KR101635795B1 - 다당류/단백질 접합체 백신의 제조에 있어서 시안화제인 1-시아노벤조트리아졸 (1-cbt)을 통한 다당류의 활성화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다당류가 직접 또는 스페이스를 통해 단백질에 공유 결합으로 결합될 수 있도록, 수성 또는 일부 수성 용액 중에서 다당류를 시안화하기 위한 새로운 시약을 제공한다. 이러한 시약으로는 1-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CPPT), 1-시아노-이미다졸 (1-CI), 1-시아노벤조트리아졸 (1-CBT) 또는 2-시아노피리다진-3(2H)온 (2-CPO), 또는 이들의 기능성 유도체 또는 변형체를 포함한다. 실시예들은 다양한 다당류 및 단백질들에 대한 이들 시약의 사용에 대해 예시하며, 본 발명을 일반적으로 적용가능하다는 것을 보여준다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2009년 12월 17일에 출원된 동일 표제의 미국 가출원 61/287,593에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 탄수화물에 단백질을 접합시키기 위한 시약 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백신의 제조시 사용되는 방법 및 화학물질과, 상기 방법으로 제조되는 백신에 관한 것이다.
탄수화물이 공유결합에 의해 단백질에 결합되어 있는 백신은 탄수화물 모이어티에 대해 면역 반응을 유도하는데 특히 성공적인 것으로 입증되었다. "접합체"라 알려진 이러한 백신의 예로, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b형 (예, ActHib, Hiberix), 네이세리아 메닝기디티스(Neisseria meningiditis) A, C, W 및 Y형 (예, Menactra), 및 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) (예, Prevnar, Synflorix)가 이용가능하다. 단백질에 탄수화물을 연결시키기 위해서는, 탄수화물이 단백질과 직접 또는 스페이서를 통해 반응할 수 있도록 활성화되어야 한다 (Dick, W.E. Jr and Beurret, M. Glyconjugates of bacterial carbohydrate antigens. A survey and consideration of design and preparation factors. In: Conjugate Vaccines (Eds Cruse, J.M. and Lewis, R.E.). Karger, Basel, 1989). 한가지 활성화 방법은 탄수화물을 산화시켜 알데하이드로 만든 후, 이를 단백질의 라이신에 환원성 아민화를 통해 연결시키는 것이다. 다른 예로는, 단백질을 먼저 하이드라지드 또는 아미노옥시기로 관능화시킨 후, 이를 탄수화물의 알데하이드와 반응시킨다 (Lees, A. Use of amino-oxy functional groups in the preparation of protein-polysaccharide (PS) conjugate vaccines. 미국 특허 공개공보 2005/0169941; 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 다당류를 활성화시키는 다른 방법으로, 시아노겐 브로마이드를 이용하여 다당류에 시아노-에스테르를 형성시킨 후, 이를 아디픽 디하이드라지드 등의 스페이스 분자와 반응시킨다. 그런 후, 관능화된 다당류를 단백질과 반응시킨다. 다당류를 시안화하는 개선된 방법에서는 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보레이트 (CDAP)를 사용한다 (Lees, A., Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents. 미국 특허 5,651,971; 5,693,326; 및 5,849,301). CDAP는 단백질이 직접 다당류에 연결될 수 있게 한다. 또한, CDAP를 이용하여 다당류에 스페이스로 부가하여 관능화한 다음 이를 단백질에 연결시킬 수 있다. 하이드라지드 또는 아미노옥시로 관능화된 단백질도 CDAP로 활성화된 다당류에 연결시킬 수 있다 (미국 특허 5,849,301; 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명은 다당류가 직접 또는 스페이스를 통해 단백질에 공유 결합으로 결합될 수 있도록, 수성 또는 일부 수성 용액 중에서 다당류를 시안화하기 위한 새로운 시약을 제공한다.
본 발명은 백신 제조에 있어서 현행 방법 및 설계와 관련된 문제점과 단점들을 해소시키며, 특히 백신 제조를 위한 새로운 단백질 접합 툴과 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는, 1-CBT, 1-Cl, CPPT 또는 2-CPO 등의 화합물 또는 기능성 유도체 또는 변형체를, 화합물과 혼합하여, 활성화된 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 활성화된 화합물을 제2 화합물과 혼합하여 접합체를 제조하는, 탄수화물의 접합 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 화합물은 천연 또는 합성 탄수화물, 다당류, 올리고당 또는 이의 조합이다. 또한, 바람직하게는, 상기 제2 화합물은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이며, 항원성 분자일 수 있다. 접합은 직접, 또는 접합을 용이하게 하는 관능기를 부가함으로써 간접적으로 이루어질 수 있다. 상기 방법은, 바람직하게는, 예컨대 투석 여과, 크로마토그래피, 또는 이의 조합에 의해 상기 접합체 보다 저분자량의 성분들을 제거하는 단계를 더 포함한다. 제조되는 접합체는, 바람직하게는 백신 또는 진단제이다. 상기 방법은, 상기 활성화된 화합물과 상기 제2 화합물 사이에 연결성 화합물을 포함시키는 단계도 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 링커의 포함 단계뿐만 아니라 상기 방법의 단계들은 함께 수행되지만, 각각 독립적으로 수행될 수도 있다.
본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 방법으로 제조되는 백신에 관한 것이다. 바람직하게는, 백신은 비제한적인 예로서 물, 염수, 알코올, 사카라이드, 다당류, 오일 또는 이의 조합을 포함할 수 있는, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
본 발명의 다른 구현예들과 이점은 하기 설명에서 일부 기술되며, 일부는 이러한 설명으로부터 자명해지거나 또는 본 발명의 실시를 통해 습득할 수 있을 것이다.
본 발명은 다당류가 직접 또는 스페이스를 통해 단백질에 공유 결합으로 결합될 수 있도록, 수성 또는 일부 수성 용액 중에서 다당류를 시안화하기 위한 새로운 시약을 제공한다.
도 1. Superdex200 컬럼 (1 x 30 cm)의 겔 여과 컬럼에서 수행한 BSA/CDAP/덱스트란과 BSA/CPPT/덱스트란의 크로마토그램을 중첩시킨 것.
도 2. 1-CI를 이용하여 관능화시킨 다당류에 대한 간접 접합체의 SEC HPLC 분석 결과.
도 3. Superdex 200로 분석된 CRM(1-CI/Ps6A) 접합체의 크로마토그램.
도 4. Superdex 200 분획들의 SEC HPLC 분석 결과.
도 5. CPPT (1-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오르보레이트; 또한 CPIP로도 지칭됨), 1-CBT (1-시아노벤조트리아졸), 1-Cl (1-시아노이미다졸), 및 2-CPO (2-시아노피리다진-3(2H)온)의 화학 구조.
도 2. 1-CI를 이용하여 관능화시킨 다당류에 대한 간접 접합체의 SEC HPLC 분석 결과.
도 3. Superdex 200로 분석된 CRM(1-CI/Ps6A) 접합체의 크로마토그램.
도 4. Superdex 200 분획들의 SEC HPLC 분석 결과.
도 5. CPPT (1-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오르보레이트; 또한 CPIP로도 지칭됨), 1-CBT (1-시아노벤조트리아졸), 1-Cl (1-시아노이미다졸), 및 2-CPO (2-시아노피리다진-3(2H)온)의 화학 구조.
본 발명의 일 구현예는, CPPT, 1-CBT, 1-CI 또는 2-CPO, 또는 전술한 임의의 화합물의 기능성 유도체 또는 보존적인 변형체를, 화합물과 혼합하여, 활성화된 화합물을 제조하는 단계를 포함하는, 화합물의 접합 방법에 관한 것이다. 상기 활성화된 화합물은 제2 화합물과 혼합하여 접합체로 제조된다. 이러한 단계들은 독립적으로 또는 함께 수행될 수 있으며, 2 사이에 링커로서 다른 화합물이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 활성화된 화합물을 링커 분자와 혼합한 다음, 이를 제2 화합물과 반응시켜, 접합체를 제조한다. 바람직한 링커로는, 헥산디아민, 에틸렌디아민, 하이드라진, 아디픽 디하이드라지드 또는 1,6-디아미노옥시헥산이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
접합은 직접 또는 간접 접합일 수 있으며, 즉, 접합을 용이하게 하는 관능기를 첨가하거나 첨가하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 화합물은 천연 또는 합성 탄수화물, 다당류, 올리고당 또는 이의 조합이다. 바람직하게는, 제2 화합물은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이며, 보다 바람직하게는, 상기 제2 화합물은 진단제 또는 백신 제조를 위한 항원성 분자이다.
본 발명은, 직접 또는 스페이스를 통해 단백질에 공유 결합으로 결합될 수 있도록, 수성 또는 일부 수성 용액 중에서 다당류를 시안화하기 위한, 새로운 시약을 제공한다. 예로, 본 방법을 통상적으로 적용가능함을 보여주는, 다양한 다당류 및 단백질에 대한 이들 시약의 사용을 예시한다.
본 출원에서 탄수화물, 다당류 및 올리고당은 상호 호환적으로 사용된다. 본 방법은 천연 또는 합성 탄수화물을 사용할 수 있다.
단백질은 천연, 재조합 또는 합성 물질을 지칭할 수 있다. 이는 펩타이드를 포함할 수 있다. 단백질 이외의 다른 단백질들도 활성화된 탄수화물에 직접 또는 간접 결합시키기 위한 제2 모이어티로서 사용할 수 있다.
직접 접합은 단백질을 상기 활성화된 탄수화물에 추가적인 관능기를 도입하지 않고 연결하는 것을 의미한다. 간접 접합은 접합을 촉진시키기 위해 사용되는 관능기의 부가를 의미한다. 예컨대, 탄수화물은 아민으로 관능화시킨 다음, 브로모아세틸기와 반응시킬 수 있다. 그런 후, 브로모아세틸화된 탄수화물을 티올화된 단백질과 반응시킨다 (Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 2nd ed, 2008). 용어 "관능화"는 일반적으로 예컨대 접합을 용이하게 하기 위해 관능기를 부가하기 위해 기를 화학적으로 부착시키는 것을 의미한다. 예로는, 단백질의 하이드라지드 또는 아미노옥시기로의 관능화와, 탄수화물의 아미노기로의 관능화를 포함한다.
방법 및 시약
단백질에 탄수화물을 접합시키면 이의 분자량이 증가되는데, 이는 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC HPLC)를 이용하여 모니터링할 수 있다. 고분자량의 물질들은 보다 빨리 용출되며, 단백질은 일반적으로 280 nm에서 이의 흡광도를 모니터링한다. 흡광 그래프가 좀더 빠른 시기로 이동되는 것은 분자량 증가, 즉 접합체를 의미한다. SEC HPLC에서는, BioSep G4000 SEC 컬럼 (Phenomenex) 또는 유사 컬럼을 Empower 소프트웨어가 구비된 Waters 600 시스템을 사용하였다.
일반적으로 기술된 바와 같이, TNBS를 이용하여 아민과 하이드라지드를 분석하였다: "Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid" Qi XY, Keyhani NO, Lee YC. Anal Biochem. 1988 Nov 15;175(1):139-44 (원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 Vidal and Franci, J Immun. Meth 86:155, 1986.
단백질 농도는 이의 여기 계수 및 280 nm에서의 흡광도로부터 결정하였다. Monsigny M. et al. (Anal Biochem . 175(2):525-30, 1988; 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)의 방법으로 탄수화물을 분석하였다.
Wilmington PharmaTech, Lot No. 1795-1536-10로 1-시아노-4-피롤리디노피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CPPT)를 준비하였고, 이는 역상 HPLC로 측정된 바에 따르면 순도가 97% 보다 높았다 (도 5 참조). 1-시아노-4-디메틸아미노피리딘 테트라플루오로보레이트 (CDAP)는 Merck Kga로부터 제공받았다. 1-시아노-이미다졸 (1-CI)은 Apin Chemicals (Abingdon, UK)로부터 구입하였다 (도 5 참조). 1-시아노-벤젠트리아졸 (1-CBT)은 Sigma Aldrich (도 5 참조)로부터 구입하였다. CRM 및 테타누스 톡소이드는 Serum Institute of India (Pune)로부터 구입하였다. BSA는 Amresco (Solon, OH)로부터 구입하였다. 뉴모코코스 다당류는 인도 Serum Institute 또는 ATCC (Manassas, VA)로부터 구입하였다. Hib PRP와 네이세리아 멩기디티스 다당류는 인도 Serum Institute로부터 구입하였다. T2000 덱스트란 (GE Healthcare)을 S400HR 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 분획화하여, 고분자량의 분획을 수득하였다. 그외 사용된 시약, N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 헥산디아민.2HCl, 및 트리에틸아민 (TEA)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 아세토니트릴은 GFS Chemical로부터 구입하였다.
아래 실시예들은 본 발명의 구현예들을 예시하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: 모델 시스템: 모델 시스템으로서, BSA 를 다당류 덱스트란에 직접 또는 스페이서를 통해 간접적으로 공유 결합시켰다.
CDAP 및 CPPT는 각각 0.43 M로 아세토니트릴에 용해시키고, 120 ㎍을 데스트란 2 ml(염수 중의 6 mg/ml + 0.02% 소듐 아지드)에 첨가하였다. 30초 후, 각각 (~ 7㎕)에 첨가하여, pH를 약 pH 9.8로 유지시켰다. 2분째에, 활성화된 덱스트란 분액 1 ml을 취하여, 0.5 M 헥산 디아민 용액 1 ml 또는 BSA 용액 1 ml (10 mg/ml)에 첨가하였다. 4시간 후, 헥산디아민으로 유도체화된 덱스트란 용액을 밤새 염수를 자주 교체하면서 투석하였다. 저분자량의 물질을 추가로 제거하기 위해, 용액을 각각 ~6 ml로 만들고, 코링 스핀 필터 장치(Spin-X 10 kDa cutoff)를 이용하여 농축시키고, 이 과정을 반복하였다. 2차 스핀으로 수득한 여과물을 트리니트로벤젠설폰산 (TNBS)을 이용하여 분석하였고, 기본적으로 아민이 없다는 것을 확인하였다. 탈염한 체류물(desalted retentate)을 대상으로 아민과 덱스트란을 분석하였다. BSA-덱스트란 접합체를 밤새 4℃에서 인큐베이션한 다음, PBS로 평형화한 Superdex200 크기 배제 컬럼 (GE Healthcare)에서 분획화하였다. 2종의 접합체에 대한 용출 프로파일은 도 1에 나타낸다. 보이드(void) 부피 피크를 모아, BSA 및 덱스트란에 대해 분석하였다 (표 1 참조).
활성제 | mg BSA / mg Dex | NH 2 /100 kDa Dex |
CDAP | 0.71 | 59 |
CPPT | 0.90 | 78 |
상기 데이타에서, CPPT는 덱스트란을 활성화하고, CDAP도 그러하며, 더 양호할 수 있는 것으로 나타났다. 단백질을 CPPT로 활성화된 다당류에 직접 접합시킬 수 있음을 입증해준다.
실시예
2:
CPPT
를 이용한 다당류의
아민으로의
관능화
헤모필러스 인플루엔자(Hib), 네이세리아 메닝기디티스 A(MenA) 및 네이세리아 메닝기디티스 C(MenC) 캡슐 다당류들의 각 용액 7.5 mg/ml을 제조하였다. 각 용액의 1.35 ml에, 아세토니트릴 중의 100 mg/ml CPPT 75 ㎕를 첨가하였다. 30초에, TEA 5 ㎕를 Hib 및 MenA 다당류에 첨가하였다. TEA 6 ㎕를 MenC 용액에 첨가하였다. 2.5분에, 활성화된 PS 0.6 ml을 0.5 M 헥산디아민 0.6 ml에 첨가하였다. 3시간 후, 각각을 염수에 대해 충분히 투석하였다.
각 용액을 대상으로, 레조르시놀 황산을 이용하여 다당류에 대해 분석하였고, MenA 및 MenC에 대한 표준 물질로서 대응되는 다당류를 사용하였다. Hib 다당류에 대한 표준물질로서 리보스를 사용하였고, 반복 단위 당 리보스 1 mole을 사용하고, 반복 단위의 분자량은 243 g/mole이다 (표 2 참조).
다당류 NH2/100 kDa Hib 38 MenA 19.5 MenC 13 |
상기 표는 다양한 다당류를 관능화기 위한 CPPT의 용도를 추가로 예시한다.
실시예
3: 1-
시아노
-
이미다졸을
이용한, 모델 다당류인
덱스트란의
유도체화
1-CI 30 mg을 T2000 덱스트란 (GE Healthcare) 20 mg/ml 용액 2 ml에 첨가하였다. 0.2 M 트리에틸아민 100 ㎕ 분액을 5번 첨가하여, pH를 9 - 9.2로 유지하였다. 약 3분 후, 0.5 M 헥산디아민 2 ml을 첨가하고, 0.5 M NaOH를 이용하여 pH를 9로 적정하였다. 2시간 반응 후, 용액을 염수에 대해 충분히 투석하였다. 용액을 원심분리하여 투명하게 한 다음, 덱스트란과 아민에 대해 분석하였다. 산물에는 덱스트란 100 kDa 당 아민 27개가 함유되어 있는 것으로 확인되었으며, 이는 1-CI를 이용하여 다당류를 아민으로 관능화시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 1- CI ( BSA - 덱스트란 )를 이용한 모델 단백질로의 모델 PS 의 직접 접합
고분자량 덱스트란 13.5 mg/ml 용액을 준비하였다. NMP 중의 1-CI 100 mg/ml 용액 67.5 ㎕를 1 ml에 첨가하고, 30초 후, 각각 0.2 M TEA 100 ㎕를 4번 첨가한 다음, 0.5 M NaOH 약 20 ㎕를 첨가하였다. 약 3.5분째에, BSA 20 mg/ml 용액 0.5 ml을 첨가하였다. 각각 0.1 M 소듐 보레이트 (pH 9.0) 100 ㎕를 2번 첨가하여, pH를 약 8.5로 높였다. 4℃에서 2일 경과 후, 반응 혼합물을 SEC HPLC로 분석하였다. 도는, BSA + 1-CI 활성화된 덱스트란이 크기 배제 컬럼으로부터 훨씬 빨리 용출되는 것을 보여주며, 이는 다당류의 접합으로 고분자량이 되었음을 의미한다.
실시예
5: 다른
PS
의 1-
CI
를 이용한 활성화
뉴모니아 혈청형 1 PS(Ps1) 및 6B PS(Ps6B)의 캡슐 다당류들을 염수 + 0.02% 소듐 아지드 중에 10 mg/ml로 준비하였다. NMP 93 ㎕에 현탁한 1-CI 9.3 mg을 Ps1 1 ml에 첨가한 다음 0.2 M TEA 100 ㎕ 8번 첨가하였다. 2.5분째에, 1 M 헥산디아민 0.5 ml을 첨가한 다음, 0.5 M NaOH 100 ㎕를 2번 첨가하였다. pH는 약 9였다. NMP 중의 100 mg/ml 1-CI 용액 100 ㎕를 Ps6B 용액 1 ml에 첨가하였다. 0.2 M TEA 100 ㎕를 2번 첨가한 다음, 0.5 M NaOH 50 ㎕를 2번 첨가하여, pH를 ~9.5 - 10.8로 유지시켰다. 2.5분째에, 1 M 헥산디아민 0.5 ml을 0.5 M NaOH 50 ㎕와 함께 첨가하였다. 약 3시간 후, 각각을 염수에 대해 충분히 투석하였다. 그런 후, 레조르시놀 황산 분석을 이용하여 다당류에 대해, TNBS를 이용하여 아민에 대해 분석하였다 (표 3 참조).
아민 / 100 kDa PS | |
Ps1-NH2 | 9.8 |
Ps6B-NH2 | 4.5 |
따라서, 1-CI를 다당류를 활성화하여 관능화하는데 사용할 수 있다는 것이 명확해졌다.
실시예
6: 1-
CI
를 이용하여
관능화한
다당류에 간접 접합
1 M HEPES(pH 8) 239 ㎕를 실시예 5에서 제조한 2.2 ml의 Ps6B-NH2 약 9.5 mg 용액에 첨가하였다. NMP 중의 0.1 M NHS 브로모아세테이트 170 ㎕를 첨가하였다. 1시간 후, 이 용액을 Amicon Ultra15 30 kDa 컷오프 스핀 필터를 이용하여 10mM NaPO4 + 5mM EDTA pH 6.8 완충액을 이용하여 반복 세정하여, 탈염하였다. 체류물들을 최종 부피 약 0.7 ml로 만들었다. 테타누스 톡소이드를 다음과 같이 티올화하였다: 테타누스 톡소이드 (35 mg/ml) 571 ㎕에 1 M HEPES 64 ㎕를 첨가하여 pH 8로 만들었다. NMP 중의 0.1 M SPDP 27 ㎕를 천천히 첨가하였다. 약 2시간 후, pH를 5.7로 낮춘 다음, 0.5 M DTT 33 ㎕를 첨가하여 티올을 탈보호시켰다. 30분 후, 용액을 10mM NaPO4 + 5mM EDTA pH 6.8 완충액으로 평형화한 1 x 15cm G25 컬럼에서 탈염하였다. 보이드 부피를 모아, 최종 농도 약 62 mg/ml로 농축하였다. 티올 함량을 DTNB로 측정하였다. 테타누스는 약 6 mole 티올/mole TT의 비율을 보유하였다. 브로모아세틸화된 다당류 및 티올화된 TT를 다음과 같이 조합하였다: 0.66 ml Ps6B-BrAc + 73 ㎕ 1 M HEPES, pH 8 + 230 ㎕ 티올화된 TT.
반응을 4℃에서 진행되게 한 다음, SEC HPLC로 분석하였다 (도 2). 접합체를 S400HR 컬럼 크기 배제 (GE Healthcare)로 겔 여과하여 분획화하였다. 고분자량의 물질이 함유된 보이드 부피 분획을 모아, 단백질과 탄수화물에 대해 분석하였다. 접합체는 약 Ps6 mg 당 TT 약 1 mg을 가지는 것으로 확인되었다. 이는, 1-CI가 단백질을 탄수화물과 간접 접합하는데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
*실시예 7: 1- CI 를 이용한 단백질에 다당류의 직접 접합
뉴모니아 혈청형 6A (Ps6A)의 캡슐 다당류들을 물에 10 mg/ml로 용해시켰다. 1 ml 시험관 5개를 2분간 80℃로 가열하고, 각각에 0.1 M 소듐 보레이트(pH 9) 1 ml을 첨가하였다. 2.5시간 후, 시험관을 얼음 위에 두어 냉각시킨 다음 투석하였다. TEA 25 ㎕를 5 mg/ml의 수화된 PS6A 10 ml에 첨가하고, 1-CI 50 mg을 볼텍싱하면서 첨가하였다. 2.5분에, 17.2 mg/ml의 CRM 30 ml을 첨가하고, pH를 약 9로 유지시켰다. 밤새 반응 후, 용액을 Amicon Ultra 15 30 kDa 컷오프 스핀 장치를 이용하여 약 1 ml로 농축시켰다. 10 mM 소듐 보레이트, 150 mM NaCl, pH 9로 평형화한 Superdex 200 컬럼 (1 x 30cm)에 0.5 ml을 주입하고, 0.5 ml/분으로 컬럼을 운영하였다. 크로마토그램은 도 3에 나타낸다. 분획 0.5 ml을 수집하고, SEC HPLC로 선택 분획들을 분석하였다. SEC 크로마토그램은 도 4에 나타내며, 이는 모든 분획들이 비접합된 CRM 보다 MW이 더 크다는 것을 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, 분획들 20-28 모두 비접합된 CRM 보다 더 빨리 용출되었는데, 이는 각 분획이 더 높은 분자량을 가진다는 것을 의미한다.
실시예
8: 1-
시아노벤조트라졸
(1-
CBT
)을 이용한 다당류의
관능화
12 mg의 1-CBT을 아세토니트릴 240 ㎕ + NMP 120 ㎕에 현탁하였다. 0.2 M 120 ㎕를 20 mg/ml T2000 덱스트란 (10 mg) 0.5 ml에 첨가한 후, 1-CBT 현탁물 120 ㎕를 첨가하였다. 약 3분째에, 0.5 M 아디픽 디하이드라지드 0.5 ml을 첨가하였다. 2시간 반응 후, 용액을 2일 동안 염수에 대해 충분히 투석하였다. 그런 후, 용액을 농축한 다음, 덱스트란 및 하이드라지드에 대해 분석하였다.
덱스트란 약 9.5 mg을 덱스트란 100 kDa 당 하이드라지드 약 11의 비율로 회수되었다. 하이드라지드가 덱스트란에 연결되었는지를 검증하기 위해, TNBS 표지된 하이드라지드-덱스트란의 분액을 50 nm에서 모니터링하면서 SEC HPLC로 분석하였고, 이때 TNBS-하이드라지드 부산물이 흡광되었다. 크로마토그램에서, 트리니트로벤젠은 고분자량의 덱스트란과 조합되어 있는 것으로 나타났으며, 이는 하이드라지드가 덱스트란에 실제 연결되었음을 의미한다. 이는, 1-CBT를 다당류의 관능화에 사용할 수 있음을 보여준다.
실시예
9: 1-
CBT
활성화된 다당류에 단백질의 직접 접합
0.2 M TEA 120 ㎕를 20 mg/ml T2000 덱스트란 용액 500 ㎕에 첨가하고, 아세토니트릴 중의 50 mg/ml 1-CBT 160 ㎕를 첨가하였다. 약 2분째에, 47 mg/ml BSA 염수 용액 200 ㎕를 첨가하였고, 이 용액은 점성인 상태로 되었다. 밤새 반응 후, 접합체를 SEC HPLC로 분석하였다. BSA 대부분은 컬럼의 보이드 부피에서 용출되었는데, 이는 이것이 고분자량임을 의미한다. 이는, 1-CBT가 단백질을 다당류에 직접 접합시키는데 사용할 수 있다는 것을 입증해준다.
실시예 10: 선택된 2- 시아노피리다진 -3(2H)-온 ( Kim et al , Tetrahedron 61:5889, 2005)의 Kim 등의 방법에 따라 시아네이트 카보하이드레이트로 합성
탄수화물을 2-CPO (X = Cl, Y = Cl)를 이용하여 활성화한 다음, 단백질과 직접 반응시키거나 또는 예컨대 아미노기로 관능화하였다. 시약 2a (반응도 1 김 등 참조)는 아세토니트릴 중의 최대 100 mg/ml로 구성되며, 이를 탄수화물 1 mg에 대해 1 mg의 비율로 뉴모코커스 타입 14 다당류(Ps14)의 10 mg/ml 용액에 첨가하였다. pH를 트리에틸아민을 이용하여 pH 9.5로 높이고, 그 상태로 유지하였다. 2.5분 후, 용액의 절반을 동일 부피의 0.5 M 헥산디아민에 첨가하고, pH 약 8로 적정하였다. 용액의 나머지 절반은 10 mg/ml 용액의 동량의 테타누스 톡소이드와 조합하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 헥산디아민 다당류 용액을 염수에 대해 충분히 투석한 다음, 아민 및 다당류에 대해 분석하였다. 100 kDa 다당류 당 아민 10의 비율이 확인되었다. 테타누스 다당류 용액을 S400HR 컬럼 (GE Healthcare)에서 분획화하여, 접합되지 않은 단백질을 제거하였다. 단백질과 다당류 농도를 측정하였다. 다당류 mg 당 단백질 약 0.75 mg의 비율이 확인되었다.
당해 기술 분야의 당업자라면 본원에 기술된 상세한 설명과 실시를 고려하여 본 발명의 다른 구현예들과 용도들을 명확하게 인지할 것이다. 모든 공개문헌, 미국 및 외국 특허들과 특허 출원들을 비롯하여, 본원에 인용된 모든 참조 문헌들은, 본 명세서에 구체적이고 전체적으로 원용에 의해 포함된다. 용어 포함하는(comprising)은 어떠한 문장에 사용되더라도 용어 이루어진 및 필수적으로 이루어진을 포함하는 것으로 의도된다. 나아가, 용어 포함하는, 비롯하여 및 함유하는은 제한하고자 하는 의도는 아니다. 상세한 내용과 실시예들은 아래 청구항에 의해 정해지는 본 발명의 실제 범위와 사상에 대한 단순 예로만 간주되는 것으로 이해된다.
Claims (10)
- 화합물의 접합 방법으로서,
1-시아노벤조트리아졸 (1-CBT)을 상기 화합물과 혼합하여, 활성화된 화합물을 제조하는 단계; 및
상기 활성화된 화합물을 제2 화합물과 혼합하여, 상기 활성화된 화합물을 제2 화합물과 접합하는 단계;를 포함하며,
여기서 상기 화합물은 천연 또는 합성의 탄수화물, 다당류, 올리고당 또는 이의 조합이고, 상기 제2 화합물은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 제2 화합물은 항원성 분자인 것을 특징으로 하는 화합물의 접합 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 접합은 직접 접합이거나 또는 접합을 촉진시키는 관능기가 첨가되는 간접 접합인 것을 특징으로 하는 화합물의 접합 방법.
- 제1항에 있어서, 투석, 여과, 크로마토그래피 또는 이의 조합에 의해, 상기 상기 제2 화합물과 접합된 활성화된 화합물보다 저분자량의 성분들을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 접합 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 화합물과 접합된 활성화된 화합물은, 백신인 것을 특징으로 하는 화합물의 접합 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계들은 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 화합물의 접합 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 활성화된 화합물을 연결성 화합물과 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 접합 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 연결성 화합물은 헥산디아민, 에틸렌디아민, 하이드라진, 아디픽 디하이드라지드 또는 1,6-디아미노옥시헥산인, 화합물의 접합 방법.
- 제1항의 방법에 따라 제조되는 백신.
- 삭제
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