KR101734871B1 - 진균 감염 치료용 신규 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 현탁액에서 콜레스테롤 함유 암포테리신 B를 포함하는 진균 감염을 치료하기 위한 신규 제제에 관한 것이다.

Description

진균 감염 치료용 신규 제제{A NOVEL FORMULATION FOR TREATING FUNGAL INFECTIONS}
본 발명은 나노좀 시스템(nanosomal system)에 기반한 신규의 약물 전달 시스템에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 염수(saline)에 현탁된 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 시료를 냉동전자현미경(cryoEM)을 이용하여 연구하였다. 새로운 시료 및 2년 된 시료를 초음파 처리하지 않은 상태에서 분석하고 초음파 처리 후에 분석하였다. cryoEM 이미지 분석은 크기 분포 및, 라멜라성(lamellarity; 단일 라멜라 대(對) 다층 라멜라) 및 응집(aggregation)과 같은 전체적인 형태를 포함하였다.
면역 결핍 및 면역 적격 환자에 있어서 상이한 속의 효모균 및 피부사상균에 의한 전신성 및 국소적 진균증의 증가하는 발생은 중요하고 불충분하게 해결된 의학적 문제로 남아있다. 이에 따른 사망률 및 놀라운 장기 질병률이 크게 주목을 받고 있다. 지금까지 개발된 모든 약물에 있어서, 작용범위가 제한되고, 약효가 불충분하고, 적당한 제형이 제한되고, 약물 부작용이 있고, 생명을 위협하는 독성이 있는 문제가 있고 아주 가끔은 상기 문제들의 일부 또는 전부를 조합한 문제가 있어왔다. 항생제의 폴리엔 아미노글리코시드기는 가장 유망한 광범위한 적용범위 및 약효가 있는 것으로 나타났다. 그러나, 이들 화합물 대부분이 갖는 독성이 이들 화합물을 치료제에 포함시키는 것의 장애요인이었다.
암포테리신 B는 데옥시콜린산 나트륨 미셀 현탁액, 리포좀, 지질 복합체 및 지질 콜로이드 분산액과 같은 여러가지 제제가 모두 다양한 정도까지 생명을 위협하는 신장독성을 포함한다는 사실에도 불구하고 광범위하게 임상적으로 사용되어온 유일한 폴리엔 마크로라이드계 항생제였다.
암포테리신 B를 제제화하는 목적은 신장독성을 제거하고, 안정한 제제를 만들고, 저투여량에서 효과를 확보하고, 고투여량에서도 독성 및 약물 부작용을 제거하는데 있다.
암포테리신 B 제제를 설명하는 다수의 허여 및 출원된 특허 및 간행물이 존재한다. 후술하는 4개의 제제를 제외한 다른 제제는 사용할 수 없었는데 이는 이러한 다른 제제를 충분히 신장/안정적으로 만들 수 없었기 때문이다.
모든 알려진 암포테리신 B 제제에 있어서, 그 구성 성분은 인지질/지질과 안정화제의 기다란 선택목록으로부터 선택된다. 암포테리신 B는 염수에서 침전하는 것으로 알려져 있기 때문에 어떠한 제제도 염수에 주입되지 않는다.
1. 통상적인 암포테리신 B: 5% 덱스트로스에 현탁된 암포테리신 B - 데옥시콜레이트 콜로이드 현탁액
효능: 33%, 신장독성: 67%
암포테리신 B는 수성 매질에서 불용성이다. 상기 문제는 1950년대 후반 데옥시콜레이트에 암포테리신 B를 용해시키고 물에 용해된 5% 덱스트로스 내 미셀 현탁액으로 제형화함으로써 미미하게 극복되었다. 암포테리신 B는 NaCl에 침전하므로, 데옥시콜레이트에 용해된 암포테리신 B는 NaCl에서 제조되지도 않았고 염수에 희석되지도 않았다. 또한, 이러한 현탁액은 제제에 안정성을 부여하기 위하여 동결건조되었다.
2. 5% 덱스트로스에 희석된 리포좀 암포테리신 B
효능: 77%, 신장독성: 20%
완충액으로서 4.5% 수크로스 및 디소듐 숙시네이트 헥사히드레이트에 용해된 소야 수소화 포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 콜레스테롤 및 알파 토코페롤의 조합으로 이루어진 리포좀 암포테리신 B는 인지질, 스테롤, 막 안정화당 및 이들의 다양한 비율의 다수의 조합으로부터 선택되었다. 막 안정화 수크로스의 사용에도 불구하고, 이러한 제제는 불안정성을 극복하기 위해 동결건조되었다. 이러한 리포좀 암포테리신 B 제제는 염수에 침전하는 것으로 보고되므로 염수에 희석하거나 염수에 접촉시키는 것은 강력하게 금지된다.
미국특허 제 4766046호는 아래와 같이 기재하고 있다.
암포테리신 B 리포좀의 크기 및 불안정성으로 인해, 몇 주의 보관 기간에 걸쳐서 유의적인(몇 배) 크기의 증가없이 작은 직경의 암포테리신 B 리포좀을 제조 및 보관하는 것이 가능하지 않았다. 따라서, 리포좀 크기와 관련 있는 상이한 생체내 리포좀 흡수 및 약물 방출 및 독성 특성 때문에, 보관된 암포테리신 B 리포좀의 치료 지수를 제어 및 평가하는 것은 어려웠다. 상기 크기 불안정성 문제는 1-2 미크론보다 큰 리포좀의 경우 특히 심각한데, 이는 콜레스테롤 함유 암포테리신 B 리포좀이 더 작은 본래 크기 리포좀보다 실질적으로 독성이 더 있기 때문이다. 상기 크기 안정성 문제는 제제화후에 즉시 리포좀을 투여하는 것에 의해서만 해결되어 왔다. 물론, 이는 일반적인 임상 환경에서는 약물 전달에 대한 비현실적인 접근방법이다.
3. 5% 덱스트로스에 희석된 암포테리신 B 지질 복합체
효능: 34%, 신장독성: 63%
상기 제제는 암포테리신 B, 합성 인지질, 즉 디미리스토일포스파티딜콜린 및 디미리스토일포스파티딜글리세롤로 이루어진다. 상기 수성 현탁액은 투여 전에 5% 덱스트로스에 희석된다. 통상적인 암포테리신 B와 비교하여 효능 및 독성 프로파일이 전혀 개선되지 않는다.
4. 5% 덱스트로스에 희석된 암포테리신 B 콜로이드 분산액
효능: 46%, 신장독성: 40%
트로메타민, 디소듐 에덴테이트 디히드레이트 및 락토오스 모노히드레이트 HCl과 함께 동결건조된 암포테리신 B 및 소듐 콜레스테릴 설페이트.
암포테리신 B 지질 제제에 존재하는 글루코스는 국소 적용 제제의 이로운 효과를 현저히 감소시킨다. 글루코스의 억제 기작은 글루코스에 의해 도입된 고점도와 관련이 있거나 콜로이드 입자의 지질/물 계면상의 글루코스에 의해 도입된 변화와 관련이 있는 것으로 보인다(Crowe JH 외, 1988 Biochem. Biophys Acta. 947:367-384). 리포좀 암포테리신 B의 최상의 치료 성공률도 본 발명의 경우보다 낮은 77%이다.
따라서, 본 발명에서는 덱스트로스를 염수로 대체하여 암포테리신 B 신장독성을 감소시키고자 하였다. 염수가 암포테리신 B1-4의 침전을 유발한다는 잘 알려지고 문서화된 사실을 고려하여, 지질 조성 및 지질: 약물 비를 특이하게 디자인하여, 나노좀 내의 암포테리신 B가 나노좀 약물의 침전을 방지하기 위하여 고정된다는 것을 확인하였다.
본 발명의 목적은 신장독성이 감소된 염수 현탁액에서 안정화된 콜레스테롤 함유 나노좀(nanosome)의 신규 제제를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 향상된 항균 활성을 가지는 염수 현탁액에서 안정화된 콜레스테롤 함유 나노좀의 신규 제제를 제안함에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 매우 안정한 염수 현탁액에서 안정화된 콜레스테롤 함유 나노좀의 제제를 제안함에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 독성이 적은 염수 현탁액에서 안정화된 콜레스테롤 함유 나노좀의 신규 제제를 제안함에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 암포테리신 B의 투여량이 매우 적음에도 불구하고 높은 항감염 활성을 보이는, 염수 현탁액에서 안정화된 콜레스테롤 함유 나노좀의 신규 제제를 제안함에 있다. 본 발명의 또다른 목적은 더 적은 암포테리신 B 투여량에도 더 높은 항감염 활성을 나타내도록 최적화되고, 나아가 신장/독성을 최소화하는 것을 목적으로 한 다양한 용도의 신규 제제 및 정맥 내, 안 내 및 국소 등과 같은 다양한 용도를 위한 안정한 제제를 제안함에 있다.
본 발명은 현탁액 내에 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B를 포함하는, 진균 감염을 치료하기 위한 신규 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 염수 현탁액에서 안정화된 콜레스테롤 함유 나노좀의 신규 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
도 1은 새롭고 초음파처리된 리포좀 시료(A) 및 2년된 초음파처리된 리포좀 시료(B)의 cryoEM 이미지. 두 개의 막 층을 갖는 리포좀(백색 화살표) 및 양파형 구조를 갖는 리포좀(흑색 화살표). 스케일 바는 200 nm를 나타낸다.
도 2는 더욱 큰 단일 라멜라 리포좀(흑색 화살표)내에 포착된 단일 라멜라 리포좀을 보여주는 새롭고 초음파처리된 리포좀 시료(A) 및 2년된 초음파처리하지 않은 리포좀 시료의 cryoEM 이미지. 스케일 바는 200 nm를 나타낸다.
도 3은 (a) 0.5 시간에서 통상적인 암포테리신 B 크림, (b)1.0 시간에서 통상적인 암포테리신 B 크림, (c) 2.0 시간에서 통상적인 암포테리신 B 크림, (d) 0.5 시간에서 나노좀 암포테리신 B 제제, (e) 1.0 시간에서 나노좀 암포테리신 B 제제, 및 (f) 2.0 시간에서 나노좀 암포 테리신 B 제제의 도포후 피부의 횡단면이다.
용액에서 농도는 주사액 및 주입액 또는 어떤 다른 액상 투여 형태의 경우에 일반적으로 수성인 용매의 단위 체적당 용질의 분자수이지만, 콜로이드 현탁액과 같은 현탁액을 포함한 입자상 제제의 경우에 약물의 유효 농도는 약물 담체 입자의 수에 의해 결정된다. 이러한 담체는 지질, 단백질 또는 다른 주사, 경구 또는 흡입, 경피 제제용 등의 생분해성 담체 및 국소 제제용 비생분해성 담체의 다양한 나노 또는 마이크로 크기의 조립체이다. 본 발명에 있어서, 나노좀은 약물의 단위 량에 대한 약물 함유 나노좀의 수를 증가시켜서 투여전 나노화를 이용하여 보완하여 최적의 효능을 달성하기 위하여 약물에 대한 지질의 비가 최적으로 높다.
입자 크기에 따른 자질: 약물의 비의 최적화는 제조 후 및 투여 전에 제제내 API의 담체 입자의 수를 증가시켜서 활성 제약의 유효 농도를 증가시키는 본 발명의 새로운 개념에 기반한다. 이는 지질 함유 제제의 입자 크기를 감소시킴으로써 달성된다. 상기 제제에서, 약물에 대한 지질의 비가 최적으로 높기 때문에, 약물의 mg 당 입자의 수는 더욱 많다. 현탁액에서 약물의 유효 농도는 더욱 높기 때문에, 더욱 많은 수의 분자가 신체에서 균일하게 분포한다. 이는 치료적 투여량의 요건을 감소시키게 된다. 예를 들어 암포테리신 B와 같은 API는 높은 투여량에서 독성이 있기 때문에, API의 요건을 감소시키면 동물/환자에 대한 독성이 자동적으로 감소되어 약물 제제가 더욱 안전하게 된다.
입자상 제제내의 API는 담체 입자들의 다수의 층에 캡슐화된다. 소수성/친유성 약물은 지질 나노좀의 지질 이중층에 삽입된 채로 남아있기 때문에, 이러한 나노좀의 단편화 또는 파괴시에도 수성 생체내 환경에서 방출되지 않는다. 지질 나노좀내에 캡슐화된 이러한 약물은 나노좀의 표면으로부터 표적 세포 표면에 전달된다. 이러한 경우, 나노좀의 내측 라멜라에 캡슐화된 약물은 치료적으로 이용되지 않아서, 궁극적으로는 세망내피계의 세포에 의해 포식되고 생체내 치료 사슬로부터 배출된다. 내측 라멜라에서 약물의 누적적인 캡슐화는 나노좀 표면의 라멜라의 경우보다 몇 배 더 높다. 다중 라멜라 나노좀의 모든 라멜라가 분리되어 새로운 작은 다중 라멜라를 형성하는 경우, 상기 약물을 캡슐화하는 내측 라멜라는 나노좀의 라멜라를 노출시키는 외측 약물로 전환되고, 상기 약물의 유효 농도는 이러한 혼합 라멜라 제제에 API를 첨가하지 않고도 증가하는 것으로 예상될 수 있다. 더욱 높은 치료 효능을 증가시키기 위한 더욱 높은 유효 농도를 제공하기 위한 이러한 최적화는 혼합 라멜라 마이크로 및/또는 나노좀을 환자의 침대곁에서 초음파 파쇄함으로써 가능하게 된다. 상기 혼합 라멜라 집단으로부터 각각의 입자는 몇 개의 라멜라로 전환되는 몇 개의 라멜라를 이용한다. 나노좀의 수를 증가시킴으로써, 담체 입자중의 대부분의 API는 표면과 접촉하여 약물 운반 나노좀의 수의 증가에 비례하여 치료 효능을 배가시킨다. 본 발명에 있어서, 지질:약물의 비는 아래의 표에서 나타낸 바와 같이 45:1 내지 45:15의 범위이다.
상이한 지질 제제의 형상 및 크기
제품 유형 형상 크기 지질:약물 투여량 신장 독성
염수 내 나노좀 암포테리신 B 나노좀 둥근형 0.02-0.2 ㎛ 45:1 1-3 mg/kg 2%
AmBisome 리포좀 둥근형 0.08-0.1 ㎛ 7:1 3-5 mg/kg 10-20%
Abelect 지질 복합체 리본형 2-5 ㎛ 1:1 5 mg/kg 42-63%
Amphotec 콜로이드 분산액 디스크형 0.12-0.14 ㎛ 1:1 4-6 mg/kg 25-40%
지질 기질:약물의 비가 높을수록 약물의 mg당 리포좀의 수가 많다.
나노화 공정( Nanofication process )
초음파 처리기를 이용하여 본 발명에 따른 약물의 베드사이드(bedside) 나노화를 수행하기 위한 새로운 방법이 개발되었다. 상기 기구는 핸드 프리 작동(hand free) 작동이 가능하고, 입자를 더욱 작은 라멜라 나노좀으로 전환함으로써 후술하는 기작을 통해 치료 효능을 최적으로 증가시킨다.
염증 부위에서, 모세관은 천공을 형성하고 더욱 투과적이 되어, 세포 및 입자상 물질이 순환혈류로부터 주변 염증 부위로 이동하거나/크로스오버하는 것을 가능하게 한다. 천공형성에 의해 염증 부위로 입자상 물질내 약물 전달을 강화하는 것은 더 큰 담체 입자를 나노좀으로 전환함으로써 촉진될 수 있다. 나노화 결과, 표적 부위에서 약물 함유 나노좀 농도의 수의 증가로 인해 치료 효능이 증가된다.
나노화의 또 다른 중요한 용도는 세망내피계의 식세포에 의한 더욱 큰 입자의 손실을 감소시키는 것이다. 더욱 큰 입자는 포착 세포에 의해 외래 입자로서 신속하게 확인되어 순환계로부터 신속하게 포식 제거된다. 포식 속도는 약물 운반 입자의 크기에 반비례한다. 따라서, 큰 다층 라멜라 입자를 나노좀으로 전환하여 크기를 감소시키면 혈장 반감기가 증가되고 포식 손실을 지연시켜서 치료 효능을 더욱 증가시킨다.
본 발명은 나노좀 시스템에 기반한 새로운 약물 전달 시스템의 기술들의 어레이를 이용하는 제어 방출 제약에 관한 것이다. 본 발명에서, 염수에서 나노좀 암포테리신 B를 함유하는 콜레스테롤의 시료를 냉동전자현미경(cryo-EM)을 이용하여 연구했다. 새로운 시료 및 2년된 시료를 초음파 처리하지 않은 상태에서 분석하고, 초음파 처리 후에도 분석하였다. cryoEM 이미지의 분석은 크기 분포 및, 라멜라성(lamellarity; 단일 라멜라 대(對) 다층 라멜라) 및 응집(aggregation)과 같은 전체적인 형태를 포함하였다.
하기의 구체적인 의문이 해결되었다: 크기분포, 전체적인 형상 특성.
염수에 현탁된 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 새롭거나 2년된 시료를 cryoEM를 이용하여 이미지화했다. 상기 시료를 10 배 희석하고, 초음파처리하지 않은 상태에서 이미지화하고 45분의 초음파 처리 후에 이미지화했다. 초음파 처리는 시료를 8 ℃ 미만의 온도로 유지하는 얼음중탕에서 수행했다.
크기 분포
희석된 나노좀 시료의 cryoEM은 다양한 형상 및 크기의 입자를 갖는 매우 불균일한 시료를 보여주었다. 입자 크기는 직경이 20 nm에서 마이크로미터까지 다양했다. 예상할 수 있는 바와 같이, 초음파처리하지 않은 시료와 비교할 때, 초음파처리한 시료에서는 20-200 nm의 더욱 작은 직경을 갖는 다량의 나노좀을 확인할 수 있었다. 초음파 처리의 경우뿐 아니라 초음파 처리하지 않은 경우에 있어서도 새로운 시료와 오래된 시료 사이에 cryoEM 이미지의 분명한 차이는 관찰될 수 없었다. 상기 시료가 이러한 넓은 분포의 크기 및 형상을 갖는 입자를 포함하고 있었기 때문에, 평균 직경을 계산 및 제시하는 것은 관련이 없고 잘못된 정보만을 주게 될 것이다.
전체적인 형상
cryoEM에 의해 이미지화한 나노좀은 약 7 nm의 두께를 갖는 잘 정의된 막을 보여주었다. 나노좀이 서로 거의 항상 접촉 상태에 있는 초음파처리하지 않은 시료와 비교할 때, 초음파 처리한 시료는 서로 분리된 입자로 보이는, 더욱 더 작은 나노좀을 보여주었다. 오래되거나 새로운 시료 모두의 경우에 있어서 초음파처리하지 않은 입자의 가장 바깥쪽 막은 종종 하나 이상의 리포좀을 둘러싸서, 인접하는 나노좀 간 구별을 어렵게 만들었다.
라멜라성 (lamellarity)
cryoEM은 나노좀이 단일 라멜라 및 다층 라멜라로서 나타남을 보여주었다. 초음파처리하지 않은 시료와 비교하여 초음파처리한 시료의 경우에 더욱 많은 단일 라멜라 나노좀이 확인되었다. 다층 라멜라 입자를 둘러싸는 막 층들의 수는 2 개의 라멜라 내지는 10 개 이상의 막 층을 갖는 양파형 구조에 이르기까지 다양했다. 또한, 막들이 서로 근접 거리에 있지 않은 경우, 큰 입자가 하지 않는 더 작은 입자들을 포착하고(entrap) 있는 것처럼 보인다. 그러나, 얼음 두께를 통해 이러한 포착된 나노좀은 z-축을 따라 공간적으로 위치하는 것이 가능하다.
응집
cryoEM은 어느 시료에서도 많은 삼차원적인 나노좀 응집체를 나타내지 않았다. 초음파처리하지 않은 시료 내의 입자는 주로 서로 밀착되어 있었고, 가장 바깥쪽의 층(들)을 공유하고 있었기 때문에 하나의 나노좀의 말단과 또 다른 것의 시작부를 구별하는 것이 종종 어려웠다.
결론
나노좀 시료는 형상이 다양하고 직경이 20 nm 내지 마이크로미터의 범위인 입자들을 갖는 매우 불균일한 시료를 나타냈다. 초음파처리하지 않은 시료와 비교하여 초음파 처리한 시료의 경우에 20-200 nm의 더 작은 직경을 갖는 단일 라멜라 나노좀이 훨씬 더 자주 보였다. 이는 초음파가 초음파처리하지 않은 시료내 확인된 큰 다층 라멜라 입자들을 작은 단일 라멜라 나노좀으로 효과적으로 파괴하기 때문인 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 초음파 처리한 시료 내에서 약간의 큰 다층 라멜라 리포좀이 여전히 관찰되었고, 이들은 초음파처리하지 않은 시료 내의 큰 다층 라멜라 입자들과 비교할 때 보다 잘 분리되었다. 초음파 처리 시간을 연장시킨 결과, 큰 입자들이 더욱 완전히 파괴된다.
초음파 처리한 시료 또는 초음파 처리하지 않은 시료를 비교할 때, 오래된 시료와 새로운 시료 사이에 명백한 시각적 차이는 없었다.
AmB 신장독성을 감소시키는데 있어서 염수의 중요성
투여량 관련 독성, 특히 신장독성은 암포테리신 B의 비경구 투여에 있어서 주요한 장애 요인이었다. 암포테리신 B는 스테롤 풍부 막에 결합하고 자기 조립 공극 형성을 받아서 세포의 파쇄를 유도하는 것으로 알려져 있다. 콜레스테롤 함량이 풍부한 신장 및 콜레스테롤에 고친화성을 갖는 암포테리신 B와 같은 폴리엔 마크로라이드계 약물은 이러한 화합물의 치료제로서의 사용을 제한하는 복잡한 시나리오를 제시한다. 콜레스테롤 함유 지질 제제내에 암포테리신 B를 캡슐화하는 것은 충분한 이점이 없다(하기 표 2 참조).
암포테리신 B 제제 신장독성 1 (%)
리포좀 Amp B 10-20
Amp B 콜로이드 분산액 25-40
암포테리신 B 지질 복합체 42-63
암포테리신 B 데옥시콜레이트 34-602
또한, 염수 현탁액 형태로 제제화하여 암포테리신 B 독성을 극복하기 위한 치료법은 달성되고 있지만, 종전과 같이 암포테리신이 염수에 침전하는 것으로 알려져왔다. 본 발명에서, 암포테리신 B를 이동을 방지하여 침전을 방지하기 위해 콜레스테롤 함유 기질에 고정시켰다. 본 발명의 산물로서, 염수에 현탁된 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 현탁액은 신장 독성을 현저하게 저하시킨다.
에르고스테롤 함유 나노좀은 더욱 높은 농도의 암포테리신 B를 허용하고 리슈만편모충증의 치료에만 값어치가 있겠지만, 본 발명에서 제공되는 바와 같이 염수 현탁액 내의 나노좀 암포테리신 B 내에서 에르고스테롤을 콜레스테롤로의 교체는 효모, 곰팡이, 피부사상균 및 리슈만편모충에 대한 강력한 활성을 위해 필요한 것이다.
현탁 매질로서 염수를 포함하는 본 발명은 암포테리신 B에 의해 야기되는 신장 기능 저해, 즉 요독증이 신사구체 여과속도(GFR) 및 신장 혈류의 감소, 농축 능력의 감소, 소변 산성화의 변경 및 칼륨 소모와 관련이 있다는 가설에 기반한다. 암포테리신 B의 신장독성은 생물학적 막에서 그의 이오노포어(ionophore) 특성과 관련이 있다. (Schell R E: Amphotericin B induced nephrotoxicity: Influence of Sodium Status (Letter). Nephron 1992; 60:52).
신사구체 독성은 암포테리신 B의 단독 투여 후에 빠르게 발생할 수 있거나 환자의 수화 상태 및 신기능에 따라 수주 내지 수일의 암포테리신 B 요법후 느리게 발생할 수 있다. 나트륨 로딩이라고 알려진 방법인 암포테리신 B 주입 전후에 염수를 정맥내 투여하는 것은 암포테리신 B에 의한 신사구체 여과 속도의 감소를 둔화시킨다(R Sabra & R A Branch (1991) Mechanism pf Amphotericin B- Induced Decrease in Glumerular Filtration Rate in Rats. Antimicrobial Agents and Chemotherapy: 35; 2509-2514).
LD 50
약물에 대한 지질의 비를 증가시키고 염수를 이용하여 나노좀을 현탁한 결과 나노좀이 매우 안전하게 되었다. 동물 예비임상 독성 연구 동안에, 동물이 60 mg/kg까지 죽지않았고 60 mg/kg 이상은 투여될 수 없었기 때문에 LD50은 측정할 수 없었다. 이러한 나노좀은 현턱액을 이용하는 것이 적합하기 때문에, 농축 투여 형태로 투여될 수 없고 동물은 60 mg의 투여량에 대한 것보다 더욱 높은 용적에 내성이 없을 수 있다. 리포좀 암포테리신 B에서와 같이 염수가 없는 콜레스테롤(Ambisome 독성/조성 기준이라함) 뿐 아니라 암포테리신 B 지질 복합체의 경우처럼 콜레스테롤이 없는 염수(Abelcet 독성/조성 기준이라함)는 콜레스테롤 함유의 높은 지질 대 약물 비의 나노좀 염수현탁액의 독특한 조성처럼 신장 독성을 유의적인 수준으로 감소시킨다. 염수에 현탁된 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 시험관내 효과는 효모와 곰팡이의 다수의 임상 분리물에 대하여 통상적인 암포테리신 B 보다 아주 많이 높았다(약 10 배 높음; MIC는 많이 낮음). 활성이 더 높은 이유는 이들 나노좀뿐 아니라 진균 막이 유사하고 바람직한 수-지방친화성 환경을 가져서 나노좀으로부터 진균으로 분자의 전달이 용이하기 때문이다.
콜레스테롤 & 염수에서 나노좀의 안정화
어떠한 다른 막 안정화제 없이 염수내에서 콜레스테롤 함유 암포테리신 B 나노좀의 안정성은 본 발명의 새로운 조성물에 의해 가능하게 되었다. 본 발명의 나노좀 암포테리신 B는 그 자체가 제조일로부터 24개월 이상 안정하다. 따라서, 콜레스테롤 및 염수가 조성물의 안정성을 증가시키는데 있어서 주요한 역할을 한다는 것이 명백하다.
실시예
실시예 1 : 1-15 mg 약물 캡슐화
염수에 현탁된 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B에 있어서, 염수(NaCl) 0.89 ml 당 상이한 양, 즉 1-15 mg의 암포테리신 B를 지질의 양을 증가시키지 않고 성공적으로 삽입시켰다. 따라서, 1-15 mg/ml의 암포테리신 B 제제 각각의 경우, 지질의 양은 45 mg으로 고정된다. 즉, 지질 대 약물의 비가 45:1 내지 45: 15의 범위이다.
혁신적인 제제의 "나노좀내의 약물: 지질 비" 및 "상청액내 암포테리신 B"의 측정 결과는 다음과 같다:
Figure 112011017996211-pct00001
암포테리신 B의 분석 및 잔류 메탄올 함량을 측정하여 그 결과를 아래에 나타낸다:
관찰결과:
(A) 상청액에서 암포테리신 B의 측정
모든 시료를 원심분리하고 상청액을 취해 암포테리신 B에 대한 분석을 수행했다. UV 가시 분광분석계를 이용한 405 nm의 판독 결과는 상청액에서 암포테리신 B가 없어서 무시될 수 있는 것으로 확인되었는데, 이는 상기 혁신적인 제제에 캡슐화되지 않은 암포테리신 B가 없다는 것을 나타낸다.
(B) 나노좀에서 약물: 지질의 비
상기 제제의 나노좀에서 약물: 지질의 비를 측정하여 그 결과를 하기에 나타낸다:
Figure 112011017996211-pct00002

실시예 2 : 덱스트로스 현탁액과 비교한 염수내 나노좀 암포테리신 B의 상대적 신장독성
암포테리신 B의 고유한 신장독성은 광범위한 범위의 효력있는 항균제의 완전한 가능성을 방출하는데 있어서 주된 장애 요인이었다. 전술한 바와 같이, 약물 작용에 대한 덱스트로스의 알려진 단점 및 염수의 이점의 가능성에도 불구하고, 암포테리신 B가 염수에 침전하는 것으로 알려져 있기 때문에 덱스트로스는 염수로 대체될 수 없었다. 이러한 나노좀 암포테리신 B의 독특한 디자인은 나노좀 기질에 암포테리신 B를 고정함으로써 염수 현탁액에서 안정한 제제를 가능하게 하였다. 덱스트로스 대 염수의 신장 독성을 평가하기 위하여, 하기의 실험을 수행하였다.
각 그룹당 6 마리 수컷 및 6 마리 암컷으로 이루어진 두 그룹의 스위스 알비노 마우스를 이용하여 실험을 수행했다. 한 그룹에는 염수 제제를 투여하고, 다른 그룹에는 덱스트로스를 매일 3 mg/kg의 투여량으로 처음 8일간 투여한 다음, 9일 및 10일째에는 5 mg/kg/day의 투여량으로 투여했다. 각 그룹의 동물수의 절반으로부터 격일로 혈액을 수집하고 2 일 내지 11일까지 매일 혈청 크레아티닌을 측정했다.
개개의 동물 임상 화학 데이터 - 5% 덱스트로스내의 나노좀 암포테리신 B - 투여량: 3 mg/kg/day; 8일 이후는 5 mg/kg/day
동물번호 크레아티닌 (mg/dl)
일
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Mb4941 0.30 0.25 0.17 0.22 0.11 0.25 0.12
Mb4942 0.28 0.17 0.25 0.12 0.23 0.17 0.19
Mb4943 0.16 0.15 0.13 0.17 0.34 0.25 0.16
Mb4944 0.24 0.21 0.22 0.16 0.22 0.18
Mb4945 0.12 0.19 0.19 0.17 0.16 0.12
Mb4946 0.20 0.23 0.22 0.18 0.2 0.22
Mb4947 0.18 0.14 0.15 0.19 0.16 0.14 0.12
Mb4948 0.16 0.19 0.10 0.21 사망 - - - -
Mb4949 0.13 0.20 사망 - - - - - - - -
Mb4950 0.14 0.14 0.19 0.25 0.12 0.18
Mb4951 0.18 0.17 0.25 0.17 0.14 0.06
Mb4952 0.14 0.13 0.24 0.14 0.07 0.08
평균 0.19 0.18 0.18 0.16 0.22 0.18 0.18 0.18 0.20 0.14 0.15
SD 0.06 0.04 0.04 0.06 0.02 0.04 0.04 0.08 0.06 0.06 0.03
N 12 6 6 5 6 5 6 10 4 6 4
동물번호-Mb4949- 혈액 채취후 2일째에 사망한 것으로 확인됨
동물번호-Mb4948- 혈액 채취후 6일째에 사망한 것으로 확인됨
정상 염수내의 나노좀 암포테리신 B - 투여량: 3 mg/kg/day; 8일 이후는 5 mg/kg/day
동물
번호		 크레아티닌(mg/dl)
일
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Mb4953 0.16 0.17 0.20 0.10 0.08 0.16 0.15
Mb4954 0.21 0.19 0.24 0.19 0.15 0.13 0.22
Mb4955 0.15 0.27 0.21 0.12 0.12 0.11 0.23
Mb4956 0.13 0.09 0.12 0.08 0.09 0.02
Mb4957 0.13 0.20 0.06 0.19 0.27 0.13
Mb4958 0.15 0.26 0.15 0.22 0.11 0.20
Mb4959 0.12 0.19 0.09 0.08 0.08 0.11 0.21
Mb4960 0.24 0.19 0.11 0.11 0.06 0.13 0.05
Mb4961 0.12 0.21 0.14 0.16 0.11 0.16 0.24
Mb4962 0.13 0.13 0.10 0.04 0.22 0.15
Mb4963 0.19 0.18 0.17 0.16 0.14 0.27
Mb4964 0.13 0.24 0.12 0.15 0.07 0.20
평균 0.16 0.20 0.18 0.17 0.12 0.13 0.14 0.13 0.14 0.16 0.18
SD 0.04 0.04 0.06 0.06 0.04 0.04 0.07 0.06 0.02 0.08 0.07
N 12 6 6 6 6 6 6 12 6 6 6
양 그룹에서는 혈청 크레아티닌 수준의 유의적인 차이가 관찰되지 않아서 더욱 많은 투여량으로 더욱 긴 기간 동안 실험하는 것이 필요했다.
본 실험에서는, 각 그룹당 수컷 및 암컷의 수가 동일한 50 마리의 마우스로 이루어진 두 그룹의 마우스를 이용했다. 매일 투여를 10 mg/kg 투여량의 격일 투여로 교체하고, 한 그룹에는 5% 덱스트로스내의 나노좀 암포테리신 B를 투여하고, 다른 그룹에는 정상 염수내의 나노좀 암포테리신 B를 투여했다. 혈청 크레아티닌 수준을 측정하기 위하여, 혈액을 매주 채취하였다.
나노좀 암포테리신 B

 혈청 크레아티닌 농도(mg/dl)
0일 1 주 2 주 3 주 4 주 5 주 6 주
5% 덱스트로스내 0.19±0.04 0.19±0.04 0.20±0.04 0.21±0.07 0.23±0.06 0.25±0.07 0.25±0.06
정상 염수내 0.18±0.05 0.18±0.03 0.18±0.04 0.17±0.04 0.17±0.03 0.16±0.04 0.18±0.04
덱스트로스 그룹에서는 2주째까지 유의적인 차이가 관찰되지 않았고, 심지어 그 후 6주까지도 혈청 크레아티닌 수준의 증가는 유의적이지 않았다. 기선(baseline)의 두 배를 초과하는 혈청 크레아티닌의 증가는 4주째에 2 마리, 5주째에 3 마리, 6주째에 1마리의 동물에서 확인된다. 3주째에 1 마리의 동물 및 5주째에 또 다른 1 마리의 사망은 약물의 신장 독성과 관련이 있는 것으로 보인다. 전체 신장 독성은 동물의 14%에서 확인되었다.
염수 그룹에서 혈청 크레아티닌 수준은 6주의 실험 기간에 걸쳐서 일관되게 유지되었다. 1 마리의 동물에서만 혈청 크레아티닌 수준이 투여 6주 후에 기선의 두 배를 초과했다. 전체 신장 독성은 동물의 2%에서만 확인된다. 상기 마우스들 중 5 마리가 실험 동안에 사망했지만, 그 사망은 약물과 관련이 있는 것으로 보이지 않았다.
실시예 3: 콜레스테롤 & 염수에서 나노좀의 안정화
어떠한 다른 막 안정화제 없이 염수내에서 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 2년 동안의 안정성은 본 발명에서 보고된 독특한 조성에 의해 가능하게 되었다.
최종 제품에 대한 실시간 안정성 시험
제품: 염수에 현탁된 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B
저장 수명: 이러한 나노좀 암포테리신 B는 제조일로부터 24 개월 이상 안정하다.
제안된 유통기간: 24 개월
저장: 2-8 ℃ 에서 저장
제어 배치(batch): 나노좀 암포테리신 B의 안정성 연구 시험을 하기의 3 개의 배치에 대하여 수행하였다.
Figure 112011017996211-pct00003
저장 조건: 장기 안정성 연구를 위하여 상기 제품들을 2-8℃ 에서 유지한다.
시험 간격: 저장된 시료를 예정된 간격으로 회수하는데, 그 간격은 아래와 같다: 0달째, 3달째, 6달째, 12달째, 18달째, 24달째.
염수에서 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 실시간 안정성 연구 데이터는 다음과 같다:
배치 번호: 50F07-147
제조일: 08/2007
만료일: 07/2009
시간 설명 입자상 물질 확인 메탄올 함량 지질 함량 분석결과
0달 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 734.3 ppm 35.25 mg 0.996 mg
3달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 733.6 ppm 35.05 mg 0.994 mg
6달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 732.5 ppm 34.9 mg 0.991 mg
12달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 730.8 ppm 34.73 mg 0.987 mg
18달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 728.5 ppm 34.5 mg 0.984 mg
24달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 725.0 ppm 34.2 mg 0.980 mg
염수에서 콜레스테롤 함유 리포좀 암포테리신 B의 실시간 안정성 연구 데이터는 아래와 같다:
배치 번호: 50F07-148
제조일: 08/2007
만료일: 07/2009
시간 설명 입자상 물질 확인 메탄올 함량 지질 함량 분석결과
0 달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 720 ppm 35.5 mg 0.9976
3 달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 718.5 ppm 35.35 mg 0.996
6 달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 716.8 ppm 35.25 mg 0.9952
12 달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 712.5 ppm 35.06 mg 0.993
18 달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 708 ppm 34.85 mg 0.9905
24 달째 황색 현탁액 입자없음 암포테리신 B에 대하여 양성 705 ppm 34.6 mg 0.988
염수에서 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 실시간 안정성 연구 결과는 아래와 같다:
배치 번호: 50F07-149
제조일: 08/2007
만료일: 07/2009
시간 설명 입자상 물질 확인 메탄올 함량 지질 함량 분석결과
0 달째 황색 현탁액 입자 없음 암포테리신 B에 대하여 양성 744 ppm 35.4 mg 1.006 mg
3 달째 황색 현탁액 입자 없음 암포테리신 B에 대하여 양성 742.5 ppm 35.3 mg 1.002 mg
6 달째 황색 현탁액 입자 없음 암포테리신 B에 대하여 양성 741.4 ppm 35.15 mg 0.998 mg
12 달째 황색 현탁액 입자 없음 암포테리신 B에 대하여 양성 738.8 ppm 34.95 mg 0.994 mg
18 달째 황색 현탁액 입자 없음 암포테리신 B에 대하여 양성 736.0 ppm 34.7 mg 0.9905 mg
24 달째 황색 현탁액 입자 없음 암포테리신 B에 대하여 양성 732.5 ppm 34.4 mg 0.988 mg
실시예 4: 통상적인 암포테리신 B와 염수내 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B (N 암포테리신 B)의 시험관내(in - vitro) 활성의 비교
본 실험은 병원성 효모 및 피부사상균을 포함한 곰팡이에 대한 효능을 확인하기 위해, 통상적으로 사용된 항균제, 즉 암포테리신 B, 보리코나졸(Voriconazole),이트라코나졸(Itraconazole) 및 플루코나졸(Fluconazole)에 대한 나노좀 암포테리신 B의 항균 스펙트럼 및 MIC를 결정하기 위해 수행되었다.
하기의 임상 분리물을 실험했다.
Figure 112011017996211-pct00004
염수내 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 시험관내 활성은 효모 및 곰팡이의 다수의 분리물에 대하여 통상적인 암포테리신 B보다 몇 배 더 높다(일부의 경우 10 배이고 MIC는 많이 낮음). 또한, 암포테리신 B는 지금까지는 피부사상균에 대하여 효과적이지 않은 것으로 알려져 있지만, 나노좀 암포테리신 B는 피부사상균, 즉, 트리코파이튼 러브럼(Trichophyton rubrum), 트리코파이튼 톤슈란스(Trichophyton tonsurans), 트리코파이튼 멘타그로파이트스(Trichophyton mentagrophytes) 및 에피더모피톤 프로코숨(Epidermophyton floccosum)에 대하여 효과적이다. 이와 같이 활성이 더 높은 이유는 진균 막뿐만 아니라 이들 나노좀은 모두 유사하고 바람직한 수-지방친화성을 가져서 나노좀으로부터 진균으로의 암포테리신 B의 전달이 용이하기 때문일 수 있다.
또한, 관찰 결과는 암포테리신 B가 콜레스테롤 함유 나노좀으로서 투여될 때 투여량을 감소시키는 가능성을 지지한다. 데옥시콜린산 나트륨에서 약물의 콜로이드 현탁액인 통상적인 암포테리신 B는 1 mg/체중 kg/day의 하루 투여량으로 투여되는 한편, 투여량을 제한하는 독성을 극복하기 위하여 개발된 이의 상업적으로 이용가능한 지질 제제는 투여량이 3-6mg/kg 체중/day의 범위이다. 고투여량은 치료 경제학에 영향을 미치고 약물비용을 부적당하게 만들지만, 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B는 치료 투여량을 저하시켜서 치료 비용을 적당하게 만들 수 있다.
피부사상균 :
1. 트리코파이튼 러브럼(Trichophyton rubrum), 트리코파이튼 톤슈란스(Trichophyton tonsurans), 트리코파이튼 멘타그로파이트스(Trichophyton mentagrophytes)
2. 석고상 소포자균(Microsporum gypseum)
3. 에피더모피톤 프로코숨(Epidermophyton floccosum)
피부 감염을 유발하는 균
1. 칸디다, 아스퍼질러스, 뮤코(Mucor)
아졸 내성 종
1. 칸디다 알비칸스
N 암포테리신 B: 활성(0.03-0.25)
암포테리신 B: 활성(0.125-1)
플루코나졸: 가변(0.125-64)
보리코나졸:가변(0.03-8)
이트라코나졸: 가변(0.03-8)
2. 크립토콕커스 네오포르만스
N 암포테리신 B: 활성(0.03-0.25)
암포테리신 B: 활성(0.25-1)
플루코나졸: 가변(0.125-16)
보리코나졸:가변(0.03-16)
이트라코나졸: 중간(0.03-4)
3. 아스퍼질러스 후라버스, 아스파질러스 푸미가터스
N 암포테리신 B: 활성(0.06-0.5)
암포테리신 B: 활성(0.5-2)
플루코나졸: 내성(32-64)
보리코나졸:활성(0.125-1)
이트라코나졸: 가변(0.03-16)
4. 아스퍼질러스 오리재
N 암포테리신 B: 활성(1-2)
암포테리신 B: 중간(2-4)
플루코나졸: 내성(64)
보리코나졸:중간(0.5-4)
이트라코나졸: 활성(0.125-0.5)
5. 푸사륨 속
N 암포테리신 B: 활성(0.06-0.5)
암포테리신 B: 활성(0.5-1)
플루코나졸: 내성(16-64)
보리코나졸: 중간(0.5-4)
이트라코나졸: 내성(8-32)
6. 슈달레스케리아 보이디(Pseudallescheria boydii)
N 암포테리신 B: 활성(0.125-1)
암포테리신 B: 활성(0.5-1)
플루코나졸: 내성(8-32)
보리코나졸: 활성
이트라코나졸: 활성
7. 리조퍼스 아리주스, 리조퍼스 퍼실러스
N 암포테리신 B: 활성(0.125-0.5)
암포테리신 B: 활성(0.5-2)
플루코나졸: 내성(8-64)
보리코나졸: 가변(1-8)
이트라코나졸: 내성(8-16)
8. 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera)
N 암포테리신 B: 활성(0.06)
암포테리신 B: 활성(0.5)
플루코나졸: 내성(64)
보리코나졸: 가변(2-16)
이트라코나졸: 내성(16)
9. 뮤코 속
N 암포테리신 B: 활성(0.5-1)
암포테리신 B: 활성(1-2)
플루코나졸: 내성(64)
보리코나졸: 가변(8-16)
이트라코나졸: 내성(0.03-8)
10. 아포피소마이세스 엘레간스(Apophysomyces elegans)
N 암포테리신 B: 활성(1)
암포테리신 B: 활성(2)
플루코나졸: 내성(64)
보리코나졸: 중간(8)
이트라코나졸: 내성(16)
11. 커블라리아 속
N 암포테리신 B: 활성(0.03-0.125)
암포테리신 B: 활성(0.125-1)
플루코나졸: 내성(8-64)
보리코나졸: 활성(1-2)
이트라코나졸: 내성(8-16)
12. 알터나리아 속
N 암포테리신 B: 활성(0.25)
암포테리신 B: 활성(1-2)
플루코나졸: 내성(32-64)
보리코나졸: 활성(0.5-1)
이트라코나졸: 활성(1-2)
13. 클래도피알로포라 반티아나 (Cladophialophora bantiana)
N 암포테리신 B: 활성(0.25-0.5)
암포테리신 B: 활성(0.5-1)
플루코나졸: 내성(32-64)
보리코나졸: 활성(0.25-2)
이트라코나졸: 활성(0.5-2)
14. 피알로포라 베루코사(Phialophora verrucosa)
N 암포테리신 B: 활성(2)
암포테리신 B: 중간(4)
플루코나졸: 내성(16)
보리코나졸: 활성(1)
이트라코나졸: 내성(16)
15. 시탈리듐 디미디아텀(Scytalidium dimidiatum)
N 암포테리신 B: 활성(0.03)
암포테리신 B: 활성(0.5)
플루코나졸: 내성(32)
보리코나졸: 활성(0.5)
이트라코나졸: 내성(16)
16. 스포로트리코시스(Sporothrix schenckii)
N 암포테리신 B: 활성(0.125-0.25)
암포테리신 B: 활성(0.5-1)
플루코나졸: 내성(8-64)
보리코나졸: 가변(0.03-16)
이트라코나졸: 가변(0.03-16)
17. 페니실리움 마르네페이
N 암포테리신 B: 활성(0.125-0.25)
암포테리신 B: 활성(0.25-1)
플루코나졸: 내성(32-64)
보리코나졸: 활성(0.25-1)
이트라코나졸: 활성(1-2)
18. 트리코파이튼 러브럼(Trichophyton rubrum)
N 암포테리신 B: 활성(0.06-0.125)
암포테리신 B: 활성(0.25-1)
플루코나졸: 가변/내성(4-32)
보리코나졸: 활성(0.25-0.5)
이트라코나졸: 내성(8-16)
19. 트리코파이튼 멘타그로파이트스(Trichophyton mentagrophytes)
N 암포테리신 B: 활성(0.125-0.5)
암포테리신 B: 활성(0.5-2)
플루코나졸: 내성(32-64)
보리코나졸: 활성(0.5-1)
이트라코나졸: 활성(1-2)
20. 석고상 소포자균(Microsporum gypseum)
N 암포테리신 B: 활성(0.125)
암포테리신 B: 활성(0.5)
플루코나졸: 내성(64)
보리코나졸: 활성(0.125-0.5)
이트라코나졸: 활성(0.25-0.5)
21. 패실리오마이세스 속(Paeciliomyces spp.)
N 암포테리신 B: 가변(0.25-16)
암포테리신 B: 중간(1-4)
플루코나졸: 내성(64)
보리코나졸: 가변(0.125-8)
이트라코나졸: 가변(0.06-16)
플루코나졸 내성 종: 석고상 소포자균, 트리코파이튼 멘타그로파이트스, 트리코파이튼 러브럼, 페니실리움 마르네페이, 스포로트리코시스, 실탈리덤 디미다텀, 피알로포라 베루코사, 클래도피알로포라 반티아나, 알테나리오 속, 클루불리아 속, 아포피소마이세스 엘레간스, 뮤코 속, 압시디아 코림비페라, 리조퍼스 아리주스, 리조퍼스 퍼실러스, 슈달리스케리아 보이디, 푸사륨 속, 아스퍼질러스 플라버스, 아스퍼질러스 푸미가터스, 아스퍼질러스 오리재, 패실로마이세스 속.
보리코나졸 내성 종: 뮤코 속.
보리코나졸 가변 종: 스포로트리코시스, 압시디아 코림비페라, 리조퍼스 아리주스, 리조퍼스 퍼실러스, 크립토콕커스 네오포르만스, 칸디다 알비칸스, 패실로마이세스 속.
이트라코나졸 내성 종: 트리코파이튼 러브럼, 쿠불라리아 속, 푸사륨 속, 압시디아 코림비페라, 뮤코 속, 아포피소마이세스 엘레간스, 쿠불라리아 속, 리조퍼스 아리주스, 리조퍼스 퍼실러스, 피알로포라 베루코사, 시탈리듐 디미다텀.
이트라코나졸 가변 속: 스포로트리코시스, 아스퍼질러스 플라버스, 아스퍼질러스 푸미카터스, 칸디다 알비칸스, 패실로마이세스 속.
나노좀 암포테리신 B 가변 종: 패실로마이세스 속.
실시예 5: 초음파 처리 전후 TEM 및 동결 파쇄 SEM
ml 당 입자수에 대한 지질: 약물 비의 효과, ml당 입자수에 대한 초음파처리의 효과
나노좀 시료는 형태가 다양하고 직경이 20 nm 내지 마이크로미터의 범위인 입자를 갖는 매우 균질한 시료를 나타냈다. 초음파처리하지 않은 시료와 비교하여 초음파 처리한 시료의 경우에는 20-200 nm의 더욱 작은 직경을 갖는 단일 라멜라 나노좀이 더욱 많이 확인되었다. 이는 초음파처리가 시료에서 확인된 큰 다층라멜라 입자들을 작은 단일 라멜라 나노좀으로 효과적으로 파괴하기 때문인 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 초음파 처리한 시료의 경우에는 일부의 큰 다층 라멜라 리포좀이 여전히 관찰되었고, 이들은 초음파처리하지 않은 시료내의 큰 다층 라멜라 입자들에 비해 잘 분리되었다. 초음파 처리 시간을 연장시키면, 큰 입자들이 더욱 완전히 파괴될 수 있다.
초음파 처리한 시료 또는 초음파 처리하지 않은 시료를 비교할 때 오래된 시료와 새로운 시료 사이에 명백한 차이는 없었다. 따라서, 상기 시료는 도 1 및 2에서 도시한 바와 같이, 조사된 장시간(2년)에 걸쳐 안정한 것으로 보인다.
실시예 6: 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테린 B의 염수 현탁액의 국소적 안과적 사용
염수내의 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테린 B는 눈에서 국소적으로 연구되고 안전하고 효과적인 것으로 확인된다. 상이한 농도의 나노좀 암포테리신 B 및 통상적인 암포테리신 B로 처리한 아스퍼질러스 푸미가터스 각막염 모델 및 무처리 대조군. 그 결과, 염수내 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B의 농도의 1/2이 전체 농도의 통상적인 암포테리신 B 만큼이나 효과적이다.
토끼에서 실험적 진균 각막염의 치료 동안 콜레스테롤 함유 나노좀 암포테리신 B 염수 제제의 효능 및 독성의 평가
목적:
a. 실험용 토끼 모델에서 유도된 진균 각막염의 치료시 국소적 나노좀 암포테리신 B의 효능을 평가한다.
b. 0.1% 및 0.05% 농도의 나노좀 암포테리신 B의 효능을 0.1% 농도의 통상적인 암포테리신 B의 효능과 비교한다.
c. 나노좀 암포테리신 B를 이용한 처리에 따른 토끼에서의 어떠한 눈 독성을 평가하고 이를 0.1% 농도의 암포테리신 B의 국소적 적용에 따른 독성과 비교한다.
방법
대상: 뉴질랜드 백색 토끼-72
균 분리물: 아스퍼질러스 푸미가터스(ATCC 13073), 칸디다 알비칸스, 푸사륨 솔라니
아스퍼질러스 푸미가터스(Aspergillus fumigatus) 및 푸사륨 솔라니(Pusarium solani)를 감자 덱스트로스 아가에서 30℃로 3-10일간 성장시켰다. 상기 배양액을 살균 면봉으로 부드럽게 문지르고 이를 15 ml 원뿔형 튜브에서 3-4 ml 살균 염수에 옮겨서 분생자 현탁액을 제조했다. 분생자의 최종 농도를 ml 당 106개의 분생자수로 조절했다. 칸디다 알비칸스를 감자 덱스트로스 아가 플레이트에서 35℃ 로 24 시간동안 성장시켰다. 직경이 1 mm보다 큰 5 개의 콜로니를 취하고 15 ml 살균 원추형 튜브에서 0.85% 살균 염수 5 ml에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 볼텍싱하고, 혈구계를 이용하여 세포수를 측정했다. 효모 세포의 현탁액을 살균 염수에서 제조하여 106 CFU/ml의 최종 농도를 얻었다.
각막염의 유발 및 치료
본 연구에서는 전체 72 마리의 토끼를 사용하였는데, 그중 60 마리의 토끼에는 아스퍼질러스 푸미가터스 접종물로 감염시키고, 그중 22 마리의 토끼는 접촉 렌즈 모델을 이용히여 감염시키고, 나머지 38 마리는 기질내 방법을 이용하여 감염시켰다. 8 마리의 토끼는 칸디다 알비칸스의 임상 분리물로 감염시켰다(기질내 접종을 통해 4 마리의 토끼는 108 효모/ml를 감염시키고, 2 마리는 109 세포/ml를 감염시키고, 2 마리의 토끼는 접촉 렌즈 모델을 이용하여 109 세포/ml로 감염시켰다). 4 마리의 토끼는 기질내 방법을 이용하여 106 포자/ml 접종량의 푸사륨 솔라니로 접종시켰다.
접촉 렌즈를 이용한 각막염의 유발: 토끼를 근육내 케타민 및 실라진으로 마취시켰다. 국소 프로파라카인 0.5%를 이용하여 각막을 마취시켰다. 오른쪽 눈의 깜빡막을 예리한 절개를 통해 제거했다. 99% 이소프로필 알콜(Merck, USA)이 적셔진 7 mm 여과지 디스크를 각막의 중심에 30초간 위치시키고, 각막의 상피를 제거했다. 그 눈을 락트산나트륨 용액으로 씻어서 잔류하는 미량의 이소프로필 알콜을 제거했다. 각막의 중심부에 격자모양의 마찰부를 만들었다. 큰 구경의 피펫 팁을 이용하여 균 접종물을 노출 각막에 옮기고, 살균 접촉 렌즈(직경 14.0 mm; Pure vision, Bosch and Lomb, Ireland)를 위치시켜서 그 접종물을 유지했다. 접촉 렌즈의 돌출을 방지하기 위하여, 5-0 실크 봉합사를 이용하여 눈꺼풀봉합술을 수행하여 눈꺼풀을 밀폐시켰다. 48 시간후 접촉 렌즈를 제거하여 눈을 검사한 후 48 시간 마다 검사했다. 각 토끼로부터 각막 버튼을 얻어서 미생물학적 및 조직병리학적 연구를 실시했다.
접종물의 기질내 주입에 의한 각막염의 유발: 케타민 및 실라진을 근육내 주사하여 토끼를 마취시켰다. 국소적 프로파라카인 0.5%를 이용하여 각막을 마취시켰다. 20 l의 균 접종물(106 포자/ml)을 슬리트 램프의 안내하에서 구부러진 30G 인슐린 니들을 이용하여 기질내 주사했다. 상기 토끼를 2일 마다 각막염의 증상에 대하여 검사했다.
항균성의 평가:
접종물을 기질내 주사한 모델에서 지속적인 감염이 확인되었기 때문에, 이러한 모델을 이용하여 치료 연구를 수행했다. 치료를 위하여, 토끼를 각 그룹당 4 마리씩 4 그룹으로 무작위로 나누었다.
아스퍼질러스 푸미가터스로 접종한 그룹들은 다음과 같았다.
그룹 1): 0.1% 나노좀 암포테리신 B로 처리함.
그룹 2): 0.1% 통상적인 암포테리신 B로 처리함.
그룹 3): 0.05% 나노좀 암포테리신 B로 처리함.
그룹 4): 정상 살균 염수(무처리 대조군).
슬릿 램프 현미경을 이용히여 측정한 상이한 임상 징후에 대한 복합 점수를 주어서 치료 전후 감염을 등급으로 나누었다. 각 그룹에 대한 이망 점수를 도표화하고 그 평균을 취했다.
결과
접촉 렌즈 모델: 진균 각막염의 초기 표준화를 위하여, 사용된 22 마리의 토끼중 8 마리의 토끼를 아스퍼질러스 푸미가터스의 포자 현탁액만을 함유하는 접종물로 감염시켰다. 그러나, 어떠한 임상학적 또는 미생물학적 감염 증거는 제공하지 않았다(얼룩 및 배양물 모두는 음성이었다. 표 1). 다음에, 14 마리의 토끼에게 포자 및 균사체의 혼합물을 감염시켜서, 표 1에서 나타낸 바와 같이 일관성있게 감염시켰다. 일관성있는 임상적 감염이 있었으나, 감염의 정도는 5일후에 감소했다. 따라서, 5일째에 치료를 시작하는 것은 불가능했다. 따라서, 기질내 주사 모델을 다음 실험에 이용했고, 항생제를 이용한 치료를 감염 5일째에 시작하였다.
접촉 렌즈 모델을 이용하여 토끼 눈에서 진균성 각막염을 유발시킨 결과
토끼 확인 번호 사용된 접종물 임상 특징 현미경분석
KOH/Calcofluor		 진균 배지 과정
SD-1 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰없음
SD-2 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰없음
SD-3 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰없음
SD-4 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰없음
SD-5 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰
SD-6 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰
KR-01 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰
KR-02 포자 단독 없음 -ve -ve 마찰
KR-03 포자+균사체 없음 -ve -ve 마찰
KR-04 포자+균사체 있음 -ve -ve 마찰
KR-05 포자+균사체 있음 -ve +ve 디스크를 이용한 마찰
KR-06 포자+균사체 있음 +ve +ve 디스크를 이용한 마찰
KR-07 포자+균사체 있음 +ve +ve 디스크+항생제를 이용한 마찰
KR-08 포자+균사체 있음 +ve +ve 디스크+항생제를 이용한 마찰
KR-09 포자+균사체 있음 -ve +ve 마찰+디스크+항생제
KR-10 포자+균사체 있음 -ve +ve 마찰+디스크+항생제
KR-11 포자+균사체 있음 -ve +ve 마찰+디스크+항생제
KR-12 포자+균사체 없음 -ve +ve 마찰+디스크+항생제
KR-13 포자+균사체 있음 +ve +ve 마찰+디스크+항생제
KR-14 포자+균사체 있음 -ve +ve 마찰+디스크+항생제
KR-15 포자+균사체 있음 -ve +ve 마찰+디스크+항생제
KR-16 포자+균사체 있음 -ve +ve 마찰+디스크+항생제
기질내 모델( intrastromal model)을 이용한 항균 요법의 평가:
무처리 토끼는 15일째에 16.1±4.1 SD의 평균 점수를 가졌다. 그러나, 0.1% 나노좀 암포테리신 B로 처리한 토끼는 8.6±2.37 SD의 평균 점수를 기졌는데, 이는 무처리 그룹과 비교하여 통계적으로 유의적이었다(p<0.001). 마찬가지로, 0.05% 나노좀 암포테리신 B로 처리한 그룹 및 0.1% 통상적인 암포테리신 B로 처리한 그룹은 각각 8.8±2.37 SD 및 8.4±2.0 SD의 평균 점수를 가졌다.
상기 세 약물로 처리한 토끼 그룹은 모두 무처리 그룹과 비교하여 치유에 있어서 유의적인 차이가 있었는데, 이러한 차이는 통계적으로 유의적이었다(p<0.001). 그러나, 아스퍼질러스 각막염에 대한 0.05% 나노좀 제제의 복합 입상 점수는 0.1%의 통상적인 약물과 유사하다.
S.N
0		 항균제
 평균 임상 복합 점수(n=38)
D0 D2 D4 D5 D7 D9 D11 D15
1 0.1% 나노좀 암포테리신 B 0 7.2 13.1 13.6 14.88 14.23 12.05 8.66
2 0.05% 나노좀 암포테리신 B 0 8.25 13.43 13.7 14.45 13.1 10.78 8.8
3 0.1% 통상의 암포테리신 B 0 8.3 13.6 14.5 14.5 12.3 11.5 8.4
4 무처리 대조군 0 8.4 14.4 16.1 16.5 16.1 16.3 16.1
실시예 7: 혁신적으로 디자인된 "암포스테린 B의 인지질-콜레스테롤 나노좀 매개 피부 전달의 실험적 입증
피부를 통해 흡수되지 않는 것으로 잘 알려진 암포테리신 B는, 혁신적인 콜레스테롤/인지질 나노좀에 암포테리신 B를 캡슐화함으로써 본 발명에 의해 극복되어진 효과적인 국소 제제의 개발을 제한했다. 암포테리신 B를 캡슐화한 나노좀의 침투 및 피부 전달은 콜레스테롤-인지질 나노좀의 특별한 이점, 즉, 인지질과 세포내지질의 상호작용, 지질과 함께 수분의 존재, 그리고 암포테리신 B 분자의 용해도 및 구획화와 같은 물리화학적 특성의 변화때문일 수 있다. 또한, 관찰된 바와 같이, 혁신적 제제에서 나노좀 암포테리신 B의 국소 적용시 피부에서 암포테리신 B의 유지의 달성은 개선된 약물-수용체 상호작용 및 암포테리신 B의 보호 작용에 대한 거동후에 가장 추구되는 것이다.
피부 투과 거동 및 형광성 표지 사진 분석의 연구후에 얻은 결과는 통상적으로 제조한 암포테리신 B 크림과 비교하여 나노좀 암포테리신 B 제제가 우수하다는 것을 나타내고 있다. 이는 암포테리신 B의 국소적 피부 전달을 위한 나노좀 암포테리신 B의 신규성의 근거를 형성한다.
목적:
통상적인 암포테리신 B 크림과 비교하여 암포테리신 B의 피부 전달에 관한 콜레스테롤 함유 나노좀 염수 제제의 영향을 연구한다.
투과 연구를 위한 적당한 연구 매질의 개발
분석을 위한 방법 개발 및 확인
Franz 확산 셀을 이용한 시험관내 투과 연구
약물 운반의 모니터링(형광 표지 연구)
암포테리신 B는 BCS 류의 IV 약물에 속하기 때문에, 피부를 포함한 어떠한 장벽을 침투하기가 어렵다. 그 이유는 여러가지가 있는데 다음과 같다:
약물 특이 문제; 용해도; 구획화(partitioning); 피부 특이 문제(단단한 각질 케라틴 장벽); 약물-피부 상호작용; 약물과 피부의 물리화학적 특성의 차이로 인한 부적당한 상호작용.
유용한 국소 적용을 이루기 위한 예전의 시도에도 불구하고, 암포테리신 B의 거대 분자는 피부를 통해 흡수되기가 어렵다. 따라서, 어느 것도 이러한 목적을 성공적으로 달성할 수 없었다. 분자의 근본적인 문제는 이의 물리화학적 특성 외에도 피부 장벽이다. 이는 국소 전달용 나노좀 시스템의 가능성을 조사하기 위한 합리성을 제공한다. 여기서, 상기 가설은 수분-유지질 소포 환경내의 약물이 피부층내로 더욱 깊이 이동하기 위하여 상이한 물리화학적 특성을 획득하게 된다는 가설에 기반한다. 유지질 분자와 함께 소포내의 수분은 통상적인 시스템과 비교하여 약물 전달의 개선에 중요한 역할을 한다. 이 밖에, 인지질과 피부 지질의 통합은 개선된 전달을 위한 전도성 환경의 구성을 촉진한다.
방법
확산 및 체류 연구
상이한 담체 시스템을 이용한 암포테리신 B의 피부 투과를, Franz 확산 셀을 이용하여 연구했다. 확산 셀 및 수용 셀의 유효 투과 면적은 3.14 cm2이었고, 각 셀의 체적은 10 ml 및 30 ml 였다. 수용 유체의 온도는 32±1 ℃로 유지했다. 수용 구획은 침강 조건을 촉진하기 위하여 증류수에서 Briz-35(%) + 도쿠세이트 소듐(DOS)(1%)을 함유했다.
털을 제거하고 피부를 탈지시킨 다음, 수컷 Laca 마우스(4-6 주령)의 복막 피부를 공여 및 수용 구획의 사이에 배치했다. 피부를 침강 배지로 2 시간 동안 평형화시킨 후, 358.5 ㎍에 해당하는 제제(나노좀/통상적인 크림)를 공여 구획에 적용했다. 시료 (1 ml)를 소정 간격으로 보충하면서 수용 구획의 시료추출 포트를 통해 회수하고 적당히 희석한 후 UV 분광분석기를 이용하여 분석했다.
형광 표지 이동 연구:
암포테리신 B의 고유 형광 특성을 이용하여, 시간에 따른 약물의 이동 및 편재를 시각화했다. 연구 하루 전에 제모 크림을 이용하여 Laca 마우스를 면도했다. 마우스를 소정 간격으로 인도적으로 희생시킨 후 즉시, 피부를 pH 7.4의 PBS로 세척하고 -20℃의 10% 포르말린에 저장하여 냉동-마이크로절편화했다. 상기 절편을 F2 필터를 구비한 형광 현미경하에서 관찰했다.
관찰결과
확산 및 체류 연구
여러 가지 용매계를 시험했고, 최종적으로 Briz-35(5%) + 도쿠세이트 소듐(1%)로 이루어진 계를 침강 매질로 선택했다. 본 연구의 목적은 피부층에서 및 피부층을 통한 약물의 침투, 체류 및 투과를 각각 평가함에 있다. 주요한 관찰 결과는 통상적인 크림(0.142±0.05)과 비교하여 나노좀의 적용(즉, 1.291±0.04)후 피부층내에 분명한 약물 체류가 있다는 것이다. 그러나, 투과에 관하여는, 피부층을 투과하지 못한 약물 암포테리신 B(나노좀계 및 통상적인 계 모두의 경우에서)는 도 3에서 도시한 바와 같이 유의적이지 않다.
도 3은 (a) 0.5 시간에서 통상적인 암포테리신 B 크림, (b)1.0 시간에서 통상적인 암포테리신 B 크림, (c) 2.0 시간에서 통상적인 암포테리신 B 크림, (d) 0.5 시간에서 나노좀 암포테리신 B 제제, (e) 1.0 시간에서 나노좀 암포테리신 B 제제, 및 (f) 2.0 시간에서 나노좀 암포테리신 B 제제의 도포후 피부의 횡단면이다.
암포테리신 B의 약물 방출 및 체류
번호 제제 시용된 매질 % 약물투과 체류한 약물(㎍/cm2)
1 나노좀 암포테리신 B 5% Briz35 + 1% DOS(증류수중) 0.3±0.015 1.291±0.04
2 통상적인 암포테 리신 B 크림 5% Briz35 + 1% DOS(증류수중) 0.1±0.017 0.142±0.05
형광성 표지 이동 연구 -
피부층에서 약물의 침투를 모니터하기 위한 형광성 표지 연구(통상적인 제제 및 나노좀 제제의 적용후) 결과를 도 1에서 도시하였다. 상기 연구는 여러 가지 시간 간격, 즉 0.5 시간, 1.0 시간 및 2.0 시간에서 모니터하는 것을 포함한다. 상기 연구 결과 상기 간격들에서 분명한 차이가 확인되었다. 가장 현저한 차이는 2 시간 연구후에 확인되었다.
침투 거동 연구(Franz 확산 셀) 및 투과 연구(형광성 표지 피부 조직학적 연구)의 결과는 나노좀 소포체가 암포테리신 B의 운반을 개선하는 능력이 있음을 나타낸다. 약물 체류 데이터 및 피부 조직의 2시간째 이미지에 의해 확인된 바와 같이, 나노좀에 함유된 암포테리신 B는 통상적인 약물 제형과 비교하여 명백히 피부를 침투할 수 있다. 나노좀 암포테리신 B뿐만 아니라 통상적인 약물 제제의 불충분한 투과는 약물이 피부층을 투과하지 못해서 암포테리신 B의 경피 약물 전달에 적합하지 않다는 것을 나타낸다. 따라서, 나노좀내의 암포테리신 B는 피부 전달에 대한 양호한 가능성을 나타냈다. 불충분한 투과의 경우에도 이점을 제공하는데, 이는 암포테리신 B가 전신으로 흡수될 수 없기 때문이다.

Claims (4)

  1. 지질 혼합물, 즉, 인지질과 콜레스테롤의 혼합물로 구성된 나노좀 내에 캡슐화되어 있는 암포테리신 B를 필수적으로 함유하고, 암포테리신 B:지질의 비가 45:1이며, 정상 염수(normal saline) 현탁액 각 ml당 리포좀 암포테리신 B 1 mg이 현탁되어 있고, 상기 현탁액은 염수에만 추가로 희석 가능한 것을 특징으로 하는, 진균 감염 치료용 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암포테리신 B는 초음파 처리되어 입자가 대부분 직경 20-200 nm인 더욱 작은 라멜라 나노좀으로 전환된 것인 제제.
  3. 삭제
  4. 삭제
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