KR101683623B1 - 초임계 추출법에 의한 미백 활성이 우수한 커피박 추출물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 로스팅한 커피 원두를 열수추출하는 단계; 및 상기 열수추출하고 남은 커피박을 초임계 추출하는 단계;를 포함하는 커피박 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 커피박을 이용하여 이산화탄소 단일 용매로 초임계 추출함으로써 멜라닌 합성 저해 및 티로시나제 활성 억제 특성을 동시에 나타내어 미백 활성이 우수한 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 커피박으로부터 미백 활성이 우수한 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로 커피를 열수추출하고 남은 부산물인 커피박으로부터 기능성 화장품 소재나 의약품 소재로 응용될 수 있는 미백 활성이 우수한 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
커피는 쓴맛, 떫은맛, 신맛 및 구수한 맛 등을 함께 즐길 수 있어 전 세계적으로 가장 널리 음용되는 대표적인 기호식품 중 하나로 경제적으로도 매우 중요한 위치를 차지하고 있으며, 2012년 통계청이 발표에 따르면, 우리나라 성인 1인당 커피소비량은 293잔(1.93kg)으로 아시아 국가 중 두 번째로 커피를 많이 마시는 것으로 조사되었다.
커피는 크게 아라비카 종과 로부스타 종으로 나눌 수 있으며, 종별로 다당류, 단백질 및 지방질 등에서 함량 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 커피는 지방산 성분, 스테롤 성분 및 커피에만 존재하는 디터펜 류 등 여러 유용 성분을 포함하고 있는데, 대표적인 지방산 성분으로 palmitic acid, stearic acid, linoleic acid 및 oleic acid 등이 있으며, 이들은 당뇨, 심장질환, 고콜레스테롤 질환 개선에 도움이 된다고 보고된바 있다[Food Research International, 31, pp. 479-486, 1998]. 또한, 스테롤 성분으로 β-sitosterol, stigmasterol 및 campesterol 등이 있으며, 디터펜 류로 cafestol과 kahweol 등이 함유되어 있다.
특허문헌 1에서는 로스팅한 커피 원두로부터 추출된 피부 색소 장애 또는 피부 결점의 치료 또는 예방에 효과적인 구강용 조성물에 관한 것으로 초임계 추출로 카페인을 제거한 뒤 알콜 수용액으로부터 미백 활성용 추출물을 제조하는 특징을 개시하고 있으며, 비특허문헌 1에서는 커피 원두의 열수추출의 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물을 이용하여 항산화, 미백, 항염증 효과를 측정하여 부탄올 분획물이 가장 효능이 뛰어나다는 특징을 개시하고 있다.
그러나 특허문헌 1은 티로시나제의 활성은 저해하지 않으면서 멜라닌 합성만 저해하는 커피 원두 추출물에 관한 발명으로 커피박의 미백효과에 대해서는 기재되어 있지 않으며, 비특허문헌 1은 티로시나제의 활성을 저해하는 커피 원두 추출물에 관한 것으로, 멜라닌 합성 저해 및 커피박 추출물의 미백효과에 대해서는 기재되어 있지 않다.
따라서, 커피 음료 제조과정에서 버려지는 산업용 폐기물인 커피박을 재활용할 수 있으면서 티로시나제의 활성을 억제하면서 동시에 멜라닌 합성을 저해할 수 있는 추출물의 제조방법이 필요한 시점이다.
박강수 대구한의대학교 대학원 화장품약리학 석사학위 논문 2010
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 커피 열수추출하고 남은 커피박을 초임계 이산화탄소 추출법을 이용하여 추출함으로써 멜라닌 합성 저해활성 및 티로시나제 효소 활성 저해능이 동시에 우수하여 미백 활성이 우수한 커피박 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로스팅한 커피 원두를 열수추출하는 단계; 및 상기 열수추출하고 남은 커피박을 초임계 추출하는 단계;를 포함하고,
상기 초임계 추출 조건은 초임계 이산화탄소를 용매로 120 내지 270 bar에서 추출하는 것을 특징으로 하는 미백 활성이 우수한 커피박 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미백 활성은 멜라닌 합성 저해 활성 및 티로시나제 생성 억제 활성이 동시에 우수한 것을 의미하며,
구체적으로, 커피박 추출물 100 ㎍/mL에서 멜라닌 합성 저해능이 30.0% 이상이고, 티로시나제 활성 저해능이 25.0% 이상인 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 열수추출은 상기 로스팅한 커피 원두를 70 내지 100 ℃의 물로 0.5 내지 10분간 추출하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 보다 바람직한 초임계 추출 조건은 이산화탄소 용매로 150 내지 200 bar의 압력에서 추출하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 초임계 추출 조건은 30 내지 50 ℃에서 40분 내지 140분간 추출하는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 미백 활성이 우수한 커피박 추출물은 로스팅한 커피 원두를 열수추출하고 남은 커피박을 이용하여 초임계 추출하여 제조된 것으로, 커피 원두를 열수추출하거나 초임계 추출하여 제조된 추출물보다 세포 독성이 거의 없으며, 멜라닌 합성 저해 활성과 티로시나제 활성 억제능이 동시에 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 제조방법을 이용하여 커피 음료 제조과정에서 발생되는 산업폐기물인 커피박을 재활용하여 미백 기능성 성분을 제조할 수 있으므로 부가적인 수익 창출에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타낸 이미지이다((a) 음성대조군; (b) 양성대조군; (c) 실시예 1).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 화합물의 멜라닌 저해 활성효과에 대한 막대그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 화합물에 의한 티로시나제 함량 변화 추이를 나타낸 막대그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 화합물의 멜라닌 저해 활성효과에 대한 막대그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 화합물에 의한 티로시나제 함량 변화 추이를 나타낸 막대그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 로스팅한 커피 원두를 열수추출하는 단계; 및 상기 열수추출하고 남은 커피박을 초임계 추출하는 단계;를 포함하고,
상기 초임계 추출 조건은 초임계 이산화탄소를 용매로 120 내지 270 bar에서 추출하는 것을 특징으로 하는 미백 활성이 우수한 커피박 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 열수추출은 70 내지 100 ℃의 물로 0.5 내지 10분간 추출하는 것일 수 있는데, 상기 열수추출하는 단계는 커피 원두에 함유된 미백 활성에 관여하지 않는 수용성 성분이 제거될 수 있어 멜라닌 저해 활성이 높고, 티로시나제 생성을 억제하여 생성된 티로시나제 함량이 낮아 미백 활성이 우수한 추출물을 제조할 수 있어 바람직하다.
상기 열수추출 시 온도 및 추출 시간이 상기 범위 미만이면, 추출되지 않고 커피 원두에 잔류하는 미백 활성에 관여하지 않는 수용성 성분이 많아져 초임계 추출 단계에서 미백 활성 성분과 함께 추출될 수 있으므로, 커피박 추출물 중의 미백 활성 물질의 함량이 낮아질 수 있어 바람직하지 않으며, 열수추출 시 온도 및 추출 시간이 상기 범위를 초과하면, 커피 원두에 함유된 미백 활성 성분이 변성될 수 있으며, 미백 활성 성분이 수용성 성분과 함께 열수추출될 수 있어 제조되는 커피박 추출물의 수율이 저하될 수 있어 바람직하지 않다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 커피 원두를 열수추출하는 단계 및 상기 열수추출하고 남은 커피박을 초임계 추출하는 단계를 함께 사용하여 제조된 추출물이 열수추출로 제조된 추출물 및 열수추출 단계를 거치지 않고 초임계 이산화탄소로만 추출한 추출물보다 멜라닌 합성 저해활성과 티로시나제 생성 억제 활성이 동시에 우수하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 초임계 추출은 초임계 이산화탄소를 용매로 사용하여 유속을 5 내지 20 ml/min의 속도로 투입하여 추출하는 것일 수 있는데, 30 내지 50 ℃에서 40분 내지 140분간 추출하는 것일 수 있는데, 더욱 바람직하게는 150 내지 200 bar의 압력으로 추출하는 것일 수 있다.
이산화탄소는 초임계 상태에서 유기 용매에 가까운 성질을 가지는데 온도 및 압력이 높아질수록 일반적인 비극성 성질뿐만 아니라 극성의 성질이 향상되어 양쪽성 성질을 나타내게 되어 추출능이 향상된다. 본 발명에 따르면, 초임계 추출 조건에서 압력이 270 bar이상이면 추출능이 향상될 수 있으나 미백 활성에 관여하지 않는 성분도 함께 추출될 수 있으므로 커피박 추출물 중의 미백 활성 물질의 함량이 낮아질 수 있어 바람직하지 않으며, 미백 활성 성분이 변성될 수 있어 멜라닌 합성 저해능이 저하되거나, 티로시나제 생성 억제 활성이 저하되어 생성되는 티로시나제 함량이 증가될 수 있어 미백 활성이 저하된 추출물을 얻을 수 있어 바람직하지 않다. 또한 추출시간이 상기 범위를 미만이면 추출되는 미백 활성 성분의 함량이 낮아 바람직하지 않으며, 추출시간이 상기 범위를 초과하면 추출수율은 향상되나 미백 활성에 관여하지 않는 성분이 함께 추출될 수 있어 커피박 추출물 중의 미백 활성 물질의 함량이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다.
본 발명에 따르면, 열수추출하는 방법으로는 특별히 제한은 없으며, 예를 들어, 커피 드립 추출장치일 수 있다. 이때, 열수추출된 추출물은 커피 음료로 음용할 수 있다. 또한, 상기 제조방법에서 열수추출하고 남은 커피박 대신에, 커피 산업에서 커피 음료를 제조하고 버려지는 산업폐기물인 커피찌꺼기(커피박)을 이용할 수도 있다.
본 발명에 따른 커피박 추출물은 멜라닌 합성 저해활성 및 티로시나제 생성 억제 활성이 동시에 우수한 것일 수 있는데, 특히, 커피박 추출물 100 ㎍/mL에서 멜라닌 합성 저해능이 30.0% 이상이고, 동시에 티로시나제 활성 저해능이 25.0% 이상일 수 있는데, 바람직하게는 커피박 추출물 100 ㎍/mL에서 멜라닌 합성 저해능이 30.0 내지 65.0% 범위이며, 동시에 티로시나제 활성 저해능이 25.0 내지 65.0%범위일 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예
실시예
1
1) 열수추출
로스팅 후 블렌딩 방식으로 생산되어 유통되는 로부스타 종 커피 원두 가루를 구매하여 실험에 이용하였다. 커피메이커를 이용하여 80 ℃의 물로, 30초 동안 추출하여 수용성 성분을 제거하고, 수용성 성분이 제거된 커피 원두 가루는 건조하여 수분을 제거하여 커피박을 제조하였다.
2) 초임계 추출
커피박을 150 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
실시예
2
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되 2) 단계에서 2시간 대신 1시간 동안 추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
실시예
3
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되 2) 단계에서 150 bar 대신 250 bar 조건에서 커피박 추출물을 제조하였다.
실시예
4
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되 2) 단계에서 150 bar 대신 250 bar 조건으로, 2시간 대신 1시간 동안 추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
비교예
1
실시예 1의 1) 단계에서 제조된 커피박에 물을 첨가하여 2시간 동안 90 ℃로 가열 교반하는 방법으로 열수추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
비교예
2
실시예 1의 1) 단계를 거치지 않은 커피 원두에 물을 첨가하여 2시간 동안 90 ℃로 가열 교반하는 방법으로 열수추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
3
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되 2) 단계에서 150 bar 대신 100 bar 조건으로, 2시간 동안 추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
비교예
4
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되 2) 단계에서 150 bar 대신 350 bar 조건으로, 2시간 동안 추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
비교예
5
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되 2) 단계에서 150 bar 대신 450 bar 조건으로, 2시간 동안 추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
비교예
6
실시예 1의 1) 단계에서 30초 대신에 1시간 동안 열수추출하고 남은 커피박을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하였다.
비교예
7
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되, 실시예 1의 2) 단계에서 2시간 대신 3시간 동안 추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
8
실시예 1의 1) 단계를 거치지 않은 커피 원두를 이용하여 150 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 1시간 동안 추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
9
실시예 1의 1) 단계를 거치지 않은 커피 원두를 이용하여 150 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
10
실시예 1의 1) 단계를 거치지 않은 커피 원두를 이용하여 250 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 1시간 동안 추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
11
실시예 1의 1) 단계를 거치지 않은 커피 원두를 이용하여 250 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
12
실시예 1의 1) 단계를 거치지 않은 커피 원두를 이용하여 350 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
13
실시예 1의 1) 단계를 거치지 않은 커피 원두를 이용하여 450 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 커피 추출물을 제조하였다.
비교예
14
실시예 1과 동일한 방법으로 커피박 추출물을 제조하되 2) 단계에서 추출용매로 이산화탄소 100% 대신에 에탄올:이산화탄소=8:92로 보조용매가 첨가된 추출용매를 이용하여, 2시간 동안 추출하여 커피박 추출물을 제조하였다.
비교예
15
커피 원두를 80 ℃에서 2시간 동안 열수추출한 뒤, 열수추출액을 클로로포름을 첨가하여 물층(A)과 클로로포름층으로 분리하였다. 상기 물층(A)에 에틸아세테이트를 첨가하여 물층(B)과 에틸아세테이트 층으로 분리하고, 상기 물층(B)에 부탄올을 첨가하여 부탄올 층을 수거하여 미백 기능성 물질이 함유된 커피 추출물을 제조하였다.
대조군
양성대조군으로 알부틴(Arbutin)을 이용하였다.
시험예
1: 세포독성 확인
1) 세포배양
세포 독성을 확인하기 위하여 B16F10 mouse melanoma 세포주(한국세포주은행)를 10% fetal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic Antimycotic이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 사용하여 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
2) 세포독성 확인
B16F10 세포에 대한 커피 추출물의 세포 독성은 XTT assay로 측정하였다. B16F10 세포는 24 well plate에 5×104 cells/well이 되게 분주하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하였다. 그 후, 새로운 배양액과 커피추출물을 농도별로 조제하여 첨가한 후, 7일 동안 추가 배양하였다. 배양이 모두 완료된 날인 8일째에 배지를 제거하고, PBS로 세척한 후 XTT-phenazine methosulfate(PMS)(1 mg/mL XTT-10㎍/mL PMS) 250 μL를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 추가 배양한 후, 생성된 formazan을 macroplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
커피 추출물의 농도에 따른 세포 생존율을 하기 표 1에 나타내었다.
| 구분 | 세포 생존능(%) | ||
| 100 ㎍/mL | 200 ㎍/mL | 300 ㎍/mL | |
| 대조군 | 100 | 100 | 100 |
| 실시예 1 | 101 | 100 | 100 |
| 실시예 2 | 100 | 101 | 99 |
| 실시예 3 | 102 | 102 | 100 |
| 실시예 4 | 100 | 100 | 100 |
| 비교예 1 | 100 | 92 | 85 |
| 비교예 2 | 99 | 89 | 80 |
| 비교예 3 | 100 | 100 | 99 |
| 비교예 4 | 102 | 100 | 100 |
| 비교예 5 | 101 | 100 | 100 |
| 비교예 6 | 101 | 101 | 100 |
| 비교예 7 | 100 | 100 | 100 |
| 비교예 8 | 100 | 100 | 100 |
| 비교예 9 | 102 | 100 | 100 |
| 비교예 10 | 101 | 100 | 99 |
| 비교예 11 | 100 | 100 | 99 |
| 비교예 12 | 101 | 100 | 100 |
| 비교예 13 | 100 | 100 | 99 |
| 비교예 14 | 101 | 100 | 100 |
| 비교예 15 | 100 | 100 | 98 |
표 1에 나타낸 바와 같이, 열수추출법으로만 추출된 비교예 1 및 2에서 커피 추출물의 농도가 100 내지 300 ㎍/mL일때 세포독성이 나타났다. 이후 실험에서는 커피 추출물의 농도를 대부분의 실험군이 세포독성을 나타내지 않는 범위인 100 ㎍/mL로 희석하여 사용하였다.
시험예
2: 멜라닌 합성
억제능
세포 내 멜라닌의 합성은 외부로부터 자외선이 침투하면, 멜라닌형성세포(melanocyte) 성장인자인 MSH(melanocyto-stimulating hormone)가 분비되어 MCIR(melanocortin 1 receptor)와 결합한다. 이 결합체는 MITF(microphthalmia-associated transcription factor) pathway의 세포내 cAMP 신호를 증폭시키고, 증폭된 신호는 PKA(protein kinase A)를 활성화 시킨다. PKA의 활성은 MITF의 발현을 증가시키는데, 이러한 MITF의 발현의 증가는 Melanosomes의 tyrosinase 활성과 tyrosinase mRNA를 증가시킨다. 지속적인 tyrosinase의 활성과 tyrosinase mRNA의 증가는 멜라닌 합성이 증가 되어 피부 색소 침착으로 이어진다.
멜라닌 정량은 Hosei등의 방법을 변형하여 사용하였다. B16F10 mouse melanoma 세포주를 사용하여 αMSH(멜라닌 합성을 유도 호르몬)과 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 추출물로 처리하여 멜라닌 합성 억제능을 측정하였다.
6-well plate에 well당 B16F10 cell을 1×105로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 추출물 200 ㎍를 배양액 2 mL에 분주하여 2 mM theophylline과 2 μM α-MSH을 처리한 후, 7일 동안 추가 배양하였다. 배양이 모두 완료된 날인 8일째에 배지를 제거하고, PBS로 2회 세척한 후 lysis buffer(0.01 M sodium phosphate buffer, 1% Triton X-100, 5 mM EDTA) 500 μL를 첨가하여 세포를 용해하여 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 원심분리를 통해 얻어진 세포를 60℃ 항온기를 이용하여 24시간 동안 건조한 뒤, 10% DMSO가 첨가된 1 N NaOH 수용액 300 μL를 첨가하여 90℃에서 1시간 동안 처리하여 용해시키고, 475 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군의 흡광도를 기준으로한 백분율로 환산하여 하기 표 2에 나타내었다.
| 구분 | melanin inhibition(%) |
| 양성대조군 | 37 |
| 실시예 1 | 35 |
| 실시예 2 | 32 |
| 실시예 3 | 34 |
| 실시예 4 | 31 |
| 비교예 1 | 10 |
| 비교예 2 | 11 |
| 비교예 3 | 23 |
| 비교예 4 | 28 |
| 비교예 5 | 28 |
| 비교예 6 | 25 |
| 비교예 7 | 18 |
| 비교예 8 | 10 |
| 비교예 9 | 29 |
| 비교예 10 | 20 |
| 비교예 11 | 10 |
| 비교예 12 | 13 |
| 비교예 13 | 27 |
| 비교예 14 | 20 |
| 비교예 15 | 24 |
표 2에 나타낸 바와 같이, 초임계 추출을 하지 않고 열수추출의 방법으로만 제조된 비교예 1 및 비교예 2는 낮은 멜라닌 합성 억제능을 나타내었다. 또한, 초임계 추출법에서 용매로 이산화탄소 이외에 다른 용매를 혼합하여 사용한 경우에는 커피박 추출물의 수율은 우수하였으나 멜라닌 합성 억제능이 떨어지는 것으로 확인되어, 초임계 추출 시 이산화탄소 단일 용매를 사용하는 것이 미백 활성에 효과적인 것으로 확인되었다.
한편, 비교예 7의 경우, 실시예 1 및 2 보다 멜라닌 합성 억제능이 저하되는 것으로 보아 초임계 추출 시 추출시간을 길게 하면 미백 활성 성분 이외에 미백에 관여하지 않는 성분까지 함께 추출되는 것으로 추정되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 열수추출 후, 초임계 추출방법으로 추출압력은 120 내지 270 bar 및 추출 시간은 30 내지 150분 범위 내에서 용매로 이산화탄소 단일 용매를 사용하는 것이 다른 방법에 비하여 멜라닌 합성 억제에 효과적인 것을 확인하였다.
시험예
3:
티로시나제
활성 저해
멜라닌 합성 효소들 가운데 티로시나제(Tyrosinase)는 속도 조절 효소로서, 본 발명에 따른 커피박 추출물이 티로시나제 효소 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Matinez-Esparza 등의 방법을 변형하여 측정하였다. B16F10 mouse melanoma 세포주를 사용하여 αMSH(멜라닌 합성을 유도 호르몬)과 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 추출물로 처리하여 티로시나아제 함량을 측정하였다.
6-well plate에 well당 B16F10 cell을 1×105로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 15에 따른 추출물 200 ㎍를 배양액 2 mL에 분주하여 2 mM theophylline과 2 μM α-MSH을 처리한 후, 7일 동안 추가 배양하였다. 배양이 모두 완료된 날인 8일째에 배지를 제거하고, PBS로 2회 세척한 후 lysis buffer(0.01 M sodium phosphate buffer, 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 0.1 M PMSF) 200 μL를 첨가하여 ice bath에서 30분 동안 세포를 용해하였다. 이후, 4 ℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 원심분리를 통해 얻어진 세포의 상층액을 티로시나제 함량 측정에 사용하였다. 각 샘플의 세포 상층액에 반응액(10 mM L-DOPA, 20 unit tyrosinase, 0.01 M sodium phosphate buffer)를 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 후 475 nm 흡광도로 측정하였다. 단백질 정량은 Bradford 시약으로 595 nm 흡광도를 측정하여 계산하였으며 티로시나제 표준곡선을 사용하여 티로시나아제 함량을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.
| 구분 | Tyrosinase단백질함량(Unit/㎍) | inhibition(%) |
| 음성대조군 | 40.7 | - |
| 양성대조군 | 24.8 | 39.1 |
| 실시예 1 | 29.5 | 27.5 |
| 실시예 2 | 25.6 | 37.1 |
| 실시예 3 | 30.5 | 25.1 |
| 실시예 4 | 25.7 | 36.9 |
| 비교예 1 | 27.1 | 33.4 |
| 비교예 2 | 28.0 | 31.2 |
| 비교예 3 | 35.4 | 13.0 |
| 비교예 4 | 43.8 | 0 |
| 비교예 5 | 40.3 | 0.9 |
| 비교예 6 | 24.6 | 39.5 |
| 비교예 7 | 68.0 | 0 |
| 비교예 8 | 55.4 | 0 |
| 비교예 9 | 55.7 | 0 |
| 비교예 10 | 50.7 | 0 |
| 비교예 11 | 47.3 | 0 |
| 비교예 12 | 33.4 | 17.9 |
| 비교예 13 | 32.7 | 19.6 |
| 비교예 14 | 37.0 | 9.1 |
| 비교예 15 | 36.1 | 11.3 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 4의 커피박 추출물로 처리한 군은 티로시나제 단백질 함량이 낮았으며, 티로시나제 활성 저해능이 25 내지 40%로 우수하였다.
비교예 8 내지 13을 참고하면, 커피 원두에서는 낮은 초임계 추출압력에서는 티로시나제 단백질 함량이 음성 대조군보다 높은 것으로 확인되었으며, 추출압력이 증가될 수록 티로시나제 단백질 함량이 감소되는 것으로 보아 낮은 압력의 추출물에는 티로시나제 활성 억제를 저해하는 물질 또는 티로시나제를 활성시키는 물질이 다량 함유되어 있을 것으로 추정되며, 높은 압력으로 추출되면서 티로시나제 활성을 저해하는 물질의 함량이 증가되는 것으로 추정되었다.
또한, 실시예 1 내지 4 및 비교예 3 내지 5를 참고하면, 커피박의 경우 낮은 초임계 추출압력에서는 티로시나제 활성을 저해하는 물질의 효과로 티로시나제 단백질 함량이 낮으나, 초임계 추출압력이 증가할수록 티로시나제 단백질 활성 억제를 저해하는 물질 또는 티로시나제를 활성시키는 물질이 함유되어 티로시나제 활성억제가 저해되어 티로시나제 단백질 함량이 높아지는 것으로 추정되었다. 한편, 커피 원두를 1시간 동안 열수추출한 뒤, 150 bar로 초임계 추출한 비교예 6의 경우에는 티로시나제 단백질의 함량이 실시예 1보다 증가한 것으로 나타나 열수추출 과정을 통해 티로시나제 활성 억제를 저해하는 물질이 제거되는 것으로 예상되었다. 즉, 커피 원두 초임계 추출물의 조성과 커피박 초임계 추출물의 조성은 차이가 있을 것으로 추정되며, 본 발명에 따라 열수추출 과정을 거친 커피박을 초임계 추출하면 낮은 추출압력조건에서 멜라닌 합성 억제 및 티로시나제 활성 저해효과를 동시에 나타내는 추출물을 우수한 수율로 제조가 가능하다.
Claims (6)
- 로스팅한 커피 원두를 70 내지 100 ℃의 물로 0.5 내지 10분간 열수추출하는 단계; 및
상기 열수추출하고 남은 커피박을 초임계 이산화탄소를 용매로 120 내지 270 bar에서 초임계 추출하는 단계;를 포함하는 커피박 추출물의 제조방법이고,
상기 커피박 추출물은 멜라닌 합성 저해 활성 및 티로시나제 생성 억제 활성이 동시에 우수하고,
상기 커피박 추출물 100 ㎍/mL에서 멜라닌 합성 저해능이 30.0% 이상이고, 티로시나제 활성 저해능이 25.0% 이상인, 미백 활성이 우수한 커피박 추출물의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 초임계 추출 조건은 초임계 이산화탄소를 용매로 150 내지 200 bar에서 추출하는 것을 특징으로 하는 미백 활성이 우수한 커피박 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 초임계 추출 조건은 30 내지 50 ℃에서 40분 내지 140분간 추출하는 것을 특징으로 하는 미백 활성이 우수한 커피박 추출물의 제조방법.
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