KR101742933B1 - 신규한 리소인지질 아실기 전이효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규의 리소인지질 아실기 전이효소를 제공한다. 본 발명의 상기 과제는, 본 발명의 서열번호 1 및 6의 염기 서열과 서열번호 2 및 7의 아미노산 서열에 의해 해결한다.

Description

신규한 리소인지질 아실기 전이효소{NOVEL LYSOPHOSPHOLIPID ACYLTRANSFERASE}
본 발명은 신규의 리소인지질 아실기 전이효소에 관한 것이다.
고도 불포화 지방산의 생합성
지방산은 인지질이나 트리아실글리세롤 등의 지질을 구성하는 중요한 성분이다. 불포화 결합을 2곳 이상 함유하는 지방산은 고도 불포화 지방산(PUFA)이라 총칭하고, 아라키돈산이나 디호모-γ-리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등이 알려져 있으며, 여러 가지 생리 활성이 보고되어 있다(비특허문헌 1).
이 고도 불포화 지방산은 여러 가지 분야에서의 이용이 기대되고 있는데, 동물 체내에서 합성할 수 없는 것도 포함되어 있다. 그래서, 여러 가지 미생물을 배양하여 고도 불포화 지방산을 획득하는 방법이 개발되어 왔다. 또한, 식물로 고도 불포화 지방산을 생산시키는 시도도 이루어지고 있다. 이러한 경우, 고도 불포화 지방산은, 예컨대 트리아실글리세롤 등의 저장 지질의 구성 성분으로서, 미생물의 균체 내 혹은 식물 종자 속에 축적되는 것이 알려져 있다.
고도 불포화 지방산의 일종인 아라키돈산은, 프로스타글란딘이나 류코트리엔 등에의 중간 대사물로서 주목받아, 기능성 식품이나 의약품의 소재에 적용하는 시도가 수많이 이루어지고 있다. 또한, 아라키돈산은, 모유 중에 포함되어 있어 유아의 발육, 특히 태아의 신장이나 뇌의 발육에 있어서 중요하며, 유아의 발육에 필요한 성분으로서, DHA(도코사헥사엔산)와 함께 영양학적 견지로부터도 주목을 받고 있다.
아라키돈산은 도 1에 도시한 경로로 생합성된다. 구체적으로는, 신규 지방산 합성에 의해 생성된 팔미틴산으로부터, 수회의 쇄장 연장 반응과 불포화화 반응에 의해 아라키돈산이 생성된다. 이 경로 중에서, 쇄장 연장 효소 및 Δ9 불포화화 효소는 아실-CoA에 작용한다. 또한, Δ12 불포화화 효소, Δ6 불포화화 효소, Δ5 불포화화 효소는 포스파티딜콜린 등의 인지질의 아실기에 작용하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2). 따라서, 아라키돈산 등의 PUFA 생합성에 있어서는, 아실기가 아실-CoA와 인지질과의 사이에서 전이될 필요가 있다. PUFA의 생합성에 한하지 않고, 인지질이 생합성된 후, 지방산만이 치환되는 것을 인지질의 「리모델링」이라고 하고, 이 반응에 리소인지질 아실기 전이효소(이하 「LPLAT」라고 기재함)가 관여하고 있음이 알려져 있다(비특허문헌 3).
트리아실글리세롤의 생합성
저장 지질인 트리아실글리세롤은 생체 내에서 다음과 같이 생성된다. 즉, 글리세롤-3-인산이 글리세롤-3-인산 아실기 전이효소(이하 「GPAT」라고 기재하는 경우도 있음)에 의해 1위(α위)의 히드록실기가 아실화되어 리소포스파티딘산(이하 「LPA」라고 기재하는 경우도 있음)으로 된다. LPA는 아실기가 하나밖에 없는 리소인지질이며, 이것이 리소포스파티딘산 아실기 전이효소(이하 「LPAAT」라고 기재하는 경우도 있음)에 의해 아실화되어 포스파티딘산(이하 「PA」라고 기재하는 경우도 있음)으로 된다. 이 PA가 포스파티딘산포스파타아제에 의해 탈인산화되어 디아실글리세롤로 되고, 이 디아실글리세롤이 디아실글리세롤 아실기 전이효소(이하 「DGAT」라고 기재하는 경우도 있음)에 의해 아실화되어 트리아실글리세롤이 된다. 또한, 아실-CoA : 콜레스테롤 아실기 전이효소(이하 「ACAT」라고 기재하는 경우도 있음)나 리소포스파티딜콜린 아실기 전이효소(이하 「LPCAT」라고 기재하는 경우도 있음) 등이 간접적으로 트리아실글리세롤의 생합성에 관여하는 것이 알려져 있다.
인지질의 생합성
상기한 바와 같이 하여 LPA에서부터 LPAAT의 작용에 의해 생성된 PA는, 여러 가지 인지질 생합성의 전구체가 된다. 예컨대, PA로부터, 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜글리세롤(PG) 등, 중요한 인지질이 생합성된다. PA는 이와 같이 지질 생합성의 중간체일 뿐만 아니라, 세포 증식, 혈소판 응집 효과, 평활근 수축 효과, 암의 침윤 촉진 효과 등 매우 다방면에 걸친 생물학적, 약리적 작용을 갖는 지질성의 세포내 및 세포간 매개인자이기도 하다.
리소인지질 아실기 전이효소
상기한 바와 같이, LPLAT는 PUFA 생합성에 관여한다고 생각된다. 이 LPLAT란, 리소인지질에 아실기를 도입하는 활성을 갖는 효소의 총칭이며, 기질에 대한 특이성의 차이에 의해, 즉, 기질이 되는 리소인지질의 분자종의 차이에 따라, 여러 가지 칭호의 LPLAT가 존재한다. 그 하나가, LPA를 기질로 하여, 트리아실글리세롤이나 인지질의 합성에 관여하는 LPAAT이다. LPLAT가 작용하는 리소인지질에는, 그 밖에, 리소포스파티딜콜린(LPC), 리소포스파티딜세린(LPS), 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 리소포스파티딜이노시톨(LPI) 등이 포함된다. 따라서, 각 효소가 작용하는 인지질의 분자종의 차이로부터, LPAAT, LPCAT, 리소포스파티딜세린 아실기 전이효소(LPSAT), 리소포스파티딜이노시톨 아실기 전이효소(LPIAT) 등이라 불린다. 각 효소는, 1종의 리소인지질에 특이적으로 작용하는 경우도 있지만, 복수종의 특이적인 리소인지질에 작용하는 경우도 있다. 예컨대, LPAAT라고 불리는 LPLAT 중에도, LPA만이 아니라 LPC, LPE 등에도 작용하는 것이 포함된다.
서열상의 특징에 의한 리소인지질 아실기 전이효소의 분류
LPLAT는, 글리세로인지질 아실기 전이효소로 분류된다. 이 글리세로인지질 아실기 전이효소는, 아미노산 서열의 비교로부터, LPAAT 패밀리, MBOAT(막결합 O-아실기 전이효소) 패밀리 및 DGAT2 패밀리의 3가지의 그룹으로 분류된다고 생각되고 있다(비특허문헌 5). LPAAT 패밀리에 속하는 효소는, 공통적으로 막 결합 영역을 지니고, 서열상, 보존된 모티브(LPAAT 모티브)가 있는 것을 특징으로 한다. LPAAT 패밀리에 속하는 것에는, LPAAT이나 GPAT 등이 포함된다. MBOAT 패밀리에 포함되는 효소는 공통적으로 막 결합 영역을 갖는 것을 특징으로 한다. MBOAT 패밀리에는, LPLAT 이외에, DGAT나 ACAT 등이 포함되는 것이 알려져 있다. 동물 등에서는, MBOAT 패밀리에 속하는 몇 개의 효소가 막 인지질 생합성에 매우 중요한 리모델링 반응을 담당하는 효소라고 생각되고 있다.
LPLAT는, 세균, 효모 등의 단세포 생물에서부터 포유동물 등의 고등 생물에게 이르기까지 폭넓은 생물에서 보고되어 있다. 균류의 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서는, 막결합형의 LPLAT 유전자로서는, SLC1(YDL052C)과 SLC4(YOR175C)(「ALE1」 또는 「LPT1」이라고 하는 경우도 있음)가 알려져 있다(비특허문헌 5). 동물에서는, LPLAT 호몰로그가 복수 존재하고, de novo의 트리글리세리드 합성계에서 LPA에 작용하여 PA를 생성하는 반응을 담당함으로써, 인지질의 리모델링에 작용하는 것이 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 6).
지질 생산균인 Mortierella alpina(이하, 「M. alpina」라고 기재하는 경우도 있음)에서는, 4종류의 LPLAT를 얻고 있는데, 이들은 모두 LPAAT 패밀리에 속하는 것이다(특허문헌 1∼3). 그러나, M. alpina로부터 MBOAT 패밀리에 속하는 LPLAT를 얻을 수 있었다고 하는 보고는 없다.
특허문헌 1 : 국제 공보 WO2004/087902호 특허문헌 2 : 미국 특허 출원 공개 공보 US2006/0094090호 특허문헌 3 : 국제 공보 WO2008/146745호
비특허문헌 1 : Lipids, 39, 1147(2004) 비특허문헌 2 : J.B.C., 278(37), 35115-35126, (2003) 비특허문헌 3 : J.B.C., 276(29), 26745-26752, (2001) 비특허문헌 4 : Proc. Nath, Aca, Sci., 105(8), 2830-2835, (2008) 비특허문헌 5 : J.B.C., 282(42), 30845-30855, (2007) 비특허문헌 6 : J.B.C., 284(1), 1-5, (2009) 비특허문헌 7 : Trends Biochem. Sci. 25, 111-112, (2000) 비특허문헌 8 : Journal of lipid reserach 2009 R80035 JLR200v1
상기한 바와 같이, 아라키돈산 등의 PUFA 생합성에 있어서는, 인지질의 리모델링이 필수이며, 이 반응에는 LPLAT가 관여한다고 생각된다. 그러나, 지금까지 알려져 있었던 LPAAT 호몰로그에서는, 숙주에 도입하여 발현시키더라도, 총 지방산 중의 PUFA의 비율을 충분히 높일 수 없다고 하는 과제가 있었다. 그래서, 숙주에 도입하여 발현시킨 경우에 숙주의 총 지방산 중의 PUFA의 비율을 충분히 높일 수 있는 신규의 핵산 및 단백질을 동정할 것이 요구되고 있다. 또한, 이용가치가 높은 지방산의 함유량이 높은 유지를 생산할 수 있는 핵산 및 단백질을 동정하여, 이들을 이용하여, 유용 지방산의 생산을 가능하게 하거나, 혹은 유용 지방산의 함유량을 높이는 방법을 개발할 것이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은, 숙주 세포에서 발현시킴으로써, 숙주의 지질 대사에 영향을 주거나, 목적으로 하는 지방산의 함유량을 증가시키거나 하여, 유용한 유지 생산을 가능하게 하는 단백질 및 핵산을 제공하는 것이다.
아라키돈산 등 PUFA 생합성에 있어서는 인지질의 리모델링이 필수이다. 지질 생산균 M. alpina는, 아라키돈산 등 유용한 PUFA를 대량으로 축적할 수 있지만, 동물 등에서 보고되어 있는 것과 같은, 지질의 리모델링에 관여하는 MBOAT 패밀리에 속하는 아실기 전이효소는 M. alpina에서는 얻지 못하고 있다. 본 발명자는, 이 점에 주목하여, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 한 결과, M. alpina로부터, MBOAT 패밀리에 속하는 효소를 코드하는 cDNA를 획득하고, 또한, 얻어진 cDNA를 효모 등의 고증식능을 갖는 숙주 세포에 도입하여 지방산 조성물의 산생을 시도한 바, M. alpina로부터 얻어지고 있는 기지의 LPAAT를 코드하는 핵산을 함유하는 벡터를 도입한 숙주가 산생하는 지방산 조성물과 비교하여, 다른 지방산 조성물, 특히 아라키돈산 비율이 높은 지방산 조성물을 생성할 수 있음을 알아냈다. 따라서, 본 발명자들은, 기지의 LPAAT와는 다른 신규의 LPLAT에 관한 유전자의 클로닝에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음과 같다.
(1) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 것에 기재한 핵산.
(a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트(stringent)한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 80% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(e) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(2) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 것인 (1)에 기재한 핵산.
(a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼50개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(e) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(3) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 것에 기재한 핵산.
(a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 80% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(e) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(4) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 것인 (3)에 기재한 핵산.
(a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼50개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(e) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 상기 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(5) 코드하는 단백질이 막결합성 O-아실 트랜스페라제 패밀리에 속하는 것인 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재한 핵산.
(6) 이하의 (a)∼(d) 중 어느 것에 기재한 핵산.
(a) 서열번호 1 또는 6으로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(c) 서열번호 4 또는 9로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 5 또는 10으로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(7) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재한 단백질.
(a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질
(8) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 (7)에 기재한 단백질.
(a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1∼50개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 리소인지질 아실기 전이효소 활성을 갖는 단백질
(9) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재한 단백질.
(a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질
(10) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것인 (9)에 기재한 단백질.
(a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1∼50개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 상기 아미노산 서열을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 갖는 단백질
(11) 막결합성 O-아실 트랜스페라제 패밀리에 속하는 것인 (7)∼(10) 중 어느 하나에 기재한 단백질.
(12) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
(13) (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재한 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
(14) (13)에 기재한 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체.
(15) (14)에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물로서, 그 지방산 조성물 중의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율이, 비형질전환체인 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물의 아라키돈산 비율보다도 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물.
(16) (14)에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, (15)에 기재한 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물의 제조방법.
(17) (15)에 기재한 지방산 조성물을 포함하는 식품.
(18) (13)에 기재한 재조합 벡터를 이용하여, 그 벡터가 도입된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 그 벡터를 도입하고 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높게 하는 방법.
(19) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 것에 기재한 핵산.
(a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 80% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(e) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(20) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재한 단백질.
(a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 단백질
본 발명의 LPLAT는, 아라키돈산 등의 유용한 지방산이나 저장 지질의 생산능 향상을 도모할 수 있기 때문에, 미생물이나 식물 중에서의 고도 불포화 지방산의 생산성을 향상시키는 것으로서 바람직하다. 이에 따라, 원하는 특성이나 효과를 갖는 지질을 제공할 수 있기 때문에, 식품, 화장료, 의약품, 비누 등에 적용할 수 있는 것으로서 유용하다.
도 1은 아라키돈산의 생합성 경로를 도시하는 모식도이다. 한편, 도 1 중, PL은 인지질, CoA는 코엔자임A, DS는 디새튜라제(지방산 불포화화 효소), GLELO는 지방산 쇄장 연장 효소, 18:0-는 스테아로일기, 18:1-는 올레오일기, 18:2-는 리노일기, 18:3(n-6)-는 γ-리놀레일기, DGLA-는 디호모-γ-리놀레일기, ARA-는 아라키도일기를 각각 나타낸다.
도 2는 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT5의 cDNA 전장 서열(서열번호 4) 및 그것으로부터 유도되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 도시한 도면이다.
도 3은 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT6의 cDNA 전장 서열(서열번호 9) 및 그것으로부터 유도되는 아미노산 서열(서열번호 7)을 도시한 도면이다.
도 4A는 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT5의 게놈 서열(서열번호 5)과 ORF의 서열(서열번호 1)을 서열 비교한 도면이다.
도 4B는 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT5의 게놈 서열(서열번호 5)과 ORF의 서열(서열번호 1)을 서열 비교한 도면이다.
도 4C는 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT5의 게놈 서열(서열번호 5)과 ORF의 서열(서열번호 1)을 서열 비교한 도면이다.
도 5A는 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT6의 게놈 서열(서열번호 10)과 ORF의 서열(서열번호 6)을 서열 비교한 도면이다.
도 5B는 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT6의 게놈 서열(서열번호 10)과 ORF의 서열(서열번호 6)을 서열 비교한 도면이다.
도 5C는 M. alpina 1S-4주 유래의 LPLAT6의 게놈 서열(서열번호 10)과 ORF의 서열(서열번호 6)을 서열 비교한 도면이다.
도 6은 M. alpina에 있어서 LPLAT6 또는Δ5 지방산 불포화화 효소의 발현을 억제한 경우의, 균체 내 고도 불포화 지방산 조성비를 나타내는 그래프이다. 도 6 중, GLA는 γ-리놀렌산, DGLA는 디호모-γ-리놀렌산, ARA는 아라키돈산을 각각 나타낸다.
도 7은 M. alpina에 있어서 LPLAT6 또는 Δ5 지방산 불포화화 효소의 발현을 억제한 경우의, 트리아실글리세롤 분획의 고도 불포화 지방산 조성비를 나타내는 그래프이다. 도 7 중, GLA는 γ-리놀렌산, DGLA는 디호모-γ-리놀렌산, ARA는 아라키돈산을 각각 나타낸다.
도 8은 M. alpina에 있어서 LPLAT6 또는 Δ5 지방산 불포화화 효소의 발현을 억제한 경우의, 인지질 분획의 고도 불포화 지방산 조성비를 나타내는 그래프이다. 도 8 중, GLA는 γ-리놀렌산, DGLA는 디호모-γ-리놀렌산, ARA는 아라키돈산을 각각 나타낸다.
본 발명은, 아라키돈산의 생합성 과정에 있어서, 아실기를 아실-CoA와 인지질과의 사이에서 전이시키는 것을 특징으로 하는, Mortierella속 유래의 신규의 리소인지질 아실기 전이효소(「LPLAT」)에 관한 것이다. 본 발명의 단백질은 리소인지질에 작용할 수 있다. 아실기 공여체는, 통상 아실-CoA이지만, 이것에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 양태를 구체적으로 설명한다.
본 발명의 리소인지질 아실기 전이효소를 코드하는 핵산
본 발명의 핵산에 의해서 코드되는 리소인지질 아실기 전이효소(LPLAT)는, 그 전형적인 예로서, LPLAT5 및 6을 포함한다. LPLAT5 및 6은 이하의 실시예에서 설명하는 것과 같이, 공지된 M. alpina 유래의 LPAAT를 발현시킨 숙주가 산생하는 지방산 조성물과는 달리, 아라키돈산의 비율이 높은 것을 특징으로 하는 조성의 지방산 조성물을 숙주 속에 산생시킬 수 있었다. 따라서, 본 발명의 LPLAT는, 바람직하게는 공지된 M. alpina 유래의 LPAAT에 비하여 아라키돈산 산생 효율이 매우 높다.
본 발명의 LPLAT5 및 LPLAT6을 코드하는 핵산의 cDNA, CDS, ORF 및 아미노산 서열의 대응 관계를 이하의 표 1에 정리하여 기재했다.
Figure 112016127872020-pat00001
즉, 본 발명의 LPLAT5에 관련되는 서열로서는, LPLAT5의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열번호 1, LPLAT5의 아미노산 서열인 서열번호 2, LPLAT5의 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열번호 3, 그 cDNA의 염기 서열인 서열번호 4 및 그 게놈 서열인 서열번호 5를 들 수 있다. 이 중, LPLAT5의 cDNA 서열인 서열번호 4의 제161-1693번째의 염기 서열이 CDS(서열번호 3)에 상당하고, 제161-1690번째의 염기 서열이 ORF(서열번호 1)에 상당한다. 도 2에 LPLAT5의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 기재한다. LPLAT5의 게놈 서열(서열번호 5)은 인트론을 2개 포함하고 있고, 엑손 영역은 서열번호 5의 제1-314번째, 제461-587번째, 제668-1759번째의 염기 서열의 영역이다.
마찬가지로, 본 발명의 LPLAT6에 관련되는 서열로서는, LPLAT6의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열번호 6, LPLAT6의 아미노산 서열인 서열번호 7, LPLAT6의 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열번호 8, 그 cDNA의 염기 서열인 서열번호 9 및 그 게놈 서열인 서열번호 10을 들 수 있다. 이 중, LPLAT6의 cDNA 서열인 서열번호 9의 제38-1759번째의 염기 서열은 CDS(서열번호 8)에 상당하고, 제38-1756번째의 염기 서열이 ORF(서열번호 6)에 상당한다. 도 3에 LPLAT6의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 기재한다. LPLAT6의 게놈 서열(서열번호 10)은 인트론을 하나 포함하고 있고, 엑손은 서열번호 10의 제1-1095번째 및 제1318-1944번째의 염기 서열의 영역이다.
본 발명의 핵산이란, 단일쇄 및 이중쇄의 DNA 외에, 그 RNA 상보체도 포함하며, 천연 유래의 것이라도, 인공적으로 제작한 것이라도 좋다. DNA에는, 예컨대 게놈 DNA나, 상기 게놈 DNA에 대응하는 cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA 및 이들의 조합이나, DNA와 RNA의 하이브리드를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 핵산의 바람직한 양태로서는, (a) 서열번호 1 혹은 6으로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 핵산, (b) 서열번호 2 혹은 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, (c) 서열번호 4 혹은 9로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 핵산 또는 (d) 서열번호 5 혹은 10으로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 핵산 등을 들 수 있다.
상기 염기 서열을 얻기 위해서는, LPLAT 활성을 갖는 생물의 EST나 게놈 DNA의 염기 서열 데이터로부터, 기지의 LPLAT 활성을 갖는 단백질과 동일성이 높은 단백질을 코드하는 염기 서열을 탐색할 수도 있다. LPLAT 활성을 갖는 생물로서는, 지질 생산균이 바람직하고, 지질 생산균으로서는 M. alpina을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
EST 해석을 하는 경우에는, 우선, cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리의 제작 방법에 관해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001))를 참조할 수 있다. 또한, 시판되는 cDNA 라이브러리 제작 키트를 이용하더라도 좋다. 본 발명에 적합한 cDNA 라이브러리의 제작 방법으로서는, 예컨대 다음과 같은 방법을 들 수 있다. 즉, 지질 생산균인 M. alpina의 적당한 주를 적당한 배지에 식균하여, 적당한 기간 전배양한다. 본배양 중에 적시에 배양물을 채취하여, 그로부터 균체를 회수하여, 전 RNA를 조제한다. 전 RNA의 조제에는, 염산구아니딘/CsCl법 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 전 RNA로부터 시판 키트를 이용하여 poly(A)+RNA를 정제할 수 있다. 또한, 시판 키트를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 그 후, 제작한 cDNA 라이브러리의 임의 클론의 염기 서열을, 벡터 상에 인서트 부분의 염기 서열을 결정할 수 있도록 설계된 프라이머를 이용하여 결정하여, EST를 얻을 수 있다. 예컨대, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)로 cDNA 라이브러리를 제작한 경우는, 디렉셔널(directional) 클로닝을 행할 수 있다.
서열번호 1 및 6에 관해서, GenBank에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTX를 이용하여 상동성 해석을 하면, 서열번호 1로부터 추정되는 아미노산 서열은 진균류 유래의 LPLAT 호몰로그와 상동성을 보이고, 서열번호 6으로부터 추정되는 아미노산 서열은 동물 유래의 LPLAT 호몰로그와 상동성을 보인다. 각 서열의 ORF와, 가장 동일성이 높았던 서열에 관련한 염기 서열의 동일성 및 아미노산 서열의 동일성을 clustalW로 구하면, 서열번호 1에 대하여 가장 E-value가 낮은, 즉 동일성이 가장 높던 것은 Schizosaccharomyces pombe 유래의 리소인지질 아실기 전이효소 호몰로그(GI : 161085648)로, ORF의 염기 서열의 동일성이 43.2%, 아미노산 서열의 동일성이 33.3%이다. 마찬가지로, 서열번호 6에 대하여 동일성이 가장 높던 것은 Xenopus laevis 유래의 추정 단백질(GI : 56788919)로, ORF의 염기 서열의 동일성이 41.2%, 아미노산 서열의 동일성이 28.6%이다.
LPLAT5와 LPLAT6 사이의 동일성은, ORF의 염기 서열에서 40.0%, 아미노산 서열에서 19.1%이다.
본 발명은 또한, 상기 서열번호 1 및 6으로 나타내어지는 염기 서열(「본 발명의 염기 서열」이라고 기재하는 경우도 있음) 및 서열번호 2 및 7로 나타내어지는 아미노산 서열(「본 발명의 아미노산 서열」이라고 기재하는 경우도 있음)로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산을 포함한다. 「동등한 기능」을 갖는다란, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질 및 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이, 「리소인지질 아실기 전이효소 활성(LPLAT 활성)」, 「본 발명의 단백질을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성(이하, 「아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성」이라고 하는 경우도 있음)」 및/또는 「18:1-CoA에서 18:1-PL로의 변환, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 변환에 관여하는 활성(이하, 아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성」이라고 하는 경우도 있음)」을 갖는 것을 말한다. 바람직하게는 LPLAT5 및/또는 6과 같은 활성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 「리소인지질 아실기 전이효소(LPLAT) 활성」이란, 아실기를 아실-CoA와 리소인지질의 사이에서 전이시키는 활성을 말한다. 「리소인지질」이란, 인지질로부터 아실기가 하나 취해진 지질을 말한다. 본 명세서에 있어서, 리소인지질은 특별히 한정되지 않고, 리소포스파티딘산(LPA), 리소포스파티딜콜린(LPC), 리소포스파티딜세린(LPS), 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 리소포스파티딜이노시톨(LPI) 등이 포함된다.
본 발명의 LPLAT는, 1종의 리소인지질에 특이적으로 작용하는 것이라도, 복수 종의 특이적인 리소인지질에 작용하는 것이라도 좋다.
본 발명의 LPLAT 활성은 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있는데, 예컨대, J.B.C.,282(47), 34288-34298(2007)에 기재된 방법을 들 수 있다.
본 발명의 「아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성」은, 상기한 대로, 본 발명의 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성을 말하며, 구체적으로는, 본 발명의 염기 서열을 포함하는 핵산 또는 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높일 수 있는 활성과 같은 활성을 말한다. 이 활성의 측정은 공지된 방법을 이용할 수 있는데, 예컨대, 상기 본 발명의 염기 서열 등을 발현 벡터 pYE22m에 삽입한 것을, Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄장 연장 효소 유전자, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자를 도입하여 발현시킴으로써 아라키돈산을 생산할 수 있도록 육종한 효모 Saccharomyces cerevisiae를 숙주로 하여 형질전환시키고, 얻어진 형질전환체를 배양하여 회수한 균체를, 이하의 실시예에 기재한 방법으로 지방산 해석을 하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 「아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성」은, 18:1-CoA에서 18:1-PL로의 변환, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 활성을 말한다. 바람직하게는, 이 활성은 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및/또는 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하는 활성을 말한다. 여기서, 18:1-는 올레오일기를, 18:3(n-6)-는 γ-리놀레일기를, DGLA-는 디호모-γ-리놀레일기를, PL은 인지질을, CoA는 코엔자임A를 각각 나타낸다. 따라서, 예컨대 DGLA-CoA는 디호모-γ-리놀레일기를 포함하는 아실-CoA를 의미하고, DGLA-PL은 디호모-γ-리놀레일기를 포함하는 인지질을 의미한다. 아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성의 확인은, 각각의 출발 기질에서 생성 기질로의 변환을 확인함으로써 행할 수 있다. 혹은, 본 발명의 단백질을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 숙주 혹은 세포에 있어서, 본 발명의 단백질을 과잉 발현하거나 또는 아라키돈산을 생산능을 갖는 세포에 있어서 그 단백질의 발현을 억제함으로써 확인할 수 있다. 예컨대, 이하의 실시예에 기재한 방법으로, 본 발명의 단백질을 과잉 발현시킨 숙주 혹은 세포의, 또는 본 발명의 단백질의 발현을 억제한 숙주 혹은 세포의 지방산 조성 해석을 하여, 그 지방산 조성의 변화로부터, 상기한 각각의 출발 기질에서 생성 기질로의 변환을 확인하는 방법 등을 들 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 염기 서열 등은, LPLAT 활성, 상기 아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성 및/또는 상기 아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다.
더욱 특히 바람직하게는, 본 발명의 핵산에 의해서 코드되는 리소인지질 아실기 전이효소(LPLAT)는, LPLAT 중, 막결합성 O-아실 트랜스페라제(MBOAT) 패밀리에 속하는 효소를 말한다.
「MBOAT 패밀리」란, PFAM의 액세션 번호 PF03062의 단백질에 속하는 패밀리로, 글리세로인지질 아실기 전이효소 중 아미노산 서열 중에 막 관통 영역을 갖는 효소군을 말한다. PFAM(http://pfam.sanger.ac.uk/)란, 단백질 패밀리의 얼라이먼트로부터 얻어지는 프로파일의 데이터베이스이며, Sanger Institute에 의해 제공되고 있다. 각 프로파일은 유사한 서열로 이루어지고, 히든 마르코프 모델에 의해 해석된다. 대상이 되는 단백질명 외에, 키워드, 그 단백질을 코드하는 핵산 서열, 그 단백질의 아미노산 서열, 액세션 번호 등의 정보를 이용하여, 원하는 단백질이 어떤 단백질 패밀리에 속하는지를 검색할 수 있다. 본 발명에서 얻어진 LPLAT를 코드하는 핵산 서열 또는 LPLAT의 아미노산 서열을 이용한 검색에 따르면, 상기 단백질은 액세션 번호 PF03062의 MBOAT 패밀리에 속하는 것이 분명하다. 또한, MBOAT 패밀리에 속하는 효소에는, 공통적으로, 보존된 히스티딘 잔기가 활성 중심으로서 존재하고 있고, 예컨대, LPLAT5에서는 아미노산 서열 중의 제317번째의 히스티딘 잔기, LPLAT6에서는 아미노산 서열 중의 제456번째의 히스티딘 잔기가 그 활성 중심에 상당한다.
또한, MBOAT 패밀리는 LPAAT 패밀리와 달리, LPAAT 모티브를 포함하지 않는다. LPAAT 모티브란, 특허문헌 3에 기재된 LPAAT 단백질의 아미노산 서열 중에 4곳 존재하는 보존 모티브의 「HXXXXD(HX4D)」를 말한다. 예컨대, 특허문헌 3에 기재된 지질 생산균인 M. alpina 유래의 LPAAT3에서는, 특허문헌 3 중의 서열번호 2의 아미노산 잔기 115-120, LPAAT4에서는, 서열번호 4의 아미노산 잔기 115-120가 LPAAT 모티브에 상당한다. 그러나, 본 발명의 LPLAT 단백질은 이러한 모티브를 갖지 않는다.
M. alpina에서는, 지금까지의 LPLAT는 4종류 발견되어 있는데(특허문헌 1∼3), MBOAT 패밀리에 속하는 LPLAT 효소는 아직 발견되지 않았다. 그래서, 본 발명의 LPLAT는, 특히 바람직하게는, MBOAT 패밀리에 속하는 LPLAT로서, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다.
상기와 같은, 본 발명의 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산으로서는, 이하의 (a)∼(e) 중 어느 것에 기재한 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다. 한편, 이하에 드는 염기 서열의 기재에 있어서, 「본 발명의 상기 활성」이란, 상기한 「LPLAT 활성, 아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성 및/또는 아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성」을 의미한다.
(a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
본 발명의 핵산은, 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 「본 발명의 상기 활성」에 대해서는 상기한 대로이다.
구체적으로는, 서열번호 2 또는 7에 나타내는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수 개(바람직하게는 1개 또는 여러 개(예컨대, 1∼400개, 1∼200개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개))의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이며, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다. 여기서, 아미노산 서열이 결실, 치환 및/또는 부가되었다란, 동일 서열 중의 임의이며 또한 하나 혹은 복수의 아미노산 서열 중의 위치에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환 및/또는 부가가 있음을 의미한다. 이 결실, 치환 및/또는 부가는, 이들 중 2종 이상이 동시에 생기더라도 좋지만, 상기 결실, 치환 및/또는 부가의 수는 일반적으로 작을수록 바람직하다.
상기에서, 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 특정한 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것인데, 원래 서열의 구조에 관한 특징을 실질적으로 변화시키지 않으면 어떠한 치환이라도 좋고, 예컨대, 치환 아미노산이, 원래의 서열에 존재하는 나선을 파괴하거나, 원래의 서열을 특징짓는 다른 종류의 이차 구조를 파괴하거나 하지 않으면 어떠한 치환이라도 좋다.
보존적 치환은, 일반적으로는, 생물학적 계 합성이나 화학적 펩티드 합성으로 도입되지만, 바람직하게는, 화학적 펩티드 합성에 의한다. 이 경우, 치환기에는, 비천연 아미노산 잔기가 포함되어 있더라도 좋고, 펩티드 모방체나, 아미노산 서열 중, 치환되어 있지 않은 영역이 역전하고 있는 역전형 또는 동일 영역이 반전하고 있는 반전형도 포함된다.
이하에, 아미노산 잔기를 치환할 수 있는 잔기별로 분류하여 예시하지만, 치환 가능한 아미노산 잔기는 이하에 기재되어 있는 것에 한정되는 것은 아니다.
A군 : 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌 및 시클로헥실알라닌
B군 : 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산 및 2-아미노수베린산
C군 : 아스파라긴 및 글루타민
D군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산 및 2,3-디아미노프로피온산
E군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린 및 4-히드록시프롤린
F군 : 세린, 트레오닌 및 호모세린
G군 : 페닐알라닌 및 티로신
비보존적 치환의 경우는, 상기 종류 중, 어떤 하나의 멤버와 다른 종류의 멤버를 교환할 수 있는데, 이 경우는, 본 발명 단백질의 생물학적 기능을 유지하기 위해서, 아미노산의 히드로파시(hydropathy) 지수(히드로파시아미노산 지수)를 고려하는 것이 바람직하다(Kyte 등, J. Mol. Biol., 157:105-131(1982)).
또한, 비보존적 치환의 경우는, 친수성에 기초하여 아미노산의 치환을 할 수 있다.
본 명세서 및 도면에 있어서, 염기나 아미노산 및 그 약어는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 따르거나 또는 예컨대 Immunology--A Synthesis(제2판, E.S. Golub 및 D.R. Gren 감수, Sinauer Associates, 매사추세츠주 선더랜드(1991)) 등에 기재되어 있는 것과 같은, 당업계에서 관용되고 있는 약어에 기초한다. 또한 아미노산에 대해서 광학 이성체가 있을 수 있는 경우는, 특별히 명시하지 않으면 L체를 나타낸다.
D-아미노산 등의 상기한 아미노산의 입체 이성체, α,α-이치환 아미노산 등의 비천연 아미노산, N-알킬아미노산, 젖산 및 그 밖의 비관용적인 아미노산도 또한 본 발명의 단백질을 구성하는 요소가 될 수 있다.
한편, 본 명세서에서 이용하는 단백질의 표기법은, 표준적용법 및 당업계에서 관용되고 있는 표기법에 기초하여, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 그리고 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다. 마찬가지로, 일반적으로는, 특별히 언급하지 않는 한, 단일쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌단은 5'단이며, 이중쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 한다.
당업자라면, 당업계에서 공지된 기술을 이용하여, 본 명세서에 기재한 단백질의 적당한 변이체를 설계하여, 제작할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 그다지 중요하지 않다고 생각되는 영역을 타겟팅함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 손상시키는 일없이 그 구조를 변화시킬 수 있는 단백질 분자 중의 적절한 영역을 동정할 수 있다. 또한, 유사한 단백질 사이에서 보존되어 있는 분자의 잔기 및 영역을 동정할 수도 있다. 더욱이, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하다고 생각되는 영역 중에, 생물학적 활성을 손상시키지 않고, 또한, 단백질의 폴리펩티드 구조에 악영향을 주지 않고서, 보존적 아미노산 치환을 도입할 수도 있다.
당업자라면, 본 발명 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하고, 동 단백질의 펩티드와 유사한 펩티드의 잔기를 동정하여, 이 2개의 펩티드의 아미노산 잔기를 비교하여, 본 발명의 단백질과 유사한 단백질의 어느 잔기가, 생물학적 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기인지를 예측하는, 소위 구조-기능 연구를 할 수 있다. 또한, 이와 같이 예측한 아미노산 잔기의 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택함으로써, 본 발명 단백질의 생물학적 활성이 유지되어 있는 변이체를 선택할 수도 있다. 또한, 당업자라면, 본 단백질의 변이체의 삼차원 구조 및 아미노산 서열을 해석할 수도 있다. 더욱이, 얻어진 해석 결과로부터, 단백질의 삼차원 구조에 관한, 아미노산 잔기의 얼라인먼트를 예측할 수도 있다. 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기는, 다른 분자와의 중요한 상호 작용에 관여할 가능성이 있는데, 당업자라면, 상기한 것과 같은 해석 결과에 기초하여, 이러한 단백질 표면 상에 있다고 예측되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않는 변이체를 제작할 수 있다. 또한, 당업자라면, 본 발명의 단백질을 구성하는 각각의 아미노산 잔기 중, 하나의 아미노산 잔기만을 치환하는 변이체를 제작할 수도 있다. 이러한 변이체를 공지된 분석 방법에 의해 스크리닝하여, 개개의 변이체의 정보를 수집할 수 있다. 이에 따라, 어떤 특정한 아미노산 잔기가 치환된 변이체의 생물학적 활성이, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 비하여 저하하는 경우, 그와 같은 생물학적 활성을 띠지 않는 경우, 또는 본 단백질의 생물학적 활성을 저해하는 부적절한 활성이 생기는 경우를 비교함으로써, 본 발명의 단백질을 구성하는 개개의 아미노산 잔기의 유용성을 평가할 수 있다. 또한, 당업자라면, 이러한 일상적인 실험에서 수집한 정보에 기초하여, 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합하여, 본 발명 단백질의 변이체로서는 바람직하지 않은 아미노산 치환을 용이하게 해석할 수 있다.
상기한 것과 같이, 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001)), 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997), Kunkel(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kunkel(1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6 등에 기재된 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법에 따라서 조제할 수 있다. 이러한 아미노산의 결실, 치환 혹은 부가 등의 변이가 이루어진 변이체의 제작은, 예컨대, Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지된 수법에 의해, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예컨대 QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사 제조), GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(INVITROGEN), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 타카라바이오) 등을 이용하여 행할 수 있다.
한편, 단백질의 아미노산 서열에, 그 활성을 유지하면서 1 또는 복수 개의 아미노산의 결실, 치환, 혹은 부가를 도입하는 방법으로서는, 상기한 부위 특이적 변이 유발 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법 및 유전자를 선택적으로 개열(開裂)하여 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환 혹은 부가한 후에 연결하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 핵산은, 바람직하게는, 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼50개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산이다. 본 발명의 단백질에 있어서의 아미노산의 변이 또는 수식의 수, 혹은 변이 또는 수식의 부위는, 본 발명의 상기 활성이 유지되는 한 제한은 없다. 본 발명의 상기 활성의 측정 방법은 상기한 대로이다.
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
본 발명의 핵산은, 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 「본 발명의 상기 활성」에 대해서는 상기한 대로이다.
상기 염기 서열은, 당업자에게 공지된 방법으로 적당한 단편을 이용하여 프로브를 제작하고, 이 프로브를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션, 서던 블롯 등의 공지된 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리 등으로부터 얻을 수 있다.
하이브리다이제이션법의 상세한 순서에 대해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001); 특히 Section 6-7), 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997); 특히 Section 6.3-6.4), 『DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995); 하이브리다이제이션 조건에 관해서는 특히 Section 2.10) 등을 참조할 수 있다.
하이브리다이제이션 조건의 강도는, 주로 하이브리다이제이션 조건, 보다 바람직하게는, 하이브리다이제이션 조건 및 세정 조건에 의해서 결정된다. 본 명세서에 있어서의 「스트린전트한 조건」에는, 중간 정도 또는 고도로 스트린전트한 조건이 포함된다.
구체적으로는, 중간 정도로 스트린전트한 조건으로서는, 예컨대 하이브리다이제이션 조건으로서, 1×SSC∼6×SSC, 42℃∼55℃의 조건, 보다 바람직하게는 1×SSC∼3×SSC, 45℃∼50℃의 조건, 가장 바람직하게는 2×SSC, 50℃의 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션 용액 중에, 예컨대 약 50%의 포름아미드를 포함하는 경우에는, 상기 온도보다도 5 내지 15℃ 낮은 온도를 채용한다. 세정 조건으로서는, 0.5×SSC∼6×SSC, 40℃∼60℃를 들 수 있다. 하이브리다이제이션 및 세정시에는, 일반적으로 0.05%∼0.2%, 바람직하게는 약 0.1% SDS를 가하더라도 좋다.
고도로 스트린전트(하이-스트린전트)한 조건으로서는, 중간 정도로 스트린전트한 조건보다도 높은 온도 및/또는 낮은 염 농도에서의 하이브리다이제이션 및/또는 세정을 포함한다. 예컨대, 하이브리다이제이션 조건으로서, 0.1×SSC∼2×SSC, 55℃∼65℃의 조건, 보다 바람직하게는 0.1×SSC∼1×SSC, 60℃∼65℃의 조건, 가장 바람직하게는 0.2×SSC, 63℃의 조건을 들 수 있다. 세정 조건으로서, 0.2×SSC∼2×SSC, 50℃∼68℃, 보다 바람직하게는 0.2×SSC, 60∼65℃를 들 수 있다.
특히 본 발명에 이용되는 하이브리다이제이션 조건으로서는, 예컨대 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 50% 포름아미드 중 42℃의 조건에서 프리하이브리다이제이션을 행한 후, 프로브를 첨가하여 하룻밤 42℃로 유지하여 하이브리드 형성시키고, 그 후, 0.2×SSC, 0.1% SDS 중, 65℃에서 20분간의 세정을 3회 행한다고 하는 조건을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판되는 하이브리다이제이션 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, DIG 핵산 검출 키트(로슈·다이아그노스사), ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제조)를 사용한 하이브리다이제이션 등을 들 수 있다.
본 발명에 포함되는 핵산으로서는, 바람직하게는, 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 80% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
본 발명의 핵산은, 서열번호 1 또는 6으로 나타내어지는 핵산 서열에 대하여 적어도 동일성이 80% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 「본 발명의 상기 활성」에 대해서는 상기한 대로이다.
바람직하게는, 서열번호 1 또는 6으로 나타내어지는 염기 서열에 대하여 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 한층 바람직하게는 90%(예컨대, 92% 이상, 더한층 바람직하게는 95% 이상, 나아가서는 97%, 98% 또는 99%)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.
2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트는, 시각적 검사나 수학적 계산에 의해 결정할 수 있는데, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 핵산의 서열 정보를 비교함으로써 결정하는 것이 바람직하다. 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로서는, 예컨대, 미국 국립 의학 라이브러리의 웹사이트 : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ bl2seq/bls.html로부터 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램(Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10) : 버전 2.2.7 또는 WU-BLAST2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST2.0에 관한 표준 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트 : http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
본 발명의 핵산은, 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 그리고 「본 발명의 상기 활성」에 관해서는 상기한 대로이다.
구체적으로는, 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 보다 한층 바람직하게는 97%(예컨대, 98%, 나아가서는 99%) 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
본 발명의 핵산은, 바람직하게는, 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 98% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.
2개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해서 결정할 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 퍼센트를 결정할 수도 있다. 그와 같은 컴퓨터 프로그램으로서는, 예컨대, BLAST, FASTA(Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)) 및 ClustalW 등을 들 수 있다. 특히, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은, Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재된 것으로, 미국 바이오테크놀로지정보센터(NCBI)나 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹사이트에서 공적으로 입수할 수 있다(BLAST 메뉴얼, Altschul 등 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul 등). 또한, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스), DINASIS Pro(히타치소프트), Vector NTI(Infomax) 등의 프로그램을 이용하여 결정할 수도 있다.
복수의 아미노산 서열을 병렬시키는 특정한 얼라인먼트 스킴은, 서열 중, 특정한 짧은 영역의 매칭도 보일 수 있기 때문에, 이용한 서열의 전장 서열 사이에 유의한 관계가 없는 경우라도, 그와 같은 영역에 있어서, 특정한 서열 동일성이 매우 높은 영역을 검출할 수도 있다. 또한, BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코어가 붙은 매트릭스를 이용할 수 있는데, 선택 파라미터로서는, 이하의 것을 이용할 수 있다: (A) 낮은 조성 복잡성을 갖는 쿼리 서열의 세그멘트(Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정된다; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이터베이스에 있어서의 조성 편중 영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol., 266: 544-71도 참조), 또는 단주기성의 내부 리피트로 이루어지는 세그멘트(Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정됨)를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것, 및 (B) 데이터베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 임계치, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라서, 단순히 우연에 의해 발견되는 적합의 기대 확률; 어느 적합에 기인하는 통계학적 유의차가 E-스코어 임계치보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다.
(e) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
본 발명의 핵산은, 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.
「본 발명의 상기 활성」 및 하이브리다이즈의 조건은 상기한 대로이다.
더욱이, 본 발명의 핵산에는, 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산도 포함된다. 구체적으로는, 서열번호 1 또는 6에 나타내는 염기 서열 중 1개 또는 복수 개(바람직하게는 1개 또는 여러 개(예컨대, 1∼1500개, 1∼1000개, 1∼500개, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개))의 염기가 결실, 치환 및/또는 부가된 염기 서열을 포함하는 핵산으로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산을 이용할 수도 있다. 여기서, 염기 서열이 결실, 치환 및/또는 부가되었다는 것은, 동일 서열 중의 임의의 1 혹은 복수의 염기 서열 중의 위치에 있어서, 1 또는 복수의 염기의 결실, 치환 및/또는 부가가 있음을 의미한다. 이 결실, 치환 및/또는 부가는, 이들 중 2종 이상이 동시에 생기더라도 좋지만, 상기 결실, 치환 및/또는 부가의 수는 일반적으로 작을수록 바람직하다.
본 발명의 핵산의 바람직한 양태로서는, 이하의 (a)∼(d) 중 어느 것에 기재한 핵산도 포함된다.
(a) 서열번호 1 또는 6으로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(c) 서열번호 4 또는 9로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 5 또는 10으로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산
(a) 서열번호 1 또는 6으로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 핵산, (b) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산, (c) 서열번호 4 또는 9로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 핵산에 대해서는 상기한 대로이다. 상기 서열의 부분 서열이란, 상기 염기 서열에 포함되는 ORF, CDS, 생물학적 활성을 갖는 영역, 이하에 기재하는 것과 같은 프라이머로서 이용한 영역, 프로브로 될 수 있는 영역이 포함되고, 천연에서 유래하는 것이라도, 인공적으로 제작한 것이라도 좋다.
한편, 본 발명의 핵산은, 바람직하게는, 막결합성 O-아실 트랜스페라제 패밀리에 속하는 단백질을 코드하는 핵산이다. 「막결합성 O-아실 트랜스페라제 패밀리」에 대해서는 상기한 대로이다.
또한, 본 발명의 핵산에는 이하의 핵산도 포함된다.
(1) (a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 80% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(e) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린전트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산 및,
(2) 이하의 (a)∼(e) 중 어느 것인 (1)에 기재한 핵산.
(a) 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1∼50개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(b) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산
(c) 서열번호 1 또는 6으로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열을 포함하는 핵산
(d) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산
(e) 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산.
본 발명의 리소인지질 아실기 전이효소 단백질
본 발명의 단백질은, 「리소인지질 아실기 전이효소 활성(LPLAT 활성)」, 「아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성」 및/또는 「아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성」을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 단백질은, 천연에서 유래하는 것이라도, 인공적으로 제작한 것이라도 좋다.
본 발명의 단백질은 바람직하게는, 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 LPLAT5 및 LPLAT6이다. 또한, LPLAT5 및 LPLAT6의 변이체, 즉, 「리소인지질 아실기 전이효소 활성(LPLAT 활성)」, 「아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성」 및/또는 「아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성」을 갖는다고 하는 요건을 만족하는 변이체도 본 발명에 포함된다.
「리소인지질 아실기 전이효소 활성」, 「아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성」 및 「아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성」은, 상기 『본 발명의 리소인지질 아실기 전이효소를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 대로이다. 한편, 이하의 「본 발명의 상기 활성」이란, 상기 「LPLAT 활성, 아라키돈산의 비율을 높일 수 있는 활성 및/또는 아라키돈산의 생합성 경로에 관여하는 활성」을 의미한다.
본 발명의 단백질로서는, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재한 단백질이 포함된다.
(a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질
「1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열」, 「동일성이 80% 이상」의 정의에 대해서는, 상기 『본 발명의 리소인지질 아실기 전이효소를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 대로이다.
본 발명의 단백질에는, 서열번호 1 또는 6의 염기 서열을 포함하는 핵산에 의해서 코드되는 단백질의 변이체, 또는 서열번호 2 또는 7로 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가 등의 많은 종류의 수식에 의해 변이된 단백질, 혹은 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질, 다른 단백질과의 융합 단백질로서, 또한, 본 발명의 상기 활성을 갖는 단백질도 포함된다.
본 발명의 단백질은, 인공적으로 제작한 것이라도 좋으며, 그 경우는, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드켐테크사 제조, PerkinElmer사 제조, Pharmacia사 제조, 프로테인테크놀로지인스트루먼트사 제조, 신세셀베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 시마즈세이사쿠쇼사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
또한, 본 발명의 단백질은, 바람직하게는, 막결합성 O-아실 트랜스페라제 패밀리에 속하는 단백질이다. 「막결합성 O-아실 트랜스페라제 패밀리」의 정의 등은, 상기 『본 발명의 리소인지질 아실기 전이효소를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 대로이다.
또한, 본 발명의 단백질에는 이하의 단백질도 포함된다.
(1) (a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1 혹은 복수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(2) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재한 (1)의 단백질.
(a) 서열번호 2 또는 7에 있어서 1∼50개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(b) 서열번호 2 또는 7로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
본 발명의 핵산의 클로닝
본 발명의 LPLAT 단백질을 코드하는 핵산은, 예컨대, 적절한 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝함으로써, 클로닝할 수 있다. 또한, 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭하여, 적절한 벡터에 연결함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 별도의 벡터에 서브클로닝할 수도 있다.
예컨대, pBlue-Script(상표) SK(+)(Stratagene), pGEM-T(Promega), pAmp(TM:Gibco-BRL), p-Direct(Clontech), pCR2.1-TOPO(Invitrogene) 등의 시판되는 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 또한, PCR 반응으로 증폭하는 경우, 프라이머는, 상기한 서열번호 1 또는 6 등에 나타내어지는 염기 서열의 어느 부분도 이용할 수 있지만, 예컨대, 이하의 실시예 1에 예로 드는 프라이머이다. 그리고, M. alpina 균체로부터 조제한 cDNA에, 상기 프라이머 및 내열성 DNA 폴리머라제 등을 작용시켜 PCR 반응을 행한다. 상기 방법은 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001))』 등에 따라서, 당업자라면 용이하게 행할 수 있다.
얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, GENECLEAN(푸나코시), QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN), ExoSAP-IT(GE헬스케어바이오사이엔스) 등의 키트를 이용하는 방법, DEAE-셀룰로오스 여과지를 이용하는 방법, 투석 튜브를 이용하는 방법 등이 있다. 아가로스 겔을 이용하는 경우에는, 아가로스 겔 전기영동을 하여, DNA 단편을 아가로스 겔로부터 잘라내어, GENECLEAN(푸나코시), QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN), Freeze & Squeeze법 등에 의해 정제할 수 있다.
클로닝한 핵산의 염기 서열은 염기 서열 시퀀서를 이용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 발현용 벡터 구축 및 형질전환체의 제작
본 발명은 또한, 본 발명의 LPLAT 단백질을 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은 더욱이, 상기 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체도 제공한다.
이러한 재조합 벡터 및 형질전환체는 다음과 같이 하여 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 LPLAT 단백질을 코드하는 핵산을 갖는 플라스미드를 제한효소를 이용하여 소화한다. 이용하는 제한효소로서는, 예컨대, EcoRI, KpnI, BamHI 및 SalI 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 한편, 말단을 T4 폴리머라제 처리함으로써 평활화하더라도 좋다. 소화 후의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한다. 이 DNA 단편을, 발현용 벡터에 공지된 방법을 이용하여 삽입함으로써, LPLAT 단백질 발현용 벡터를 얻을 수 있다. 이 발현 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환체를 제작하여, 목적으로 하는 단백질의 발현에 사용한다.
이 때, 발현 벡터 및 숙주는, 목적으로 하는 단백질을 발현할 수 있는 것이라면 특히 한정되지 않고, 예컨대, 숙주로서, 진균이나 세균, 식물, 동물 혹은 이들의 세포 등을 들 수 있다. 진균으로서, 지질 생산균인 M. alpina 등의 사상균, S.cerevisiae(Saccharomyces Cerevisiae) 등의 효모 등을 들 수 있다. 또한 세균으로서, 대장균이나 고초균(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 또한 식물로서는, 유채씨, 콩, 목화, 홍화, 아마 등의 유량식물을 들 수 있다.
지질 생산균으로서는, 예컨대, MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있으며, 구체적으로는, 모르티에렐라속에 속하는 미생물, 예컨대, 모르티에렐라·엘론가타(M. elongata) IFO8570, 모르티에렐라·엑시구아(M. exigua) IFO8571, 모르티에렐라·히그로필라(M. hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라·알피나 IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라아속에 속하는 미생물 또는 모르티에렐라·이자벨리나(M. isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라·나나(M. nana) IFO8190, 모르티에렐라·라마니아나(M. ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라·뷔나세아(M. vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, M. alpina가 바람직하다.
진균류를 숙주로서 이용하는 경우는, 본 발명의 핵산이 숙주 속에서 자립 복제 가능하거나, 혹은 그 균의 염색체 상에 삽입될 수 있는 구조인 것이 바람직하다. 그리고 동시에, 프로모터, 터미네이터를 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 숙주로서 M. alpina를 사용하는 경우, 발현 벡터로서, 예컨대, pD4, pDuraSC, pDura5등을 들 수 있다. 프로모터로서는, 숙주 속에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 프로모터를 이용하더라도 좋고, 예컨대, histonH4.1 유전자 프로모터, GAPDH(글리세르알데히드3-인산데히드로게나아제) 유전자 프로모터, TEF(Translation elongation factor) 유전자 프로모터와 같은 M. alpina에 유래하는 프로모터가 이용된다.
M. alpina 등의 사상균에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는, 예컨대, 일렉트로포레이션(electroporation)법, 스페로플라스트(spheroplast)법, 파티클 딜리버리법 및 핵 내에의 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다. 영양 요구성의 호스트주를 이용하는 경우는, 그 영양소를 뺀 선택 배지 상에서 생육하는 주를 선택함으로써, 형질전환주를 취득할 수 있다. 또한, 형질전환에 약제 내성 마커 유전자를 이용하는 경우에는, 그 약제를 포함하는 선택 배지로 배양을 하여, 약제 내성을 보이는 세포 콜로니를 얻을 수 있다.
효모를 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서, 예컨대, pYE22m 등을 들 수 있다. 또한, pYES(Invitrogen)나 pESC(STRATAGENE) 등의 시판되는 효모 발현용 벡터를 이용하더라도 좋다. 또한 본 발명에 알맞은 숙주로서는, S. cerevisiae EH13-15주(trp1, MATα) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 프로모터로서는, 예컨대, GAPDH 프로모터, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터 등의 효모 등에 유래하는 프로모터가 이용된다.
효모에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는, 예컨대, 초산리튬법, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 덱스트란 중개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 중개 트랜스펙션, 프로토플라스트 융합, 리포좀 중의 폴리뉴클레오티드(단수 또는 복수)의 피포(被包) 및 핵 내에의 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다.
대장균 등의 세균을 숙주로서 이용하는 경우는, 발현 벡터로서는, 예컨대 Pharmacia사의 pGEX, pUC18 등을 들 수 있다. 프로모터로서는, 예컨대, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터가 이용된다. 세균에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는, 예컨대 일렉트로포레이션법이나 염화칼슘법을 이용할 수 있다.
본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법
본 발명은, 상기 형질전환체로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법이다. 구체적으로는 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 그러나, 본 제조 방법에 대해서는, 이 방법에 한정되지 않고, 일반적인 공지된 다른 방법을 이용하여 행할 수도 있다.
본 발명의 단백질을 발현시킨 생물의 배양에 이용하는 배지는, 적당한 pH 및 침투압을 지니고, 각 숙주의 증식에 필요한 영양소, 미량 성분, 혈청이나 항생 물질 등의 생물 재료를 포함하고 있는 배양액(배지)이라면, 어떠한 배양액도 이용할 수 있다. 예컨대, 효모를 형질전환하여 LPLAT5 및 6을 발현시킨 경우는, SC-Trp, Leu, Ura 배지, YPD 배지, YPD5 배지 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
배양 조건은, 숙주의 증식에 알맞고, 또한 생성된 효소가 안정적으로 유지되는 데 적당한 조건이라면 어떠한 조건이라도 좋지만, 구체적으로는, 혐기도, 배양 시간, 온도, 습도, 정치 배양 또는 진탕 배양 등의 개개의 조건을 조절할 수 있다. 배양 방법은, 동일 조건에서의 배양(1단계 배양)이라도 좋고, 2 이상의 다른 배양 조건을 이용하는, 소위 2단계 배양 혹은 3단계 배양이라도 좋지만, 대량 배양을 하는 경우에는, 배양 효율이 좋은 2단계 배양 등이 바람직하다.
본 발명의 지방산 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 LPLAT 단백질이 발현하고 있는 세포에 있어서의 1 또는 그 이상의 지방산의 집합체인 지방산 조성물로서, 이 지방산 조성물 중의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율이, 비형질전환체인 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물의 아라키돈산 비율보다도 높은 것을 특징으로 하는 상기 지방산 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 LPLAT5 및 6이 발현하고 있는 형질전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물이다. 이하의 실시예에서는, 아라키돈산 생산 효모에 있어서 LPLAT5 또는 6으로 형질전환시킨 경우, 아라키돈산의 비율이 대조군의 지방산 조성물의 아라키돈산 비율보다도 적어도 1.5배 상승했다.
지방산은, 유리 지방산이라도 좋고, 트리글리세리드, 인지질 등이라도 좋다.
본 발명의 지방산 조성물에 포함되는 지방산으로서는, 장쇄 탄수화물의 쇄형 혹은 분기형의 모노카르복실산을 말하며, 예컨대, 미리스틴산(테트라데칸산)(14:0), 미리스트올레산(테트라데센산)(14:1), 팔미틴산(헥사데칸산)(16:0), 팔미톨레산(9-헥사데센산)(16:1), 스테아린산(옥타데칸산)(18:0), 올레인산(cis-9-옥타데센산)(18:1(9) 또는 단순히 18:1이라 표기하는 경우도 있음), 박센산(11-옥타데센산)(18:1(11)), 리놀레산(cis, cis-9,12옥타데카디엔산)(18:2(9,12) 또는 단순히 18:2라 표기하는 경우도 있음), α-리놀렌산(9,12,15-옥타데카트리엔산)(18:3(9,12,15)), γ-리놀렌산(6,9,12-옥타데카트리엔산)(18:3(6,9,12), GLA 또는 18:3(n-6)으로 표기하는 경우도 있음), 스테아리돈산(6,9,12,15-옥타데카테트라엔산)(18:4(6,9,12,15)), 아라키딘산(이코산산)(20:0), (8,11-이코사디엔산)(20:2(8,11)), 미드산(5,8,11-이코사트리엔산)(20:3(5,8,11)), 디호모-γ-리놀렌산(8,11,14-이코사트리엔산)(20:3(8,11,14) 또는 DGLA라 표기하는 경우도 있음), 아라키돈산(5,8,11,14-이코사테트라엔산)(20:4(5,8,11,14) 또는 ALA라 표기하는 경우도 있음), 에이코사테트라엔산(8,11,14,17-이코사테트라엔산)(20:4(8,11,14,17), 에이코사펜타엔산(5,8,11,14,17-이코사펜타엔산)(20:5(5,8,11,14,17)), 베헨산(도코산산)(22:0), (7,10,13,16-도코사테트라엔산)(22:4(7,10,13,16)), (7,10,13,16,19-도코사펜타엔산)(22:5(7,10,13,16,19)), (4,7,10,13,16-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,10,13,16)), (4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산)(22:6(4,7,10,13,16,19)), 리그노세린산(테트라도코산산)(24:0), 네르본산(cis-15-테트라코센산)(24:1), 세로트산(헥사도코산산)(26:0) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 한편, 상기 물질명은 IUPAC 생화학명명법으로 정의된 관용명이며, 조직명 및 탄소수와 이중 결합의 위치를 나타내는 수치를 괄호 안에 기재했다.
본 발명의 지방산 조성물은, 상기한 지방산 중, 1 또 그 이상의 지방산의 조합이라면, 어떠한 수의 어떠한 종류의 지방산으로 이루어지는 조성물이라도 좋다.
상기 본 발명의 지방산 조성물의 제조 방법에 의해 얻어진 동결 건조한 균체에, 적당한 비율로 조정한 클로로포름:메탄올을 첨가하여 교반한 후, 적당한 시간, 가열 처리를 한다. 또한 원심 분리에 의해 균체를 분리하여, 용매를 회수하는 것을 수회 반복한다. 그 후, 적당한 방법을 이용하여 지질을 건고시키고 나서, 클로로포름 등의 용매를 첨가하여 지질을 용해한다. 이 시료를 적당량 분취하여, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후에, 헥산으로 추출하고, 헥산을 유거하고 나서, 가스 크로마토그래피로 분석을 한다.
한편, 본 발명의 핵산을 함유하는 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물 중의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율은, 공지된 LPLAT 지방산 조성물의 아라키돈산 비율보다도 높다. 이것은, 본 발명의 LPLAT가 아실기의 아실-CoA에서 인지질로의 전이 혹은 인지질에서 CoA로의 전이가 필요한 지방산의 변환율을 상승시킬 수 있기 때문이다. 구체적으로는, 이하의 실시예에도 기재하는 것과 같이, 아라키돈산 생산 효모(S. cerevisiae)로 본 발명의 바람직한 양태인 LPLAT5 및 LPLAT6을 발현시킨 경우, 이 LPLAT5 및 LPLAT6가 발현된 효모에 의해 산생되는 지방산 조성물 중에 있어서의 아라키돈산의 비율이 높은 것을 들 수 있다. 이 경우, LPLAT5는, 18:1-CoA에서 18:1-PL로의 변환, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하고, LPLAT6는, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하고 있음이 발견되었다.
또한, 후술하는 실시예에 있어서 기재하는 것과 같이, M. alpina에 있어서도, LPLAT6은, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하고 있음이 발견되었다.
따라서, 본 발명은 또한, 재조합 벡터를 이용하여, 그 벡터가 도입된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 상기 벡터를 도입하지 않는 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높게 하는 방법도 제공한다.
본 발명의 지방산 조성물을 포함하는 식품 등
또한, 본 발명은, 상기 지방산 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명의 지방산 조성물은, 통상의 방법에 따라서, 예컨대, 유지를 포함하는 식품, 공업 원료(화장료, 의약(예컨대, 피부외용약), 비누 등의 원료)의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다. 화장료(조성물) 또는 의약(조성물)의 제형으로서는, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 식품의 형태로서는, 캡슐 등의 의약 제제의 형태 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 지방산 조성물이 배합된 자연 유동식, 반소화 상태 영양식 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태를 들 수 있다.
더욱이, 본 발명 식품의 예로서는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서, 식품이란, 고체, 유동체와 액체 및 이들의 혼합물로서, 섭식 가능한 것의 총칭을 말한다.
영양 보조 식품이란, 특정한 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강하게 하는 또는 건강에 좋다고 하는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등이 포함된다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건 용도 식품과 동의이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이에게 주기 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 무처리 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이에게 주기 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 주기 위한 조제유를 말한다.
이들 식품으로서는, 육류, 어류, 너트 등의 천연 식품(유지로 처리한 것); 중화요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 가하는 식품; 튀김, 프라이, 유부, 볶음밥, 도넛, 유과 등의 열 매체로서 유지를 이용한 식품; 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 쵸콜릿, 즉석라면, 캬라멜, 비스킷, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 가한 가공 식품; 오카키(일본과자), 하드 비스킷, 팥빵 등의 가공 마무리할 때에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 식품은, 유지를 포함하는 식품에 한정되는 것이 아니라, 예컨대, 빵, 국수류, 밥, 과자류(캔디, 츄잉검, 구미, 정과, 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품; 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품; 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품; 어묵, 튀긴 어묵, 생선 굳힌 식품 등의 수산 식품; 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알코올 음료, 차 등을 들 수 있다.
본 발명의 LPLAT 단백질을 코드하는 핵산 또는 LPLAT 단백질을 이용한 균주의 평가·선택 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 LPLAT 단백질을 코드하는 핵산 또는 LPLAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 평가나 선택을 하는 방법을 제공한다. 구체적으로는 다음과 같다.
(1) 평가 방법
본 발명의 한 양태로서, 본 발명의 LPLAT 단백질을 코드하는 핵산 또는 LPLAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 평가를 하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 평가 방법으로서는, 우선, 본 발명의 염기 서열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 피검 균주인 지질 생산 균주의 본 발명의 상기 활성에 관해서 평가하는 방법을 들 수 있다. 이러한 평가 방법의 일반적 수법은 공지이며, 예컨대, 국제 특허 출원 팜플렛 WO01/040514호, 일본 특허 공개 평8-205900호 공보 등에 기재되어 있다. 이하, 이 평가 방법에 관해서 간단히 설명한다.
우선, 피검 균주의 게놈을 조제한다. 조제 방법은, Hereford법이나 초산칼륨법 등, 어떠한 공지된 방법도 이용할 수 있다(예컨대, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130(1990) 참조).
본 발명의 염기 서열, 바람직하게는, 서열번호 1 또는 6에 기초하여 프라이머 또는 프로브를 설계한다. 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명에 따른 염기 서열의 어느 부분도 이용할 수 있으며, 또한 그 설계는 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있다. 프라이머로서 이용하는 폴리뉴클레오티드의 염기수는 통상 10 염기 이상이며, 15∼25 염기인 것이 바람직하다. 또한, 사이에 들어가는 부분의 염기수는 통상 300∼2000 염기가 적당하다.
상기에서 제작한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 상기 피검 균주의 게놈 중에 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열이 존재하는지 여부를 조사한다. 본 발명의 염기 서열과 특이적인 서열의 검출은, 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 염기 서열에 특이적 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 이용하고, 또 한 쪽의 프라이머로서 이 서열보다도 상류 혹은 하류 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 예컨대, PCR법 등에 의해서 피검 균주의 핵산을 증폭하여, 증폭물의 유무, 증폭물의 분자량의 크기 등을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법에 알맞은 PCR법의 반응 조건은 특별히 한정되지 않는다. 얻어진 반응 생성물인 증폭 산물을, 아가로스 겔 등을 이용한 전기영동법 등에 의해 분리하여, 증폭 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 이에 따라, 증폭 산물의 분자량이 본 발명의 염기 서열과 특이적인 영역에 상당하는 핵산 분자를 포함하는 크기인지 여부를 확인함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 예측 또는 평가할 수 있다. 또한, 상기 증폭 산물의 염기 서열을 상기 방법 등으로 해석함으로써, 또한 본 발명의 상기 활성을 보다 정확하게 예측 또는 평가할 수 있다. 한편, 본 발명의 상기 활성의 평가 방법은 상기한 대로이다.
또한, 본 발명의 상기 평가 방법으로서는, 피검 균주를 배양하여, 서열번호 1 또는 6 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 LPLAT 단백질의 발현량을 측정함으로써, 피검 균주의 본 발명의 상기 활성을 평가할 수도 있다. 한편, LPLAT 단백질의 발현량은, 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하여, LPLAT 단백질의 mRNA 또는 단백질을 정량함으로써 측정할 수 있다. mRNA 또는 단백질의 정량은, 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있다. mRNA의 정량은, 예컨대, 노던 하이브리다이제이션이나 정량적 RT-PCR에 의해서, 단백질의 정량은, 예컨대 웨스턴 블로팅에 의해서 행할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
(2) 선택 방법
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 LPLAT 단백질을 코드하는 핵산 또는 LPLAT 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 선택을 하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 선택 방법으로서는, 피검 균주를 배양하여, 서열번호 1 또는 6 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 LPLAT 단백질의 발현량을 측정하여, 목적으로 하는 발현량의 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 또한, 기준이 되는 균주를 설정하고, 이 기준 균주와 피검 균주를 각각 배양하여, 각 균주의 상기 발현량을 측정하고, 기준 균주와 피검 균주의 발현량을 비교하여, 원하는 균주를 선택할 수도 있다. 구체적으로는, 예컨대, 기준 균주 및 피검 균주를 적당한 조건으로 배양하여, 각 균주의 발현량을 측정하고, 기준 균주보다도 피검 균주 쪽이 고발현 또는 저발현인 피검 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, LPLAT 단백질의 발현량을 측정하는 방법을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 선택 방법으로서는, 피검 균주를 배양하여, 본 발명의 상기 활성이 높거나 혹은 낮은 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 피검 균주를 선택할 수도 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, LPLAT 단백질의 발현량을 측정하는 방법을 들 수 있다.
피검 균주 또는 기준 균주로서는, 예컨대, 상기한 본 발명의 벡터를 도입한 균주, 상기 본 발명의 핵산의 발현이 억제된 균주, 돌연변이 처리가 실시된 균주, 자연변이된 균주 등을 이용할 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. 돌연변이 처리로서는, 예컨대, 자외선 조사나 방사선 조사 등의 물리적 방법, EMS(에틸메탄술포네이트), N-메틸-N-니트로소구아니딘 등의 약제 처리에 의한 화학적 방법 등을 들 수 있지만(예컨대, 오오시마 야스지(大嶋泰治) 편저, 생물화학실험법39 효모분자유전학실험법, p.67-75, 학회출판센터 등 참조), 이들에 한정되지 않는다.
한편, 본 발명의 기준 균주, 피검 균주로서 이용하는 균주로서는, 상기한 지질 생산균 또는 효모 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 기준 균주, 피검 균주는, 다른 속이나 종에 속하는 어떠한 균주를 조합시켜 이용하더라도 좋고, 피검 균주는 1 또는 그 이상의 균주를 동시에 이용하더라도 좋다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 실시예에 한정되는 것이 아니다.
실시예
〔실시예 1〕
M. alpina의 게놈 해석
M. alpina 1S-4주를 100 ml의 GY2:1 배지(2% 글루코오스, 1% 효모 엑기스 pH 6.0)에 식균하여, 28℃에서 2일간 진탕 배양했다. 여과에 의해 균체를 집균하여, DNeasy(QIAGEN)를 이용하여 게놈 DNA를 조제했다.
상기 게놈 DNA의 염기 서열을, Roche454GS FLX Standard를 이용하여 결정했다. 그 때, 프래그먼트 라이브러리의 염기 서열 결정을 2런분, 메이트페어 라이브러리의 염기 서열 결정을 3런분 행했다. 얻어진 염기 서열을 어셈블리함으로써, 300개의 Super Contig를 얻을 수 있었다.
cDNA 라이브러리의 제작
M. alpina 1S-4주를 100 ml의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하여, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10 L 배양조(AbleCo., 동경)에 5 L의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데카놀, 0.3% KH2PO4, 0.1% Na2SO4, 0.05% CaCl2·2H2O, 0.05% MgCl2·6H2O, pH 6.0)를 넣어, 전배양물을 전량 식균하여, 300 rpm, 1 vvm, 26℃의 조건으로 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2 및 3일째에 각각 2%, 2% 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하여, 염산구아디닌/CsCl법으로 totalRNA를 조제했다. Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(타카라바이오)를 이용하여, totalRNA으로부터 poly(A)+RNA의 정제를 했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작했다.
S. cerevisiae 유래 SLC4 호몰로그의 탐색
S. cerevisiae의 MBOAT 패밀리(PfamPFO3062)의 LPLAT를 코드하는 SLC4(YOR175c)로부터 유도되는 아미노산 서열을 M. alpina 1S-4의 게놈 염기 서열에 대하여, tblastn 해석한 결과, 서열번호 5와 서열번호 10에 나타내는 서열을 포함하는 Super contig가 히트되었다.
프로브의 제작
서열번호 5와 서열번호 10에 대응하는 cDNA를 클론화하기 위해서, 이하의 프라이머를 제작했다(표 2).
Figure 112016127872020-pat00002
cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 상기 프라이머 중, MaLPAAT5-1F와 MaLPAAT5-3R, MaLPAAT6-2F와 MaLPAAT5-3R의 조합으로, ExTaq(타카라바이오)를 이용하여 PCR 반응을 행했다. 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TAcloning kit(INVITROGEN)를 이용하여 클로닝하여, 서열번호 4의 195번째에서부터 931번째의 염기 서열을 포함하는 플라스미드를 pCR-LPLAT5-P, 서열번호 9의 766번째에서부터 1414번째의 염기 서열을 포함하는 플라스미드를 pCR-LPLAT6-P로 했다. 이어서, 이들 플라스미드를 각각 주형으로 하여, 상기 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 행했다. 반응에는, ExTaq(타카라바이오)를 이용했지만, 첨부한 dNTP 믹스 대신에 PCR 라벨링 믹스(로슈·다이아노그스사)를 이용하여, 증폭되는 DNA를 디곡시게닌(DIG) 라벨한 프로브를 제작했다. 이 프로브를 이용하여, cDNA 라이브러리를 스크리닝했다.
하이브리다이제이션의 조건은 다음과 같다.
버퍼 : 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드;
온도 : 42℃(하룻밤);
세정 조건 : 0.2×SSC, 0.1% SDS 용액 중(65℃)에서 20분간×3회;
검출은, DIG 핵산 검출 키트(로슈·다이아그노스사)를 이용하여 행했다. 스크리닝에 의해서 얻어진 파지 클론으로부터, in vivo 엑시전에 의해, 플라스미드를 잘라내어, 각 플라스미드 DNA를 얻었다. LPLAT5 프로브 1로 스크리닝하여 얻어진 플라스미드 중 인서트 길이가 가장 긴 것을 pB-LPLAT5, LPLAT6 프로브 1로 스크리닝하여 얻어진 플라스미드 중 인서트 길이가 가장 긴 것을 pB-LPLAT6로 했다. 플라스미드 pB-LPLAT5의 인서트, 즉 LPLAT5의 cDNA의 염기 서열은 서열번호 4, 플라스미드 pB-LPLAT6의 인서트, 즉 LPLAT6의 cDNA의 염기 서열은 서열번호 9였다.
서열 해석
LPLAT5의 cDNA 서열인 서열번호 4에는, 161번째에서부터 1693번째의 염기 서열로 이루어지는 CDS(서열번호 3)가 포함되어 있고, 161번째에서부터 1690번째의 염기 서열로 이루어지는 ORF(서열번호 1)가 포함되어 있었다. 도 2에 LPLAT5의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 기재했다.
한편, LPLAT6의 cDNA 서열인 서열번호 9에는, 38번째에서부터 1759번째의 염기 서열로 이루어지는 CDS(서열번호 8)가 포함되어 있고, 38번째에서부터 1756번째의 염기 서열로 이루어지는 ORF(서열번호 6)가 포함되어 있었다. 도 3에 LPLAT6의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열을 기재했다.
서열번호 1 및 서열번호 6을 GENEBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTX를 이용하여 상동성 해석을 했다. 서열번호 1로부터 추정되는 아미노산 서열은 진균류 유래의 LPLAT 호몰로그와 상동성을 보이고, 서열번호 6으로부터 추정되는 아미노산 서열은 동물 유래의 LPLAT 호몰로그와 상동성을 보였다. 각 서열에 대하여 가장 E-value가 낮았던, 즉 동일성이 가장 높았던 아미노산 서열은 다음과 같았다. 각 서열의 ORF와, 가장 동일성이 높았던 서열에 따른 염기 서열의 동일성 및 아미노산 서열의 동일성을 clustalW로 구하여, 이하에 합쳐 기재했다.
서열번호 1은, Schizosaccharomyces pombe 유래의 리소인지질 아실기 전이효소 호몰로그(GI : 161085648)와, ORF의 염기 서열에서 43.2%, 아미노산 서열에서 33.3%의 동일성이었다. 한편, 서열번호 6은, Xenopus laevis 유래의 추정 단백질(GI : 56788919)과 ORF의 염기 서열에서 41.2%, 아미노산 서열에서 28.6%의 동일성이었다. 또한 LPLAT5와 LPLAT6 사이의 동일성은, ORF의 염기 서열에서 40.0%, 아미노산 서열에서 19.1%였다.
LPLAT5의 CDS(서열번호 3) 및 LPLAT6의 CDS(서열번호 8)를 포함하는 게놈 서열을 각각 서열번호 5 및 서열번호 10에 기재했다. 서열번호 5는 인트론을 2개 포함하고 있고, 엑손은 1-314, 461-587, 668-1759였다. 또한, 서열번호 10은 인트론을 하나 포함하고 있고, 엑손은 1-1095, 1318-1944였다. 도 4에 LPLAT5의 게놈 서열과 ORF 서열의 얼라인먼트를, 도 5에 LPLAT6의 게놈 서열과 ORF의 얼라인먼트를 기재했다.
〔실시예 2〕
효모 발현용 벡터의 구축
LPLAT5 및 LPLAT6을 효모로 발현시키기 위해서, 다음과 같이 벡터를 구축했다.
pBLPLAT5를 주형으로 하여,
프라이머 Eco-MaLPLAT5-F(서열번호 15) : GAATTCATGCTAAACTCATTCTTCGGGGACGC와
프라이머 Xho-MaLPLAT5-R(서열번호 16) : CTCGAGTTACAGCGTCTTGATTTTAACTGCAGC를 이용하여, ExTaq(타카라바이오)에 의해, PCR 반응을 행했다.
얻어진 DNA 단편에 대해서, TOPO-TAcloningKit(INVITROGEN)를 이용하여, TA-클로닝을 행하여, 인서트 부분의 염기 서열을 확인하여, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 pCR-LPLAT5로 했다. 이 플라스미드를 제한효소 EcoRI와 XhoI로 소화하여 얻어진 약 1.6 k의 DNA 단편을, 효모 발현용 벡터 pYE22m(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)의 EcoRI-SalI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pYE-MALPLAT5를 구축했다.
한편, pBLPLAT6을 제한효소 EcoRI와 KpnI로 소화하여, 얻어진 1.9 kb의 DNA 단편을 효모 발현 벡터 pYE22m의 EcoRI-KpnI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pYE-LPLAT6을 구축했다.
아라키돈산 생산 효모에서의 발현
(1) 아라키돈산 생산 효모의 육종
아라키돈산 생산 효모(S. cerevisiae)를 육종하기 위해서, 이하의 플라스미드를 구축했다.
우선, M. alpina 1S-4주로부터 조제한 cDNA를 주형으로 하여, Δ12-f와 Δ12-r, Δ6-f와 Δ6-r, GLELO-f와 GLELO-r 또는 Δ5-f와 Δ5-r과 같은, 프라이머의 조합으로 ExTaq를 이용하여 PCR를 행하고, M. alpina 1S-4주의 Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄장 연장 효소 유전자 및 Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자를 증폭했다.
Δ12-f : TCTAGAATGGCACCTCCCAACACTATTG(서열번호 17)
Δ12-r : AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC서열번호 18)
Δ6-f : TCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGTGTGAG(서열번호 19)
Δ6-r : AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(서열번호 20)
GLELO-f : TCTAGAATGGAGTCGATTGCGCAATTCC(서열번호 21)
GLELO-r : GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(서열번호 22)
Δ5-f : TCTAGAATGGGTGCGGACACAGGAAAAACC(서열번호 23)
Δ5-r : AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(서열번호 24)
이들을 TOPO-TA-cloningKit에 의해 클론화했다. 염기 서열을 확인하여, 각각의 염기 서열을 포함하는 클론을 각각 플라스미드 pCR-MAΔ12DS(서열번호 25의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ6DS(서열번호 26의 염기 서열을 포함함), pCR-MAGLELO(서열번호 27의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ5DS(서열번호 28의 염기 서열을 포함함)로 했다.
한편, 플라스미드 pURA34(일본 특허 공개 2001-120276호 공보)를 제한효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.2 kb의 DNA 단편을, 벡터 pUC18를 제한효소 EcoRI와 SphI로 소화한 후 말단을 평활화하고, 셀프 라이게이션하여 얻어진 벡터의 HindIII 사이트에 삽입하여, 벡터의 EcoRI 사이트 측이 URA3의 5' 측인 클론을 pUC-URA3으로 했다. 또한, YEp13을 제한효소 SalI와 XhoI로 소화하여 얻어진 약 2.2 kb의 DNA 단편을 벡터 pUC18의 SalI 사이트에 삽입하여, 벡터의 EcoRI 측이 LEU2의 5' 측인 클론을 pUC-LEU2로 했다.
이어서, 플라스미드 pCR-MAΔ12DS를 제한효소 HindIII로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한효소 XbaI로 소화하여 얻어진 약 1.2 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-URA(STRATAGENE)를 제한효소 SacI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한효소 SpeI로 소화한 약 6.6 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ6DS를 제한효소 XbaI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.6 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pESC-U-Δ12를 제한효소 SalI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한효소 HindIII로 소화한 약 8 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-U-Δ12:Δ6을 얻었다. 이것을 제한효소 PvuII로 부분 소화하여 얻어진 약 4.2 kb의 단편을 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6을 얻었다.
또한, 플라스미드 pCR-MAGLELO을 제한효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 0.95 kbp의 DNA 단편과, 벡터 pESC-LEU(STRATAGENE)를 제한효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 7.7 kbp의 DNA 단편과 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ5DS를 제한효소 XbaI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.3 kbp의 DNA 단편과 플라스미드 pESC-L-GLELO를 제한효소 ApaI로 소화한 후 말단을 평활화한 것을 제한효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 8.7 kbp의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pESC-L-GLELO:Δ5를 얻었다. 이것을 제한효소 PvuII로 소화하여 얻어진 약 3.2 kb 단편을 pUC-LEU2의 SmaI 사이트에 삽입하여, 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5를 얻었다. S. cerevisiae YPH499주(STRATAGENE)를 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6과 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5로 동시형질전환했다. 형질전환주는, SC-Leu,Ura(1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 위에서 생육하는 것으로서 선발했다. 이렇게 해서 얻어진 주 중, 임의의 1주를 ARA3-1주로 했다. 이 주는, 갈락토오스를 포함하는 배지에서 배양함으로써, GAL1/10 프로모터로부터 Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄장 연장 효소 유전자, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자가 발현함으로써, 아라키돈산을 생산할 수 있다.
(2) 아라키돈산 생산 효모의 형질전환
ARA3-1주를 플라스미드 pYE22m, pYE-MALPLAT5, pYE-MALPLAT6으로 각각 형질전환했다. 형질전환주는, SC-Trp,Leu,Ura(1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 위에서 생육하는 것으로서 선발했다.
각각의 플라스미드 도입주 중에서 임의의 3주를 이하의 배양에 사용했다. 이하의 표 3∼8에 있어서, 대조군이란 플라스미드 pYE22m로 형질전환된 주를 말하고, LPLAT5는 플라스미드 pYE-MALPLAT5로 형질전환된 주를 말하며, LPLAT6은 플라스미드 pYE-MALPLAT6로 형질전환된 주를 말한다.
(3) 지방산 무첨가 배지에서의 배양
상기 형질전환주를 SC-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에서 30℃, 하루 동안 진탕 배양하고, 그 중 1 ml를 SG-Trp,Leu,Ura(1 L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 갈락토오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 액체 배지 10 ml에서 15℃, 6일간 진탕 배양했다. 집균하여, 수세한 후, 동결 건조하여, 균체의 지방산 분석을 행했다.
결과를 표 3에 나타낸다.
Figure 112016127872020-pat00003
또한, 표 3의 결과를 바탕으로, 아라키돈산 생성 경로에 있어서 어느 지방산이 다음 지방산으로 변환되었는지를 구했다. 예를 들면, 18:2→18:3(n-6)의 변환율을 구하는 경우,
변환율=(18:3(n-6)+DGLA+ARA)/(18:2+18:3(n-6)+DGLA+ARA)×100
이 된다.
결과를 표 4에 나타낸다.
Figure 112016127872020-pat00004
표 3 및 표 4에 나타낸 것과 같이, 총 지방산에 차지하는 아라키돈산의 비율이 대조군에 비해서, LPLAT5 발현주에서는 1.5배, LPLAT6 발현주에서는 2.3배 상승했다. 또한, 아라키돈산 생합성 경로에 있어서의 지방산의 변환율을 보면, LPLAT5 발현주에서는, 18:1→18:2,18:3(n-6)→DGLA, DGLA→ARA의 변환율이 상승하고 있고, LPLAT6 발현주에서는, DGLA→ARA의 변환율이 현저히 상승하고 있었다. 이들의 변환에는, 도 1에서 나타낸 것과 같이, 아실기의 아실-CoA에서 인지질로의 전이 혹은 인지질에서 CoA로의 전이가 필요하며, LPLAT5 및 LPLAT6이 이것에 관여하고 있는 것이 시사되었다.
(4) 리놀레산 첨가 배지에서의 배양
상기 형질전환주를, SC-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에서 30℃, 하루 동안 진탕 배양하고, 그 중 1 ml를, 5 mg/ml 리놀레산 및 0.1% Triton X-100을 포함하는 SG-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에 식균하여, 15℃, 6일간 진탕 배양했다. 집균하여, 수세한 후, 동결 건조하여, 균체의 지방산 분석을 행했다. 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure 112016127872020-pat00005
또한, 표 5의 결과를 바탕으로 아라키돈산 생성 경로에 있어서 어느 지방산이 다음 지방산으로 변환되었는지를 구했다. 표 6에 결과를 나타낸다.
Figure 112016127872020-pat00006
표 5에 나타낸 것과 같이, 총 지방산에 차지하는 아라키돈산의 비율이 대조군에 비해서, LPLAT5 발현주에서는 2배, LPLAT6 발현주에서는 3.5배 상승했다. 또한, LPLAT5 발현주에서는, 첨가한 리놀레산의 비율이 대조군에 비해서 상승하고 있었다. 아라키돈산 생합성 경로에 있어서의 지방산의 변환율을 보면(표 6), LPLAT5 발현주, LPLAT6 발현주 모두 18:3(n-6)→DGLA, DGLA→ARA의 변환율이 상승하고 있고, 특히 LPLAT6 발현주에서 현저히 상승하고 있었다.
(5) γ-리놀렌산 첨가 배지에서의 배양
상기 형질전환주를, SC-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에서 30℃, 하루 동안 진탕 배양하고, 그 중 1 ml를, 5 mg/ml γ-리놀렌산 및 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 SG-Trp,Leu,Ura 액체 배지 10 ml에 식균하여, 15℃, 6일간 진탕 배양했다. 집균하여, 수세한 후, 동결 건조하여, 균체의 지방산 분석을 행했다. 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure 112016127872020-pat00007
또한, 표 7의 결과를 바탕으로, 아라키돈산 생성 경로에 있어서 어느 지방산이 다음 지방산으로 변환되었는지를 구했다(표 8).
Figure 112016127872020-pat00008
표 7에 나타낸 것과 같이, LPLAT5 발현주에서는 첨가한 γ-리놀렌산의 총 지방산에 차지하는 비율이 상승하고 있었다. 그러나, 그 하류의 생성물인 디호모-γ-리놀렌산이나 아라키돈산의 비율은 상승하지 않았다(표 8). 한편, LPLAT6 발현주에서는 아라키돈산의 총 지방산에 차지하는 비율이 대조군에 비해서 2.8배 상승하여, DGLA→ARA의 변환율이 현저히 상승했다(표 8).
이상과 같이, LPLAT5 및 LPLAT6은, 아실기의 아실-CoA에서 인지질로의 전이, 혹은 인지질에서 CoA로의 전이가 필요한 지방산의 변환율을 상승시킬 수 있다. LPLAT5는, 18:1-CoA에서 18:1-PL로의 변환, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하고 있음이 시사되었다. 한편, LPLAT6은, 18:3(n-6)-PL에서 18:3(n-6)-CoA로의 변환 및 DGLA-CoA에서 DGLA-PL로의 변환에 관여하고 있음이 시사되었다.
〔실시예 3〕 LPLAT6의 M. alpina에서의 기능 해석
모르티에렐라 발현 벡터의 구축
어댑터로서, 이하의 올리고뉴클레오티드를 합성했다.
A-1 : GATCCGGCGCGCCGCGGCCGCTCTAGAGTCGACGGCGCGCCA(서열번호 29)
A-2 : AGCTTGGCGCGCCGTCGACTCTAGAGCGGCCGCGGCGCGCCG(서열번호 30)
A-1과 A-2를 어닐링하여, 플라스미드 pUC18을 제한효소 EcoRI와 HindIII로 소화한 것과 연결하여, pUC18-R을 구축했다.
M. alpina 1S-4주로부터 조제한 게놈 DNA 혹은 플라스미드를 주형으로 하여, 이하의 프라이머의 조합으로, ExTaq(타카라바이오)를 이용하여, PCR에 의해 각각의 DNA 단편을 증폭하고, TOPO-TAcloning Kit(Invitrogen)를 이용하여 클론화했다.
구체적으로는, 게놈 DNA를 주형으로 하여,
프라이머 URA5g-F1 : GTCGACCATGACAAGTTTGC(서열번호 31) 및
프라이머 URA5g-R1 : GTCGACTGGAAGACGAGCACG(서열번호 32)의 조합으로, URA5 유전자를 포함하는 게놈 DNA, 약 2 kbp를 증폭하고;
프라이머 GAPDHp-F1 : GTCGACGATCACGTCGGGTGATGAGTTG(서열번호 33) 및
프라이머 GAPDHp-R1 : TCTAGAGATGTTGAATGTGTGGTGTGTG(서열번호 34)의 조합으로, GAPDH 프로모터, 약 0.9 kbp를 증폭하고;
프라이머 GAPDHt-F1 : GCGGCCGCTAAGAAAAGGGAGTGAATCGC(서열번호 35) 및
프라이머 GAPDHt-R1 : GGATCCGGCGCGCCGATCCATGCACGGGTCCTTCTC(서열번호 36)의 조합으로, GAPDH 터미네이터, 약 0.5 kbp를 증폭했다.
또한, 플라스미드 pB-LPLAT6를 주형으로 하여,
프라이머 XbaI-LPLAT6-F1 : TCTAGAATGGAGGCACTCTTGCACCAGG(서열번호 37) 및
프라이머 NotI-LPLAT6-R1 : GCGGCCGCTTACTCAGTCTTGACAGACTTG(서열번호 38)의 조합으로, LPLAT6 유전자 CDS, 약 1.6 kbp를 증폭하고;
프라이머 EcoRV-LPLAT6-F2 : GATATCGGGTAAAGCCTTCCTGGAACG(서열번호 39) 및
프라이머 XbaI-LPLAT6-R2 : TCTAGATTACTCAGTCTTGACAGACTTGGATCG(서열번호 40)의 조합으로, LPLAT6 유전자 CDS 3' 측 약 0.7 kbp를 증폭했다.
더욱이, 플라스미드 pCR-MAΔ5DS를 주형으로 하여,
프라이머 XbaI-Δ5DS-F1 : TCTAGAATGGGTGCGGACACAGGAAAAAC(서열번호 41) 및
프라이머 NotI-Δ5DS-R1 : GCGGCCGCTTACTCTTCCTTGGGACGAAG(서열번호 42)의 조합으로, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자 CDS, 약 1.3 kbp를 증폭하고;
프라이머 NdeI-Δ5DS-R2 : TCTAGATTACTCTTCCTTGGGACGAAG(서열번호 43) 및
프라이머 XbaI-Δ5DS-F2 : CATATGCATCCAGGACATCAACATCTTG(서열번호 44)의 조합으로, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자 CDS 3' 측 약 0.5 kbp를 증폭했다.
플라스미드 pUC18-R의 제한효소 EcoRI, NotI 사이트에, GAPDH 터미네이터를 동일한 제한효소로 잘라낸 단편을 삽입하여, 플라스미드 pUC-GAPDHt를 구축했다. 계속해서, 플라스미드 pUC-GAPDHt를 제한효소 XbaI와 SalI로 절단하고, GAPDH 프로모터를 동일한 제한효소로 잘라낸 단편을 삽입하여, 플라스미드 pUC-GAPDHpt를 구축했다. 플라스미드 pUC-GAPDHpt를 제한효소 SalI로 절단하여, URA5 유전자를 포함하는 게놈 DNA를 동일한 제한효소로 절단한 단편을 삽입했다. 삽입된 방향을 확인하여, URA5 유전자의 방향이, 벡터의 제한효소 사이트 EcoRI→HindIII와 같은 방향으로 삽입되어 있는 것을 플라스미드 pDUraRSC로 했다.
플라스미드 pDUraRSC를 제한효소 XbaI와 NotI로 절단하고, LPLAT6 유전자 CDS를 동일한 제한효소로 잘라낸 DNA 단편을 삽입하여, 플라스미드 pDUraRSC-LPLAT6으로 했다. 플라스미드 pDUraRSC-LPLAT6을 제한효소 EcoRV와 XbaI로 절단하여 얻어진 약 7 kbp의 DNA 단편과, LPLAT6 유전자 CDS 3' 측 약 0.7 kbp를 동일한 제한효소로 잘라낸 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pDUraRSC-LPLAT6-RNAi를 구축했다.
Δ5DS 발현 억제(RNAi) 벡터의 구축
플라스미드 pDUraRSC를 제한효소 XbaI와 NotI로 절단하여, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자 CDS를 동일한 제한효소로 잘라낸 DNA 단편을 삽입하여, 플라스미드 pDUraRSC-Δ5DS를 구축했다. 플라스미드 pDUraRSC-Δ5DS를 제한효소 EcoRI와 NdeI로 절단하여 얻어진 약 1.2 kbp의 DNA 단편과, 제한효소 XbaI와 EcoRI로 절단하여 얻어진 약 5.5 kbp의 DNA 단편, 또한 Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자 CDS 3' 측 약 0.5 kbp를 제한효소 NdeI와 XbaI로 잘라낸 것을 연결하여, 플라스미드 pDUraRSC-Δ5DS-RNAi를 구축했다.
M. alpina 형질전환주의 취득
플라스미드 pDUraRSC-LPLAT6-RNAi 또는 플라스미드 pDUraRSC-Δ5DS-RNAi로, M. alpina로부터 특허문헌(WO2005/019437 「지질 생산균의 육종 방법」) 방법에 따라서 유도한 우라실 요구성 주 Δura-3을 숙주로 하여, 파티클 딜리버리법으로 형질전환을 했다. 형질전환주의 선택에는, SC 한천 배지(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco) 0.5%, 황산암모늄 0.17%, 글루코오스 2%, 아데닌 0.002%, 티로신 0.003%, 메티오닌 0.0001%, 아르기닌 0.0002%, 히스티딘 0.0002%, 리신 0.0004%, 트립토판 0.0004%, 트레오닌 0.0005%, 이소류신 0.0006%, 류신 0.0006%, 페닐알라닌 0.0006%, 한천 2%)를 이용했다.
M. alpina 형질전환주의 평가
각 플라스미드에 의해 형질전환하여 얻어진 약 50주씩을, GY 배지(글루코오스 2%, 효모 엑기스 1%, pH 6.0) 4 ml에 식균하여, 28℃에서 4일간 진탕 배양했다. 배양 종료 후, 균체를 여과에 의해 회수하여, 동결 건조했다. 건조 균체의 일부(약 10-20 mg 정도)를 취하여, 염산메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르로 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 유거하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 하여, 지방산 분석을 행했다. 각각의 플라스미드로 형질전환한 주 중, 디호모-γ-리놀렌산의 조성비가 아라키돈산의 조성비를 상회하는 주, LPLAT6-D#6(플라스미드 pDUraRSC-LPLAT6-RNAi에 의해 형질전환)과 Δ5DS-D#45(플라스미드 pDUraRSC-Δ5DS-RNAi에 의해 형질전환)를 각각 선발했다.
이들 2주와, 대조군(야생주인 M. alpina 1S-4주)을, GY 배지 4 ml, 28℃에서 4일간 진탕 배양했다. 배양 종료 후, 균체를 여과에 의해 회수하여, 동결 건조했다. 건조 균체의 일부(약 10-20 mg 정도)를 취하여, 물리적으로 미세하게 부셨다. 클로로포름:메탄올(2:1) 4 ml를 첨가하여, 때때로 교반하면서, 70℃에서 1시간 유지한 후, 원심 분리하여 상청을 회수했다. 남은 균체에, 또한 클로로포름:메탄올(2:1) 4 ml를 첨가하여, 때때로 교반하면서, 70℃에서 1시간 유지한 후, 원심 분리하여 상청을 앞의 상청과 함께 회수했다. 스피드백 원심 농축 장치에 의해, 지질을 건고시켜, 5 ml의 클로로포름에 용해했다. 이 중, 1 ml를 상기와 같이 건고시켜, 염산메탄올법에 의해 지방산을 메틸에스테르로 유도하여, 지방산 분석을 행했다. 한편, 클로로포름에 용해한 것 중의, 2 ml도 상기와 마찬가지로 건고시켜, 소량의 클로로포름에 용해하여, 전량을 이하의 박층 크로마토그래피에 투입했다. 즉, 실리카겔 60 플레이트(머크), 전개 용매 헥산:디에틸에테르:초산 70:30:1의 조건으로 박층 크로마토그래피를 행하여, 지질을 분획했다. 0.015% 프리뮬린, 80% 아세톤수용액(프리뮬린 용액)을 분무하고, UV 조사에 의해 지질을 가시화하여, 트리아실글리세롤(TG) 분획 및 인지질(PL) 분획에 연필로 표시를 붙이고, 실리카겔을 각각 긁어내어 시험관에 모았다. 염산메탄올법에 의해, 지방산을 메틸에스테르로 유도하여, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 분석했다. 즉, 디클로로메탄 1 ml, 10% 염산메탄올 2 ml를 가하여, 50℃에서 3시간 반응시켜, 지방산을 메틸에스테르로 유도했다. 계속해서, 헥산 4 ml, 물 1 ml를 첨가하여, 격하게 교반한 후, 원심 분리하여, 상층을 분취했다. 스피드백으로 용매를 유거하여, 아세토니트릴에 용해하고 가스 크로마토그래피에 투입하여, 지방산 분석을 했다. 결과를 도 6∼8에 나타낸다.
도 6은 클로로포름:메탄올(2:1)로 추출된 전체 지질 중의 고도 불포화 지방산의 조성비를 도시한다. 대조군에서는, 아라키돈산이 많은 데 대하여, LPLAT6-D#6주와 Δ5DS-D# 45주에서는, 디호모-γ-리놀렌산에서 아라키돈산으로의 변환이 억제되기 때문에, 디호모-γ-리놀렌산과 아라키돈산의 비율은 같은 정도였다. 도 7에, 균체 내의 지질의 대부분을 차지하는 트리아실글리세롤 중의 고도 불포화 지방산 조성비를 도시했다. 균체 내 전체 지질과 마찬가지로 대조군에 비해서, LPLAT6-D#6주와 Δ5DS-D# 45주에서는 디호모-γ-리놀렌산의 조성비가 높아지고 있었다. 한편, 도 8에 도시한 인지질 분획에서는, LPLAT6-D#6주와 Δ5DS-D#45주의 지방산 조성은 크게 달랐다. 즉, Δ5DS-D# 45주에서는, 디호모-γ-리놀렌산의 비율이 높은 데 대하여, LPLAT6-D#6주에서는, 대조군에는 못 미치지만 아라키돈산의 비율이 높고, 또한, 대조군이나 Δ5DS-D# 45주에 비해서 γ-리놀렌산의 비율도 높아지고 있었다.
M. alpina 내에서의 아라키돈산의 생합성 경로는 도 1과 같이 추정되고 있다. 상기한 실험에서도, Δ5 지방산 불포화화 효소는, DGLA-PL에 작용하여, 아라키돈산을 생성하는 것이 강하게 시사되었다. 한편, LPLAT6 발현 억제주에서는, 18:3(n-6)-PL이 축적되었다. 또한, TG 분획의 DGLA 비율은 상승하지만 PL 분획에서는 DGLA 비율의 현저한 상승은 보이지 않았다. 이들로부터, LPLAT6은 M. alpina 내에 있어서, 18:3(n-6)-PL의 18:3(n-6)-CoA로의 변환과 DGLA-CoA의 DGLA-PL로의 변환을 담당하고 있음이 강하게 시사되었다.
배열표 프리텍스트
서열번호 11 : 프라이머
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서열번호 22 : 프라이머
서열번호 23 : 프라이머
서열번호 24 : 프라이머
서열번호 29 : 어댑터 A-1
서열번호 30 :어댑터 A-2
서열번호 31 : 프라이머 URA5g-F1
서열번호 32 : 프라이머 URA5g-R1
서열번호 33 : 프라이머 GAPDHp-F1
서열번호 34 : 프라이머 GAPDHp-R1
서열번호 35 : 프라이머 GAPDHt-F1
서열번호 36 : 프라이머 GAPDHt-R1
서열번호 37 : 프라이머 XbaI-LPLAT6-F1
서열번호 38 : 프라이머 NotI-LPLAT6-R1
서열번호 39 : 프라이머 EcoRV-LPLAT6-F2
서열번호 40 : 프라이머 XbaI-LPLAT6-R2
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서열번호 42 : 프라이머 NotI-Δ5DS-R1
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SEQUENCE LISTING <110> Suntory Holdings, Ltd. <120> Novel lysophospholipid acyltransferase genes <130> FA0038-09149 <140> PCT/JP2010/055244 <141> 2010-03-25 <150> JP 2009-076809 <151> 2009-03-26 <160> 44 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1530 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (1)..(1530) <223> <400> 1 atg cta aac tca ttc ttc ggg acg ctc tcg gag gct gtc tcc ttc cca 48 Met Leu Asn Ser Phe Phe Gly Thr Leu Ser Glu Ala Val Ser Phe Pro 1 5 10 15 gag gat cag ctt cgt tgc ctc tcg gct ctg tta ctc tcc tac cct ctg 96 Glu Asp Gln Leu Arg Cys Leu Ser Ala Leu Leu Leu Ser Tyr Pro Leu 20 25 30 gca ctt gct ttt cgc cta ctg ccc aac aac ccc aac ctt aaa cat act 144 Ala Leu Ala Phe Arg Leu Leu Pro Asn Asn Pro Asn Leu Lys His Thr 35 40 45 gtc tct gtc ctg act tcc ttc ttc ctg atc gtg gtt att gtg gat gat 192 Val Ser Val Leu Thr Ser Phe Phe Leu Ile Val Val Ile Val Asp Asp 50 55 60 ctc gtc gga ttg atg cat ctt ctg gga tcc agc atc gct gtc tgg agg 240 Leu Val Gly Leu Met His Leu Leu Gly 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Gly Ile Asp His Val Val Val Ala Pro Ser Pro Ala Ala Val 210 215 220 Thr Pro Val Arg Glu Lys Thr Pro Ile Ser Phe Gly Arg Asp Ile Ala 225 230 235 240 Leu Pro Gln Leu Pro Thr Leu Ala Glu Thr Ile Gly Tyr Ala Phe Phe 245 250 255 Pro Phe Ala Phe Leu Val Gly Pro Gln Phe Ser Phe Ser Leu Tyr Lys 260 265 270 Lys Phe Ile Ser Met Glu Leu Phe Asn Val Pro Val Pro Ala Ser Ala 275 280 285 Gly Arg Asp Glu Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Asn Gly Ile 290 295 300 Pro Gln Gly Ser Leu Arg Tyr Ala Leu Arg Cys Phe Ser Leu Gly Val 305 310 315 320 Phe Tyr Leu Gly Leu Gly Gln Val Leu Gly Gly Tyr Phe Pro Thr Ala 325 330 335 Ala Leu Leu Gly Lys Ala Phe Leu Glu Arg Ser Tyr Leu Glu Lys Val 340 345 350 Phe Ile Phe Trp Trp Thr Gly Lys Thr Val Leu Asn Lys Tyr Leu Gly 355 360 365 Ile Trp Thr Ile Ala Glu Gly Pro Cys Val Leu Ser Gly Ile Thr Phe 370 375 380 Asn Gly Tyr Asp Ala Gln Gly Arg Pro Glu Trp Asp Gly Leu Arg Asn 385 390 395 400 Val Asn Pro Leu Asn Tyr Glu Phe Ala Thr Ser Leu Thr Gln Ile Val 405 410 415 Thr Ser Phe Asn Met Asn Thr Asn Phe Trp Ala Lys Leu Tyr Ile Phe 420 425 430 Lys Arg Leu Arg Phe Leu Gly Asn Lys Asn Leu Ser Ala Leu Gly Val 435 440 445 Leu Leu Phe Leu Ala Ile Trp His Gly Thr His Ile Gly Tyr Phe Phe 450 455 460 Cys Phe Gly Leu Glu Phe Met Asp Met Glu Thr Glu Arg Arg Leu Ser 465 470 475 480 Val Arg Phe Gly Arg Pro Ile Asn Ala Phe Ile Ala Arg Gln Gln Gly 485 490 495 Val Ser His Ala Ile Leu Lys Ala Val Trp Gly Val Ile Thr Trp Leu 500 505 510 Leu Thr Thr Ser Ala Leu Tyr Phe Ala Ala Val Pro Phe Asp Leu Leu 515 520 525 Gln Met Asp Lys Ser Leu Ala Ala Ile Arg Ala Ile Asn Tyr Leu Gly 530 535 540 Ile Tyr Val Met Ala Gly Leu Leu Phe Leu Asp Ile Ala Leu Ser Val 545 550 555 560 Val Met Pro Lys Lys Arg Ser Lys Ser Val Lys Thr Glu 565 570 <210> 8 <211> 1722 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 8 atggaggcac tcttgcacca ggttcatgac acctacctgc ccgcttggtt cggacccaaa 60 cccccggcgg cttttctcga ctatggtctg acccagtccc taagcgaggc ctcgggcatt 120 cccgaaccct cgctgcgtct actcatgacg atcctggcgg gttacccagt 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ccgccagatc 540 tcgttcttgc acgtctacca ccacagctcc atcttcacca tctggtggtt ggtcaccttt 600 gttgcaccca atggtgaagc ctacttctcg gctgcgttga actcgttcat ccacgtgatc 660 atgtacggct actacttcct gtccgccttg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc 720 tacatcacgc gttcgcagat gacgcagttc tgcatgatgt cgatccagtc ctcctgggac 780 atgtatgcca tgaaggtgct tggccgcccc ggatacccct tcttcatcac cgccctgctt 840 tggttctaca tgtggaccat gctcggactc ttctacaact tctacagaaa gaacgccaag 900 ttggccaagc aggccaagat cgatgctgcc aaggagaagg caaggaagtt gcagtaa 957 <210> 28 <211> 1341 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 28 atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag 60 gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt 120 catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt 180 gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca 240 ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag 300 ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc 360 tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt 420 gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt 480 gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac 540 aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat 600 ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct 660 gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg 720 ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc 780 aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt 840 gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc 900 tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt 960 accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt 1020 gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca 1080 gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc 1140 acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac 1200 taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc 1260 gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt 1320 cttcgtccca aggaagagta a 1341 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adoptor A-1 <400> 29 gatccggcgc gccgcggccg ctctagagtc gacggcgcgc ca 42 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adoptor A-2 <400> 30 agcttggcgc gccgtcgact ctagagcggc cgcggcgcgc cg 42 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer URA5g-F1 <400> 31 gtcgaccatg acaagtttgc 20 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer URA5g-R1 <400> 32 gtcgactgga agacgagcac g 21 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDHp-F1 <400> 33 gtcgacgatc acgtcgggtg atgagttg 28 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDHp-R1 <400> 34 tctagagatg ttgaatgtgt ggtgtgtg 28 <210> 35 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDHt-F1 <400> 35 gcggccgcta agaaaaggga gtgaatcgc 29 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GAPDHt-R1 <400> 36 ggatccggcg cgccgatcca tgcacgggtc cttctc 36 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer XbaI-LPLAT6-F1 <400> 37 tctagaatgg aggcactctt gcaccagg 28 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NotI-LPLAT6-R1 <400> 38 gcggccgctt actcagtctt gacagacttg 30 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer EcoRV-LPLAT6-F2 <400> 39 gatatcgggt aaagccttcc tggaacg 27 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer XbaI-LALAT6-R2 <400> 40 tctagattac tcagtcttga cagacttgga tcg 33 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer XbaI-delta5DS-F1 <400> 41 tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaac 29 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NotI-delta5DS-R1 <400> 42 gcggccgctt actcttcctt gggacgaag 29 <210> 43 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer NdeI-delta5DS-R2 <400> 43 tctagattac tcttccttgg gacgaag 27 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer XbaI-delta5DS-F2 <400> 44 catatgcatc caggacatca acatcttg 28

Claims (6)

  1. 이하의 (a)∼(d) 중 어느 하나에 기재한 핵산:
    (a) 서열번호 1로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 핵산,
    (b) 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열로 이루어지는 핵산,
    (c) 서열번호 4로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 핵산,
    (d) 서열번호 5로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 핵산.
  2. 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
  3. 제1항에 기재한 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
  4. 제3항에 기재한 재조합 벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체.
  5. 제4항에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터, 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 지방산 조성물의 제조 방법으로서, 상기 지방산 조성물 중의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율이, 비형질전환체인 숙주를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물의 아라키돈산 비율보다도 높은 것을 특징으로 하는, 지방산 조성물의 제조 방법.
  6. 제3항에 기재한 재조합 벡터를 이용하여, 그 벡터가 도입된 숙주의 지방산 조성에 있어서의 아라키돈산의 비율을, 그 벡터를 도입하고 있지 않은 숙주의 지방산 조성에 있어서의 비율보다도 높게 하는 방법.
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