JPH03500650A - ポリエン系マクロライドのプレリポソーム粉末 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリエン系マクロライドのプレリポソーム粉末本発明は抗真菌性ポリエン系マク ロライドを含有するリポソームを調製するのに使用できる組成物、およびその製 造方法に関する。

宿主−真菌間の相互作用を理解するため、臨床的な観察および動物実験の研究が なされている。真菌症に対する宿主防御は多元的であり、病因によって種々異な り得ると認識されてきた。殆どの場合、抵抗性の機序は十分に規定されていない が、種々の先天性バリアーおよび細胞性免疫応答が一義的に重要であると思わｎ る。先天的な防御の虚弱と細胞性免疫応答の衰弱とが、クリブトコツカス・不才 ホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、およびカン ジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種 のような日和見感染源、ならびにヒストブラズ？−カブスラタム（Ｈｉｓｔｏｐ ｌａｓｍａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）およびコク７ジオイデス・イミチス（Ｃｏ ｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　１ｍｍ１ｔｉｓ）などの真因性病原体由来の重篤を真菌 症に対する個体の感受性を増大させ得ることは明らかである。多くの研究によっ て真菌が種々の宿主免疫機能に悪影響を与え得ることが証明され、それにより、 重要な宿主防御を完全に理解する困難性はますます複雑化の感を呈してきた。

これら多（の実験的知見の臨床上の重要性を評価するのは時期尚早であるが、多 くの研究者らによって、真菌が好中球の機能に障害を与え、ＩｇＥ応答を誘起し 、そして細胞性免疫応答を抑制する原因となることが証明されている。

感受性の増大に伴うと思われる宿主の変化は、火傷または刺傷などの外傷では偶 発的に誘起さね得、慢性アルコール依存症では自己誘導的に誘起され、そして真 性糖尿病、種々の先天性免疫不全症、膠原病、リンパ細網腫瘍性疾患、および他 の膿瘍タイプにおいては自然に発生し、あるいはカテーテルなどの器具の使用、 心臓の切開手術などの外科的手法により、または移植片拒絶を防くためおよび腫 瘍性疾患を処置することを目的とした細胞毒性薬物の使用、コルチコステロイド 療法、および広域スペクトラム抗生物質の長期使用により、医原的に誘起され得 る。

真菌症に対する抵抗性を補助する化学的因子は十分に規定されていない。これら の物質についての学識は、臨床レベルにおける状況証拠および実験レベルにおけ るインビトロ所見を主として基礎とするものである。思春期に起こる皮膚の脂肪 および脂肪酸量のホルモン関連性の増加は、皮膚糸状菌であるミクロスボルム・ オードウイニイ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ　ａｕｄｏｕｉｎｉｉ）によって惹起 される白撥に対する抵抗性の増大と相関するが、もっとも、思春期の変化が抵抗 性の唯一の因子ではない。血清、髄液、および唾液中にある物質は、クリプトコ ツカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ）の増殖を制限することができ、体液中の塩基性ペプチドはカンジダ・アルビカ ンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）を阻止することが示さねている。

臨床的および実験的試験の結果により、Ｃ，アルビカンス、Ｃ，ネオホルマンス 、アスペルギルス・フミガラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔＵＳ ）、およびＣ，イミチスが補体カスケードの別経路を活性化することが示されて いる。真因の細胞壁のポリサッカライドの性質により、医療上重要な真菌はすべ て、補体を活性化すると期待される。このような活性化は、ある種の真菌症に対 する防御において重要であろう。動物において後期−活性化補体成分（Ｃ３−Ｃ ９）の欠損とＣ。

ネオホルマンスおよびＣ，アルビカンスなどの真菌に対する感受性の増大との間 には、正の相関性があることが証明されている。食細胞が真菌に対する抵抗性に 重要であると仮定すると、補体の活性化は、補体フラグメン）Ｃ３ａおよびＣ５ ａの生成に基づく急性炎症性応答を刺激し、かつ食細胞による摂取のためにオプ ソニン化フラグメント（Ｃ３ｂおよびＣ３ｄ）で真菌要素を包む、という役割を 果たすことができる。

ヒトおよび他の動物の全身性の真菌症は、病原性であり、健康な宿主に疾患を引 き起こすある種の真菌、および通常は無害であるが、免疫防御が障害を受けてい る患者では疾、巴を惹起する他の真菌（日和見性病原体）によって引き起こされ る。これらの真因の中には腐敗菌であるものもあり（土壌、鳥類の糞）、また正 常ヒト細菌叢の一部（共生）であるものもある。ヒトは、決して孤立性のまたは 必須の宿主ではない。

土壌腐敗菌の例としては、ヒストプラズマ・カブスラツム（Ｈｉｓｔ。

ｐｌａｓｍａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕ＋＋＋）が挙げられ、これは通例、風土病の 感染源であるｏ遅延型の皮膚過敏症試験では８０％−９０％の成人がヒスドプラ スミアに対して陽性反応を示す。日和見感染性の病原体にはカンジダ・アルビカ ンスがあり、これは通常、口腔、胃腸管、およびおソラ＜ハ皮膚に存在している 。しかし、急性白血病の患者、（士、Ｃ。

アルビカンスは普通、血液中に存在し、これが、劇症の、通常は致死性の敗血症 に至らしめる。他の日和見感染は、糖尿病アシド−シス（ムフール菌症）および ホジキン病（たとえばクリプトコックス症およびヒストプラズマ症）の患者に認 められる。これらの疾病誘発の機序は定かでないが、細胞性免疫が良好な予後に は必須であると思わｎる。

活性ワクチンまたは能動免疫血清の免疫化のいずれによっても、商業的に入手可 能な調製物を得るのに十分な成功を収めていない。

活性疾患の処置は、対症的であり（たとえば蒲みの解消）、時には手術も行い（ 治療不能の障害性組織の切除、および水頭症の矯正）、そして化学療法治療（第 １表）が最も成功を収める。通常使用される化学療法剤の中には、ヒドロキシス テルバミジン・イセチオネート、アンホテリシンＢ５５−フルシトシンン（フル シトシン）、ミコナゾール、およびケトコナゾールがある。これらの薬物に対す る応答は、真菌、疾患のタイプ、および疾病の経過によって種々変動する。

たとえば、殆とのＢ、デルマテチジス感染では応答は良好であるが、Ａ、フミガ ラスによって誘起される殆どの疾患では良好でない。応答は、Ｃ，イミチスによ る髄膜炎におけるよりも、Ｂ、デルマチテジスによって誘起される皮膚損傷にお けるほうが良好であり、また劇症カンジダ症におけるよりも慢性クリプトコック ス症におけるほうが良好である。以下の第１表に、いくつかの全身性真菌症、お よび一般的に許容されている化学療法剤を一覧にして示す。

（以下余白） ！１考 疾　患　第１次選択　第２次選択 アスペルギルス症　アンホテリシンＢ　ケトフナゾールブラストミセス症　アン ホテリシンＢ　ヒドロ牛／スチルバミジン・イセチオネート カンジダ症　アンホテリンンＢ　フルシトシンまだ一ケトコナゾール コクシジオイデス症　アンホテリシンＢ　ケトコナゾールクリプトコックス症　 アンホテリシンＢ　χいずれかの薬物をフルシトシン　単独で使用 ヒストプラズマ症　アンホテリシンＢ　ケトコナゾール本ム）−に菌Ｍ　アンホ テリシンＢ　ミコナゾールＸパラコクレジオイド　アンホテリシンＢ　スルポン アミド。

ミコーシス　ヶトコナゾールエ ！：真菌の最小阻止濃度に基づく。

感染は、リンパ腫に罹患した患者では５１％、白血病の患者では７５％を死に至 らしめる。細菌はこのような多くの感染の原因となる生物であるが、真菌は、リ ンパ腫の患者においては致死性感染の１３％の原因となり、また白血病の患者で は２０％以上の原因菌となる。真菌類であるカンジダ・アルビカンスか、こわら 感染の８０％以上の原因菌であり、アスペルギルスｓｐｐ、もこのような感染の 頻繁の原因菌である。さらに、真菌感染は、免疫系の先天性および後天性不全症 の患者における罹患および死亡の主要な原因である。

ヒトの真菌感染を処置するために有用である活性物質を検索するために、協調し た多大の努力が払わわている。その結果、多くの化合物が単離され、それらが抗 真菌活性を有することが証明されているが、それらの殆どは、溶解性、安定性、 吸収性および毒性に伴う問題によってヒトの感染における治療学的価値は限定さ れている。殆どの有用な抗真菌抗生物質は、２つのカテゴリーのいずれかに帰属 される。１つは真菌の細胞膜に作用するものであり、もう１つは細胞に取り込ま れてＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質合成などの生存に必要な細胞プロセスを妨 害するものである。以下の第２表にこれらの有用な抗真菌性物質とその作用機序 を示す。

第２表 幾つかの有用な抗真菌性物質、その化学的分類およびその作用機序クラス　化合 物　機序 ポリエン　アンホテリシンＢ　真菌細胞膜のステロール（エルゴナイスタチン　 ステロール）と相互作用し、生存に必要な構成成分、たとえばカリ ラムの流出に対して選択に透過性 にする。

イミタソール　ミコナゾール　ラフステロールの脱メチル化を阻クロトリマゾー ル　害することにより真菌の細胞膜のケトコナゾール　生存に必要なエルゴステ ロールの生成を妨げる：さらに真菌細胞へ の直接的殺菌作用を有する。

ピリミジン　５−フルオロシト　受容細胞に取り込まれて脱アミノシン化ヲ受け 、５−フルオロウラシル を生成し、それがＲＮＡの合成を 阻害する：さらにはチミジレート 合成およびＤＮＡ合成を阻害する と考えられる。

グリサン　グリセオフルビン　チ二一プリンと結合し、微小管アセンブリーを阻 害する。

３−７　リール　ピロールニドリン　スクシネート＊たはＮＡＤＨとコピロール 　エンザイムＱ間の終末電子伝達を阻害すると考えろれる。

グルタルアミド　シクロへキシミド　８０Ｓリボン−ムレベルのタンパク合成を 阻害し、アミノアンルｔ ＲＮＡのリポゾームへの運搬を妨 げる。

ポリエン系マクロライド抗生物質は、ストレプトマイセスの様々な種から産生さ れる二次代謝産物である。これら化合物の幾つかの共通した特徴は、既に単離さ れている８０以上の種々のポリエン類を分類するのに役立つ。すべては、２６− ３８個の炭素原子力１ら構成され、一連の不飽和炭素原子およびヒドロキシ基を 含有するマクロライド環によって特性化される。この分子のこれら特徴は、ポリ エン類の両親媒性（これは種々の特性、たとえば親水性および疎水性を有する基 を含有する分子に関連するものである）に寄与しても）る。この環状構造体は、 内部エステルの生成またはラクトン結合１こよって閉環している（第１図）。共 役二重結合の数は各ポリエンで異なり、当該化合物群は一般に不飽和度によって 分類される。

ポリエン系マクロライドの毒性作用は、細胞膜のステロールとの結合性によって 左右されると思われる。したがって、それは真菌細胞の膜、および他の真核細胞 （ヒト、植物および原生動物）の膜と結合するが、膜ステロールを含有しないも のである細菌の細胞膜とｊよ結合しない。ポリエン系マクロライドと哺乳動物お よび真菌の膜ステロールとの相互作用により、細胞内成分を漏出させて細胞を死 り＝至らしめるトランスメンブランチインネルが形成される。

抗生物質の有用性は通常、病原体と宿主との感受性の差ｌこよって判断される。

２つのポリエン系マクロライド物質、ナイスタテン（ｎｙｓｔａｔｉｎ）および アンホテソシンＢは相対的に真菌に対して特異的てあり、その結果として、ヒト における治療上の有用性を有して先）ることが立証されている。こわら２つのポ リエン系マクロライドの相対的特異性は、それらが、ヒト細胞膜の主要なステロ ールであるコレステロールについてよりも、真菌膜の主要なステロールであるエ ルゴステロールについて大きな結合力を有していることに由来するものと考えら れる。

アンホテリシンＢは７つの共鳴炭素結合を有するヘプタエンマクロライドである 。この化合物は、１９５６年、Ｓ、ノドスムのフ゛ロス濾過物から最初に崖離さ れた。他のポリエン系マクロライド抗生物質と同様、アンホテリシンＢは水に不 溶性である。その溶解性の問題は、その抗生物質をデオキシコール酸ナトリウム およびリン酸ナトリウムと混合し、得られた混合物を滅菌水または食塩水で水和 。

することによって回避された。アンホテリシンＢはしたがって、種々の真菌に対 して有効である量で非経口的に使用されている、最も顕著にヒトに対する毒性の 無いポリエン系の抗生物質である。

Ｓ、ノウルセイ（ｎｏｕｒｓｅｉ）から最初に単離されたナイスクチンは、アン ホテリシンＢと構造的に類似しているが、環の共役部分が中断されているので、 テトラエンおよびジエンを形成しているため、ヘプタエンとは分類されない。本 薬物は、経口的および局所的に十分寛容性があるので、その毒性および水不溶性 に鑑み、静脈内用途には利用されない。ナイスクチンは経口用錠剤（５００，０ ００単位）として、または局所用の軟膏剤（１ｏｏ、　０００単位／ｇ）として 利用可能である。それは、皮膚および皮下のカンジダ症を治療するために使用さ れる。

最近、特定の薬物を患者に投与する前にそれをリポソームに包嚢することで、そ の薬物の薬物動態、組織分布、代謝および治療効能を顕著に変化させることがで きることが示された。リポソームは、水溶液を乾燥脂質のフィルムに添側すると 自然に形成される脂質運搬体と定義することができる。さうに、これら薬物の分 布および薬物動態は、包嚢されるリポソームの脂質組成、大きさ、Ｎ荷および膜 流動性を変化させることによって改変することができる。

近年、リポソームは、ネズミのリーシニマニア症Ｕニュー（Ｎｅｅｔ、Ｒ。

Ｒ，Ｃ，）らのＪ、ハｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ｃｈｅ＋ｎｏｔｈｅｒ、　、　８巻 （１９８１）、　３７１−３８１頁、「リポソームに包嚢されたアンホテリシン および他の抗真菌性物質の抗す−シニマニア症活性」］、ヒストブラスマ症［テ ィラー（Ｔａｙｌｏｒ、　Ｒ，Ｌ、　）らのＡｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、 　Ｄｊ　ｓ、　１２５巻（３９８２）、　６１０−６１１頁、「リポソーム中の アンホテリシンＢ：ヒストブラスマ症の新規治療法」］、クリプトコックス症［ グレイビル（Ｇｒａｙｂｉ　１１．　Ｊ、　Ｒ，）らのＪ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　 Ｄｉｓ、　、　１４５巻（１９８２）−、７４Ｂ−７５２頁、「リポソーム会合 性アンホテリ／ンＢによる不ズミクリプトコノクス症の処置」］、およびカンジ ダ症［トレンプレイ（Ｔｒｅｍｂｌａｙ、　Ｃ，）らのＡｂｓｔｒ、　１９８３ １ＣＡＡＣ，７５５号（１９８３）、　２２２頁、「マウスの全身性カンジダ症 におけるアンホテリシンＢ（ＡＭＢ）およびリボン−・ムＡＭＢ（ｌｉｐ−ＡＭ Ｂ）の効能の比較工を処置するだめの、アンホテリシンＢの運搬体として使用さ れている。リポソームに包嚢されたアンホテリシンＢは、日本マカークザルのコ クンジオイデス症の処置にも使用されている［グレイビル（Ｇｒａｙｔ）ｉ比Ｊ 、　Ｒ，）らのＡｂｓｔｒ、　１９８２ＩｃｃＡｃ、　４９２号（１９８２）、 　１５２頁、「リポソーム会合アンホテリシンＢ　（Ｌｉｐ−ＡＭ　Ｂ　）を使 用する霊長類動物のコクシ／オイデス症の処置ｊＪ。

ポリエン類などの有効な抗真菌性の薬物が入手可能になったにも拘わらず、真菌 感染の処置には主要ζ問題が残ったままである。殆どの入手可能なポリエン抗生 物質は、毒性という副作用を有し、それによりそれるの臨床的適用が制限を受け ている。テトラエン−ジエンのポリエン系マクロライド抗生物質であるナイスク チンは高い疎水性を示し、効果的な全身投与を行えない。これは、種々の方法で 調製された懸濁剤として使用され、経口的に患者に投与されてきた。しかし、こ れらの試験では、全身性真菌感染に対するナイスクチン投与の有益な効果を一般 的に証明できなかった。

本発明者らは最近になって、ワボンーム包嚢アンホテリシンＢを使用すれば、実 験的不ズミカンジダ症を処置でき二口ベソッ〜へレジ−タイン（Ｌｏｐｅｚ−Ｂ ｅｒｅｓｔｅｉ　ｎ）らのＪ−Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　、　１５０巻、　２ ７８−２８３頁（１９８４）〕、また白血痰およびリンパ腫の患者の真菌感染の 処置に使用できること［ロペｙ　７−ベレシユタインらのＪ、　Ｉｎｆｅｃｔ、 　Ｄｉｓ、　、　１５１巻、　７０４−７１−頁（１９８５）］を証明した。

本発明は、水溶液中に懸濁する際に、抗真菌性のポリエン系マクロライドを含有 するリポソームを調製するのに適した微細な粉末を製造する方法に関する。本方 法は以下の工程からなる。所定量のポリエン系マクロライドおよびリン脂質をそ れぞれ第１溶媒および第２溶媒に溶解し、第１溶液および第２溶液を調製する。

得られた第１溶液および第２溶液を所望の比率に混合し、混合物を調製する。

次いで、第１溶媒および第２溶媒を、たとえば留去によって混合物から除去し、 残渣を得る。次いで、得られた残渣を、第三級ブタノールおよび塩化メチレンか らなる第３溶媒に溶解し、第３溶液を調製する。次いで、この第３溶液から留去 によって第３溶媒を抽出し、残留物を得る。次いで、この残留物を実質的に第三 級ブタ／−ルからなる溶媒に溶解し、第４溶液を調製する。次いで、この第４溶 液を直径約０．０５から０．５マイクロメーターの穴を存するフィルターで濾過 し、濾液を得る。この濾液を凍結乾燥して第三級ブタノールを除去し、微細声粉 末を得る。この微細粉末を使用すれば、水溶液中で単にインキュベートまたは懸 濁することによって、ポリエン系マクロライドを含有するリポソームを調製する ことができる。

抗真菌性ポリエン系マクロライドか組み込まゎたリポソームを直接的に調製する のに適した安定な粉末は、本発明の方法によって製造するごとができる。本明細 書に記載している条件は具体的にはナイスクチンおよびアンホテリシンＢに適用 されるが、他のポリエン系マクロライド抗生物質物質にも同様に使用することが でき、その際は、当業者にとって理解され得る若干の修飾を加えるだけで、殆ど 実験することもなく操作できよう。

本発明のプレリポソームポリエン系マクロライド粉末の製造方法は、ナイスタテ ンまたはアンホテリシンＢなどの抗真菌性ポリエン系マクロライドをメタノール などの第１有機溶媒に溶解し、第】溶液を調製することを包含する。リン脂質を にとえばクロロホルムなどの第２有機溶媒に溶解し、第２溶液を調製する。得ら れた第１溶液と第２溶液とを混合し、抗真菌性ポリエン系マクロライドおよびリ ン脂質を約１：５かる約１：５０で、好ましくは約１：１０で含有する第１混合 物を調製する。この混合物から有機溶媒を除去するに当几り、たとえば減圧下に 温度約３５℃から約４５°Ｃで溶媒留去し、乾燥フィルムなどの残渣を形成させ る。次いで、得られた残渣を、第三級ブタノールと塩化メナレンとの混合比約２ ：ｌ（＋イスタテンにとって好ましい比率）から約１：４０（アンホテリシンＢ にとって好ましい比率）の混液のような第３有機溶媒の所定量に溶解し、溶媒を 留去して残留物を得る。得られた残留物を実質的に第三級ブタノールからなる溶 媒に溶解し、第４溶液を得、清澄化の１こめに必要であれば、これを暖め、直径 約０．０５から０．５マイクロメーター（ｕｍ）の穴を有するフィルターに通す 。第４溶液を清澄化するために暖めたい場合、特にアンホテリシンＢを使用しん 場合は、好ましくは温度約５０°Ｃから約７０°Ｃに暖める。得られた濾液を１ ことえばドライアイス−アセトンを用いて凍結させる。次いで、この凍結物質を 凍結乾燥し、実質的にすべての溶媒を除去する。凍結乾燥した後、微細なプレリ ポソームポリエン系マクロライド粉末が製造される。この粉末は、通常利用され る乾燥冷所の保存条件下で容易かつ安定に保存される。

既述したプレリポソームポリエン系マクロライド粉末は、以下の一般的な操作法 にしたがってリポソーム懸濁液を再構成するのに簡便に使用できる。この粉末を パイロジエン（発熱物質）不含の食塩水なとの水溶液に加え、次いでリポソーム 懸濁剤が調製されるよう２５℃−４５°Ｃで１−１０分間インキコベートする。

ポリエン系マクロライドの含量は、得みれたリポソームをメタノールに溶解し、 ポリエン系マクロライドに特徴的な吸収波長で光学密度をモニターすることによ って３則定することができる。

本発明で適当である代表的なリン脂質は、天然に存在し、また合成されたホスフ ァチジルコリン、ならびにホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファ チジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルグリセロール、スフ ィンゴミエリン、カルシオリピン、糖脂質、ガングリオシド、セレブロシド、お よび単独または大豆リン脂質などと混合されて使用される同様のものがある。

有用なリン脂質をさらに具体的に挙げれば、卵ホスファテジルフリン、ジラウロ イルホスファチジルコリン、シミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミト イルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１−ミリス トイル−２−バルミトイルホスファチジルコリン、１−バルミトイル−２−ミリ ストイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−バルミトイルホスファ チジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジ ルグリセロール、シミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイル ホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジ オレオイルホスファチジルグリセロール、シミリストイルホスファチジン酸、ジ パルミトイルホスファチジン酸、シミリストイルホスファチジルエタノールアミ ン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、シミリストイルホスファ チジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン 、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、およびジステア ロイルスフィンゴミエリンがある。

本発明の方法によって調製される最初の粉末化組成物、およびその後の（生成） リポソームの両脂質組成物は通常、同じものである。

その生成リポソームを生体内適用（薬物供給用など）に使用する場合、通常、脂 質組成物は体温以下の転移温度を有するのが望ましい。生体膜に特徴的なゲルー 液結晶相転移温度、すなわち３７℃よりも低い転移温度を有するリン脂質からな るリポソームは流体であり、３７°Ｃ以上の転移温度を有するものは固体あると 考えられる。リポソーム適用のための脂質または脂質群の組成を選択するに当た るもう１つの留意事項は、アルキル−エーテル結合脂質（エステル結合でない） は加水分解に対して比較的安定であり、したがって生成リポソームのためのアル キル−エーテル結合脂質は治療上適用にとっては特に望ましいものと考えられる 。

さらに、他の脂質様物質、たとえばステロイド類、コレステロール、長鎖脂肪族 アミンもしくはカルボン酸などの脂肪族アミン類または酸類、長鎖硫酸塩および リン酸塩、リン酸ジセテル、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール、お よびインプレノイド化合物を脂質成分に混合させることにより、特定の所望のか つ既知の性質を元のリポソーム、すなわち合成リポソームに付与することができ る。さらに、ヒドロキシ基、分枝状炭素鎖、環状誘導体、芳香性誘導体、エーテ ル類、アミド類、多重不飽和誘導体、ハロゲン化誘導体などの変性脂肪族部、ま たは炭水化物、グリコール、リン酸塩、ホスホン酸塩、４級アミン、硫酸塩、ス ルホン酸塩、カルボキシ、アミン、スルフヒドリル、イミダゾール基およびこれ らの基の組合わせを含有する変性親水性部のいずれかを含有する合成リン脂質を 、リン脂質と置換、またはそれと混合することができる。

不発明における抗真菌性ポリエン系マクロライドには、ナイスタテン、アンホテ リシンＢ１バルトリンン（ｐａｒｔｒｉｅｉｎ）およびそれらのメチルエステル などの誘導体がある。

本発明の好ましい態様および利用性を説明するため、以下に実施例を示すが、こ れらは、添付の請求の範囲で特に明記していない限り、本発明の限定を言回する ものではない。

寒嵐豊ユ プレリポソームのナイスクチン粉末（Ｌ−Ｎｙｓ）の製造およびその使用ナイス タチン２５ｘｇのメタノール２５１ｇ溶液をシミリストイルホスファチジルコリ ン（ＤＭＰＣ）１７５ｚｇおよびシミリストイルホスファチジルグリセロール（ ＤＭＰＧ）’７：＋ｉｇのクロロホルム１０１ｅ溶液と混合した。ＤＭＰＣ：　 ＤＭＰＧの比率は７・３であり、ナイスタテン：　ＤＭＰＣ＋ＤＭＰＧの比率は １：］０であっ１こ。次いで、回転エバポレーター中、減圧して４０℃で有機溶 媒を留去し、乾燥脂質フィルムを生成させた。第三級ブタノールおよび塩化メチ レンの２：ｌ混液３０ｘρを加え、乾燥した脂質フィルムを溶解させた。次いで 、減圧下、４０°Ｃて溶液から有機溶媒を留去し、脂質残漬を得た。この脂質残 渣を第三級ブタノールに溶解し、得られた溶液を０．２部ｗフィルターに通した 。濾液の１部を取り、ナイスタテン濃度を測定した。容器をドライアイス−アセ トン中に浸漬して濾液を凍結させた。得られた凍結物を一晩凍結乾燥し、微細な プレリポソームナイスクチン粉末を製造した。

この微細粉末１０１００ｉナイスタテン約ＬｏＭｇを含有）をパイロジョン不含 の食塩水１０ＨＱ中に懸濁しπ。この粉末懸濁液を２−５分間４０℃に暖め、そ の中でリポソームを生成させた。この懸濁した物質はその中で生成されたリポソ ーム１００％であることが、顕微鏡検査によって決定された。顕微鏡検査により 決定したことであるが、懸濁物質は１００％リポソームであり、結晶は何ら見い だせなかった。得られた懸濁液を２０．００Ｏｒｐｍ（４０，７００Ｘ９）で１ 時間遠心し、得られたベレットを回収し、食塩水に再懸濁した。

この再懸濁ベレット中に残ったナイスクチンは、メタノールに溶解して３０６ｒ ＋ｍで光学密度を測定すると、加えた最初の量の７０−８０％であると測定され た。リポソームの包嚢率は、濾過工程後に測定すると、〉９９％であると認めら れた［粉末がらりボソームを生成させた後では、遊離の薬物は検出されなかった ］。再！濁したベレットは可溶性の脂質または他の物質を実質的に含有していな いリポソーム調製物であり、臨床的投与に適したものであった。

実施例２ プレリポソームアンホテリシンＢ粉末の製造および用途メタノール中、アンホテ リシンＢおよびクロロホルム中、リン脂質（ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ＝７　：　３ ）を比率１：１０で混合した。次いで、回転エバポレーターを使用し、減圧下に 有機溶媒を４０℃で留去した。

第三級ブタ／−ルおよび塩化メチレンを１　：　３０−４０の比率で加え、乾燥 脂質フィルムを可溶化させた。次いで、有機溶媒を留去した。

次いで、フラスコ中の残渣を第三級ブタノールに溶解し、５２°Ｃ以上に暖め、 ０．２部ｍフィルターで濾過した。得られた濾液から試料を取り出し、アンホテ リシンＢｆｉ度を測定した。

次いで、この混合物を凍結させ（アセトンとドライアイスを使用）、−晩凍結乾 燥した。微細粉末が得られた。

このようにして得ちれた粉末をパイロンエン不含の食塩水中に懸濁させた。リポ ソームは、この懸濁液を約４０’Ｃに約２−５分間暖めなければ生成されなかっ た。次いで、このＭ、、ｆｉｉｆｆｌを１００％リポソームにした（結晶不含） にれは顕微鏡観察によって確認した］。ごの懸濁液を２０．　ＯＯ０ｒｐ１１で １時間遠心し、得られたベレットを取り出し、食塩水に再懸濁した。口の最終懸 濁液から一部試料を取り出し、メタノールに溶解して４０５ｎｍのＯ，Ｄ、を測 定することによってリポソーム中に組み込まれたアンボテ９２２３里を測定した 。粉末からリポソームに至るまでの薬物の包嚢効率は９９−１００％であった。

本明細書に記載の要素および方法、または本明細書に記載の方法の各工程もしく は順序は、以下の請求の範囲に記載している本発明の思想および範囲を逸脱する ことな（、変化させることかできる。

国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．水溶液中に懸濁させた際に抗真菌性ポリエン系マクロライドを含有するリポ ソームを形成する粉末の製造方法であって、（ａ）抗真菌性ポリエン系マクロラ イドおよびリン脂質をそれぞれ所定量の第１有機溶媒および所定量の第２有機溶 媒に溶解し、第１溶液および第２溶液を調製し、 （ｂ）第１溶液および第２溶液を混合して混合物を調製し、（ｃ）この混合物か ら第１有機溶媒および第２有機溶媒を除去して残渣を得、 （ｄ）得られた残渣を所定量の第３有機溶媒に溶解して第３溶液を調製し、 （ｅ）この第３溶液から第３有機溶媒を抽出して残留物を残し、（ｆ）残留物を 、実質的に第三級ブタノールからなる溶媒に溶解して第４溶液を調製し、 （ｇ）この第４溶液を直径約０．１ｎｍから約０．５ｎｍの穴を有するフィルタ ーに通して濾液を得、そして （ｈ）得られた濾液を凍結乾燥して実質的に第三級ブタノールからなる溶媒を除 去する 工程からなる方法。
2. ２．請求項１に記載の方法によって製造される組成物。
3. ３．（ａ）抗真菌性ポリエン系マクロライドおよびリン脂質をそれぞれ所定量の 第１有機溶媒および所定量の第２有機溶媒に溶解し、第１溶液および第２溶液を 調製し、 （ｂ）第１溶液および第２溶液を混合して混合物を調製し、（ｃ）この混合物か ら第１有機溶媒および第２有機溶媒を除去して残渣を得、 （ｄ）得られた残渣を所定量の第３有機溶媒に溶解して第３溶液を調製し、 （ｅ）この第３溶液から第３有機溶媒を抽出して残留物を残し、（ｆ）残留物を 、実質的に第三級ブタノールからなる溶媒に溶解して第４溶液を調製し、（ｇ） この第４溶液を直径約０．１ｎｍから約０．５ｎｍの穴を有するフィルターに通 して濾液を得、そして （ｈ）得られた濾液を凍結乾燥し、実質的に第三級ブタノールからなる溶媒を除 去する 工程からなる方法によって製造される組成物。
4. ４．抗真菌性ポリエン系マクロライドがナイスタチン、アンホテリシンＢ、バル トリシンまたはそれらの誘導体である請求項１に記載の方法、または請求項３に 記載の組成物。
5. ５．抗真菌性ポリエン系マクロライドがナイスタチンまたはアンホテリシンＢで ある請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
6. ６．抗真菌性ポリエン系マクロライドがアンホテリシンＢである請求項１に記載 の方法、または請求項３に記載の組成物。
7. ７．抗真菌性ポリエン系マクロライドがナイスタチンである請求項１に記載の方 法、または請求項３に記載の組成物。
8. ８．リン脂質が１つまたはそれ以上のホスファチジルコリン、ホスファチジルセ リン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、およびホスファチジ ン酸である請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
9. ９．リン脂質がＤＭＰＣおよびＤＭＰＧを含有する請求項１に記載の方法、また は請求項３に記載の組成物。
10. １０．リン脂質が７：３の比率のＤＭＰＣおよびＤＭＰＧから実質的に構成され る請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
11. １１．第１溶媒がメタノールである請求項１に記載の方法、または請求項３に記 載の組成物。
12. １２．第２溶媒がクロロホルムである請求項１に記載の方法、または請求項３に 記載の組成物。
13. １３．工程（ｂ）が、第１溶液および第２溶液を混合して抗真菌性ポリエン系マ クロライドとリン脂質とを比率約１：５から約１：５０で含有する第１混合物を 調製することを特徴とする請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成 物。
14. １４．工程（ｂ）が、第１溶液および第２溶液を混合して抗真菌性ポリエン系マ クロライドとリン脂質とを比率約１：１０で含有する第１混合物を調製すること を特徴とする請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
15. １５．工程（ｃ）が、第１混合物から第１溶媒および第２溶媒を除去するに当た り、第１混合物を減圧下、温度約３５℃から約４５℃で留去することを特徴とす る請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
16. １６．濾過工程の前に第４溶液を約５０℃から約７０℃に暖めることによって清 澄化させることを特徴とする請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組 成物。
17. １７．第３有機溶媒が第三級ブタノールおよび塩化メチレンからなる請求項１に 記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
18. １８．第３有機溶媒が比率約２：１から約１：４０の第三級ブタノールおよび塩 化メチレンからなる請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
19. １９．フィルターが約０．ｎｍの穴を有する請求項１に記載の方法、または請求 項３に記載の組成物。
20. ２０．抗真菌性ポリエン系マクロライドおよびリン脂質の比率が約１：５から約 １：２０である請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。
21. ２１．抗真菌性ポリエン系マクロライドおよびリン脂質の比率が約１：１０であ る請求項１に記載の方法、または請求項３に記載の組成物。