KR101666708B1

KR101666708B1 - 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 유효성분 추출물 및 그 추출방법

Info

Publication number: KR101666708B1
Application number: KR1020140015123A
Authority: KR
Inventors: 조송미; 오상아; 민광현
Original assignee: 전남과학대학교 산학협력단
Priority date: 2014-02-10
Filing date: 2014-02-10
Publication date: 2016-10-17
Also published as: KR20150094174A

Abstract

본 발명은 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름으로부터 유효성분을 추출하여 건강기능식품, 식품첨가제, 음료수, 화장료, 아토피치료제, 세제 등에 적용시켜 피부를 보호함은 물론, 피부노화를 방지와 아토피 등을 치료할 수 있도록 한 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 유효성분 추출방법에 관한 것으로, (a) 뿌리를 제외한 둥근잎꿩의비름을 채취하는 단계; (b) 상기 채취된 둥근잎꿩의비름을 건조하는 단계; (c) 상기 건조된 둥근잎꿩의비름을 분쇄하는 단계; (d) 상기 분쇄된 둥근잎꿩의비름의 유효성분을 추출하는 단계; (e) 상기 추출물의 상등 액을 분리하여 단계; (f) 상기 상등 액을 농축하는 단계; 로 이루어진다.

Description

항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 유효성분 추출물 및 그 추출방법{Extraction method of Hylotelephium ussuriense active component}

본 발명은 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름으로부터 유효성분을 추출하여 건강기능식품, 식품첨가제, 음료수, 화장료, 아토피치료제, 세제 등에 적용시켜 피부를 보호함은 물론, 피부노화를 방지와 아토피 등을 치료할 수 있도록 한 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 유효성분 추출물 및 그 추출방법에 관한 것이다.

둥근잎꿩의비름(Hylotelephium ussuriense)은 돌나물 과에 속하는 다년생 초본식물로서 국내에서 경상북도 청송군 주왕산 계곡 그늘진 바위틈에서만 분포하는 자생식물로 2012년까지 환경부에서 지정한 동.식물 멸종위기 식물2급에 속하는 귀중한 유전자원이다(Kwon and Yoon, 2010).

둥근잎꿩의비름은 둥근꿩의비름이라고 불리우며 초장은 15~25cm 정도이고 잎은 원형 또는 타원형으로 가장자리가 불규칙하고 둔한 톱니모양으로, 꽃은 7월 하순부터 10월 초순까지 줄기 끝에 산방꽃차례 비슷한 취산꽃차례에 자잘하며 붉은 자주색으로 촘촘히 모여 피는데 관상용으로도 이용가치가 높아 화훼작물로서의 개발 가치가 높다(Kwon et al., 2010).

또한 둥근잎꿩의비름의 어린순은 식용으로 이용되고 있으며, 한방에서는 식물전체를 선혈이나 대하증 등의 약재로도 사용하고 있다.

이러한 둥근잎꿩의비름은 자연 상태에서 개화기가 짧고, 개화 종료 후 지하부는 월동을 위한 휴면아가 생성되고 지상부는 고사하므로 개체의 번식 혹은 대량재배에 어려움이 많다(Jeong, 1999; Kwon and Jeong, 1999).

최근들어 식물조직배양기술을 이용한 잎과 줄기 절편과 돌나물의 잎절편 및 화뢰절편으로부터 식물체 증식에 관한 연구가 보고된바 있다(Yoon 1997; Ahn and Lee, 2004; Kwon and Yoon, 2010). 그러나 이렇게 증식된 자원의 생리적 활성이나 기능성 원료로서 활용 가능성에 대한 연구는 알려진 바가 없다.

현대 사회는 다양한 병원체나 환경악화에 따라 생기는 환경스트레스를 받고 있다. 이러한 각종 스트레스가 계속 가중되면 생명 유지에 필수적인 산소는 반응성이 높아 심각한 생리장애 및 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 변하게 된다. 이와 같은 활성산소종은 노화를 촉진하고 다양한 질병의 원인으로 작용하고 있다.

삭제

이러한 활성산소종의 피부노화 양상은 피부에 미세주름, 진피의 위축, 피하지방의 감소를 초래할 뿐 아니라 아토피성 피부염, 여드름성 피부 이상 현상을 유발한다.

또한 현대인의 다양한 인스턴트식 식습관에 의해 발생되는 활성산소종은 인체내 지질을 과산화시켜 해로운 물질을 생성시켜 심근경색이나 뇌졸중 , 동맥경화등의 각종 성인병을 야기시키도한다.

이러한 활성산소종을 제거하기 위해 항산화제 BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene) 등이 알려져 있으나 이들은 합성항산화제로서 이들의 변이성, 발암성, 세포 내 독성 등 부작용이 보고되면서 안전성에 문제가 없는 천연 항산화제를 개발하려는 시도가 요구되고 있다(Kang et al 2005).

본 발명은 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름으로부터 용매를 이용하여 유효성분을 추출하고, 그 추출된 추출물을 항산화 및 항균을 필요로 하는 원료 즉 건강기능식품, 식품첨가제, 음료수, 화장료, 아토피치료제, 세제 등에 적용시켜 피부를 보호함은 물론, 피부노화를 방지와 아토피 등을 치료할 수 있도록 함에 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 과제 해결 수단 구성은,

(a) 뿌리를 제외한 둥근잎꿩의비름을 채취하는 단계;

(b) 상기 채취된 둥근잎꿩의비름을 건조하는 단계;

(c) 상기 건조된 둥근잎꿩의비름을 분쇄하는 단계;

(d) 상기 분쇄된 둥근잎꿩의비름의 유효성분을 추출하는 단계;

(e) 상기 추출물의 상등 액을 분리하여 단계;

(f) 상기 상등 액을 농축하는 단계; 로 이루어진다.

상기와 같은 구성을 갖는 본 발명의 방법으로 추출된 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 유효성분 추출물은, 항산화 및 항균을 필요로 하는 원료 즉 건강기능식품, 식품첨가제, 음료수, 화장료, 아토피치료제, 세제 등에 적용시켜 피부를 보호함은 물론, 피부노화를 방지와 아토피 등을 치료할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 둥근잎꿩의비름 추출물의 항세균활성효과를 나타낸 사진.

이하 본 발명의 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물 및 그 추출방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 항산화 및 항균 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 유효성분 추출물 추출방법은,

(a) 뿌리를 제외한 둥근잎꿩의비름을 채취하는 단계; (b) 상기 채취된 둥근잎꿩의비름을 건조하는 단계; (c) 상기 건조된 둥근잎꿩의비름을 분쇄하는 단계; (d) 상기 분쇄된 둥근잎꿩의비름의 유효성분을 추출하는 단계; (e) 상기 추출물의 상등 액을 분리하여 단계; (f) 상기 상등 액을 농축하는 단계; 로 이루어진다.

상기의 둥근잎꿩의비름으로부터 추출용매를 이용하여 유효성분(항산화 및 항균 능)을 추출하는 방법을 각 단계별 실시 예를 들어 설명하면 다음과 같다.

(a) 단계

본 발명의 (a) 단계는, 뿌리를 제외한 둥근잎꿩의비름을 채취하는 단계로써,

상기 둥근잎꿩의비름은 자생지(경상북도 주왕산)에서 수집된 식물을 전남과학대학교내 온실(주간, 252 야간, 202, 16시간 광주기, 5000 Lux 광도)에서 생장시켜 사용하였다.

(b) 단계

본 발명의 (b) 단계는, 상기 채취된 둥근잎꿩의비름을 건조하는 단계로써,

상기 채취된 둥근잎꿩의비름은 멸균된 증류수로 세척하여 불순물을 제거하고 그 불순물이 제거된 둥근잎꿩의비름을 60 ~ 70℃의 열풍 건조한다.

상기 둥근잎꿩의비름을 60 ~ 70℃로 열풍조건하는 이유는, 둥근잎꿩의비름에 함유된 항산화활성 및 항균효과를 내는 유효성분의 유출을 최소화시키기 위함이다.

(c) 단계

본 발명의 (c) 단계는, 상기 건조된 둥근잎꿩의비름을 분쇄하는 단계로써,

상기 둥근잎꿩의비름을 분쇄는, 분쇄기를 이용하여 분쇄하며, 그 분쇄하는 이유는, 상기 둥근잎꿩의비름에 함유된 항산화활성 및 항균효과를 내는 유효성분을 추출용매를 이용하여 추출할 때에 빠른 시간에 추출효과를 극대화하기 위함이다.

(d) 단계

본 발명의 (d)단계는, 상기 분쇄된 둥근잎꿩의비름의 유효성분을 추출하는 단계로써,

상기 추출방법의 제1실시 예는, 상기 분쇄된 원료 9 - 11g을 50 ~ 200㎖, 바람직하게 80~100㎖의 멸균된 정제수로 60 - 70℃에서 3 ~ 5시간 열수추출하거나,

상기 추출방법의 제2실시 예는, 상기 분쇄된 원료 9 - 11g을 80% - 95% 에탄올 50 ~ 200㎖, 바람직하게 80~100㎖에 넣어 24 ~ 30시간 상온에서 교반하여 추출하거나,

상기 추출방법의 제3실시 예는, 상기 분쇄된 원료 9 - 11g을 80% - 95% 에탄올 50 ~ 200㎖에 넣어 40 ~ 60℃, 1300~1600psi 조건에서 3시간 ~ 7시간 동안 가압추출하거나

상기 추출방법의 제4실시 예는, 상기 분쇄된 원료 9 - 11g을 80% - 95% 에탄올 50 ~ 200㎖에 넣어 40 ~ 60℃, 10 - 100kHz의 조건에서 초음파 분쇄 추출한다.

상기 제1 내지 제4의 추출방법에서 추출조건 및 추출시간은 추출물을 고수율로 수득하고 추출물 내의 항산화활성 및 항균활성을 가진 유효성분의 함량을 높이기 위하여 결정된 범위이다.

(e) 단계

본 발명의 (e) 단계는, 상기 추출물의 상등 액을 분리하는 단계로써,

상기 추출물의 상등 액 분리는, 감압 여과과정을 통하여 분리하거나 또는 추출물을 30 ~ 60분간 3000~5000rpm에서 원심분리하여 상등 액을 회수한다.

(f) 단계

본 발명의 (f) 단계는, 상기 상등 액을 농축하는 단계로써,

상기 상등 액 농축방법은, 상기 상등 액을 Rotary vacuum evaporator(N-1000S-WD, EYELA, Tokyo, Japan)에서 농축 및 또는 동결건조를 수행하는 것으로 이루어진다.

상기의 둥근잎꿩의비름의 유효성분 추출방법에 따른 실험 예를 설명하면 다음과 같다.

상기 둥근잎꿩의비름 추출물은 멸균된 증류수로 세척하여 60 - 70℃의 온풍 건조기에서 건조한 다음 분쇄기로 분쇄하고, 그 분쇄된 둥근잎꿩의비름을 80%, 95% 에탄올에 넣은 후 24- 30시간 열수추출기로 추출하고, 그 추출된 추출액을 여과한 후 농축하고 동결건조시켜 된 것과 타 용매에 의해 추출된 것을 하기 표 1에 나타내었다

구분	정제수	에탄올
		80%	95%
추출수율	25.2%	35.5%	24.5%

상기 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 추출된 추출물은 타 용매에 의해 추출된 것보다 수율이 높음을 알 수 있다.

그리고 상기 추출된 추출물의 항산화 활성 측정은, 전자공여능(EDA; eletron donating abilities) 측정의 방법으로 하였으며, 이와 같은 전자공여능 측정은 Blois의 방법(1958)을 따라 측정하였다(Kim et al, 2009).

각 시료는 일정한 농도로 희석하고 시료용액 2.0㎖에 0.4mM의 α,α-diphenyl--picrylhydrazyl(DPPH, SigmaAldrich co, MO, USA) 100㎕를 넣고 교반한 후 실온에서 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도(UV-1601 Visible Spectrophotometer, Shimadzu Co., Japan)를 측정한 결과 각 추출물의 흡광도 감소율로 나타내었다.

합성 항산화제로 BHA( 2,3-tert-butyl-4 hydroxyanisole, Sigma, USA)를 대조구로 이용하여 비교하였다.

DPPH 라디칼 소거능(%)=(Control Absorbance-Sample Absorbance / Control Absorbance) × 100

상기 추출용매의 종류에 따른 DPPH 소거 능에 대한 항산화 활성 실시 예는 아래 표 2에 나타내었다.

둥근잎꿩의비름 추출물의 DPPH 소거능에 따른 항산화 활성

Fraction	Concentration(ug/㎖)	Scavenging effect(%)
정제수	10	3.53±0.50
	50	5.50±0.50
	100	10.4±1.50
	500	20.5±2.12
80% EtOH	10	2.0±0.22
	50	5.4±1.50
	100	12.0±0.22
	500	25.0±0.71
95% EtOH	10	5.0±3.0
	50	7.0±0.25
	100	30.3±2.8
	500	50.4±2.3
BHA(양성대조군)	10	5.0±3.0
	50	8.0±0.25
	100	29.3±1.8
	500	45.4±2.3

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이 둥근잎꿩의비름 추출물의 95% 에탄올 추출물에 DPPH 소거 능이 50.4% 항산화활성이 가장 높게 나타남을 알 수 있다.

또 본 발명은 총 폴리페놀함량을 측정하였는데, 그 방법은, 총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법으로 측정하였다(Lee and Kim 2009).

시료 액 25㎕에 0.1N Folin-ciocalteu reagent(SigmaAldrich co., MO, USA) 0.5㎖ 섞어준 다음, 5분간 상온에서 방치하였다.

7.5% Na₂CO₃ 0.5㎖를 첨가하고 30℃에 90분간 방치한 후 흡광도 725nm에서 측정하였다.

정량은 tannic acid equivalents (TAE, SigmaAldrich Co., MO, USA)로 작성한 표준곡선을 이용하여 함량을 계산하였다.

상기 추출물의 종류에 따른 총 폴리페놀함량측정 실시 예는 아래 표 3에 나타내었다.

둥근잎꿩의비름 추출물의 총폴리페놀함량

추출용매	Total polyphenol¹ ⁾ (㎎/g)
정제수	50±2.1
80% EtOH	95.3±2.1
95% EtOH	80.20±3.5

상기 표 3에서 나타낸 바와 같이 80% 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 95.㎎/g 로 가장 높게 나타남을 확인하였다.

그리고 상기 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등의 방법(2000)을 응용하여 측정하였다.

각 시료 100㎕를 80% Ethanol 900㎕에 혼합한 혼합물 0.5㎖에 10% Aluminium nitrate(Daejung Chemical & Metals Co., Ltd, Shiheung-city, South Korea) 0.1㎖과 1M Potassium acetate(Junsei Co., Tokyo, Japan) 0.1㎖ 그리고 80% Ethanol 4.3㎖을 가하여 실온에서 40분 방치한 뒤 415nm에서 흡광도를 측정하였다.

이때 총 플라보노이드 함량은 Quercertin(SigmaAldrich co., MO, USA)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.

상기 추출용매의 종류에 따른 총 플라보노이드 함량측정 실시 예는 아래 표 4에 나타내었다.

둥근잎꿩의비름 추출물의 총플라보노이드 함량

추출용매	Flavonoid(mg/g)
정제수	30.12±0.20
80% EtOH	90.6±0.58
95% EtOH	40.42±0.30

상기 표 4에서 나타낸 바와 80% 에탄올 추출물에서 총 플라보노이드 함량이 90.6㎎/g 로 가장 높게 나타남을 확인하였다.

또한 본 발명은 상기 추출물을 이용하여 항세균활성을 측정하였고 그 방법은, 기존에 보고된 방법에 준하여 수행하였다(Ahn et al., 2009; Lee et al., 2009; Ryu et al., 2010).

상기 항세균 활성은 그람음성균으로 Escherichia coli KCTC2571, Pseudomonas aeruginosa KCTC2513을 그람양성균으로 Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC1916, Bacillus subtilis QST713을 사용하여 Tryptic Soy Agar(TSA, Difco Co., MD, USA) 배지에 1×10⁴colony forming units(cfu)/㎖로 도말한 후 8mm 직경의 paper disc(Adventec, Toyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Japan)에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 35℃에서 18시간 배양한 후 생육 저지환을 측정하였다.

Digital caliper(PDIC-301, Stolz, USA)를 사용하여 생육저지환의 지름으로 측정하였으며 3회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하였다.

상기 추출물의 종류와 방법에 따른 항균효과 실시 예는 도 1과 아래 표 5에 나타내었다.

둥근잎꿩의비름 추출물의 항균활성효과

Strain	Clear zone (mm)^*
	Content of extract (mg/disc)
	Extracts	0.1	0.5	1.0	2.5	5.0
Gram (-) bacteria
Escherichi coli KCTC2571	80%에탄올	-	-	-	-	-
Escherichi coli KCTC2571	95%에탄올	-	-	-	-	-
Pseudomonas aeruginosa KCTC2513	80%에탄올	-	-	-	13.69±0.53	28.00±0.55
Pseudomonas aeruginosa KCTC2513	95%에탄올	-	-	-	-	-
Gram (+) bacteria
Staphylococcus aureus KCTC1916	80%에탄올	-	-	-	15.29±1.25	30.28±1.38
Staphylococcus aureus KCTC1916	95%에탄올	-	-	-	-	-
Bacillus subtilis QST713	80%에탄올	-	-	-	13.69±0.53	28.00±0.25
Bacillus subtilis QST713	95%에탄올	-	-	-	-	-

상기 표 5에서 나타낸 바와 같이 80% 에탄올 추출물 5mg 처리시 Gram negative bacteria 균주 Pseudomonas aeruginosa KCTC2513에대해 clear zone 28mm, Gram positive bacteria 균주 Staphylococcus aureus KCTC1916 clear zone 30mm 가장 높은 항균활성을 나타남을 확인하였다.

이상과 같은 본 발명의 방법으로 추출된 항산화 및 항균 효과를 갖는 둥근잎꿩의비름 유효성분 추출물은, 항산화 및 항균을 필요로 하는 원료 즉 건강기능식품, 식품첨가제, 음료수, 화장료, 아토피치료제, 세제 등에 적용시켜 피부를 보호함은 물론, 피부노화를 방지와 아토피 등을 치료할 수 있는 장점이 있다.

Claims

(a) 뿌리를 제외한 둥근잎꿩의비름을 채취하는 단계;
(b) 상기 채취된 둥근잎꿩의비름을 건조하는 단계;
(c) 상기 건조된 둥근잎꿩의비름을 분쇄하는 단계;
(d) 상기 분쇄된 둥근잎꿩의비름을 60 - 70℃에서 3 ~ 5시간 열수추출하거나 또는 80% - 95% 에탄올로 추출하는 단계;
(e) 상기 추출물의 상등 액을 분리하는 단계; 및
(f) 상기 상등 액을 농축하는 단계;
를 포함하는 방법으로 얻어지는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 둥근잎꿩의비름 건조는, 60 ~ 70℃의 열풍건조임을 특징으로 하는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계는, 자생지에서 수집된 둥근잎꿩의비름을 16시간 광주기, 5000 Lux 광도 조건으로 온실에서 생장시킨 후 채취하는 것을 특징으로 하는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 (d) 단계의 80% - 95% 에탄올 추출은, 상기 분쇄된 원료 9 - 11g을 80% - 95% 에탄올 50 ~ 200㎖에 넣어 24 ~ 30시간 상온에서 교반하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 (d) 단계의 80% - 95% 에탄올 추출은, 상기 분쇄된 원료 9 - 11g을 80% - 95% 에탄올 50 ~ 200㎖에 넣어 40 ~ 60℃, 1300~1600psi 조건에서 3시간 ~ 7시간 동안 가압추출하는 것을 특징으로 하는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 (d) 단계의 80% - 95% 에탄올 추출은, 상기 분쇄된 원료 9 - 11g을 80% - 95% 에탄올 50 ~ 200㎖에 넣어 40 ~ 60℃, 10 - 100kHz의 조건에서 초음파 분쇄추출하는 것을 특징으로 하는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 (e) 단계에서 상등 액 분리는, 감압 여과과정을 통하여 분리하거나 또는 추출물을 30 ~ 60분간 3000~5000rpm에서 원심분리하여 상등 액을 분리하는 것 중 어느 하나의 방법으로 분리하는 것을 특징으로 하는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
제 1항에 있어서,
상기 (f) 단계에서 상등 액 농축은, 상등 액을 Rotary vacuum evaporator(N-1000S-WD, EYELA, Tokyo, Japan)에서 농축 및 또는 동결건조 하는 것을 특징으로 하는, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물.
(a) 뿌리를 제외한 둥근잎꿩의비름을 채취하는 단계;
(b) 상기 채취된 둥근잎꿩의비름을 건조하는 단계;
(c) 상기 건조된 둥근잎꿩의비름을 분쇄하는 단계;
(d) 상기 분쇄된 둥근잎꿩의비름을 60 - 70℃에서 3 ~ 5시간 열수추출하거나 또는 80% - 95% 에탄올로 추출하는 단계;
(e) 상기 추출물의 상등 액을 분리하는 단계; 및
(f) 상기 상등 액을 농축하는 단계;
로 이루어진, 항균 및 항산화 능을 갖는 둥근잎꿩의비름 추출물의 제조방법.