ES2825802T3 - Formulación de anfotericina liposomal que comprende colesterol para tratar infecciones fúngicas - Google Patents

Abstract

Una formulación para el tratamiento de infecciones fúngicas que consiste en anfotericina B encapsulada en un nanosoma de fosfolípidos y colesterol en una suspensión en solución salina, en donde la suspensión es diluible solamente en solución salina, y en donde la proporción en peso lípidos/anfotericina B es 45:1.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación de anfotericina liposomal que comprende colesterol para tratar infecciones fúngicas

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a sistemas nuevos de administración de fármacos basados en sistemas nanosomales.

En este estudio se han estudiado muestras de anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina con criomicroscopía electrónica (crioME). Se ha analizado una muestra reciente y una de dos años sin sonicar, así como tras la sonicación. El análisis de las imágenes de crioME incluyó la distribución de tamaños y la morfología global, tal como la lamelaridad (unilamelar frente a multilamelar) y la agregación.

Antecedentes de la invención:

Las incidencias crecientes de micosis sistémica y tópica provocadas por diferentes géneros de levaduras, hongos y dermatofitos en pacientes inmuno-deficientes e inmuno-competentes sigue siendo un problema médico importante y abordado de manera inadecuada. La mortalidad resultante y la alarmante morbilidad prolongada son muy preocupantes. Con todos los fármacos descubiertos hasta ahora, ha habido problemas por el espectro limitado, la escasa potencia, las limitaciones de las formulaciones adecuadas, las reacciones farmacológicas adversas y las toxicidades potencialmente mortales, y bastante a menudo una combinación de algunos o todos los problemas anteriores. El grupo de antibióticos de aminoglucósidos poliénicos pareció más prometedor, de amplio espectro y potente. Sin embargo, las toxicidades de la mayoría de estos compuestos impidieron su inclusión como agentes terapéuticos.

La anfotericina B ha sido el único macrólido poliénico que ha tenido un uso clínico generalizado a pesar del hecho de que diversas formulaciones, tales como la suspensión micelar con desoxicolato sódico, liposomal, complejo lipídico y dispersión coloidal lipídica, poseen una nefrotoxicidad potencialmente mortal en grados variables.

Los objetivos en la formulación de anfotericina B son eliminar la nefrotoxicidad, producir una preparación estable, asegurar la eficacia a dosis bajas y eliminar la toxicidad y las reacciones farmacológicas adversas incluso a dosis elevadas.

Existe un gran número de patentes concedidas/presentadas y publicaciones que describen las formulaciones de anfotericina B. Excepto por las cuatro formulaciones descritas a continuación, no hay otras formulaciones operativas, ya que no se ha podido hacer que dichas formulaciones sean adecuadamente seguras desde un punto de vista nefrológico.

En todas las formulaciones de anfotericina B conocidas, los constituyentes se seleccionan de una gran lista de opciones de fosfolípidos/lípidos y estabilizantes. No se infunde ninguna preparación en solución salina, ya que se sabe que la anfotericina B precipita en solución salina.

1. Anfotericina B convencional: Suspensión coloidal de anfotericina B - desoxicolato en un 5% de dextrosa,

Eficacia 33%, Nefrotoxicidad 67%

La anfotericina B es insoluble en medio acuoso. El problema se superó de manera limitada al final de la década de 1950 disolviendo la anfotericina B en desoxicolato y formulándola en forma de una suspensión micelar en un 5% de dextrosa en agua. La anfotericina B precipita en NaCl, y por tanto no se preparó anfotericina B en desoxicolato en NaCl ni se diluyó en solución salina. Además, esta suspensión se liofilizó para proporcionar estabilidad a la preparación.

2. Anfotericina B liposomal diluida en un 5% de dextrosa

Eficacia 77%, Nefrotoxicidad 20%

Una anfotericina B liposomal constituida por una combinación de fosfatidilcolina hidrogenada de soja, diestearoilfosfatidilglicerol, colesterol y alfa tocoferol en un 4,5% de sacarosa y succinato disódico hexahidrato como tampón se seleccionó de varias combinaciones de fosfolípidos, esteroles, carbohidratos estabilizantes de membranas, y sus proporciones variables. A pesar del uso de sacarosa estabilizante de membranas, esta preparación se liofilizó para superar su inestabilidad. Se informa que esta preparación de anfotericina B liposomal precipita en solución salina, y por tanto la dilución en contacto con solución salina está claramente prohibida.

La patente de Estados Unidos 4766046 describe que:

Debido al tamaño y la inestabilidad de los liposomas de anfotericina B, no ha sido posible preparar y almacenar liposomas de anfotericina B de pequeño diámetro sin un incremento significativo del tamaño (de varias veces) a lo largo de un periodo de almacenamiento de varias semanas. Como resultado, debido a la diferente absorción de los liposomas in vivo y la liberación del fármaco y las propiedades de toxicidad que están relacionadas con el tamaño de los liposomas, ha sido difícil controlar y evaluar el índice terapéutico de los liposomas de anfotericina B almacenados. El problema de la inestabilidad del tamaño es especialmente grave cuando se alcanzan tamaños de liposomas mayores de 1-2 micras, debido a que los liposomas de anfotericina B que contienen colesterol son sustancialmente más tóxicos que los liposomas de los tamaños originales, más pequeños. El problema de la estabilidad del tamaño se ha resuelto hasta ahora solamente administrando los liposomas del tamaño correcto poco después de la preparación. Esto, por supuesto, es una aproximación poco práctica para la administración de fármacos en el ámbito clínico habitual.

3. Complejo de anfotericina B - lípido diluido en un 5% de dextrosa

Eficacia 34%, Nefrotoxicidad 63%

Esta preparación está compuesta de anfotericina B y fosfolípidos sintéticos, concretamente dimiristoilfosfatidilcolina y dimiristoilfosfatidilglicerol. La suspensión acuosa se diluye en un 5% de dextrosa antes de la administración. No se mejora ni la eficacia ni el perfil de toxicidad respecto de la anfotericina B convencional.

4. Dispersión coloidal de anfotericina B diluida en un 5% de dextrosa

Eficacia 46%, Nefrotoxicidad 40%

Se liofiliza anfotericina B y colesteril sulfato sódico con trometamina, edetato disódico dihidrato y HCl de lactosa monohidrato.

La glucosa presente en las formulaciones lipídicas de anfotericina B reduce notablemente el efecto beneficioso de la formulación aplicada de manera tópica. Se sobreentiende que el mecanismo inhibitorio de la glucosa está relacionado con la viscosidad elevada introducida por la glucosa o con los cambios introducidos por la glucosa en la interfase lípido/agua de las partículas coloidales (Crowe JH et al. 1988 Biochim. Biophys Acta. 947:367-384). Incluso el éxito terapéutico de la anfotericina B liposomal es como mucho del 77%, lo cual es inferior a la presente invención.

Por lo tanto, se previó sustituir la dextrosa por solución salina en esta invención, lo cual tiene la ventaja adicional de reducir la nefrotoxicidad de la anfotericina B. En vista del hecho muy conocido y documentado de que la solución salina provoca la precipitación de la anfotericina B1-4, se diseñó de manera exclusiva la composición de los lípidos y la proporción lípido/fármaco para confirmar que la anfotericina B en los nanosomas se inmoviliza para prevenir la precipitación del fármaco nanosomal.

Objetivos de la invención:

Un objetivo de esta invención es proporcionar una formulación nueva de nanosomas que contienen colesterol estabilizados en suspensión en solución salina con una nefrotoxicidad reducida.

Otro objetivo de esta invención es proponer una formulación nueva de nanosomas que contienen colesterol estabilizados en suspensión en solución salina que tiene una actividad antifúngica incrementada.

Otro objetivo de esta invención es proponer una formulación de nanosomas que contienen colesterol estabilizados en suspensión en solución salina que es muy estable.

Un objetivo adicional de esta invención es proponer una formulación nueva de nanosomas que contienen colesterol estabilizados en suspensión en solución salina que es menos tóxica.

Un objetivo adicional de esta invención es proponer una formulación nueva de nanosomas que contienen colesterol estabilizados en suspensión en solución salina, en la que la dosis de anfotericina B usada es muy pequeña por su elevada actividad anti-infecciosa. Otro objetivo de esta invención es proponer una formulación nueva para diversas aplicaciones dirigidas a optimizar las dosis inferiores de anfotericina B para obtener una mayor actividad anti­ infecciosa, minimizando además la nefrotoxicidad, y una preparación estable para diversas aplicaciones, tales como aplicaciones intravenosas, oftálmicas y tópicas, etc.

Breve descripción de la invención:

Según esta invención, se proporciona una formulación para el tratamiento de infecciones fúngicas de acuerdo con la Reivindicación 1 de la presente memoria.

De acuerdo con esta invención, también se proporciona una formulación para el uso en el tratamiento de una infección fúngica de acuerdo con la Reivindicación 3 de la presente memoria.

Descripción detallada de la invención:

En una disolución, la concentración es el número de moléculas del soluto por unidad de volumen del disolvente, que en el caso de las composiciones inyectables y las infusiones o cualquier otra forma de dosis líquida en general es acuoso, mientras en las preparaciones particuladas, que incluyen las suspensiones tales como las suspensiones coloidales, la concentración eficaz del fármaco se determina por el número de partículas que portan el fármaco. Tales vehículos son conjuntos de diversos tamaños del orden nano o micro de lípidos, proteínas u otros vehículos biodegradables para las composiciones inyectables, orales o inhalables, transdérmicas, etc., y no biodegradables predominantemente para las preparaciones tópicas. En esta invención, los nanosomas tienen una proporción lípido/fármaco óptimamente elevada para incrementar el número de nanosomas que contienen fármaco para cada cantidad unitaria de fármaco, y de ese modo se consigue la optimización de la eficacia complementándola con la nanoficación antes de la administración.

La optimización de la proporción lípido/fármaco con el tamaño del particulado se basa en el concepto nuevo de la presente invención, al incrementar la concentración eficaz del compuesto farmacéutico activo incrementando el número de partículas portadoras del API en las formulaciones tras la producción y antes de la administración. Esto se consigue reduciendo el tamaño de las partículas de la formulación que contiene más lípido. En la formulación, debido a la proporción lípido/fármaco óptimamente mayor, hay un mayor número de partículas/mg de fármaco. Más partículas dan como resultado una distribución mejor/mayor de fármaco en el cuerpo. Como existe una concentración más eficaz de fármaco en suspensión, existe un mayor número de moléculas distribuidas uniformemente por todo el cuerpo. Esto disminuirá el requisito de la dosis terapéutica. Como el API, por ejemplo anfotericina B, es tóxico a dosis mayores, al reducir la necesidad del API se reducirá automáticamente la toxicidad para los animales/pacientes, y por tanto conduce a una formulación más segura del fármaco.

Los APIs de la preparación particulada se encapsulan en las múltiples capas de las partículas portadoras. Los fármacos hidrófobos / lipófilos permanecen intercalados en la bicapa lipídica de los nanosomas lipídicos, y por lo tanto no se liberan en el medio acuoso in vivo incluso tras la fragmentación o ruptura de tales nanosomas. Tales fármacos encapsulados en los nanosomas lipídicos se transfieren desde la superficie de los nanosomas hacia la superficie de la célula objetivo. En tal caso, los fármacos encapsulados en las lamelas internas de los nanosomas no se utilizan terapéuticamente, y acaban siendo fagocitados por las células del sistema reticuloendotelial y salen de la cadena terapéutica in vivo. La encapsulación acumulativa del fármaco en las lamelas internas es varias veces mayor que en la lamela superficial de los nanosomas. Si todas las lamelas de un nanosoma multilamelar se separan para formar múltiples nanosomas pequeños nuevos, la lamela interna que encapsula el fármaco se convertirá por tanto en una lamela externa que expondrá el fármaco de los nanosomas, y se puede esperar lógicamente que se incremente la concentración eficaz del fármaco sin la adición del API a tal mezcla de formulación lamelar. Esta optimización para proporcionar una mayor concentración activa para conseguir una mayor eficacia terapéutica sería posible sometiendo a los micro y/o nanosomas lamelares mixtos a ruptura ultrasónica junto al lecho del paciente. A partir de la población lamelar mixta, cada partícula hace que estén disponibles varias lamelas, cada una de las cuales se convierte en varios nanosomas. Incrementando el número de nanosomas, la mayoría del API de las partículas portadoras se lleva a la superficie, y por tanto se multiplica la eficacia terapéutica en proporción al incremento del número de nanosomas que portan el fármaco. En el presente caso, la proporción lípido/fármaco varía de 45:1 a 45:15, como se muestra en la tabla a continuación.

Tabla: 1

Forma y tamaño de las diferentes preparaciones de lípidos

Más matriz lipídica / fármaco significa: mayor número de liposomas / mg de fármaco, y por tanto mejor alcance

Proceso de Nanoficación:

Se ha innovado una aproximación nueva para llevar a cabo la nanoficación clínica del fármaco de acuerdo con esta invención mediante el uso de un procesador ultrasónico. Este aparato permite el funcionamiento automático y convierte las partículas en nanosomas más pequeños y menos lamelares, lo que da como resultado una eficacia terapéutica incrementada de manera óptima a través de los mecanismos enumerados a continuación.

En el sitio de inflamación, los capilares desarrollan fenestraciones, y se hacen más permeables, lo que permite que las células se muevan y las sustancias particuladas migren/pasen de la sangre circulante al sitio inflamado circundante. La mejora de la administración de los fármacos en sustancias particuladas en las áreas inflamadas mediante la fenestración se puede facilitar convirtiendo las partículas portadoras más grandes en nanosomas. La nanoficación da como resultado el incremento de la eficacia terapéutica debido al incremento resultante del número de nanósomas que contienen el fármaco en el sitio objetivo.

Otra aplicación importante de la nanoficación es reducir la pérdida de las partículas más grandes por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial. Las células depuradoras identifican rápidamente las partículas más grandes como partículas exógenas, y en consecuencia se fagocitan y se eliminan rápidamente de la circulación. La velocidad de la fagocitosis es inversamente proporcional al tamaño de las partículas que portan el fármaco. Por lo tanto, al disminuir el tamaño convirtiendo las partículas grandes y multilamelares en nanosomas se incrementaría la semivida plasmática, y de ese modo se retrasaría la pérdida fagocítica, lo que incrementaría aún más la eficacia terapéutica.

La presente invención se refiere a compuestos farmacéuticos de liberación controlada que emplean una serie de tecnologías de sistemas nuevos de administración de fármacos basados en los sistemas nanosomales. En este estudio se han estudiado muestras de anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina con criomicroscopía electrónica (crioME). Se ha analizado una muestra reciente y una de dos años sin sonicar, así como tras la sonicación. El análisis de las imágenes de crioME incluyó la distribución de tamaños y la morfología global, tal como la lamelaridad (unilamelar frente a multilamelar) y la agregación.

Se abordaron las siguientes cuestiones específicas:

Distribución de tamaños

Caracterización de la morfología global

Se obtuvieron imágenes de anfotericina B nanosomal que contenía colesterol en muestras en solución salina, recientes y de dos años, mediante el uso de crioME. Las muestras se diluyeron 10 veces y se obtuvieron imágenes sin sonicar y tras 45 min de sonicación. La sonicación se realizó en un baño de agua helada que mantuvo la temperatura de la muestra por debajo de 8 °C.

Distribución de tamaños

La crioME de las muestras de nanosomas diluidas mostró una muestra muy heterogénea con partículas de diversas morfologías y tamaños. El tamaño de las partículas varió desde un diámetro de 20 nm hasta una escala de micrómetros. Como se podría esperar, las cantidades más grandes de los nanosomas con diámetros más pequeños, 20-200 nm, se observaron en las muestras sometidas a sonicación en comparación con las muestras sin sonicar. No se pudieron observar diferencias claras en las imágenes de crioME entre las muestras de nanosomas antiguas y recientes, ni en el caso sin sonicar ni en el caso sonicado. Debido a que las muestras contuvieron partículas con una amplia distribución de tamaños y formas, calcular y presentar los diámetros medios no sería relevante, y solamente proporcionaría una información engañosa.

Morfología global

Los nanosomas de los que se obtuvieron imágenes mediante crioME mostraron membranas bien definidas con un grosor de aproximadamente 7 nm. Las muestras sonicadas mostraron un mayor grado de nanosomas pequeños que se observaron a menudo en forma de partículas separadas, en comparación con las muestras sin sonicar donde los nanosomas estuvieron casi siempre en contacto entre sí. La(s) membrana(s) más externa(s) de las partículas sin sonicar, tanto en las muestras antiguas como en las muestras recientes, a menudo rodearon más de un nanosoma, lo que hizo difícil diferenciar entre nanosomas cercanos.

Lamelaridad

La crioME mostró que los nanosomas aparecen como unilamelares y multilamelares. Se hallaron más nanosomas unilamelares en las muestras sonicadas en comparación con las muestras sin sonicar. El número de capas de membranas que rodeaban las partículas multilamelares varió de 2 lamelas a estructuras en forma de cebolla con más de 10 capas de membranas. También parece como si las partículas grandes pudieran atrapar a las más pequeñas cuando las membranas no están muy próximas. Sin embargo, es posible que el grosor del hielo permita que estos nanosomas atrapados estén localizados espacialmente a lo largo del eje z.

Agregación

La crioME no mostró muchos agregados de nanosomas tridimensionales en ninguna de las muestras. Las partículas en las muestras sin sonicar estuvieron principalmente en un contacto estrecho, y a menudo fue difícil diferenciar dónde acababa un nanosoma y dónde comenzaba otro, ya que a menudo compartieron la capa/capas de membranas más externas.

Conclusión

Las muestras de nanosomas mostraron una muestra muy heterogénea con partículas de diversas morfologías y diámetros que oscilaron desde 20 nm hasta una escala de micrómetros. Los nanosomas unilamelares con diámetros más pequeños, 20-200 nm, se observaron con mucha más frecuencia en las muestras sonicadas en comparación con las muestras sin sonicar. Parece como si la sonicación rompiera de manera eficaz las partículas multilamelares grandes observadas en las muestras sin sonicar hasta nanosomas unilamelares pequeños. Sin embargo, todavía se observaron algunos liposomas multilamelares grandes en las muestras sonicadas, y a menudo estuvieron mejor separados en comparación con las partículas multilamelares grandes de las muestras sin sonicar. La sonicación prolongada puede dar como resultado una ruptura más completa de las partículas grandes.

No hubo diferencias visibles claras entre las muestras de nanosomas antiguas respecto de las recientes al comparar las muestras sin sonicar o sonicadas.

Importancia de la solución salina en la reducción de la nefrotoxicidad de AmB

Las toxicidades relacionadas con la dosis, especialmente la nefrotoxicidad, han sido el principal impedimento de la administración parenteral de anfotericina B. Se sabe que la anfotericina B se une a las membranas ricas en esteroles, y experimentan la formación de poros auto-ensamblados que conducen a la lisis de estas células. Los riñones, que son ricos en contenido de colesterol, y los macrólidos poliénicos, tales como anfotericina B, que tienen una afinidad elevada hacia el colesterol, representan un escenario complejo que limita el uso de tales compuestos como agentes terapéuticos. La encapsulación de anfotericina B en una formulación lipídica que contiene colesterol ha sido una ventaja inadecuada (véase la Tabla 2 a continuación).

Además, el remedio aparente para superar la toxicidad de anfotericina B formulándola en forma de una suspensión en solución salina se está consiguiendo, cuando anteriormente se sabía que la anfotericina precipita en solución salina. En esta invención, la anfotericina B se ha inmovilizado en una matriz que contiene colesterol, lo que previene la movilización y la precipitación consiguiente. El producto de esta invención, anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en una suspensión en solución salina reduce drásticamente la nefrotoxicidad.

Mientras los nanosomas que contienen ergosterol permitirían mayores concentraciones de anfotericina B y tendrían valor para el tratamiento de la leishmaniasis visceral solamente, como proporciona esta invención, la sustitución de ergosterol con colesterol en la anfotericina B nanosomal en una suspensión en solución salina es necesaria para una actividad potente contra levaduras, mohos y dermatofitos, así como leishmania.

La invención, para incluir solución salina como medio de suspensión, se basa en la hipótesis de que el deterioro de la función renal provocado por la anfotericina B, concretamente la azotemia, está asociado a una disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG) y del flujo sanguíneo renal, la reducción de la capacidad de concentración, una acidificación urinaria alterada, y la pérdida de potasio. La nefrotoxicidad de anfotericina B está relacionada con sus propiedades como ionóforo en las membranas biológicas. (Schell R E: Amphotericin B induced nephrotoxicity: Influence of Sodium Status (Letter). Nephron 1992; 60:52).

La toxicidad glomerular se puede desarrollar rápidamente tras una única dosis de anfotericina B, o evolucionar lentamente después de días a semanas de terapia con anfotericina B, dependiendo del estado de hidratación y de la función renal subyacente del paciente. Se ha informado que la administración de solución salina intravenosa antes y después de las infusiones de anfotericina B, una práctica conocida como carga de sodio, mitiga las disminuciones de la tasa de filtración glomerular provocadas por la anfotericina B (R Sabra y R A Branch (1991) Mechanism of Amphotericin B- Induced Decrease in Glomerular Filtration Rate in Rats. Antimicrobial Agents and Chemotherapy: 35; 2509-2514).

DL⁵⁰

El incremento de la proporción lípido/fármaco y también el uso de solución salina para suspender los nanosomas ha hecho que estos nanosomas sean muy seguros. Durante los estudios preclínicos de toxicidad en animales, no se pudo determinar la DL⁵⁰, ya que ningún animal murió hasta 60 mg/kg, y no se pudo administrar por encima de 60 mg/kg. Estos nanosomas están listos para el uso en una suspensión líquida, de forma que no se pueden administrar en forma de una dosis concentrada, y los animales no pudieron tolerar un volumen mayor que el de una dosis de 60 mg. Se observa que ni el colesterol sin solución salina como en la anfotericina B liposomal (consúltese la referencia de toxicidad/composición de AmBisome proporcionada anteriormente) ni la solución salina sin colesterol como en el complejo lipídico de anfotericina B (consúltese la referencia de toxicidad/composición de Abelcet proporcionada anteriormente) reducen la nefrotoxicidad a niveles insignificantes como la composición única de nanosomas con una proporción elevada lípido/fármaco que contienen colesterol en una suspensión en solución salina. La eficacia in vitro de la anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina es mucho mayor (en ocasiones 10 veces) (CIM mucho menor) que la anfotericina B convencional contra el gran número de aislamientos clínicos de levaduras y mohos. La razón de la mayor actividad se debe a que estos nanosomas, así como la membrana fúngica, tienen un medio hidro-lipófilo similar y favorable, de forma que la transferencia de la molécula desde el nanosoma hasta el hongo es sencilla.

Estabilización de nanosomas en colesterol y solución salina

La estabilidad de los nanosomas de anfotericina B nanosomales que contienen colesterol en solución salina sin ningún otro agente estabilizante de membranas se ha hecho posible mediante la composición nueva de la presente invención. La anfotericina B nanosomal de la presente invención por sí misma es estable durante al menos 24 meses desde la fecha de fabricación. Por tanto, es definitivo que el colesterol y la solución salina desempeñan un papel importante en el incremento de la estabilidad de la composición.

Ejemplos:

EJEMPLO 1: Encapsulación de 1-15 mg de fármaco

En la anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina, se podría intercalar con éxito una cantidad diferente, es decir, 1 mg a 15 mg de anfotericina B por ml sin incrementar la cantidad de lípidos, lo que significaría que para cada una de las formulaciones de anfotericina B de 1 a 15 mg/ml, la cantidad de lípidos se fija a 45 mg, es decir, la proporción lípido/fármaco varía de 45:1 a 45:15.

Determinación de la "proporción fármaco:lípido en los nanosomas" y "anfotericina B en el sobrenadante" de las formulaciones innovadoras:

Detalles de la muestra : Código del producto

1 mg/ml: NAmB-C/1

3 mg/ml: NAmB-C/3

5 mg/ml: NAmB-C/5

10 mg/ml: NAmB-C/10

15 mg/ml: NAmB-C/15

Se realizó el ensayo de anfotericina B y se determinó el contenido de metanol residual, y los resultados se presentan más adelante.

Observaciones:

(A) Determinación de anfotericina B en el líquido sobrenadante:

Se centrifugaron todas las muestras y se tomó el líquido sobrenadante para llevar a cabo el ensayo de anfotericina B. Se halló que la lectura a 405 nm en un espectrofotómetro UV-visible fue insignificante, lo que establece la ausencia de anfotericina B en el líquido sobrenadante, lo que significó que no existió anfotericina B sin encapsular en la formulación innovada.

(B) Proporción fármaco:lípido en los nanosomas

Se determinó la proporción fármaco:lípido en los nanosomas de las formulaciones anteriores. Las observaciones se proporcionan a continuación:

Código del producto Concentración Proporción fármaco/lípido

NAmB-C/1 1 mg/ml 1:44,6

NAmB-C/3 3 mg/ml 3:44,4

NAmB-C/5 5 mg/ml 5:45,3

Código del producto Concentración Proporción fármaco/lípido

NAmB-C/10 10 mg/ml 10:45,01

NAmB-C/15 15 mg/ml 15:45,8

Ejemplo 2: Nefrotoxicidad relativa de anfotericina B nanosomal en suspensión en solución salina frente a suspensión en dextrosa:

La nefrotoxicidad intrínseca de la anfotericina B ha sido el obstáculo principal para aprovechar todo el potencial de este fármaco antifúngico potente y de amplio espectro. A pesar de las desventajas conocidas de la dextrosa sobre la acción del fármaco, como se desarrolló anteriormente, y las posibles ventajas de la solución salina, no se pudo sustituir la dextrosa por solución salina, ya que, irónicamente, se sabe que la anfotericina B precipita en solución salina. El diseño único de esta anfotericina B nanosomal ha permitido la formulación estable en una suspensión en solución salina inmovilizando la anfotericina B en una matriz nanosomal. Para evaluar la nefrotoxicidad de la dextrosa frente a la solución salina, se llevaron a cabo los siguientes experimentos:

Se llevaron a cabo los experimentos con dos grupos de ratones albinos suizos, y cada grupo consistió en 6 machos y 6 hembras. A un grupo se le administró la formulación con solución salina y otra con dextrosa a una dosis diaria de 3 mg/kg durante los primeros 8 días, que se incrementó adicionalmente hasta 5 mg/kg/día para el 9° y 10°. Se recogió sangre en días alternos de la mitad de cada grupo de animales, y se determinó la creatinina sérica a partir del día 2 al día 11 diariamente.

DATOS DE QUÍMICA CLÍNICA DE ANIMALES INDIVIDUALES

Anfotericina B nanosomal en un 5% de dextrosa Dosis: 3 mg/kg/día

5 mg/kg/día desde el día 8

Tabla 3

ID del animal - Mb4949 - Se halló muerto el día 2 tras la toma de la muestra de sangre

ID del animal - Mb4948 - Se halló muerto el día 6 tras la toma de la muestra de sangre

Tabla 4

Anfotericina B nanosomal en solución salina normal Dosis: 3 mg/kg/día

5 mg/kg/día desde el día 8

No se observaron diferencias significativas en los niveles de creatinina sérica en ningún grupo, por lo que se necesitaron experimentos con mayores dosis y una duración más larga.

En este experimento, hubo dos grupos de ratones que comprendieron cada uno 50 ratones, con igual número de machos y hembras. La dosis diaria se sustituyó por una administración en días alternos de una dosis de 10 mg/kg, a un grupo se le administró anfotericina B nanosomal en un 5% de dextrosa y a otro en solución salina normal. Para la determinación de los niveles de creatinina sérica, se recogió sangre semanalmente.

Tabla 5

En el grupo de dextrosa no se observaron diferencias significativas hasta la 2a semana, e incluso posteriormente hasta las seis semanas la elevación de los niveles de creatinina sérica no fue significativa. Se observa un incremento de la creatinina sérica de más del doble del valor inicial en 2 animales en la 4a semana, 3 animales en la 5a semana, y un animal en la 6a semana. En un animal, en la 3a semana y en otro en la 5a semana la muerte parece estar relacionada con la toxicidad renal del fármaco. Globalmente, se observó nefrotoxicidad en un 14% de los animales.

En el grupo de solución salina, los niveles de creatinina sérica siguen siendo coherentes a lo largo de la duración del experimento de 6 semanas. Solamente en un animal la elevación del nivel de creatinina sérica superó el doble del valor inicial después de 6 semanas de administración. Se observa nefrotoxicidad global en solamente un 2% de los casos. 5 de los ratones murieron durante el experimento, pero la muerte no parece estar relacionada con el fármaco.

Ejemplo 3: Estabilización de nanosomas en colesterol y solución salina

Se ha hecho posible la estabilidad de la anfotericina nanosomal que contiene colesterol B en solución salina, sin ningún otro agente estabilizante de membranas, durante dos años mediante la composición única informada en esta invención.

Ensayo de estabilidad en tiempo real en el producto acabado

Producto : Anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina.

Duración de Almacenamiento : Esta anfotericina B nanosomal es estable al menos 24 meses desde la fecha de fabricación

Caducidad Propuesta 24 meses

Almacenamiento Almacenamiento a 2-8 °C

Lotes de Control Los ensayos del estudio de estabilidad de anfotericina B nanosomal se llevaron a cabo con 3 lotes

Lote N° Fecha de Fabricación Fecha de Caducidad

50F07-147 08/2007 07/2009

50F07-148 08/2007 07/2009

50F07-149 08/2007 07/2009

Condiciones de : Para el estudio de estabilidad a largo plazo los productos se mantienen a 2-Almacenamiento 8 °C

Intervalos de Ensayo : Las muestras almacenadas se retiran a intervalos predeterminados, y los

intervalos son los siguientes:

0 meses

3 meses

6 meses

12 meses

18 meses

24 meses

Datos del estudio de estabilidad en tiempo real de anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina Lote N2 50F07-147

Fecha de Fabricación 08/2007

Fecha de Caducidad 07/2009

Tabla 6

Datos del estudio de estabilidad en tiempo real de anfotericina B liposomal que contiene colesterol en solución salina Lote N2 50F07-148

Fecha de Fabricación 08/2007

Fecha de Caducidad 07/2009

Tabla 7

Datos del estudio de estabilidad en tiempo real de anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina Lote N2 : 50F07-149

Fecha de Fabricación : 08/2007

Fecha de Caducidad : 07/2009

Tabla 8

Ejemplo 4: Comparación de la actividad in vitro de la anfotericina B convencional y la anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina (N Anfotericina B)

Los experimentos se llevaron a cabo para determinar el espectro antifúngico y la CIM de la anfotericina B nanosomal frente a los antifúngicos habitualmente usados, concretamente anfotericina B, voriconazol, itraconazol y fluconazol para determinar la eficacia contra levaduras y mohos patógenos, que incluyen dermatofitos.

Se ensayaron los siguientes aislamientos clínicos:

Hongos N° de aislamientos

Candida albicans 20

Candida tropicalis 20

Otras Candida distintas de albicans 20

Cryptococcus neoformans 20

Género Trichosporon 10

Zygomycetes 25

Género Aspergillus 25

Hifomicetos dematiáceos 20

Género Fusarium 10

Género Scedosporium 5

Género Paecilomyces 5

Sporothrix schenckii 10

Penicillium marneffei 10

Total 200

La actividad in vitro de la anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina es muchas veces mayor (en algunos casos 10 veces y una CIM mucho menor) que la anfotericina B convencional contra el gran número de aislamientos clínicos de levaduras y mohos. Además, la anfotericina B se conoció hasta ahora por no ser eficaz contra los dermatofitos, mientras la anfotericina B nanosomal es eficaz contra los dermatofitos, concretamente Trichophyton rubrum, T. tonsurans, T. mentagrophytes, Microsporum gypseum, y Epidermophyton floccosum. La razón de la mayor actividad se puede deber a que estos nanosomas, así como la membrana fúngica, tienen un medio hidro-lipófilo similar y favorable, de forma que la transferencia de la molécula de anfotericina B desde el nanosoma hasta el hongo es sencilla.

Las observaciones también apoyan la posibilidad de reducir la dosis cuando se administra anfotericina B en forma de nanosomas que contienen colesterol. La anfotericina B convencional, que es una suspensión coloidal del fármaco en desoxicolato sódico, se administra en forma de una dosis diaria de 1 mg/kg de peso corporal/día, mientras sus formulaciones lipídicas comercialmente disponibles desarrolladas para superar la toxicidad limitante de la dosis tienen dosis que oscilan de 3-6 mg/kg de peso corporal/día. Las dosis elevadas afectan a la economía del tratamiento, y hacen que el fármaco sea inasequible, mientras la anfotericina B nanosomal que contiene colesterol ayudaría a reducir la dosis terapéutica y a su vez haría que el tratamiento fuera asequible.

Dermatofitos:

1. Trichophyton rubrum, T. tonsurans, T. mentagrophytes.

2. Microsporum gypseum

3. Epidermophyton floccosum

Hongos que provocan infección cutánea:

1. Candida, Aspergillus, Mucor

Especies resistentes a los Azoles:

1. Candida albicans N Anfotericina B : Activo (0,03-0,25)

Anfotericina B : Activo (0,125-1)

Fluconazol Variable (0,125-64)

Voriconazol : Variable (0,03-8)

Itraconazol : Variable (0,03-8)

2. Cryptococcus neoformans N Anfotericina B : Activo (0,03-0,25)

Anfotericina B : Activo (0,25-1)

Fluconazol Variable (0,125-16)

Voriconazol : Variable (0,03-16)

Itraconazol : Intermedio (0,03-4)

3. Aspergillus flavus, N Anfotericina B : Activo (0,06-0,5)

A. fumigatus Anfotericina B : Activo (0,5-2)

Fluconazol : Resistente (32-64)

Voriconazol : Activo (0,125-1)

Itraconazol : Variable (0,03-16)

Anfotericina B : Activo (1 -2) Fluconazol : Resistente (64) Voriconazol : Resistente (8-16) Itraconazol : Resistente (0,03-8)

N Anfotericina B : Activo (1) Anfotericina B : Activo (2)

Fluconazol : Resistente (64) Voriconazol : Intermedio (8) Itraconazol : Resistente (16)

)

)

Anfotericina B : Activo (0,5-1) Fluconazol : Resistente (8-64) Voriconazol Variable (0,03-16)

Itraconazol Variable (0,03-16)

17. Penicillium marneffei N Anfotericina B Activo (0,125-0,5)

Anfotericina B Activo (0,25-1)

Fluconazol Resistente (32-64)

Voriconazol Activo (0,25-1)

Itraconazol Activo (1 -2)

18. Trichophyton rubrum N Anfotericina B Activo (0,06-0,125)

Anfotericina B Activo (0,25-1)

Fluconazol Variable/Resistente (4-32)

Voriconazol Activo (0,25-0,5)

Itraconazol Resistente (8-16)

19. Trichophyton mentagrophytes N Anfotericina B Activo (0,125-0,5)

Anfotericina B Activo (0,5-2)

Fluconazol Resistente (32-64)

Voriconazol Activo (0,5-1)

Itraconazol Activo (1 -2)

20. Microsporum gypseum N Anfotericina B Activo (0,125)

Anfotericina B Activo (0,5)

Fluconazol Resistente (64)

Voriconazol Activo (0,125-0,5)

Itraconazol Activo (0,25-0,5)

21. Género Paeciliomyces N Anfotericina B Variable (0,25-16)

Anfotericina B Intermedio (1-4)

Fluconazol Resistente (64)

Voriconazol Variable (0,125-8)

Itraconazol Variable (0,06-16)

Especies resistentes a fluconazol: Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Penicillium marneffei, Sporothrix schenckii, Scytalidum dimidatum, Phialophora verrucosa, Cladophialophora bantiana, género Alternaria, género Curvularia, Apophysomyces elegans, género Mucor, Absidia corymbifera, Rhizopus arrhizus, R. pusilus, Pseudallescheria boydii, género Fusarium, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. oryzae, género Paeciliomyces. Especies variables a fluconazol: Candida albicans, Cryptococcus neoformans.

Especies resistentes a voriconazol: Género Mucor

Especies variables a voriconazol: Sporothrix schenckii, Absidia Corymbifera, Rhizopus arrhizus, R. pusilus, Cryptococcus neoformans, Candida Albicans, género Paeciliomyces.

Especies resistentes a itraconazol: Trichophyton rubrum, género Curvularia, género Fusarium, Absidia Corymbifera, género Mucor, Apophysomyces elegans, género Curvularia, Rhizopus arrhizus, R. pusilus, Phialophora verrucosa, Scytalidum dimidatum.

Especies variables a itraconazol: Sporothrix schenckii, Aspergillus flavus, A. fumigatus, Candida albicans, género Paeciliomyces.

Especies variables a anfotericina B nanosomal: Género Paeciliomyces

Ejemplo 5: TEM y SEM de congelación y fractura antes y después de la sonicación:

Efecto de la proporción lípido:fármaco sobre las cuentas de partículas/ml, Efecto de la sonicación sobre las cuentas de partículas/ml:

Las muestras de nanosomas mostraron una muestra muy heterogénea con partículas de diversas morfologías y diámetros que oscilaron desde 20 nm hasta una escala de micrómetros. Los nanosomas unilamelares con diámetros más pequeños, 20 a 200 nm, se observaron con mucha más frecuencia en las muestras sonicadas en comparación con las muestras sin sonicar. Parece como si la sonicación rompiera de manera eficaz las partículas multilamelares grandes observadas en las muestras sin sonicar hasta nanosomas unilamelares pequeños. Sin embargo, todavía se observaron algunas partículas multilamelares grandes en las muestras sonicadas, y estuvieron separadas en comparación con las partículas multilamelares grandes de las muestras sin sonicar. La sonicación prolongada puede dar como resultado una ruptura más completa de las partículas grandes.

No hubo diferencias visibles claras entre las muestras antiguas respecto de las recientes al comparar las muestras sin sonicar o sonicadas. Las muestras, por lo tanto, parecen ser estables a lo largo del periodo de tiempo (2 años) investigado como se muestra en las Figuras 1 y 2.

Ejemplo 6: Uso oftálmico tópico de una suspensión en solución salina de anfotericina B nanosomal que contiene colesterol

La anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina también se estudia de manera tópica en los ojos, y se descubre que es segura y eficaz. El modelo de queratitis por Aspergillus fumigatus se trató con anfotericina B nanosomal y convencional de diferentes concentraciones y controles sin tratar. Los resultados muestran que la mitad de la concentración de anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en solución salina es tan eficaz como la concentración total de anfotericina B convencional.

Evaluación de la eficacia y toxicidad de la anfotericina B nanosomal que contiene colesterol en una formulación en solución salina durante el tratamiento de la queratitis fúngica experimental en conejo.

Objetivos:

a. Evaluar la eficacia de anfotericina B nanosomal tópica en el tratamiento de la queratitis fúngica inducida en un modelo experimental en conejo.

b. Comparar la eficacia de la anfotericina B nanosomal a una concentración del 0,1% y 0,05% con la anfotericina B convencional a una concentración del 0,1%.

c. Estudiar cualquier toxicidad ocular en conejo debida al tratamiento con anfotericina B nanosomal y comparar la misma con la toxicidad debida a la aplicación tópica de anfotericina B a una concentración del 0,1%.

Métodos

Sujetos: Conejos blancos New Zealand - 72

Aislamiento fúngico: Aspergillus fumigatus (ATCC 13073), Candida albicans, Fusarium solani

Se cultivaron Aspergillus fumigatus y Fusarium solani en tubos de agar inclinado de dextrosa de patata a 30° C durante 3-10 días. Se preparó una suspensión conidial pasando suavemente una torunda estéril por el cultivo y transfiriéndola a 3-4 ml de solución salina estéril en un tubo cónico de 15 ml. La concentración final de conidios se ajustó para obtener 106 conidios / ml. Se cultivó Candida albicans en una placa de agar de dextrosa de patata durante 24 horas a 35 °C. Se recogieron cinco colonias >1 mm de diámetro y se suspendieron en 5 ml de solución salina estéril al 0,85% en un tubo cónico estéril de 15 ml. La suspensión se agitó en vórtex y las células se contaron mediante el uso de un hemocitómetro. Se preparó una suspensión de trabajo de células de levadura en solución salina estéril para conseguir una concentración final de 106 UFC/ml.

Inducción de queratitis y tratamiento

Se usó un total de 72 conejos en el estudio, de los cuales 60 conejos se infectaron con un inoculo de Aspergillus fumigatus, de los cuales 22 conejos se infectaron mediante el uso del modelo de lente de contacto, mientras 38 se infectaron mediante el uso de la técnica intraestromal. Se infectaron ocho conejos con un aislamiento clínico de Candida albicans (4 conejos con 108 levaduras/ml y 2 con 109 células/ml mediante inoculación intraestromal, y se infectaron 2 conejos usando el modelo de lente de contacto con 109 células/ml). Se infectaron cuatro conejos con un aislamiento clínico de Fusarium Solani a dosis de inóculo de (106 esporas/ml) mediante la técnica intraestromal.

Inducción de queratitis mediante el uso de lentes de contacto: Los conejos se anestesiaron con ketamina y xilazina intramuscular. La anestesia corneal se proporcionó mediante el uso de proparacaína tópica al 0,5%. La membrana nictitante del ojo derecho se retiró mediante disección cortante. Se colocó un disco de papel de filtro de 7 mm humedecido con alcohol isopropílico del 99% (Merck, EE.UU.) en el centro de la córnea durante 30 s, y se retiró el epitelio corneal de manera atraumática. El ojo se lavó con una disolución de lactato sódico para eliminar cualquier traza restante de alcohol isopropílico. Se hizo un patrón cuadriculado de abrasiones en la córnea central. Se transfirió el inóculo fúngico a la córnea desnuda mediante el uso de una punta de pipeta de orificio ancho y el inóculo se retuvo en la córnea colocando la lente de contacto estéril (diámetro 14,0 mm) (Pure vision, Bosch and Lomb, Irlanda). Para prevenir la extrusión de la lente de contacto, se cerraron los párpados llevando a cabo una tarsorrafía con suturas de seda 5-0. Los ojos se examinaron después de 48 horas retirando la lente de contacto y posteriormente cada 48 h. Se obtuvo el botón corneal de cada uno de estos conejos, y se sometió a investigación microbiológica e histopatológica.

Inducción de queratitis mediante inyección intraestromal del inóculo: Los conejos se anestesiaron con ketamina y xilazina intramuscular. La anestesia corneal se proporcionó con proparacaína tópica al 0,5%. Se inyectaron 20 l de inóculo fúngico (106 esporas/ml) de manera intraestromal mediante el uso de una aguja de insulina 30 G doblada guiándose con una lámpara de hendidura. Los conejos se examinaron cada 2 días en busca de signos de queratitis.

Evaluación de los antifúngicos: Debido a que se observó una infección persistente con el modelo de inyección intraestromal del inóculo, el estudio del tratamiento se llevó a cabo con este modelo. Para el tratamiento, los conejos se dividieron de manera aleatoria en cuatro grupos que contuvieron cada uno 4 conejos.

Los grupos a los que se inoculó Aspergillus fumigatus fueron:

Grupo 1) tratado con 0,1% de anfotericina B nanosomal,

Grupo 2) tratado con 0,1% de anfotericina B convencional,

Grupo 3) tratado con 0,05% de anfotericina B nanosomal

Grupo 4) instilación de solución salina normal estéril (controles sin tratar).

Las infecciones antes y después de la terapia se clasificaron proporcionando una puntuación compuesta para los diferentes signos clínicos determinados mediante el uso de un microscopio de lámpara de hendidura. Las puntuaciones clínicas se tabularon para cada grupo, y se tomó su media.

Resultados

Modelo de lente de contacto: Para la estandarización inicial de la queratitis fúngica, de los 22 conejos usados ocho conejos se infectaron con un inóculo que contuvo solamente una suspensión de esporas de Aspergillus fumigatus siguiendo el modelo de lente de contacto. Sin embargo, esto no proporcionó ninguna prueba clínica o microbiológica de infección (tanto el frotis como los cultivos fueron negativos, Tabla 1). Posteriormente, se infectaron catorce conejos con una mezcla de esporas y micelio, lo que proporcionó una infección consistente en los conejos como se observa en la Tabla 1. Aunque hubo una infección clínica consistente, la gravedad de la infección se redujo después de cinco días. Por lo tanto, no fue posible iniciar el tratamiento al 5° día. Por lo tanto, se adoptó el modelo de inyección intraestromal para los experimentos posteriores, y el tratamiento con antifúngicos se inició al quinto día de infección.

Tabla 9

Resultados de la inducción de queratitis fúngica en ojos de conejo mediante el uso del modelo de lente de contacto

Evaluación de la terapia antifúngica mediante el uso del modelo intraestromal: Los conejos sin tratar tuvieron una puntuación media de 16,1 ± 4,1 DE el día 15. Sin embargo, los conejos tratados con anfotericina B nanosomal al 0,1% tuvieron una puntuación media de 8,6 ± 2,37 DE, que fue estadísticamente significativa en comparación con el grupo sin tratar (p<0,001). De forma similar, los grupos tratados con anfotericina B nanosomal al 0,05% y anfotericina B convencional al 0,1% tuvieron unas puntuaciones medias de 8,8 ± 2,37 DE y 8,4 ± 2,0 DE, respectivamente.

Hubo una diferencia significativa en la cicatrización cuando los conejos se trataron con los tres fármacos en comparación con el grupo sin tratar, y fue estadísticamente significativa (p<0,001). Sin embargo, la puntuación clínica compuesta de la formulación nanosomal al 0,05% es similar a la de 0,1% del fármaco convencional para la queratitis por Aspergillus.

Tabla 10

Ejemplo 7: Prueba experimental de la "administración dérmica de anfotericina B mediada por nanosomas de fosfolípidos-colesterol" con un diseño innovador

La anfotericina B, muy conocida por no absorberse a través de la piel, ha limitado el desarrollo de una formulación tópica eficaz, que se ha superado mediante esta invención encapsulando anfotericina B en nanosomas innovadores de colesterol/fosfolípidos. La penetración y la administración dérmica de la anfotericina B encapsulada en nanósomas se puede atribuir a las ventajas específicas de los nanosomas de colesterol-fosfolípidos, es decir, la interacción de los fosfolípidos con los lípidos intercelulares; la presencia de humedad junto con los lípidos; y los cambios en las propiedades fisicoquímicas, tales como la solubilidad y el reparto de las moléculas de anfotericina B como se desee. Además, como se observó, la retención alcanzada de anfotericina B en la piel en la aplicación tópica de la anfotericina B nanosomal en la formulación innovadora es uno de los comportamientos más deseados para mejorar la interacción fármaco-receptor, así como para la acción prolongada de anfotericina B.

Los resultados, tal como se obtuvieron tras el estudio del comportamiento de la permeabilidad cutánea y el análisis fotográfico con marcaje fluorescente, apunta de manera convincente a la superioridad de la formulación de anfotericina B nanosomal frente a una crema de anfotericina B preparada de manera convencional. Esta es la base de la novedad de la anfotericina B nanosomal para la administración dérmica tópica de anfotericina B.

Objetivos:

Estudiar la influencia de los nanosomas que contienen colesterol en una formulación en solución salina en la administración dérmica de anfotericina B en comparación con una crema de anfotericina B convencional - Desarrollo del medio de estudio adecuado para los estudios de permeabilidad

Desarrollo y validación de los métodos de análisis

Estudios de permeabilidad in vitro mediante el uso de una celda de difusión de Franz

Determinación de fármaco-piel de manera retentiva

Monitorización del transporte de fármaco (estudios con marcaje fluorescente)

La anfotericina B se incluye en los fármacos de clase IV del BCS, y por tanto es difícil que penetre en cualquier barrera biológica, lo que incluye la piel. Las diversas razones incluyen las siguientes:

Problemas específicos del fármaco

Solubilidad

Reparto

Problema específico de la piel (barrera de queratina córnea dura)

Interacciones fármaco-piel

Interacciones indebidas por la diferencia en las propiedades fisicoquímicas del fármaco y la piel

A pesar de los intentos anteriores de fabricar una aplicación tópica útil, la molécula voluminosa de anfotericina B es difícil de absorber a través de la piel. Como resultado, nadie pudo conseguir con éxito el objetivo. El problema fundamental de la molécula son sus propiedades fisicoquímicas, así como la barrera cutánea. Esto proporciona un fundamento para explorar la capacidad del sistema nanosomal para la administración tópica. En la presente memoria la hipótesis se basa en el principio de que el fármaco en el entorno vesicular acuoso-lipoidal adquiriría un grupo diferente de propiedades fisicoquímicas para interaccionar de manera favorable, para migrar más profundamente en las capas de la piel. La humedad dentro de las vesículas, junto con las moléculas lipídicas, es el actor clave en la transferencia mejorada del fármaco frente a los sistemas convencionales. Además de esto, la integración de los fosfolípidos con los lípidos de la piel ayuda a construir un entorno conducente a la administración mejorada.

Metodología

Estudios de Difusión y Retención: Se estudió la permeabilidad cutánea de anfotericina B mediante el uso de diferentes sistemas portadores mediante el uso de una celda de difusión de Franz. El área de permeabilidad eficaz de la celda de difusión y la celda receptora fue 3,14 cm2, y los volúmenes de las respectivas celdas fueron 10 ml y 30 ml. La temperatura del fluido receptor se mantuvo a 32 ± 1 °C. El compartimento receptor contuvo Briz-35 (5%) Docusato Sódico (DOS) (1%) en agua destilada para facilitar las condiciones receptoras.

Se montó piel abdominal de ratones Laca macho (4 a 6 semanas de edad), tras la eliminación del pelo y la retirada de la grasa de la piel, entre los compartimentos donante y receptor. Se aplicó una formulación equivalente a 358,5 gg (crema nanosomal/convencional) en el compartimento donante, después de equilibrar la piel con el medio receptor durante 2 hr. Se retiraron muestras (1 ml) a través del orificio de toma de muestras del compartimento receptor, con sustitución, a un intervalo predeterminado y se analizaron mediante un espectrofotómetro UV tras la dilución adecuada.

Estudio de migración con marcaje fluorescente: Se ha aprovechado el carácter fluorescente intrínseco de la anfotericina B para visualizar la migración y localización del fármaco con el tiempo. Los ratones Laca se afeitaron mediante el uso de una crema depilatoria un día antes del estudio. Los ratones se sacrificaron humanamente a un intervalo predeterminado, e inmediatamente se lavó la piel con PBS de pH 7,4 y se almacenó en un 10% de formalina a -20 °C hasta la crio-microdisección. Los cortes se observaron con un microscopio de fluorescencia con un filtro F2.

Observaciones

Estudios de difusión y retención: Se probó una diversidad de sistemas disolventes y finalmente se eligió un sistema compuesto de Briz-35 (5%) Docusato Sódico (1%) como medio receptor. El objetivo de este estudio fue estudiar la penetración, retención y permeabilidad del fármaco en y a través de las capas de la piel, respectivamente. La observación principal es que existe una retención apreciable de fármaco en las capas de la piel tras la aplicación nanosomal (es decir, 1,291 ± 0,04) frente a la crema convencional (0,142 ± 0,05). Sin embargo, con respecto a la permeabilidad, el fármaco anfotericina B no pudo penetrar a través de las capas de la piel (en ambos casos de sistemas nanosomales y convencionales), y es insignificante como se muestra en la Figura 3.

Fig. 3. Sección transversal fluorescente de piel tras la aplicación de (a) crema de anfotericina B convencional a 0,5 hr; (b) crema de anfotericina B convencional a 1,0 hr; (c) crema de anfotericina B convencional a 2,0 hr; (d) formulación de anfotericina B nanosomal a 0,5 hr (e) formulación de anfotericina B nanosomal a 1,0 hr (f) formulación de anfotericina B nanosomal a 2,0 hr.

Tabla 11

Liberación y retención del fármaco de anfotericina B:

Estudio de migración con marcaje fluorescente: El estudio con marcaje fluorescente (tras la aplicación de las formulaciones convencionales y nanosomales) para monitorizar la penetración del fármaco en la capa de la piel se ha mostrado en la Fig. 1. Comprende la monitorización a diferentes intervalos de tiempo, es decir, 0,5, 1,0, 2,0 hrs. El estudio reveló una diferencia apreciable a estos intervalos. La diferencia más notable se halló tras 2 hrs de estudio.

El resultado de los estudios del comportamiento de permeabilidad (celda de difusión de Franz) y los estudios de penetración (estudios histológicos en piel con marcaje fluorescente) indican la capacidad de las vesículas nanosomales de mejorar la administración de anfotericina B. Como se muestra mediante los datos de retención de fármaco, así como la fotografía a las 2 hr de la histología cutánea, la anfotericina B contenida en los nanosomas es capaz de penetrar de manera apreciable en comparación con la formulación de fármaco convencional. La permeabilidad escasa de la anfotericina B nanosomal, así como de la formulación de fármaco convencional, revela que el fármaco no atraviesa la capa de la piel, y por lo tanto no se ajusta a la administración transdérmica de anfotericina B. En lo sucesivo, la anfotericina B en nanosomas ha mostrado una buena capacidad para la administración dérmica. La penetración escasa incluso es una ventaja, ya que no permite que la anfotericina B se absorba de manera sistémica.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación para el tratamiento de infecciones fúngicas que consiste en anfotericina B encapsulada en un nanosoma de fosfolípidos y colesterol en una suspensión en solución salina, en donde la suspensión es diluible solamente en solución salina, y en donde la proporción en peso lípidos/anfotericina B es 45:1.

2. La formulación según la reivindicación 1, en donde la anfotericina B se somete a sonicación para convertir las partículas en nanosomas más pequeños y menos lamelares de diámetros de 20-200 nm.

3. La formulación según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para el uso en el tratamiento de una infección fúngica.