミズヒキ抽出物を、キンミズヒキ抽出物の濃縮物として得ることもできる。

キンミズヒキ抽出物及び／又はキンミズヒキ抽出物の濃縮物を有効成分とする免疫制御用組成物は、前記抽出物又は濃縮物をそのまま、あるいは慣用の医薬用製剤担体とともに医薬用組成物として動物及びヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよい。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤や、注射剤、坐薬などの非経口剤が挙げられる。投与量は、経口剤の場合、通常成人で抽出物の乾燥質量で１０〜１０００ｍｇを１日数回に分けて服用するのが適当である。

本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤は、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などの賦形剤を用いて常法に従って製造される。この種の経口用製剤には本発明組成物の他に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを適宜使用できる。

有効成分以外の配合成分は、結合剤としてはデンプン、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどが例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどを例示できる。界面活性剤としてはラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。滑沢剤としては、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコールなどを例示できる。流動性促進剤としては軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどを例として挙げることができる。

キンミズヒキ抽出物及び／又はキンミズヒキ抽出物の濃縮物を有効成分として含有する免疫制御用の飲食品には、特に制限はない。通常は飲料又は健康食品、サプリメントなどの形態で摂取することが、一日当たりの摂取量の管理をするうえで好ましい形態である。飲食品としては、キンミズヒキ抽出物及び／又はキンミズヒキ抽出物の濃縮物の乾燥質量で一日当たり、１０〜１０００ｍｇ摂取可能な量を配合する。

本発明を適用する疾患としては次のものを例示できる。
Ｔｈ１が増加又は活性化すると１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチなどが発症又は憎悪する。Ｔｈ９は気道炎症、ＩｇＥ発現、皮膚炎、アトピーなどが発症又は憎悪する。Ｔｈ１７は、多発性硬化症、乾癬、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、認知機能低下などが発症又は憎悪する。本発明の組成物は、これらの疾患の予防や改善のために用いることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

＜免疫細胞に対する効果試験＞
１．インビトロ試験（Ｔ細胞分化誘導の抑制試験）
免疫応答に関して中心的役割を果たす各種Ｔ細胞（以下「Ｔ細胞」）分化に及ぼすキンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物の効果を評価した。
（１）試験方法
ａ）試験試料の調製
・キンミズヒキ抽出物の調製
キンミズヒキ（仙鶴草、福田龍株式会社）２０ｋｇに、９０％エチルアルコール１０倍量（２００ｋｇ）を加え、還流抽出を２回繰り返した。終了後、固液分離して抽出液を得た。得られた抽出液を、常法により活性炭処理、珪藻土ろ過した後、濃縮・凍結乾燥し、試験試料１（抽出物）とした（固形量１．５ｋｇ、収率７．５％（対原料））。

・キンミズヒキ抽出物の濃縮物の調製
上記試験試料１（抽出物）６００ｇを６０℃に加温した２０％エタノール溶液５４０ｇに溶解・懸濁（固形量１０％）させた後、常法により珪藻土ろ過して残渣を回収した。残渣を再び９０％エチルアルコールに溶解させ、常法により珪藻土ろ過した後、再度濃縮・凍結乾燥して濃縮物を得た（固形量２０３．３ｇ、収率３４％（対抽出物））。これを試験試料２（濃縮物）とした。

ｂ）Ｔ細胞の分化制御試験方法
本発明の組成物がＴ細胞からエフェクター細胞であるＴｈ１、Ｔｈ９、Ｔｈ１７細胞に分化する過程に対する効果を試験した。

Ａ．ナイーブＴ細胞の取得
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスより摘出した脾臓およびリンパ節を、７０μｍのセルストレイナー上ですりつぶすことにより単離した細胞に、ＡＣＫ緩衝溶液を入れ、溶血させた。その後、ＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（ミルテニーバイオテク株式会社）を用い、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。
次いで、分離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ／ｃｙ７−抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−抗ＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４４抗体（及びＰＥ−抗ＣＤ６２Ｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて染色を行い、セルソーター「ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（商標）」（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってナイーブＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４４^ｌｏｗＣＤ６２^ｈｉｇｈ）をソーティングし、ナイーブＴ細胞画分を得た。

Ｂ．細胞の分化誘導
ソーティングして得たナイーブＴ細胞を含む細胞培養系に、Ｔｈ１、Ｔｈ９、Ｔｈ１７細胞を分化誘導することが知られているＴ細胞分化誘導因子を添加した。使用した分化誘導因子は、抗ＩＬ−４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＩＦＮγ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ−４（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ−６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ−２３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）の７種類である（下記表１参照）。

また添加する誘導因子の添加量と誘導系は次のとおりである。
抗ＩＬ−４抗体を、Ｔｈ１誘導系とＴｈ１７誘導系に各系の最終濃度が１０μｇ／ｍｌ、抗ＩＦＮγ抗体をＴｈ９誘導系とＴｈ１７誘導系に各系の最終濃度が１０μｇ／ｍｌ、ＩＬ−１２をＴｈ１誘導系に最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−４をＴｈ９誘導系に最終濃度が２０ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦβをＴｈ９誘導系に最終濃度が３ｎｇ／ｍｌ、また同じくＴＧＦβをＴｈ１７誘導系に最終濃度が２ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６をＴｈ１７誘導系に最終濃度が２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−２３をＴｈ１７誘導系に最終濃度が５ｎｇ/ｍｌとなるようにそれぞれ添加する（下記表２参照）。

そしてキンミズヒキ抽出物の最終濃度が１または３μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、さらに１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体をコートした９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２μｇ／ｍｌになるように抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、３日間培養した。
また同様にキンミズヒキ濃縮物の最終濃度が１または３μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、さらに１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体をコートした９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに２μｇ／ｍｌになるように抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、３日間培養した。
なお本試験において分化させるエフェクターＴ細胞名とその細胞に発現したマーカーは、次のとおりである。
Ｔｈ１：ＩＦＮ−γ
Ｔｈ９：ＩＬ−９
Ｔｈ１７：ＩＬ−１７

Ｃ．Ｔｈ１、Ｔｈ９、Ｔｈ１７の検出
培養終了後の培養上清中に含まれる分化したＴｈ１のマーカーであるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、分化したＴｈ９のマーカーであるＩＬ−９、分化したＴｈ１７のマーカーであるＩＬ−１７をそれぞれ測定した。なおＩＦＮ−γ及びＩＬ−９はＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄａｒｒａｙ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて測定し、ＩＬ−１７はＥＬＩＳＡｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定を行った。
測定結果はダーネット法により統計的有意差検定を行った。

（２）試験結果
分化したＴ細胞マーカーであるＩＮＦ−γ（Ｔｈ１のマーカー）、ＩＬ−９（Ｔｈ９のマーカー）、ＩＬ−１７（Ｔｈ１７のマーカー）それぞれの測定結果を表３〜５、図１〜３に示した。

表３及び図１にＴｈ１誘導系にキンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物を添加した場合の、培養液中のＩＮＦ−γ産生量の測定結果を示した。キンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物は、濃度依存性でＩＮＦ−γの産生を抑制した。すなわちキンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物は、濃度依存性でナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化を統計的有意に抑制することが明らかになった。

表４及び図２にＴｈ９誘導系にキンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物を添加した場合の、培養液中のＩＬ−９産生量の測定結果を示した。キンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物は、濃度依存性でＩＬ−９の産生を抑制した。すなわちキンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物は、濃度依存性でナイーブＴ細胞のＴｈ９細胞への分化を統計的有意に抑制した。

表５及び図３にＴｈ１７誘導系にキンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物を添加した場合の、培養液中のＩＬ−１７産生量の測定結果を示した。キンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物は、濃度依存性でＩＬ−１７の産生を抑制した。すなわちキンミズヒキ抽出物及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物は、濃度依存性でナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を抑制することが確認できた。

以上に示すように、キンミズヒキ抽出物（試験試料１）及びキンミズヒキ抽出物の濃縮物（試験試料２）はいずれもナイーブＴ細胞の分化誘導系において、添加量に依存して、Ｔ細胞のエフェクター細胞であるＴｈ１、Ｔｈ９、Ｔｈ１７それぞれへの分化抑制及び／又は活性化抑制することから、免疫制御用の組成物として有用であることが明らかとなった。

Claims

キンミズヒキ抽出物及び／又はキンミズヒキ抽出物の濃縮物を有効成分として含有する免疫制御用組成物。
免疫制御が、Ｔ細胞の機能を抑制することによってなされるものである請求項１に記載の免疫制御用組成物。
免疫制御が、Ｔ細胞であるＴｈ１、Ｔｈ９、Ｔｈ１７から選択されるいずれか１以上の細胞の分化及び／又は活性を抑制するものである請求項１又は２に記載の免疫制御用組成物。