BR122022002084B1

BR122022002084B1 - Processo de conjugação de carboidratos na preparação de vacinas conjugadas e suas respectivas vacinas

Info

Publication number: BR122022002084B1
Application number: BR122022002084-4A
Authority: BR
Inventors: Andrew Lees
Original assignee: Fina Biosolutions, Llc
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2022-08-16
Also published as: KR101427862B1; CA2784144C; KR20140040292A; CA2836140A1; KR101605171B1; JP5916177B2; CA2836140C; JP2013515003A; ZA201204279B; JP5937712B2; CN102892753B; SG181750A1; JP2015145390A; JP5892944B2; US20140316110A1; JP2015145391A; KR20140106759A; KR20120104360A; US9259480B2; EP2513056A2

Abstract

A presente invenção propõe reagentes inéditos para a cianilação de polissacarídeos em soluções aquosas ou parcialmente aquosas, de modo que eles possam ser ligados por covalência à proteína quer diretamente quer através de um espaçador. Estes reagentes incluem tetrafluorborato de 1-ciano-4-pirrolidinopiridínio (CPPT), 1-ciano-imidazol (1-CI), 1- cianobenzotriazol (1-CBT), ou 2-cianopiridazin-3(2H)ona (2-CPO), ou um derivado funcional ou modificação deles. Os exemplos ilustram o uso destes reagentes com uma variedade de polissacarídeos e proteínas mostrando que os métodos são em geral aplicáveis.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS CORRELATOS

[01] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. No. 61/287.593 do mesmo título depositado em 17 de dezembro de 2009, que é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência.

ANTECEDENTES 1. CAMPO DA INVENÇÃO

[02] A presente invenção é voltada para reagentes e a métodos de se conjugar proteínas a carboidratos e, especialmente, a processos e a substâncias químicas usadas na fabricação de vacinas e também às vacinas fabricadas pelo processo.

2. DESCRIÇÃO DOS ANTECEDENTES

[03] As vacinas que contêm proteína ligada por covalência a carboidrato provaram ser notavelmente bem- sucedidas na indução de uma resposta imune à fração de carboidrato. Exemplos de tais vacinas, conhecidas como “conjugadas” são disponíveis para Haemophilus influenzae do tipo b (ActHib, Hiberix, por exemplo), Neisseria meningiditis dos tipos A, C W e Y (Menactra, por exemplo) e S. pneumoniae (Prevnar, Synflorix, por exemplo). Para que a proteína seja ligada ao carboidrato, este último geralmente precisa ser ativado, de modo que se possa fazer o mesmo reagir com a proteína, quer diretamente, quer através de um espaçador (Dick, W.E. Jr e Beurre, M. Glyconjugates of bacterial carbohydrate antigens. A survey and consideration of design and preparation factors. Em: Conjugate Vaccines (Eds Cruse, J.M. e Lewis, R. E.). Karger, Basiléia, 1989. Um meio de ativação é através da oxidação do carboidrato para produzir aldeídos, que são então ligados às lisinas na proteína através de aminação redutora. Em outros casos, a proteína é primeiro funcionalizada com hidrazidas ou com grupos aminóxi, que se faz subsequentemente reagir com aldeídos no carboidrato (Lees, A. Use of amino-oxy groups in the preparation of protein-polysaccharide (OS) conjugate vaccines Publicação da Patente dos Estados Unidos No. 2005/0169941; que é incorporada ao presente documento a título de referência). Um outro método de se ativar polissacarídeos consiste no uso de brometo de cianogênio, para formar um ciano éster no polissacarídeo que se faz subsequentemente reagir com uma molécula espaçadora tal como diidrazida adípica. Faz-se então o polissacarídeo funcionalizado reagir com a proteína. Métodos melhorados para cianilação de polissacarídeos usam tetrafluorborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP) (Lees, A., Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagentes. Patentes U.S. Nos 5.651.971; 5.693.326; e 5.849.301). A CDAP permite que a proteína seja ligada diretamente ao polissacarídeo. A CDAP pode também ser usada para funcionalizar o polissacarídeo com um espaçador, que é subsequentemente ligado à proteína. As proteínas funcionalizadas com hidrazida ou com aminóxi podem também ser ligadas a polissacarídeos ativados por CDAP (Patente U.S. No. 5.849.301; que é incorporada ao presente documento a título de referência).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[04] A presente invenção supera os problemas e desvantagens associados com estratégias e projetos atuais na fabricação de vacinas e proporciona novas ferramentas e métodos de conjugação de proteínas especialmente para a fabricação de vacinas.

[05] Uma modalidade da invenção é direcionada a um processo de conjugação de um carboidrato que compreende: a mistura de um composto tal como 1-CBT ou 1-CI, ou CPPT ou 2-CPO ou um derivado funcional ou modificação sua com o composto químico para criar um composto químico ativado; e a mistura do composto ativado com um segundo composto para criar um conjugado. É preferível que o composto químico seja um carboidrato, polissacarídeo, oligossacarídeo natural ou sintético ou uma combinação deles. Além disso, é também preferível que o segundo composto seja um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína que pode ser uma molécula antigênica. A conjugação pode ser direta ou indireta com a adição de grupos funcionais que facilitam a conjugação. O processo compreende ainda, de preferência, a remoção dos componentes com um peso molecular mais baixo do que o conjugado, por filtração por diálise, por exemplo, cromatografia ou uma combinação delas. O conjugado resultante é, de preferência, uma vacina ou um agente diagnóstico. O processo pode ainda compreender a inclusão de um composto de ligação entre o composto ativado e o segundo composto. É preferível que as etapas do processo, assim como a inclusão de um ligante sejam conduzidos em conjunto, mas cada uma delas pode ser conduzida independentemente.

[06] Uma outra modalidade da invenção é direcionada a uma vacina produzida pelos processos da invenção. É preferível que a vacina compreenda ainda um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico que pode incluir, mas sem limitação, água, solução salina, álcool, sacarídeos, polissacarídeos, óleo ou combinações deles.

[07] Outras modalidades e vantagens da invenção são apresentadas em parte na descrição que segue e em parte podem ser evidentes com a leitura da descrição ou podem ser aprendidas com a colocação em prática da invenção.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[08] A Figura 1 é um cromatograma sobreposto de BSA/CDAP/dextrano e BSA/CPPT/dextrano conduzido em uma coluna de filtração por gel com uma coluna Superdex200 (1x30cm).

[09] A Figura 2 é uma análise por SEC HPLC da conjugação indireta em polissacarídeo funcionalizado usando-se 1-CI.

[10] A Figura 3 é um cromatograma de conjugado CRM(1- CI/Ps6A) sobre Superdex200.

[11] A Figura 4 é uma análise por SEC HPLC de frações de Superdex200.

[12] A Figura 5 mostra as estruturas químicas de CPPT (tetrafluorborato de 1-ciano-4-pirrolidino-piridínio a que se refere também como CPIP), 1-CBT (1-cianobenzotriazol), 1-CI (cianoimidazol) e 2-CPO (2-cianopiridazino-3(2H)ona).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[13] Uma modalidade da invenção é voltada a um processo de conjugação de um composto químico que compreende a mistura de CPPT, 1-CBT, 1-CI ou de 2-CPO ou um derivado funcional ou uma modificação conservadora de qualquer um dos compostos precedentes com o composto químico para criar um composto químico ativado. O composto ativado é misturado com um segundo composto para criar um conjugado. Estas etapas podem ser conduzidas independentemente ou em conjunto e podem incluir um outro composto como um ligante entre os dois. É preferível que o composto ativado seja misturado com uma molécula de ligante que se faz subsequentemente reagir com um segundo composto para criar um conjugado. Os ligantes preferidos incluem, mas sem limitação, hexano diamina, etileno diamina, hidrazina, diidrazida adípica ou 1,6-diamino oxihexano.

[14] A conjugação pode ser direta ou indireta, significando com ou sem a adição de grupos funcionais que facilitam a conjugação. É preferível que o composto químico seja carboidrato, polissacarídeo, oligossacarídeo natural ou sintético ou uma combinação deles. É preferível que o segundo composto seja um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína e é mais preferível que o segundo composto seja uma molécula antigênica para a preparação de uma vacina de como um reagente diagnóstico.

[15] A presente invenção propõe reagentes inéditos para a cianilação de polissacarídeos em soluções aquosas ou parcialmente aquosas, de modo que elas possam ser ligadas por covalência a proteínas quer diretamente quer através de um espaçador. Os exemplos ilustram o uso destes reagentes com uma variedade de polissacarídeos e proteínas mostrando que os métodos são geralmente aplicáveis.

[16] Os termos carboidrato, polissacarídeo, e oligossacarídeo são usados indiferentemente neste pedido. O método pode empregar tanto carboidratos naturais como sintéticos.

[17] O termo proteína pode se referir a um material natural, recombinante ou sintético. Ela pode incluir peptídeos. Outras moléculas além da de proteína podem ser usadas como a segunda fração para ligar diretamente ou indiretamente ao carboidrato ativado.

[18] A conjugação direta se refere à ligação da proteína ao carboidrato ativado sem a introdução de grupos funcionais adicionais. A conjugação indireta se refere à adição de grupos funcionais que são usados para facilitar a conjugação. Por exemplo, o carboidrato pode ser funcionalizado com aminas que se faz subsequentemente reagir com grupos bromoacetila. O carboidrato bromoacetilado se faz então reagir com a proteína tiolada (Hermanson, GT, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 2a. ed., 2008). O termo “funcionalizaçao” geralmente significa a fixação química de um grupo para acrescentar uma funcionalidade, para facilitar a conjugação, por exemplo. Exemplos incluem funcionalização de proteínas com hidrazidas ou grupos aminóxi e a funcionalização de carboidrato com grupos amino.

MÉTODOS E REAGENTES

[19] A conjugação da proteína ao carboidrato aumenta o seu peso molecular que pode ser monitorado usando-se cromatografia analítica de exclusão molecular (SEC HPLC). Quanto mais cedo o material é eluído, maior é o seu peso molecular, e a proteína é geralmente monitorada por sua absorvância a 280 nm. Assim o desvio de absorvância para um tempo anterior é uma indicação de um aumento em peso molecular e, portanto, de conjugação. Uma coluna de SEC BioSep G4000 (Phenomenex) ou uma coluna análoga foi usada para SEC HPLC em um sistema Waters 600 equipado com software Empower.

[20] As aminas e hidrazidas foram testadas usando-se TNBS conforme descrito em linhas gerais em: ”Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid” Qi XY, Keyhani NO, Lee YC. Anal Biochem. 15 de novembro de 1988; 175(1):139-44 (incorporado ao presente documento a título de referência) e Vidal e Franci, J. Immun. Meth. 86: 155, 1986.

[21] A concentração de proteína foi determinada a partir do seu coeficiente de extinção e absorvância a 280 nm. O carboidrato foi testado pelo método de Monsigny M. et al. (Anal Biochem. 175 (2): 525-30, 1988: incorporado ao presente documento a título de referência).

[22] O tetrafluorborato de 1-ciano-4-pirrolidino piridínio (CPPT) foi preparado por Wilmington PharmaTech, Lot No. 1795-1536-10 e tinha um grau de pureza acima de 97% conforme determinado por HPLC de fase inversa (veja Figura 5). O tetrafluorborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP) foi fornecido por Merck Kga. O 1-ciano-imidazol (1CI) foi adquirido de Apin Chemicals (Abingdon, Reino Unido) (veja Figura 5). O 1-ciano-bezenotriazol (1-CBT) foi adquirido de Sigma Aldrich (veja Figura 5). O CRM e toxóide de tétano foram fornecidos pelo Serum Institute of India (Pune). O BSA foi adquirido de Amresco (Solon, OH). Os polissacarídeos pneumocócicos foram obtidos do Serum Institute of India ou de ATCC (Manassas, VA). Hib PRP e polissacarídeos de Neisseria meningiditis foram obtidos do Serum Institute of India. O T2000 dextrano (GE Healthcare) foi fracionado usando-se uma coluna de filtração por gel S400HR (GE Healthcare) para preparar uma fração de alto peso molecular. Outros reagentes usados incluem: N-metil-2- pirrolidona (NMP), hexanodiamina. 2HCl e trietilamina (TEA) foram adquiridos de Sigma-Aldrich. A acetonitrila foi obtida de GFS Chemical.

[23] Os exemplos abaixo ilustram modalidades da invenção, mas não devem ser considerados como limitando o âmbito da presente invenção.

EXEMPLO 1: SISTEMA MODELO: COMO SISTEMA MODELO, BSA FOI LIGADO POR COVALÊNCIA AO POLISSACARÍDEO DEXTRANO OU DIRETAMENTE OU ATRAVÉS DE UM ESPAÇADOR

[24] Cada um de CDAP e CPPT foi levado até 0,43M em acetonitrila e acrescentaram-se 120μL a 2 mL de dextrano (6 mg/mL em solução salina + 0,02% azida sódica). Depois de 30 segundos foi acrescentada trietilamina a cada um (~7 μL) para manter o pH a aproximadamente 9,8. Aos 2 minutos, alíquotas de 1mL do dextrano ativado foram removidas e acrescentadas ou a 1mL de uma solução a 0,5M de hexano diamina ou a uma solução de 1 mL de BSA (10 mg/mL). Depois de 4 horas, as soluções de dextrano derivado com hexano diamina foram submetidas a diálise de um dia para o outro em solução salina com mudanças frequentes. Para se remover ainda mais os reagentes de baixo peso molecular, as soluções foram levadas a ~6mL concentradas usando-se um dispositivo de filtro de centrifugação Corning (Spin-X com um cut-off de 10 kDa) e o processo foi repetido. O filtrado da segunda centrifugação foi testado usando-se ácido trinitrobenzeno-sulfônico (TNBS) e foi constatado que estava essencialmente negativo para aminas. O retido com os sais extraídos foi testado para aminas e dextrano. Os conjugados de BSA-dextrano foram incubados de um dia para o outro a 4 °C, sendo então fracionados sobre uma coluna de exclusão molecular Superdex200 (GE Healthcare), equilibrados com PBS. O perfil de eluição para os dois conjugados é apresentado na Figura 1. O pico de volume morto foi combinado e testado para BSA e dextrano (veja a Tabela 1).

[25] Estes dados mostram que CPPT ativa dextrano tão bem como CDAP e possivelmente melhor. Isso demonstra que a proteína pode ser conjugada diretamente ao polissacarídeo ativado por CPPT.

EXEMPLO 2: FUNCIONALIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS COM AMINAS USANDO CPPT

[26] Soluções de 7,5 mg/mL de polissacarídeos capsulares de Haemophilus influenzae (Hib), Neisseria meningiditis A (MenA) foram preparadas. 1,35mL de cada foram acrescentados a 75μL de 100 mg/mL de CPPT em acetonitrila. Aos 30 segundos, foram acrescentados 5μL de TEA aos polissacarídeos de Hib e de MenA. 6μL de TEA foram acrescentados à solução de MenC. Aos 2,5 minutos, 0,6 mL de PS ativado foram acrescentados aos 0,6 mL de hexanodiamina a 0,5M. Depois de 3 horas, cada uma delas foi submetida a diálise exaustivamente contra solução salina.

[27] Cada solução foi testada para polissacarídeo usando o ensaio de ácido sulfúrico de resorcinol com o polissacarídeo correspondente como o padrão para MenA e MenC. Ribose foi usada como o padrão para o polissacarídeo de Hib com 1 mole de ribose por unidade de repetição e um peso molecular de unidade de repetição de 243 g/mole (veja Tabela 2).

[28] Esta tabela ilustra ainda o uso de CPPT para a funcionalização de uma variedade de polissacarídeos.

EXEMPLO 3: DERIVAÇÃO DE DEXTRANO, UM POLISSACARÍDEO MODELO, USANDO 1-CIANOIMIDAZOL

[29] 30 mg de 1-CI foram acrescentados a 2 mL de solução de 20mg/mL de dextrano T2000 (GE Healthcare). Cinco alíquotas de 100μL de trietilamina a 0,2M foram acrescentadas para manter o pH entre 9 a 9,2. Depois de aproximadamente três minutos, foram acrescentados 2 mL de hexanodiamina a 0,5M e o pH foi ajustado para 9 com NaOH a 0,5M. Depois de 2 horas de reação, a solução foi submetida à diálise exaustivamente em solução salina. A solução foi clarificada por centrifugação e testada para a presença de dextrano e aminas. Foi constatado que o produto continha 27 aminas/100kDa de dextrano mostrando que 1-CI pode ser usado para funcionalizar polissacarídeos como aminas.

EXEMPLO 4: CONJUGAÇÃO DIRETA DE UMA PROTEÍNA MODELO A UM OS MODELO PS USANDO 1-CI (BSA-DEXTRANO)

[30] Foi preparada uma solução de 13,5 mg/mL de dextrano de alto peso molecular. 67,5μL de uma solução a 100mg/mL de 1-CI em NMP foram acrescentados a 1 mL e 30 segundos mais tarde, foram acrescentadas 4 alíquotas de 100μL cada de TEA a 0,2M, seguindo-se por aproximadamente 20μL de NaOH a 0,5M. A aproximadamente 3,5 minutos, foi acrescentado 0,5 mL de uma solução a 20 mg/mL de BSA. O pH foi elevado para aproximadamente 8,5 com a adição de 2 alíquotas de 100mL cada de borato de sódio a 0,1M, pH 9,0. Depois de dois dias a 4°C, a mistura de reação foi analisada por SEC HPLC. A figura mostra que dextrano ativado com BSA + 1-CI é eluído muito mais cedo da coluna de exclusão molecular, indicando um peso molecular mais elevado devido à conjugação ao polissacarídeo.

EXEMPLO 5: ATIVAÇÃO DE OUTROS PS COM 1-CI

[31] Polissacarídeos capsulares provenientes de sorotipos pneumocócicos 1 PS (Ps1) e 6B PS (Ps6B) foram preparados a 10 mg/mL em solução salina + 0,02% de azida sódica. 9,3 mg de 1-CI suspensos em 93μL de NMP foram acrescentados a 1mL de Ps1, acrescentando-se sem seguida 8 alíquotas de 100μL de TEA a 0,2M. Aos 2,5 minutos, foi acrescentado 0,5 mL de hexanodiamina a 1M, acrescentando-se em seguida 2 alíquotas de 100 μL cada de NaOH a 0,5M. O pH era de aproximadamente 9. Acrescentaram-se 100μL de uma solução a 100mg/mL de 1-CI em NMP a 1mL da solução de Ps6B. Duas alíquotas de 100μL de TEA a 0,2M foram acrescentadas, acrescentando-se em seguida 2 alíquotas de 50μL cada de NaOH a 0,5M para manter o pH a ~9,5 a 10,8. Aos 2,5 minutos, foi acrescentado 0,5mL de hexanodiamina a 1M juntamente com 50μL de NaOH a 0,5M. Depois de aproximadamente 3 horas, cada uma foi submetida à diálise exaustivamente contra solução salina. Cada uma foi então testada para a presença de polissacarídeo usando o ensaio de ácido sulfúrico de resorcinol e para a de aminas usando-se TNBS (veja a Tabela 3).

[32] Portanto, é evidente que 1-CI pode ser usado para ativar e funcionar polissacarídeos.

EXEMPLO 6: CONJUGAÇÃO INDIRETA A POLISSACARÍDEO FUNCIONALIZADO USANDO 1-CI

[33] 239μL de HEPES a 1M pH 8 foram acrescentados a uma solução de aproximadamente 9,5mg em 2,2mL de Ps6B-NH2 preparado no Exemplo 5. Foram acrescentados 170μL de bromoacetato de NHS a 1M em NMP. Depois de 1 hora, a solução teve os sais extraídos por lavagens repetidas usando-se um filtro de centrifugação Amicon Ultra 15 com cutoff de 30 kDa, usando-se tampão NaPO4 a 10 mM + EDTA a 5 mM pH 6,8. O retido foi então levado a um volume final de aproximadamente 0,7 mL. O toxóide de tétano foi tiolado do seguinte modo: 571μL de toxóide de tétano (35mg/mL) foi levado a um pH 8 pela adição de 64μL de HEPES a 1M. Acrescentaram-se lentamente 27μL de SPDP a 0,1M em NMP. Depois de aproximadamente 2 horas, o pH foi reduzido a 5,7 e acrescentaram-se 33μL de DTT a 0,5M para desproteger o tiol. Depois de 30 minutos, a solução teve os sais extraídos em uma coluna G25 de 1 x 15 cm, equilibrada com tampão de NaPO4 a 10 mM + EDTA a 5 mM pH 6,8. O volume morto foi combinado e concentrado até uma concentração final de aproximadamente 62 mg/mL. O teor de tiol foi determinado usando-se DTNB. O toxóide de tétano tinha uma relação de aproximadamente 6 moles de tióis/mole de TT. O polissacarídeo bromoacetilado e o TT tiolado foram combinados do seguinte modo: 0,66mL de Ps6B-BrAc + 73μL de HEPES a 1M, pH 8 + 230μL de TT tiolado.

[34] Deixou-se a reação prosseguir de um dia para o outro a 4°C, sendo então analisada por SEC HPLC (Figura 2). O conjugado foi fracionado por filtração por gel em uma exclusão molecular de coluna S400HR (GE Healthcare). As frações do volume morto que continham material de alto peso molecular forma combinadas e testadas para a presença de proteína e de carboidrato. Foi constatado que o conjugado continha aproximadamente 1mg de TT por mg de Ps6. Isto indica que 1-CI pode ser usado para a conjugação indireta de proteínas a carboidrato.

EXEMPLO 7: CONJUGAÇÃO DIRETA DE UMA PROTEÍNA A POLISSACARÍDEO USANDO 1-CI

[35] Polissacarídeo capsular proveniente do sorotipo pneumocócico 6A (Ps6A) foi solubilizado em água a 10 mg/mL. Cada um dos cinco tubos de 1mL foi aquecido a 80 °C durante 2 minutos e foi acrescentado a cada um deles 1mL de borato de sódio a 0,1M, pH 9. Depois de 2,5 horas, os tubos foram resfriados sobre gelo, sendo então submetidos à diálise. 25μL de TEA foram acrescentados a 10mL do Ps6A hidrolisado a 5mg/mL e 50mg de 1-CI acrescentados durante a centrifugação. Aos 2,5minutos, 30mL de CRM a 17,2mg/mL foram acrescentados e o pH foi mantido a aproximadamente 9. Depois de se ter deixado reagir de um dia para o outro, a solução foi concentrada até aproximadamente 1mL empregando um dispositivo de centrifugação Amicon Ultra 15 com um cutoff de kDa. Carregou-se 0,5mL em uma coluna Superdex 200 (1 x 30cm), equilibrada com borato de sódio a 10mM, NaCl a 150mM, pH 9 e com a passagem pela coluna a 0,5mL/minuto. O cromatograma é mostrado na Figura 3. Frações de 0,5mL foram coletadas e frações seletivas foram analisadas por SEC HPLC. Os cromatogramas SEC são mostrados na Figura 4 e indicam que todas as frações têm um peso molecular superior ao do CRM não conjugado. Conforme mostrado, as frações 20 a 28 todas eluíram mais cedo do que o CRM não conjugado, indicando que cada uma delas tem um peso molecular mais elevado.

EXEMPLO 8: FUNCIONALIZAÇÃO DE UM POLISSACARÍDEO COM 1- CIANOBENZOTRIAZOL (1-CBT)

[36] 12 mg de 1-CBT foram suspensos em 240μL de acetonitrila + 120μL de NMP. 120μL de 0,2M foram acrescentados a 0,5mL de 20mg/mL de dextrano T2000 (10mg) acrescentando-se em seguida 120μL da suspensão de 1-CBT. Aproximadamente aos 3 minutos, foi acrescentado 0,5mL de diidrazida adípica a 0,5M. Depois de 2 horas de reação, a solução foi submetida exaustivamente à diálise contra solução salina durante 2 dias. A solução foi então centrifugada e testada para dextrano e hidrazidas.

[37] Aproximadamente 9,5mg de dextrano foram recuperados com uma relação de aproximadamente 11 hidrazidas para 100kDa de dextrano. Para confirmar que as hidrazidas estavam ligadas ao dextrano, uma alíquota de hidrazida-dextrano rotulada com TNBS foi examinada por SEC HPLC com uma monitoração a 500nm, em que o aduto TNBS- hidrazida absorve. O cromatograma indicou que o trinitrobenzeno estava associado com o dextrano de alto peso molecular mostrando que a hidrazida estava realmente ligada ao dextrano. Isto mostra que 1-CBT pode ser usado para funcionalizar polissacarídeos.

EXEMPLO 9: CONJUGAÇÃO DIRETA DE PROTEÍNA A POLISSACARÍDEO ATIVADO POR 1-CBT

[38] 120μL de TEA a 0,2M foram acrescentados a 500μL de uma solução de dextrano T2000 a 20mg/mL e foram acrescentados 160μL de uma suspensão de 1-CBT a 50mg/mL em acetonitrila. Aos 2 minutos aproximadamente, foram acrescentados 200μL de uma solução de BSA a 47mg/mL em solução salina e a solução se tornou mais viscosa. Depois de uma reação de um dia para o outro, o conjugado foi analisado por SEC HPLC. A maior parte do BSA eluiu no volume morto da coluna, indicando que ele tinha um peso molecular elevado. Isto demonstra que 1-CBT pode ser usado para a conjugação direta de proteínas a polissacarídeos.

EXEMPLO 10: UMA 2-CIANOPIRIDAZIN-3(2H)-ONA SELECIONADA (VEJA KIM ET AL., TETRAHEDRON 61: 5889, 2005) É SINTETIZADA CONFORME DESCRITO EM KIM ET AL., EM CARBOIDRATO DE CIANATO.

[39] O carboidrato é ativado usando-se 1-CPO (X= Cl, Y= Cl), fazendo-se então reagir o mesmo diretamente com uma proteína ou funcionalizando-se o mesmo, com grupos amino, por exemplo. O reagente 2a (veja esquema 1, Kim et al.) é constituído até 100mg/mL em acetonitrila e foi acrescentado a uma solução a 10mg/mL de polissacarídeo pneumocócico do tipo 14 (Ps14) numa proporção de 1mg de reagente para 1mg de carboidrato. O pH é elevado para pH 9,5 usando-se trietilamina e mantido. Depois de 2,5 minutos, a metade da solução é acrescentada a um volume igual de hexanodiamina a 0,5M e o pH é ajustado para aproximadamente 8. A outra metade da solução é combinada com um peso igual de toxóide do tétano em solução a 10mg/mL. Depois de uma incubação de um dia para o outro a 4°C, a solução de polissacarídeo em hexanodiamina foi submetida à diálise exaustiva contra solução salina, sendo então testada para aminas e polissacarídeo. Foi encontrada uma relação de 10 aminas por 100kDa de polissacarídeo. A solução de polissacarídeo de tétano é fracionada em uma coluna S400HR (GE Healthcare) para remover a proteína que não se conjugou. Foram determinadas as concentrações de proteína e de polissacarídeo. Foi encontrada uma relação de aproximadamente 0,75mg de proteína por mg de polissacarídeo.

[40] Outras modalidades e usos da invenção se tornarão evidentes aos versados na técnica considerando o relatório e colocando em prática a invenção aqui divulgada. Todas as referências citadas na presente invenção, incluindo todas as publicações, patentes e pedidos de patentes norte- americanas e estrangeiras são específica e integralmente incorporadas ao presente documento a título de referência. O termo compreender, sempre que for usado, se destina a incluir o termo consistir essencialmente em. Além disso, os termos compreender, incluir e conter não têm uma conotação limitante. Pretende-se que o relatório e os exemplos sejam considerados exemplares somente, sendo o âmbito e espírito verdadeiros da invenção indicados pelas reivindicações que seguem.

Claims

1. Processo de conjugação de um carboidrato caracterizado por compreender: misturar 2-cianopiridazin-3(2H)ona (2-CPO) com o carboidrato para criar um composto químico ativado; e misturar o composto ativado com um segundo composto antigênico para criar um conjugado, em que o segundo composto antigênico é um peptídeo, polipeptídeo ou uma proteína.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o carboidrato é um carboidrato natural ou sintético, um polissacarídeo, um oligossacarídeo ou uma combinação deles.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a conjugação é direta ou indireta com a adição de grupos funcionais que facilitam a conjugação.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda a remoção de componentes com um peso molecular inferior ao do conjugado por diálise, filtração, cromatografia ou uma combinação deles.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjugado é uma vacina ou um agente diagnóstico.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas são conduzidas em conjunto.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda misturar o composto ativado com hexanodiamina, etilenodiamina, hidrazina, di- hidrazida adípica ou 1,6-diaminooxihexano para formar um grupo de ligação entre o composto ativado e o segundo composto antigênico.

8. Vacina caracterizada por ser produzida pelo processo conforme definido na reivindicação 1.