KR101639026B1 - 2종의 자성입자를 사용한 단일염기 다형성 판별 자동화 장치 - Google Patents

2종의 자성입자를 사용한 단일염기 다형성 판별 자동화 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 판별하는 방법 및 키트에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 판별 방법은 2종의 자성 입자를 이용함으로써 높은 정밀도로 SNP 판별이 가능하고 공정을 단순화 및 자동화시킬 수 있다.

Description

2종의 자성입자를 사용한 단일염기 다형성 판별 자동화 장치 {A device for determining single nucleotide polymorphism by using two type of magnetic particles}
본 발명은 2종의 자성입자를 사용한 단일염기 다형성 판별 자동화 장치 및 단일염기 다형성 판별 자동화 방법; 및 단일염기 다형성 판별용 키트에 관한 것이다.
게놈의 전 염기 배열에는 개체간에 차이가 있고 그 중에 1염기레벨의 개체간의 차이(보다 정밀하게는 인구의 1%이상의 빈도로 출현하는 것)을 단일염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphisms: SNP)이라고 한다.
인간 DNA에는 약 1000염기에 한 개의 빈도로 SNP가 존재한다고 생각되고 있다. 대다수의 SNP는 비번역 영역에 존재하고, 유전적인 특징의 변화를 갖지는 않지만, 유전자나 제어영역에 있는 SNP는 유전적인 개체간의 차이를 발생시킬 가능성이 있다. 유전자치료 및 진단기술의 향상에 따라서 약제감수성(내성 및 부작용의 유무 등), 감염증에 대한 저항성, 생활 습관병의 환경요인, 암, 알츠하이머병, 동물의 유전병 등 여러 질환의 발병 리스트 등에 대해서 유전자의 단일염기 다형성에 의한 설명 가능한 사례가 많이 발견되어 SNP의 해석을 이용한 개인별의 테일러메이드 (Taylor-made) 의료나 예측 의료에의 가능성이 널리 기대되고 있다.
테일러메이드 의료나 예측 의료의 실현을 위해서는 의료 현장에서의 신속, 간단하면서 싼 가격에 실현 가능하고 신뢰성이 높은 단일염기 다형성의 판정 (Typing)방법 및 시스템의 확립이 시급하다. 유전자 해석의 시장은 점점 넓어져가고 있고, 많은 유전자 배열 해석 기술의 수법이 개발되고 있다. 이 중에 폴리뉴클레오티드 (poly nucleotide)의 hybridization을 이용한 핵산의 신장과 연결, 절단 등을 행하는 효소에 의한 특정배열의 인식효율을 이용하는 것으로 크게 나누어진다. 최근에 SNP의 타이핑방법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다.
SNP 판별 방법으로, 주형 단일 가닥 DNA에 혼성화되는 프로브에서 방출되는 형광 강도로 SNP를 검출하는 방법, 특정 염기 서열을 인식하여 절단하는 제한 효소를 이용하여 SNP를 검출하는 방법 등이 공지되어 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 제10-2013-0065258호에는 PCR 앰플리콘의 희석 단계를 포함하는 DNA 용융(melting) 분석을 이용한 SNP 판별 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2012-0046018호에는 실시간 PCR 동안 다형성 검출을 위한 방법 및 키트가 개시되어 있다.
이와 같이, SNP 판별을 위한 다양한 방법들이 보고되고 있으나, SNP 판별 각 단계마다 각각의 장비가 요구되는 것이 일반적이며, 여러 공정이 결합되면 정밀도가 낮아지는 등의 문제점이 있다.
한편, 골다공증 관련 TGF-β1의 유전자 다형은 TGF-β1유전자의 엑손(exon)1의 코든(coden)10부분의 변이에 의한 것을 들 수 있다. 코든 10의 변이로 인해 Leu가 Pro로 변화된다. 이　부분의 정상적인 염기배열은 CTG를 나타내지만 많은 골다공증 환자는 CCG를 나타내고 있고, 이 다형은 골다공증환자에 고빈도로 분포되어 있다. 또한, TGF-β1의 유전자는 GC함량이 높아 고효율 PCR 효과를 올리기가 어렵고 RFLP 해석에 의한 SNP 검출에 유용한 제한 효소 사이트를 가지고 있지 않다.
TGF-β1의 유전자 다형의 알려진 해석 방법은, 먼저 혈액으로부터 DNA를 추출하거나, mRNA를 추출해서 역전사에 의한 cDNA를 조제한다. 이어서, 준비된 DNA를 주형으로써 목적하는 다형을 포함하는 부분을 증폭할 수 있도록 설정한 프라이머를 사용해서 PCR을 실시한 후, 얻어진 PCR산물의 염기배열을 해석한다. 또한, PCR산물의 염기배열 해석 시 꼭 완전한 염기배열을 결정할 필요는 없고 제한 단편장다형으로도 해석할 수 있다.
유전자 해석 결과에 기초를 둔 골다공증 위험인자의 유무 검출은, 판명된 유전자형이 이미 골다공증과 관련 유무를 조사함으로써 골다공증 위험인자라는 것을 판명하는 유전자형과 같거나 틀리다는 판정에도 사용 가능하다. 예를 들어 TGF-β1 유전자 다형이 인간 TGF-β1유전자의 엑손1의 코든10의 CTG로부터 CCG로 변이된 경우 CTG의 유전자형이 위험인자이다.
본 발명은, 단시간 내에 높은 효율과 고정밀도로 SNP 프로브로 혼성화(hybridization)를 실시하는 혼성화 반응부를 포함하되, DNA 추출부터 단일염기 다형성 검출까지의 전 과정을 자동화하는 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 정확한 검출 결과를 얻을 수 있도록 반응온도 관리를 실시할 수 있으면서도, 넓은 스테이지를 필요로 하지 않은 자동화 장치를 제공하고자 한다.
본 발명의 제1양태는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 판별 자동화 장치에 있어서, 제1반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비하며, (+) 전하를 띠는 자성입자를 사용하는 DNA 분리 공정 및 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머를 사용하는 PCR 공정을 수행하는 제1반응부; 제1반응부로부터 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드 함유 PCR 반응 산물을 제2반응부로 이동시키는 수단; 및 제2반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비하며, 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드를 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자에 고정화하는 공정, 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드의 단일가닥 (single stranded) 화 공정 및 SNP 판별용 프로브로 혼성화(hybridization)하는 공정을 수행하는 제2반응부를 구비한 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치를 제공한다.
본 발명의 제2양태는 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 판별하는 방법에 있어서, 제1반응용기에서 (+) 전하를 띠는 자성입자를 사용하여 SNP를 판별하고자 하는 개체의 시료로부터 준비된 DNA을 흡착시키고, 자력을 인가하여 DNA이 흡착된 자성 입자를 제1반응용기 하부에 수집하고 상층액은 제거하는 제1단계; 제1반응용기에 제1작용기로 수식된 프라이머 함유 PCR 시약을 주입하고, 자성 입자에 흡착된 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드 함유 PCR 반응 산물을 수득하는 제2단계; 제1반응용기의 상층액에 있는 PCR 반응 산물을 제2반응용기로 옮기는 제3단계; 제2반응용기에서 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자를 사용하여, 제1작용기와 제2작용기의 결합을 통해 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드가 결합된 자성입자를 수득하는 제4단계; 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드가 결합된 자성입자에 알칼리 용액을 처리하여 단일 가닥화된 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드를 수득하는 제5단계; 단일 가닥화된 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드에 표지물질 수식 SNP 판별용 프로브를 혼성화시키는 제6단계; 자력을 인가하여 SNP 판별용 프로브와 혼성화된 폴리뉴클레오티드가 흡착된 자성 입자를 제2반응용기 하부에 수집하고, 혼성화되지 아니한 SNP 판별용 프로브 함유 상층액을 제거하는 제7단계; 및 제2반응용기에서 제거되지 아니한 SNP 판별용 프로브의 표지물질의 수준을 측정하는 제8단계를 포함하는, 단일염기 다형성 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 (+) 전하를 띠는 자성입자, 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머, 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자, 및 선택적으로 SNP 판별용 프로브 수식용 표지물질을 포함하는 단일염기 다형성 판별용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)는 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 의미한다.
대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명의 SNP 판별 장치 또는 방법을 이용하여 SNP의 존재 및 유전자형을 판별하고자 하는 모든 동물, 특히 인간을 의미할 수 있다. 본 발명에서, "개체의 시료"는 상기 개체로부터 분리된 것으로서, 뇨, 혈액, 각종 체액, 타액 등일 수 있고, 본 발명의 목적상 유전 물질을 수득할 수 있는 것이면 제한없이 포함된다.
본 발명에서, DNA는 천연DNA 및 cDNA 뿐만 아니라, (-) 전하를 띠면서, PCR에 의해 증폭될 수 있을 뿐만 아니라 SNP 프로브와 하이브리드될 수 있는 한 폴리뉴클레오티드에 한정되지 아니한다.
SNP는 현재 여러 질환의 예방 및 치료를 위해 연구되고 있다. 예를 들어, 겸상 적혈구 빈혈증, 베타지중해빈혈(β-thalassemia), 낭성 섬유증(cystic fibrosis)을 비롯한 다양한 인간 질환을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있고, APOE(apolipoprotein E) 유전자는 알츠하이머의 높은 위험성과 연관된 것으로 알려져 있다. 또한, TGF-β1는 골다공증의 마커로서, TGF-β1 유전자의 T29(Leu10)에서 C29(Pro10)으로의 변이가 골 소실(bone loss)에 연관되어 있음이 알려져 있다.
단일염기 다형성(SNP) 판정 방법은 일련의 DNA 수집 공정, PCR 공정, SNP 판별용 프로브로 혼성화(hybridization)하는 공정 및 SNP 검출 공정(예, 형광측정 공정)을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 높은 정밀도를 나타내면서도 공정을 단순화한 SNP 판별 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, (i) 핵산과 결합할 수 있는 (+) 전하를 띠는 자성입자 및 (ii) SNP 판별이 필요한 부위의 PCR 산물과 결합할 수 있는 자성 비드를 이용하는 경우, SNP에 대한 높은 정밀도를 가지면서도 SNP 판별의 전과정을 자동화시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 자동화를 위해, 결합형(B)/유리형(F) 분리에 2종이상의 자성입자를 사용하는 것이 특징이다. 즉, 본 발명은 DNA 추출용으로 (+) 전하를 띠는 자성입자, 제1작용기 수식 프라이머의 PCR 산물을 고정화하기 위해 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자를 사용하는 것이 특징이다.
본 발명은 (-) 전하를 띠는 DNA를 (+) 전하를 띠는 자성입자에 정전기력으로 흡착시킨 상태에서도 PCR의 수율이 떨어지지 않는다는 발견에 기초하여, 단일염기 다형성 판정을 위해 핵산 추출, PCR, SNP 프로브와의 혼성화 및 선택적으로 SNP 검출을 모두 하나의 시스템 장치에서 자동화 가능하도록 설계한 것이 또 다른 특징이다.
본 발명의 단일염기 다형성 판별 장치는 제1반응용기에서 (+) 전하를 띠는 자성입자를, 제2반응용기에서 제1작용기 수식 프라이머의 PCR 산물을 고정화하기 위해 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자를 순차적으로 사용하고, 외부에서 발생된 자력에 의해 결합형(B)/유리형(F) 분리시킴으로써, 즉 상기 자성입자에 결합된 폴리뉴클레오티드를 용기의 특정 부위에, 자성입자에 결합되지 아니하는 물질을 상층액에 분리시키고 상층액을 제거함으로써, 자성입자에 결합된 폴리뉴클레오티드를 오염 없이 용이하게 분리함으로써 높은 정밀도로 SNP 판별을 할 수 있는 동시에, 자력제어장치의 존재하 상기 자성입자의 제어로써 공정의 자동화도 꾀할 수 있다.
본 발명은 자력제어장치에 의해 용기 내 특정 부위에 추출된 핵산이 흡착된 자성 입자를 수집하거나, 단일가닥화된 폴리뉴클레오티드가 흡착된 자성 입자를 수집하거나, 또는 프로브와 혼성화된 폴리뉴클레오티드가 흡착된 자성 입자를 수집할 수 있다.
본 발명은 자성입자를 통해 반응용기에 고정되어 있는 폴리뉴클레오티드에 대해 세정을 포함한 다양한 반응을 수행하고 난 후 파이펫팅에 의해 상층액을 용이하게 폐기할 수 있다. 또한, 본 발명은 파이펫팅에 의해 세정액을 포함한 다양한 액체를 반응용기에 분배하고, 파이펫팅에 의해 교반을 유도할 수 있다.
본 발명에서 자성입자는 철족금속원소인 철(Fe), 니켈(Ni), 코발트(Co), 망간(Mn), 비스무스(Bi) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 금속 또는 이들의 합금이거나 이들로부터 선택된 금속 산화물 또는 합금 산화물일 수 있다.
본 발명에서 (+) 전하를 띠는 자성입자는 표면에 양전하를 가지므로, 자성입자 표면에 음전하를 띠는 핵산이 흡착하여 시료로부터 핵산을 추출할 수 있으며, 추출된 DNA를 흡착시킨 채로 PCR에 사용될 수 있다. 본 발명의 일구체예에서 (+) 전하를 띠는 자성입자는 자성 비드의 표면에 아미노기를 수식한 아미노기 수식 자성 비드일 수 있다.
(+) 전하를 띠는 자성입자는 pH가 상승함에 따라 (+) 전하를 잃거나 (-) 전하를 나타내어 양성 표면 전하가 음성으로 변화할 수 있다.
(+) 전하를 띠는 자성입자는 예컨대, 유기실란 기능화(organosilane functionalization)에 의해 유기실란 분자가 표면에 결합되고 결합된 유기실란 분자에 의해 (+) 전하는 띠는 작용기로 표면이 개질될 수 있다.
상기 작용기는 3-아미노프로필기, 아미노메틸기, 2-아미노에틸기, N-메틸-3-아미노프로필기, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필기, N-아미노에틸-3-아미노프로필기 또는 N,N-디(2-아미노에틸)-3-아미노프로필기일 수 있으나, (+) 전하를 띨 수 있는 한 이에 제한되지 않는다.
(+) 전하는 띠는 작용기를 제공하는 유기실란 전구체의 비제한적인 예로, APTES(3-aminoproryltriethoxysilane), aminomethyltriethoxysilane, 2-aminoethyltriethoxysilane, N-methyl-3-aminoproryltriethoxysilane, N-(2-aminoethyl)-3-aminoproryltriethoxysilane, N-aminoethyl-3-aminoproryltriethoxysilane, N,N-di(2-aminoethyl)-3-aminoproryltriethoxysilane 또는 이의 혼합물이 있다.
상기 (+) 전하를 띠는 자성입자에 의해 분리된 DNA를 제1작용기로 수식된 프라이머로 증폭시킨 PCR 반응산물로부터 준비한, 제1작용기로 수식된 폴리뉴클레오티드를 제2작용기로 수식된 자성입자에 고정화시키는 제1작용기와 제2작용기 간의 결합의 비제한적인 예로는, 배위결합(coordinate bond), 공유결합(covalent bond), 금속결합(metallic bond), 수소결합(hydrogen bond), 이온 결합(ionic bond), 항원-항체 결합(antigen-antibody binding) 및 리간드-수용체 결합(ligand-receptor binding) 등이 있다. 제1작용기와 제2작용기 간의 결합은 특이적인 결합이 바람직하다.
한편, 바이오틴과 아비딘 간의 리간드 수용체 결합은 바이오틴으로 수식된 폴리뉴클레오티드와 아비딘으로 수식된 자성입자 또는 이의 역으로 수식된 폴리뉴클레오티드와 자성입자 간에 형성될 수 있다. 또는, 상기 아비딘은 복수의 바이오틴 결합자리를 가지므로 바이오틴화된 폴리뉴클레오티드와 자성비드가 아비딘을 매개로 결합하는 형태일 수 있다. 상기 아비딘은 아비딘, 스트렙타비딘, 탈당화 아비딘(deglycosylated avidin; NeutrAvidin)을 제한없이 포함한다.
본 발명의 일구체예에서, 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자는 자성 비드의 표면에 스트렙타아비딘을 수식한 스트렙타아비딘 수식 자성 비드일 수 있다. 따라서, 상기 아미노기 수식 자성 비드에 의해 추출된 DNA를 비오틴 수식 프라이머로 증폭시킨 PCR 반응산물로부터 비오틴 수식 폴리뉴클레오티드를 비오틴-스트렙타아비딘 반응을 통해 수득할 수 있다.
본 발명에서 단일가닥(single stranded)화는 프로브의 혼성화(hybridization)를 위해 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 단일가닥의 폴리뉴클레오티드로 만드는 과정을 의미하며, 알칼리 용액의 처리에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 알칼리 용액은 NaOH 용액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 프로브는 단일가닥화된 DNA 단편에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 할 수 있으며, 서로 다른 대립유전자 형태 간에 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 또, 유전자형에 따라 서로 다른 표지물질로 수식될 수 있다. 시료의 유전자형에 따라 결합하는 프로브가 달라지게 되므로, 프로브에 수식된 표지물질에서 발생되는 신호의 차이가 발생하게 된다. 따라서, 상기 혼성화 차이는 프로브에 수식된 표지물질에 의해 검출될 수 있으며, 측정된 표지물질의 비율에 의하여 SNP의 유전자형을 결정할 수 있다.
본 발명에서 표지물질은 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 물질이다. 본 발명에 적용 가능한 표지물질은 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료(예, Cy3 또는 Cy5), 형광단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자 등이 될 수 있으나, 본 발명의 목적상 프로브의 혼성화에 따른 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 물질이면 제한되지 않는다. 상기 표지물질은 형광현미경, SEM, TEM, CT, 및 MRI 등으로 검출할 수 있다.
상기 표지물질로 수식된 SNP 판별 프로브는 SNP의 유전자형에 따라, 서로 다른 표지물질이 수식된 프로브일 수 있다. 특정 유전자형에 결합되는 표지물질 수식 프로브를 시료에 가하여, 결합된 프로브로부터 방출되는 표지물질의 신호를 측정하면, 유전자형을 판별 할 수 있다.
본 발명에 따른 단일염기 다형성 판별 자동화 장치는,
제1반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비하며, (+) 전하를 띠는 자성입자를 사용하는 DNA 분리 공정 및 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머를 사용하는 PCR 공정을 수행하는 제1반응부;
제1반응부로부터 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드 함유 PCR 반응 산물을 제2반응부로 이동시키는 수단; 및
제2반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비하며, 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드를 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자에 고정화하는 공정, 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드의 단일가닥 (single stranded) 화 공정 및 SNP 판별용 프로브로 혼성화(hybridization)하는 공정을 수행하는 제2반응부를 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 단일염기 다형성 검출 장치는, (1) DNA 분리단계, (2) PCR 단계, (3) 고정화 단계, (4) 단일가닥 (single stranded) 화 단계, (5) SNP 판별용 프로브와의 혼성화(hybridization) 단계 및 (6) 표지물질 검출 단계를 전자동으로 실시할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 단일염기 다형성 판별 자동화 장치를 사용하여 하기 단계들을 수행할 수 있다:
제1반응용기에서 (+) 전하를 띠는 자성입자를 사용하여 SNP를 판별하고자 하는 개체의 시료로부터 준비된 DNA을 흡착시키고, 자력을 인가하여 DNA이 흡착된 자성 입자를 제1반응용기 하부에 수집하고 상층액은 제거하는 제1단계;
제1반응용기에 제1작용기로 수식된 프라이머 함유 PCR 시약을 주입하고, 자성 입자에 흡착된 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드 함유 PCR 반응 산물을 수득하는 제2단계;
제1반응용기의 상층액에 있는 PCR 반응 산물을 제2반응용기로 옮기는 제3단계;
제2반응용기에서 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자를 사용하여, 제1작용기와 제2작용기의 결합을 통해 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드가 결합된 자성입자를 수득하는 제4단계;
제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드가 결합된 자성입자에 알칼리 용액을 처리하여 단일 가닥화된 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드를 수득하는 제5단계;
단일 가닥화된 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드에 표지물질 수식 SNP 판별용 프로브를 혼성화시키는 제6단계;
자력을 인가하여 SNP 판별용 프로브와 혼성화된 폴리뉴클레오티드가 흡착된 자성 입자를 제2반응용기 하부에 수집하고, 혼성화되지 아니한 SNP 판별용 프로브 함유 상층액을 제거하는 제7단계; 및
제2반응용기에서 제거되지 아니한 SNP 판별용 프로브의 표지물질의 수준을 측정하는 제8단계.
도 1은 본 발명의 일구체예에 따른 단일염기 다형성 검출장치의 내부 구성을 나타낸 개념도이다.
제1반응부(1)에서는 (+) 전하를 띠는 자성입자를 사용하는 DNA 분리 공정 및 제1작용기로 수식된 프라이머를 사용하는 PCR 공정을 수행한다. 이를 위해, 제1반응부(1)는 제1반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비한다.
단일염기 다형성 판별 자동화 장치는 제1반응부(1)와 관련하여, (+) 전하를 띠는 자성입자가 구비되어 있는 제1반응용기에서 제1반응용기 내 수용되어 있는 시료로부터 나온 (-) 전하를 띠는 핵산과 상기 자성입자를 결합시킨 후 자력을 인가하여 결합형(B)/유리형(F) 분리로 핵산을 분리하고(도 2 참조), (ii) 제1반응용기에서 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머를 사용하여 (-) 전하를 띠는 DNA가 (+) 전하를 띠는 자성입자에 붙어있는 상태에서 PCR을 진행하여, 한쌍의 프라이머로 정의되는 DNA 부분을 증폭하도록 프로그램되어 있다. 이때, PCR 산물인 증폭된 DNA 중 한 가닥은 제1작용기를 갖는 프라이머를 함유하고 있다. 이어서, 단일염기 다형성 판별 자동화 장치는 (iii) PCR로 증폭된 DNA를 제1반응부로부터 제2반응부로 이동시키도록 프로그램되어 있다.
제2반응부(2)에서는 PCR로 증폭된 DNA를 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자에 고정화하는 공정, DNA의 단일가닥 (single stranded) 화 공정 및 SNP 프로브로 혼성화(hybridization)하는 공정을 수행한다(도 3 참조). 이를 위해, 제2반응부(2)는 제2반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비한다.
단일염기 다형성 판별 자동화 장치는 제2반응부(2)와 관련하여, (iv) 제2반응용기에서 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자를 사용하여 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA를 상기 자성입자에 고정화시키고, (v) 제2반응용기에서 DNA를 단일가닥(single stranded)화시키고, (vi) 제2반응용기에서 1종 이상의 SNP 프로브와 자성입자에 고정화되어 있는 DNA 단일가닥과 혼성화(hybridization)하도록 프로그램되어 있다. 이때, PCR 산물 중 제1작용기로 수식된 프라이머를 포함하는 DNA 가닥이 제2작용기로 수식된 자성입자에 고정화되어 있으므로, SNP 프로브는 상기 제1작용기로 수식된 프라이머를 포함하는 DNA 가닥에 상보적인 것이 바람직하다.
제1반응용기 및 제2반응용기는 시료를 수용하고 다양한 반응을 수행할 수 있는 구별된 1이상의 구획(웰)을 포함할 수 있다. 예컨대 복수의 샘플을 동시에 시험가능한 24～96 well maicroplate일 수 있다. 반응용기는 범용성이 높은 수지제로 제조될 수 있으나, 그 형상과 재질에 특히 제한이 없다. 반응용기(8)는 반응용기 지지대에 탈착가능하여 교체될 수도 있고 고정되어 있을 수도 있다.
제1반응부(1) 및 제2반응부(2)는 반응용기를 수납 유지 하기 위한 지지대(9), 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단(삽입도), 및 선택적으로 자력제어장치(14)을 더 포함한다.
반응용기 지지대(9)는 반응용기표면에 밀착하는 형상을 가진 금속제인 것이 좋다.
자력제어장치는 본 발명의 목적상 자력을 적절한 시기에 발생시켜 용기의 특정부위에 자성 입자를 수집할 수 있게 한다.
ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단 및/또는 자력제어장치(14)는 반응용기의 하나 이상의 구획(웰) 각각에 대응하는 자력을 발생시켜, 반응용기의 각 구획 하부에 자성입자를 부동화시킬 수 있다. 따라서, 자력 제어를 통해, 용기내 결합형(B)/유리형(F) 분리에 사용하는 자성입자에 자력을 작용시킬 수 있다. ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 반응용기의 각 구획 하부 바람직하게는 바로 밑에 설치하면, 반응용기 하부의 자력을 ON, OFF함으로써 용기 아래 좁은 면적에 수집할 수 있다. 예를 들어, 자력발생원을 용기 아래에 접근시킴으로써 반응용기 내의 자성입자에 작용하는 자력을 증대시킬 수 있고, 자력발생원을 용기로부터 밑방향 또는 옆방향으로 격리시킴으로써 작용하는 자력을 감소시킬 수 있다. 자력 발생원이 용기 하부 면에서 가까워지면 자속에 따라 상하로 길게 뻗쳐, 용기 의 특정 부위 에 자성입자들을 모이도록 할 수 있고, 상기 자성입자가 모이는 부위는 용기 바닥 밑면이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
따라서, (+) 전하를 띠는 자성입자를 사용하는 제1반응용기에서는 자력을 인가하여 (-) 전하를 띠는 핵산과 결합되어 있는 (+) 전하를 띠는 자성입자를 반응용기 에 모음으로써, 결합형(B)/유리형(F) 분리로 핵산을 분리할 수 있다. 또한, SNP 판별용 프로브와 자성입자에 고정화되어 있는 DNA 가닥을 혼성화(hybridization)하는 제2반응용기에서는, 자력을 인가하여 DNA 가닥에 하이브리드되지 아니한 SNP 판별용 프로브를 상층액을 통해 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 이어서 DNA 가닥에 하이브리드된 SNP 프로브를 분리하는 조건하에 자력을 인가하여 자성입자를 반응용기 에 모음으로써, 다음 공정에서 하이브리드되었던 SNP 판별용 프로브를 검출할 수 있도록 자성입자로부터 SNP 판별용 프로브를 분리시킬 수 있다.
한편, 용기 내측의 계면에 대량의 자성입자의 흡착이 일어날 수 있는 수지로 된 반응용기는 부적절하다.
자기발생원의 비제한적인 예로는 영구자석, 전자석 등이 있다. 자속밀도, 용적 측면에서 영구자석이 바람직하다. 영구자석을 2개 이상의 구획을 갖는 반응용기의 각 웰에 대응하도록 array상으로 나란히 늘어놓아 서로 옆의 자극을 N, S극을 번갈아 배치하면 반응용기에 작용시키는 자속의 혼란을 방지하는 것이 가능하고 효율 좋게 자성입자를 응집시킬 수 있다.
나아가, 제1반응부 및 제2반응부는 지지대 및/또는 반응용기의 온도를 조절하는 가온냉각장치(10, 11) 및/또는 온도 센서(12)를 더 구비할 수 있다.
가온냉각장치는 반응용기 지지대(9)를 가온하는 히타(10) 및 냉각하는 냉각기(11)를 포함할 수 있다. 또한, 지지대의 온도를 측정하기 위한 온도 감지 센서(12)가 온도제어 장치(13)에 연결되어, 히터 또는 냉각기의 작동을 제어할 수 있다.
따라서, 제1반응부 및 제2반응부에서 지지대 및/또는 반응용기의 온도를 조절하는 가온냉각장치(10, 11) 및/또는 온도 센서(12)는 PCR 시 또는 SNP 프로브로 혼성화(hybridization) 시 필요한 온도를 정밀하게 조절할 수 있도록 도와 준다.
구체적으로, 제1반응용기에서는 온도 조절을 통해 PCR 공정을 수행할 수 있으며, 제2반응용기에서는 온도 조절을 통해 SNP 프로브로 혼성화(hybridization)하는 공정을 위한 변성(denature), 어닐링(annealing) 및 결합형(B)/유리형(F) 분리를 수행할 수 있다(도 3 참조). 제2반응용기에서는 엄격한 온도 조건하에 PCR 산물 중 단일가닥 DNA와 SNP 프로브를 혼성화(hybridization)하는 공정을 수행한다(도 3).
DNA 시료, 시약 유닛, 시약 분주 유닛, 반응용기 운반 유닛, 혼성화(hybridization) 유닛을 구비한 종래의 DNA 프로브(probe) 자동 측정 장치는 혼성화(hybridization) 공정에서 극히 중요한 반응시의 온도와 B/F분리를 실시 할 때의 온도 관리를 실행하고 있지 않기 때문에 비 특이흡착이 증가하는 등 검출 결과의 오차가 발생하였다.
온도제어 장치(13)은 반응용기 내부를 DNA 변성(denature) 온도 (예, 96℃)로 제어하고 어닐링(annealing) 온도(예, 40～70 ℃ )로 제어할 수 있다. 또한, 온도 제어 장치는 타이머기능에 의해 반응시간도 컨트롤할 수 있다.
SNP 판별용 프로브를 이용한 혼성화(Hybridization)을 통해 시료 핵산을 측정하는 작업은 시료 수가 많기 때문에 단순작업의 반복이 필요하고, 각 공정에서 사용되는 장비가 독립하고 있기 때문에 넓은 설치 면적을 필요로 하고, 반응온도의 관리와 반응진행에 장시간이 필요하며 미량의 시료에 대해 높은 정밀도가 나오도록 하기 위해서는 혼성화(hybridization)공정을 자동화하는 것이 필요하다.
본 발명의 일구체예에서는 혼성화(hybridization)을 실시하는 반응부에 가온냉각장치와 자력제어장치를 함께 장착함으로써 특히 단순한 동작을 가지고도 혼성화(hybridization) 공정의 자동화가 가능하고 동시에 장치전체의 소형화가 가능하다.
한편, 본 발명의 단일염기 다형성 판별 자동화 장치는 하나 이상의 파이펫(pipette)이 장착된 이동할 수 있는 헤드부(7)를 구비할 수 있다. 헤드부(7)는 X-Z축 방향으로 이동하는 arm unit를 구비할 수 있다.
각 arm unit는 팁노즐(tip nozzle) (8)과 헤드부를 이동시키는 수단; 각 팁노즐에 팁을 장착,탈착시키는 수단; 및 장착된 팁으로부터 처리액 (폐액, 세정액)을 흡인, 방출하는 수단이 설치되어 있을 수 있다.
파이펫(pipette)은 액체 수용 챔버에 부분 진공을 발생시키고 선택적으로 진공 파기(vaccum release)시켜 액체를 흡입 및 분배할 수 있다. 본 명세서에서는 파이펫(pipette)은 tip rack, pipettor로 혼용사용될 수 있다. 파이펫의 tip은 rack으로부터 탈착가능하거나 고정될 수 있다.
단일염기 다형성 판별 자동화 장치는 시약 저장 용기; 폐액부; 세정액 저장 용기 및 가온 냉각장치를 갖춘 세정액부를 더 포함할 수 있다.
헤드부에 장착된 이동 수단은 프로그램에 의해 헤드부를 제1반응부, 제2반응부, 시약 저장 용기, 폐액부 및 세정액부로 이동시킬 수 있다.
따라서, 헤드부의 파이펫은 프로그램에 따라 제1반응용기 또는 제2반응용기에 시약을 운반하거나, 제1반응용기 또는 제2반응용기 밖으로 폐액을 운반할 수 있다. 또한, 헤드부의 파이펫은 프로그램에 따라 상기 세정액부에서 pipette tip을 세정할 수 있다.
본 발명에 따른 장치는 핵산 추출에서 SNP 수준 검출까지 필요한 모든 시약 수용 용기를 갖춘 시약트레이(6)를 구비할 수 있다. 시약트레이는 예를 들어 혼성화(hybridization)된 핵산을 검출하기 위해서 표식이 필요한 경우 표식시약 이나 효소 발색기질을 수납할 수 있다. 미리 시료 핵산을 표식한 것을 사용할 경우에는 본 시약트레이를 갖출 필요는 없다.
단일염기 다형성 판별 자동화 장치에서 사용될 수 있는 시약으로는 혈액 용혈제, PCR을 실시하기 위한 혼합액(2X PCR buffer, dNTP, MgCl2, BSA, Taq polymerase), 표지물질로 수식된 1종 이상의 SNP 판별용 프로브가 있다.
본 발명에 따른 장치는 tip 내 시료액을 버리는 폐액부(3), 세정액 및 시약을 분주하기 위한 디스포tip 를 유지하는 tip rack (4), 자기분리 /세정시에 반응부로부터 흡입한 폐액을 배출하고 저장하기 위한 폐액수용용기를 그 밑에 배치한 것이다. tip rack와 폐액 수용용기를 헤드부의 이동평면에 대해서 수직으로 배치함으로 스페이스를 줄일 수 있다. Tip rack (4)는 디스포 팁의 taper부를 지지하는 구멍이 있어 측정을 개시하기 전에 여기에 디스포 팁(5)가 준비되어 있다. Tip이 채워져 있는 tip rack을 살균 처리후 tip rack 고정부 (4)에 설치한다.
또한, 헤드부(7)는 완충액 디스펜서를 더 포함할 수 있다.
한편, 단일염기 다형성 판별 자동화 장치는 이동가능한 표지물질 검출기를 포함할 수 있다. 상기 검출기는 헤드부에 장착될 수도 있고 헤드부와 별도로 구비될 수 있다.
상기 검출기는 형광체와 같은 표지물질을 센싱할 수 있는 하나 이상의 칩; 상기 칩을 장착할 수 있고 제2반응용기로부터의 처리액을 흡입 및 주입하는 칩노즐; 각각의 칩노즐에 칩을 장착, 탈착시키는 수단; X-Z축 방향으로 이동을 포함할 수 있다.
상기 칩은 예컨대 하나 이상의 형광신호를 검출할 수 있는 수단을 포함할 수 있다.
본 발명은 (+) 전하를 띠는 자성입자, 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머, 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자, 및 선택적으로 SNP 판별용 프로브 수식용 표지물질을 포함하는 단일염기 다형성 판별용 키트를 제공한다.
여기서 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다. 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 2종 자성 입자를 서로 다른 반응용기에서 이용한 SNP 판별 방법은 자력제어를 통해 자동화될 수 있으므로, 의료현장 등에서 간편하게 실시 가능한 판정정밀도가 높은 단일염기 다형성 판정을 수행할 수 있고, 각종 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일구체예에 따른 단일염기 다형성 검출장치의 내부 구성을 나타낸 개념도이다.
도 2는 자성입자에 의해 핵산추출 공정을 나타낸 개념도이다.
도 3은 TGF-β1 유전자를 SNP 검출하기 위한 일구체예에 따른 공정도이다.
도 4는 본 발명의 SNP 판별 방법에 의해 784명의 혈액 시료에서 TGF-β1의 SNP를 판별한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일구체예에 따른 단일염기 다형성 판별 방법의 각 단계를 나타낸 개념도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
하기 실시예에서는 784명의 골다공증 의심환자의 혈액을 가지고 본 발명에 따라 자동화된 장치를 가지고 골다공증 마커인 TGF-β1의 단일염기 다형성 검출을 실시했다.
<재료 준비>
(1) 아미노 수식 자성 비드와 스트렙트아비딘 수식 자성 비드 준비
본 발명에 따른 자동화된 장치에서는 Invitrogen 사의 Dynabeads M-270 Amine을 사용하였으며, 스트렙트아비딘 수식 자성 비드로서, Invitrogen 사의 MyOne Streptavidin C1을 사용하였다.
(2) PCR 용 프라이머쌍
센스 5' - CGCCTCCCCCATTCCGCCCT - 3' 서열번호 1
안티센스 5' - ACCAGTAGCCACAGCAGCGGTAGCAG - 3' 서열번호 2
센스 프라이머 5'에는 비오틴을 수식하였다.
(3) SNP 검출용 프로브의 합성
골다공증의 TGF-β1의 T29(Leu10)을 가지는 야생형을 판단하는 검출용 프로브 DNA 및 C29 (Pro10)을 갖는 변이형을 판단하는 검출용 프로브 DNA를 디자인하고, 디자인 한 프로브 (probe) DNA의 5'말단에 형광 표식한 합성 올리고 DNA를 준비했다.
T allele 검출 프로브 Cy3 - 5'-TGCTGCTGCTGCTG-3' 서열번호 3
C allele 검출 프로브 Cy5 - 5'-TGCTGCCGCTGCT-3' 서열번호 4
(4) 시료 DNA의 준비
96마이크로 플레이트의 1웰당 784명의 골다공증 의심환자의 전혈 10㎕을 분주하였다.
(5) 시약 준비
(i) 96마이크로 플레이트의 1웰당 혈액 용혈제 15㎕, PCR을 실시하기 위한 혼합액(2X PCR buffer, dNTP, MgCl2, BSA, Taq polymerase), Cy3수식 프로브, Cy5수식 프로브는 시약트레이(6)에 미리 준비를 해서 4 ℃보존을 하였다.
(ii) PBS완충액, 알칼리용액, 중성용액, 세정용액, 검출용액은 외부 용기에 준비하여 arm unit에 붙어 있는 완충액 디스펜서(dispenser) (9)를 통해 제1반응부(1)과 제2반응부(2)에 공급된다.
(iii) tip 이 채워져 있는 tip rack을 살균 처리후 tip rack 고정부 (4)에 설치한다.
실시예 1. 핵산의 추출
아미노기 수식 자성비드가 수용되어 있는 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 혈액 10㎕씩 분주하고, tip을 장착한 헤드부(7)가 시약트레이(6)에서 용혈버퍼 15㎕을 취해 제1반응부(1)에 탑재되어 있는 96 웰 마이크로플레이트에 분주한 다음, 흡입과 토출 (피펫팅)을 약 10회 반복하여 혈액의 용혈을 실행하였다. 이후 일정온도에서 20분간 항온처리(incubation)하여 아미노기 수식 자성비드에 혈액에서 추출된 핵산이 붙도록 하였다.
이후 96 웰 마이크로플레이트에 자력 제어 장치를 가동함으로써 자기장을 가하여 자성비드를 회수하였다. 그 다음 새로운 tip을 장착한 헤드부(7)가 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰 에서 상층액을 취해 폐액부(3)에 버렸다.
이후 헤드부(7)에 장착되어 있는 완충액 디스펜서를 이용해서 외부용기로부터 세정액이 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 주입시킨 후 자력제어장치를 OFF상태에서 피펫팅을 실시한 후 다시 자력제어장치를 ON을 해서 자성입자를 용기 에 모이게 한 후, 상층액을 버리는 작업을 반복하였다.
실시예 2. PCR
PCR를 위해 필요한 PCR시약과 5'에 비오틴을 수식한 프라이머를 혼합해서 미리 시약트레이(6)에 준비하였다. 핵산 추출이 끝난 제1반응부(1)의 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 tip을 장착한 헤드부가 시약트레이(6)에서 PCR시약을 취해서 주입하였다. 이후 96 웰 마이크로플레이트의 가온냉각장치의 온도제어 기능을 가동시켜 PCR을 실시하였다.
실시예 3. 고정화
제2반응부(2)에 탑재된 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 streptavidin 수식 자성비드를 시약트레이(6)로부터 헤드부를 이용해 주입한 후, 제1반응부(1)의 PCR산물을 제2반응부(2)의 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 헤드부를 이용해 주입해서, 피펫팅하면서 15분간 항온처리(incubation)을 실시하였다. 이때 제2반응부(2)의 가온냉각장치의 온도제어 기능을 가동시켜 96 웰 마이크로플레이트를 25℃로 하였다. 그 상태에서 5분간 유지하여 96 웰 마이크로플레이트 중 시료의 비오틴 수식된 핵산을 streptavidin 수식 자성비드에 고정화하였다.
실시예 4. 단일가닥 (single stranded)화
고정화 수료 후에 외부 용기로부터 헤드부의 완충액 디스펜서를 이용해 알카리 용액을 96개 각 웰에 주입시킨 후 피펫팅을 실행하였다. 이후 96 웰 마이크로플레이트에 자력제어장치를 가동하여 자기흡인력을 발생시켜 자성입자를 수집하였다. 자력제어장치를 동작시킨 후에 그대로 대기시켰다. 그 다음 새로운 tip을 장착한 헤드부(7)이 반응용기(2)에서 상층액을 취해 폐액부(3)에 버렸다. 그 다음으로 중성용액을 외부용기로부터 완충액 디스펜서를 이용해 96마이크로 플레이트의 각 웰에 주입을 한 후 피펫팅을 실시한 후 자기흡인력을 발생시켜 자성입자를 수집하였다. 자력제어장치를 동작시킨 후에 그대로 대기시켰다. 그 다음 새로운 tip을 장착한 헤드부(7)이 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에서 상층액을 취해 폐액부(3)에 버렸다. 이 동작을 3회 반복하였다.
실시예 5. 혼성화(hybridization)
제2반응부(2)의 96 웰 마이크로플레이트에는 streptavidin-biotin 수식 단일가닥 DNA 시료가 존재하게 된다. 여기에 Cy3, Cy5 형광 수식한 프로브를 헤드부를 이용해서 96 웰 마이크로플레이트에 주입한 후, 충분히 피펫팅에 의해 교반을 실시한 다음 변성(denature)을 실시하였다. 이때 제2반응부(2)의 가온냉각장치의 온도제어 기능을 가동시켜 96 웰 마이크로플레이트를 70℃로 하였다. 이 후 피펫팅을 한 후에 어닐링(annealing)을 실시하였다. 이 때 제2반응부(2)의 가온냉각장치의 온도제어 기능을 가동시켜 96 웰 마이크로플레이트를 25℃까지 떨어지도록 온도 제어를 하였다. 어닐링 완료 후, 자력제어장치를 가동하여 자기흡인력을 발생시켜 자성비드를 용기 에 모이게 하였다. 자력제어장치를 동작시킨 후에 그대로 대기시켰다. 그 후 폐액부쪽으로 이동시킨 arm unit를 하방으로 이동시켜 팁노즐에 디스포팁을 장착, Arm unit를 제2반응부에 이동시켜 그대로 강하시켜 적당한 위치에 정지한 후 팁노즐을 이용해 96 웰 마이크로플레이트 중의 상층액을 흡입하고 폐액부에 이동하여 배출시켰다. 이 작업을 3회 반복하였다. 이를 통해 혼성화되지 않은 프로브는 시료로부터 제거하였다.
실시예 6. 형광 검출
형광검출기가 장착되어 있는 헤드부를 제2반응부(2)로 이동시켜 96웰 마이크로플레이트의 각각의 웰에서 발생하는 형광 빛의 변화를 측정하였다.
구체적으로, Cy3 또는 Cy5 형광 표지된 프로브를 결합된 타겟 DNA에서 방출시키고자 열처리를 하였다. 자력제어장치를 가동하여 자성 비드를 방출된 프로브와 분리하고, 4℃로 냉각하여 상기 형광 물질로부터 방출되는 형광의 강도를 검출하였다.
[SNP 판별 결과의 분석]
병원으로부터 제공받은 784명의 혈액을 가지고 본 발명의 SNP검출 자동장치를 이용해서 DNA추출부터 골다공증의 유전자 마커 TGF-ß1의 SNP검출한 결과, 98개의 샘플로부터 각각의 형광의 차이를 데이터화한 것을 도 4에 나타내었다.
점선은 Cy3와 Cy5의 시그널의 비율이２ 또는 0.5의 비율이 되는 위치를 나타내고 있다. 측정데이터는 T allele 와 C allel을 이용했을 때의 형광강도비를 계산함으로써 자동적으로 유전자형을 판단했다. 이 역치는 2나 0.5로써 2보다 클때는 T형 호모, 0.5보다 작을 때는 C형 호모, 그 이외는 헤테로이다. 이 결과를 시퀀스(Sequence)에 의해 판단된 결과와 비교했다. 판별결과는 DNA 서열 시퀀스법에 의한 판별결과와 일치하는 것을 알 수 있었다. 이 결과로 본 검출 시스템이 유효하다는 것이 확인됐다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (18)

  1. 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 판별 자동화 장치에 있어서,
    제1반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비하며, (+) 전하를 띠는 자성입자를 사용하는 DNA 분리 공정 및 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머를 사용하는 PCR 공정을 수행하는 제1반응부;
    제1반응부로부터 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드 함유 PCR 반응 산물을 제2반응부로 이동시키는 수단; 및
    제2반응용기, 반응용기 지지대, 및 반응용기 하부에 ON/OFF 방식으로 자력을 인가하는 수단을 구비하며, 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드를 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자에 고정화하는 공정, 제1작용기 수식 폴리뉴클레오티드의 단일가닥 (single stranded) 화 공정 및 SNP 판별용 프로브로 혼성화(hybridization)하는 공정을 수행하는 제2반응부
    를 구비한 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  2. 제1항에 있어서, 제1반응용기에는 (+) 전하를 띠는 자성입자가 수용되고, 제2반응용기에는 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자가 수용되어 있는 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  3. 제1항에 있어서, (i) (+) 전하를 띠는 자성입자가 구비되어 있는 제1반응용기에서 제1반응용기 내 수용되어 있는 시료로부터 나온 (-) 전하를 띠는 핵산과 상기 자성입자를 결합시킨 후 자력을 인가하여 결합형(B)/유리형(F) 분리로 핵산을 분리하고,
    (ii) 제1반응용기에서 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머를 사용하여 (-) 전하를 띠는 DNA가 (+) 전하를 띠는 자성입자에 붙어있는 상태에서 PCR을 진행하여, 한쌍의 프라이머로 정의되는 DNA 부분을 증폭하고,
    (iii) PCR로 증폭된 DNA를 제1반응용기로부터 제2반응용기로 이동시키고,
    (iv) 제2반응용기에서 제1작용기에 결합하는 제2작용기로 수식된 자성입자를 사용하여 제1작용기로 수식된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA를 상기 자성입자에 고정화시키고,
    (v) 제2반응용기에서 DNA를 단일가닥(single stranded)화시키고,
    (vi) 제2반응용기에서 1종 이상의 SNP 판별용 프로브와 자성입자에 고정화되어 있는 DNA 단일가닥과 혼성화(hybridization)하도록 프로그램되어 있는 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  4. 제1항에 있어서, 제1반응용기에 자력을 인가하여 (-) 전하를 띠는 핵산과 결합되어 있는 (+) 전하를 띠는 자성입자를 반응용기의 특정부위에 모으고,
    DNA 단일가닥에 혼성화된 SNP 프로브를 분리하는 조건하에 제2반응용기에 자력을 인가하여 자성입자를 반응용기의 특정부위에 모으면서 자성입자로부터 SNP 판별용 프로브를 분리시키는 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  5. 제1항에 있어서, 지지대 또는 반응용기의 온도를 조절하는 가온냉각장치 및 선택적으로 온도 센서를 더 구비한 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  6. 제1항에 있어서, SNP 판별용 프로브는 표지물질로 수식된 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 파이펫(pipette)이 장착된 이동할 수 있는 헤드부를 추가로 구비한 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  8. 제7항에 있어서, 파이펫(pipette)은 혈액 용혈제, PCR용 혼합액, 표지물질로 수식된 1종 이상의 SNP 프로브로 구성된 군에서 선택된 시약을 제1반응용기 또는 제2반응용기에 운반하는 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  9. 제7항에 있어서, 파이펫팅에 의해 교반을 수행하여 반응용기 내 반응을 촉진하는 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
  10. 제7항에 있어서, SNP 프로브 또는 표지물질 검출기가 헤드부에 장착되어 있는 것이 특징인 단일염기 다형성 판별 자동화 장치.
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