KR101633957B1 - 피라졸 유도체를 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

피라졸 유도체를 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피라졸 유도체 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 신장질환 예방 또는 예방용 조성물을 제공하며, 본 발명의 조성물은 단백뇨 감소, 사구체혈관간 세포 형성의 감소 및 신장 섬유화 억제 효과가 있다.

Description

피라졸 유도체를 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising a pyrazole derivative for prevention or treatment of kidney disease}
본 발명은 피라졸 유도체를 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
만성 신질환(chronic kidney disease: CKD)은 심혈관 질환 발병율과 사망률이 연령대조군 보다 10배 이상 높은 심각한 질환으로, 최근 들어 이 질환을 겪는 환자가 기하급수적으로 증가하고 있다(Schieppati A, Remuzzi G: Chronic renal diseases as a public health problem: epidemiology, social, and economic implications. Kidney Int Suppl. 98:S7-S10, 2005(1)).
만성 신질환은 epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) 및 세포외기질 (extracellular matrix: ECM) 단백의 축적을 특징으로 하고, 대표적인 병리학적 소견으로는 사구체 모세혈관 기저막의 비후, 혈관간질의 확장, 세뇨관 간질의 섬유화, 사구체 및 신장의 비대 그리고 단백뇨 등이 있다. 신장 조직 섬유화에 관련되는 인자로서 전환성장인자(transforming growth factor-β1: TGF-β1)는 다양한 자극에 의한 세포외기질 단백의 생산의 최종 매개인자로서 섬유화의 지표로 인식되고 있다Qian Y, Feldman E, Pennathur S, Kretzler M, Brosius FC 3rd: From fibrosis to sclerosis: mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy. Diabetes. 57: 1439-45, 2008)
한편 만성 신질환 중 하나인 당뇨병성 신증(diabetic kidney disease: DKD)은 만성신부전증(end-stage renal disease: ESRD)을 유발하는 가장 흔한 원인이다(U.S. Renal Data System, USRDS 2011 Annual Data Report: Atlas of End-Stage Renal Disease in the United States, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Bethesda, MD, 2011).
당뇨병성 신증을 비롯한 만성 신질환이 만성신부전증으로 진행되는 것을 억제하기 위하여 현재까지 알려진 치료 방법은 철저한 혈압 조절, 레닌안지오텐신계(renin-angiotensin system: RAS) 차단제의 사용이 시행되고 있으나 여전히 완벽한 신 보호효과를 지닌 치료제 개발이 절실한 실정이다(Zhang MZ, Wang S, Yang S, Yang H, Fan X, Takahashi T, Harris RC: The Role of Blood Pressure and the Renin-Angiotensin System in Development of Diabetic Nephropathy (DN) in eNOS-/- db/db Mice. Am J Physiol Renal Physiol. Epub ahead of print, 2011).
이에, 본 발명자들은 본 발명의 피라졸 유도체가 단백뇨 감소, 사구체혈관간 세포 형성의 감소 및 신장 섬유화 억제 효과가 있음을 발견하였으며 이들이 신장질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Schieppati A, Remuzzi G: Chronic renal diseases as a public health problem: epidemiology, social, and economic implications. Kidney Int Suppl. 98:S7-S10, 2005 Qian Y, Feldman E, Pennathur S, Kretzler M, Brosius FC 3rd: From fibrosis to sclerosis: mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy. Diabetes. 57: 1439-45, 2008 U.S. Renal Data System, USRDS 2011 Annual Data Report: Atlas of End-Stage Renal Disease in the United States, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Bethesda, MD, 2011 Zhang MZ, Wang S, Yang S, Yang H, Fan X, Takahashi T, Harris RC: The Role of Blood Pressure and the Renin-Angiotensin System in Development of Diabetic Nephropathy (DN) in eNOS-/- db/db Mice. Am J Physiol Renal Physiol. Epub ahead of print, 2011
본 발명의 목적은 피라졸 유도체를 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 피라졸 유도체를 투여하여 신장질환 예방 또는 치료하는 방법 및 신장질환 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제제를 제조하기 위한 본 발명의 피라졸 유도체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 열거된 화합물 중에서 선택된 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올;
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올의 염산염(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl);
3-(3-메톡시페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5(4H)-온;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 아세테이트;
3-(3-요오도페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H-피라졸-5-올; 및
3-{2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)비닐}-4-프로필-1-(2-피리딘일)피라졸-5-올.
본 발명은 하기 열거된 화합물 중에서 선택된 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올의 염산염(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl);
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 아세테이트;
3-(3-요오도페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올; 및
3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H-피라졸-5-올.
본 발명에서, 약제학적으로 허용되는 염은 의약업계에서 통상적으로 사용되는 염을 의미하며, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 브롬산, 요오드산, 과염소산, 주석산 및 황산 등으로 제조된 무기산염, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 하이드로 아이오딕산 등으로 제조된 유기산염, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 및 나프탈렌설폰산 등으로 제조된 설폰산염 등일 수 있으며, 열거된 이들 염에 의해 본 발명에서 의미하는 염의 종류가 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 염산염일 수 있다.
본 발명에서, 신장질환은 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환 또는 신부전증이 포함될 수 있다
상기 신장질환은 단백뇨, 사구체경화, 신장 간질성섬유화 등을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위 안에서 약학적으로 허용 가능한 희석제, 결합제, 붕해제, 윤활제, pH 조절제, 산화방지제, 용해보조제 등의 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
희석제는 슈가, 전분, 미결정셀룰로오스, 유당(유당수화물), 포도당, 디-만니톨, 알기네이트, 알칼리토금속류염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜, 무수인산수소칼슘, 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있으며; 결합제는 전분, 미결정셀룰로오스, 고분산성 실리카, 만니톨, 디-만니톨, 자당, 유당수화물, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 폴리비닐피롤리돈 공중합체(코포비돈), 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 천연검, 합성검, 코포비돈, 젤라틴, 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.
붕해제는 전분글리콘산나트륨, 옥수수전분, 감자전분 또는 전호화전분 등의 전분 또는 변성전분; 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 또는 비검(veegum) 등의 클레이; 미결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류; 알긴산나트륨 또는 알긴산 등의 알긴류; 크로스카멜로스(croscarmellose)나트륨 등의 가교 셀룰로오스류; 구아검, 잔탄검 등의 검류; 가교 폴리비닐피롤리돈(crospovidone) 등의 가교 중합체; 중탄산나트륨, 시트르산 등의 비등성 제제, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
윤활제는 탈크, 스테아린산, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 라우릴설페이트나트륨, 수소화식물성오일, 나트륨벤조에이트, 나트륨스테아릴푸마레이트, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노레이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.
pH 조절제는 초산, 아디프산, 아스코르빈산, 아스코르빈산 나트륨, 에테르산 나트륨, 사과산, 숙신산, 주석산, 푸마르산, 구연산(시트르산)과 같은 산성화제와 침강 탄산 칼슘, 암모니아수, 메글루민, 탄산 나트륨, 산화 마그네슘, 탄산 마그네슘, 구연산 나트륨, 삼염기칼슘인산염과 같은 염기성화제 등을 사용할 수 있다.
산화방지제는 디부틸 히드록시 톨루엔, 부틸레이티드 히드록시아니솔, 초산 토코페롤, 토코페롤, 프로필 갈레이트, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨 등을 사용할 수 있다.본 발명의 선방출성 구획에서, 용해보조제는 라우릴황산나트륨, 폴리소르베이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테류, 도큐세이트 나트륨, 폴록사머(poloxamer) 등을 사용할 수 있다.
또한, 지연방출성 제제를 만들기 위해 장용성 고분자, 수불용성 중합체, 소수성 화합물, 및 친수성 고분자를 포함할 수 있다.
상기 장용성 고분자는 pH5 미만의 산성 조건하에서 불용성이거나 또는 안정한 것으로, pH5 이상인 특정 pH 조건하에서 용해되거나 또는 분해되는 고분자를 말하며, 예를 들어, 히프로멜로오스아세테이트숙시네이트, 히프로멜로오스프탈레이트(히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 히드록시메틸에틸셀룰로오스프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트숙시네이트, 셀룰로오스아세테이트말레이트, 셀룰로오스벤조에이트프탈레이트, 셀룰로오스프로피오네이트프탈레이트, 메틸셀룰로오스프탈레이트, 카르복시메틸에틸셀룰로오스 및 에틸히드록시에틸셀룰로오스프탈레이트, 메틸히드록시에틸셀룰로오스과 같은 장용성 셀룰로오스 유도체; 스티렌-아크릴산 공중합체, 아크릴산메틸-아크릴산 공중합체, 아크릴산메틸메타크릴산 공중합체(예컨대, 아크릴-이즈), 아크릴산부틸-스티렌-아크릴산 공중합체, 및 아크릴산메틸-메타크릴산-아크릴산옥틸공중합체과 같은 상기 장용성 아크릴산계 공중합체; 폴리(메타크릴산 메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 L, 유드라짓 S, 에보닉, 독일), 폴리 (메타크릴산 에틸아크릴레이트) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 L100-55)와 같은 장용성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 아세트산비닐-말레인산 무수물 공중합체, 스티렌-말레인산 무수물 공중합체, 스티렌-말레인산모노에스테를 공중합체, 비닐메틸에테르-말레인산 무수물 공중합체, 에틸렌-말레인산 무수물 공중합체, 비닐부틸에테르-말레인산 무수물 공중합체, 아크릴로니트릴-크릴산메틸ㆍ말레인산 무수물 공중합체, 및 아크릴산부틸-스티렌-말레인산 무수물 공중합체와 같은 장용성 말레인산계 공중합체; 및 폴리비닐알콜프탈레이트, 폴리비닐아세탈프탈레이트, 폴리비닐부틸레이트프탈레이트 및 폴리비닐아세트아세탈프탈레이트와 같은 장용성 폴리비닐 유도체가 있다.
상기 수불용성 중합체는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되지 않는 고분자를 말한다. 예를 들어, 수불용성 중합체는 폴리비닐아세테이트(예컨대, 콜리코트 SR30D), 수불용성 폴리메타크릴레이트 공중합체[예컨대, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 NE30D, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트-트리메틸아미노에틸메타크릴레이트)공중합체(예컨대, 유드라짓RSPO)등], 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 아실레이트, 셀룰로오스 디아실레이트, 셀룰로오스 트리아실레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 디아세테이트 및 셀룰로오스 트리아세테이트 등이 있다.
상기 소수성 화합물은 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되지 않는 물질을 말한다. 예를 들어, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 글리세릴 비헤네이트, 세틸 팔미테이트, 글리세릴 모노 올레이트 및 스레아린산과 같은 지방산 및 지방산 에스테르류; 세토스테아릴 알코올, 세틸알코올 및 스테아릴알코올과 같은 지방산 알코올류; 카르나우바왁스, 밀납, 및 미결정왁스와 같은 왁스류; 탈크, 침강탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 산화아연, 산화티탄, 카올린, 벤토나이트, 몬모릴로나이트 및 비검과 같은 무기질 물질 등이 있다.
상기 친수성 고분자는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되는 고분자 물질을 말한다. 예를 들어, 덱스트린, 폴리덱스트린, 덱스트란, 펙틴 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 폴리갈락투론산, 자일란, 아라비노자일란, 아라비노갈락탄, 전분, 히드록시프로필스타치, 아밀로오스, 및 아밀로펙틴와 같은 당류; 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 구아검, 로커스트 콩 검, 트라가칸타, 카라기난, 아카시아검, 아라비아검, 젤란검, 및 잔탄검과 같은 검류; 젤라틴, 카제인, 및 제인과 같은 단백질; 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 및 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트과 같은 폴리비닐유도체; 폴리(부틸 메타크릴레이트-(2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트-메틸메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓E100, 에보닉, 독일), 폴리(에틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이드-트리에틸아미노에틸- 메타크릴레이트 클로라이드) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 RL, RS, 에보닉, 독일)과 같은 친수성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 폴리에틸렌 유도체; 카보머 등이 있다.
이외에도 착색제, 향료 중에서 선택된 다양한 첨가제로서 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 선택 사용하여 본 발명의 제제를 제제화할 수 있다.
본 발명에서 첨가제의 범위가 상기 첨가제를 사용하는 것으로 한정되는 것은 아니며, 상기한 첨가제를 선택에 의하여 통상 범위의 용량을 함유하여 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 하기 열거된 화합물 중에서 선택된 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 조성물을 포유류를 포함하는 대상체에 투여하여 신장질환 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다:
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올;
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올의 염산염(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl);
3-(3-메톡시페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5(4H)-온;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 아세테이트;
3-(3-요오도페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H-피라졸-5-올; 및
3-{2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)비닐}-4-프로필-1-(2-피리딘일)피라졸-5-올.
본 발명에서, 용어 “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 신장질환 예방 또는 치료용 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 신장질환 예방 또는 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 신장질환 예방 또는 치료용 조성물은 일일 1회 또는 일정한 시간 간격을 두고 일일 2회 이상 투여될 수 있다.
본 발명의 하기 열거된 화합물 중에서 선택된 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다:
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올;
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올의 염산염(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl);
3-(3-메톡시페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5(4H)-온;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 아세테이트;
3-(3-요오도페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H-피라졸-5-올; 및
3-{2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)비닐}-4-프로필-1-(2-피리딘일)피라졸-5-올.
예를 들어 투여량은 0.1 내지 100mg/kg/day이며, 이는 환자의 중증, 나이, 성별 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명은 또한 신장질환 예방 또는 치료용 약제학적 제제를 제조하기 위한 하기에 열거된 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다:
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올;
1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올의 염산염(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl);
3-(3-메톡시페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5(4H)-온;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 아세테이트;
3-(3-요오도페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H-피라졸-5-올; 및
3-{2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)비닐}-4-프로필-1-(2-피리딘일)피라졸-5-올.
본 발명의 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염은 단백뇨 감소, 사구체혈관간 세포 형성의 감소 및 신장 섬유화 억제 효과가 있어 신장질환 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 1의 화합물이 사구체 비대 및 사구체혈관간질 확장에 미치는 영향을 보여주는 도이다.
도 2는 실시예 1의 화합물이 콜라겐 축적(Masson's trichrome 염색, picrosirius red 염색)과 대식세포 표지자(F4/80) 생성에 미치는 영향을 보여주는 도이다.
도 3은 실시예 1의 화합물이 실시예 1의 화합물이 전환성장인자(TGF-β1), 세포외기질 단백질(피브로넥틴, 콜라겐 IV 및 콜라겐 Iα1) 및 염증성 인자(F4/80) 생성에 미치는 인자를 보여주는 도이다.
도 4 내지 도 13은 각각 실시예 1 내지 9의 화합물 및 비교예 1의 화합물에 의한 신장 근위세뇨관 세포에서의 콜라겐 Iα1 억제의 효과를 보여준다.
이하 하기 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예로 한정되는 것은 아니다.
또한, 이하에서 언급된 시약 및 용매는 특별한 언급이 없는 한 Sigma-Aldrich Korea, Alfa Aesar, 또는 Tokyo Chemical Industry(TCI) 로부터 구입한 것이며, 1H-NMR 데이터는 JEOL사의 Eclipse FT 300 MHz Spectrometer로 측정한 값이고, 13C-NMR 데이터는 JEOL사의 Eclipse FT 300 MHz Spectrometer로 측정한 값이며, Mass 데이터는 JEOL사의 MStation JMS 700 mass Spectrometer로 측정한 값이다.
실시예 1: 1-(피리딘-2-일)-3- 페닐 -4-프로필- 1H - 피라졸 -5- 올· HCl[1-(pyridin-2-yl)-3-phenyl-4-propyl- 1H -pyrazol-5-ol· HCl ]의 합성(이하 18-278 화합물)
단계 1: 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올[1-(pyridin-2-yl)-3-phenyl-4-propyl-1H-pyrazol-5-ol]의 합성
Figure 112012068995262-pat00001
...[화학식 1]
둥근 바닥플라스크에 2-프로필-3-옥소-3-페닐프로피온 산 에틸 에스터(2.52 g, 10.7 mmol)와 에탄올 10㎖을 넣고, 2-히드라지노피리딘(1.29 g, 11.8 mmol)을 에탄올 3㎖에 희석시켜 0℃에서 천천히 적가하였다. 3일동안 100℃에서 가열 환류시켰다. 감압증류하여 용매를 제거한 다음 생성된 고체를 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공건조시켜 상기 화학식 1의 화합물을 82%의 수율로 수득하였다.
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 12.50 (1H, s), 8.27-8.25 (1H, m), 8.01 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.81 (1H, m), 7.69 (2H, m), 7.48-7.34 (3H, m), 7.14-7.10 (1H, m), 2.54 (2H, d, J = 7.5 Hz), 1.64 (2H, m), 0.93 (3H, t, J = 7.3 Hz);
EIMS (70 eV) m/z (rel intensity) 279 (M+, 37), 250 (100).
단계 2: 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl의 합성(278)
Figure 112012068995262-pat00002
...[화학식 2]
둥근 바닥플라스크에 단계 1에서 제조한 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올 280mg을 에틸에테르 4mL에 용해시켰다. 여기에 2M의 HCl이 용해된 에틸에테르 0.55mL를 0℃에서 천천히 적가하였다. 상기 반응 용액에서 생성된 고체를 감압여과하여 용매를 제거한 다음, 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공건조시켜 화학식 2의 화합물 270mg을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.44 (1H, d, J = 4.2 Hz), 8.08-8.03 (2H, m), 7.66-7.64 (2H, m), 7.48-7. 42 (3H, m), 7.34-7.30 (1H, m), 2.49 (2H, brs), 2.43 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.48 (2H, m), 0.48 (3H, t, J = 7.3 Hz).
실시예 2: 3-(3-메톡시페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올[3-(3-methoxyphenyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]의 합성(18-001)
Figure 112012068995262-pat00003
...[화학식 3]
한국등록특허 10-0942382호에 개시된 합성방법에 따라 상기 화학식 3의 화합물을 합성하였다. 구체적으로 둥근 바닥플라스크에 3-(3-메톡시페닐)-3-옥소-프로피온 산 에틸 에스테르(1당량)와 에탄올 4㎖을 넣고, 여기에 2-히드라지노피리딘(1.1당량)을 에탄올 3㎖에 희석시켜 0℃에서 천천히 적가하였다. 20분 동안 가열 환류시켰다. 감압증류하여 용매를 제거한 다음 생성된 고체를 헥산과 에틸아세테이트로 세척한 후 진공건조시켜 화학식 3 화합물을 67%의 수율로 얻었다.
Figure 112012068995262-pat00004
...[화학식 3']
화학식 3의 화합물과 화학식 3'의 화합물은 엔올형 및 케토형 관계이다. 따라서 화학식 3의 화합물은 케토-엔올 토토머 반응에 의하여 화학식 3'의 화합물로도 존재할 수도 있다.
실시예 3: 3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올[3-(4-bromophenyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]의 합성(이하 18-066 화합물)
Figure 112012068995262-pat00005
...[화학식 4]
한국공개특허 제10-2011-0025149호에 개시된 합성방법에 따라 제조하였다. 구체적으로 100 mL 둥근바닥 플라스크에 에틸 4-브로모 벤조일아세테이트(제조사 : Aldrich)(10 mmol, 제조사:Aldrich)과 에탄올 (10 mL)을 넣고, 2-히드라지노피리딘(10 mmol, 제조사 : Aldrich)을 에탄올 (10 mL)에 녹인 용액을 상기 플라스크에 첨가하였다. 100℃에서 8시간 교반시킨 뒤 상온에서 냉각시켰다. 생성된 고체를 여과한 후, 에탄올과 헥산으로 세척한 후에, 고체를 진공건조시켜 화학식 4의 화합물을 수득하였다.
수율: 81% (2.5 g, 8.0 mmol);
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.8 (br, 1H) 8.30-8.28 (m, 1H), 8.03 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.94-7.88 (m, 1H), 7.73 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.21-7.16 (m, 1H), 5.91 (s, 1H);
EIMS (70eV) m/z (rel intensity) 315 (M+, 25), 317 (M+, 26), 101 (19), 79 (100).
실시예 4: 3-(4- 브로모페닐 )-1-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -5-일 아세테이트[3-(4-bromophenyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-yl acetate ]의 합성(이하 18-067 화합물)
Figure 112012068995262-pat00006
...[화학식 5]
실시예 3에서 합성한 3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 (3 mmol, 1 당량)을 CHCl3 10mL 에 녹인 후 0℃에서 트리에틸아민을 1.2당량 첨가하였다. 그 후, 아세틸클로라이드를 1당량 넣고 10분 동안 환류시켰다. 반응이 종결 후, 용액에 H2O (10mL)를 넣고 CHCl3로 추출하였다. 유기층을 무수의 MgSO4로 건조시킨 후, 여과하여 농축한 후 컬럼 크로마토그래피 (n-Hexane : EA = 5:1(v/v)) 로 분리하여 화학식 5의 화합물을 제조하였다.
실시예 5: 3-(3- 요오도페닐 )-1-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -5-올[3-(3-iodophenyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]의 합성(이하 18-082 화합물)
Figure 112012068995262-pat00007
...[화학식 6]
한국공개특허 제10-2011-0025149호에 개시된 합성방법에 따라 제조하였다. 구체적으로 100 mL 둥근바닥 플라스크에 에틸 3-요오도벤조일아세테이트(10 mmol, 제조사:Aldrich)과 에탄올 (10 mL)을 넣고, 2-히드라지노피리딘(10 mmol, 제조사 : Aldrich)을 에탄올 (10 mL)에 녹인 용액을 상기 플라스크에 첨가하였다.
100℃에서 8시간 교반시킨 뒤 상온에서 냉각시켰다. 생성된 고체를 여과한 후, 에탄올과 헥산으로 세척한 후에, 고체를 진공건조시켜 화학식 6의 화합물을 수득하였다.
수율: 80.4%
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.84 (br, 1H) 8.31-8.29 (m, 1H), 8.25-8.24 (m, 1H), 8.08-8.04 (m, 1H), 7.95-7.89 (m, 1H), 7.81-7.77 (m, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.23-7.13 (m, 2H), 5.91 (s, 1H).
실시예 6: 3-((나프탈렌-3- 일옥시 ) 메틸 )-1-(피리딘-2-일)-1H- 피라졸 -5-올[3-((naphthalen-3-yloxy)methyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol](6b)의 합성(이하 18-095 화합물)
Figure 112012068995262-pat00008
...[화학식 7]
한국공개특허 제10-2011-0025151호에 개시된 합성방법에 따라 제조하였다. 구체적으로 하기 단계 1 및 2에 따라 합성하였다.
단계 1: 에틸 4-(나프탈렌-3-일 옥시)-3-옥소부타노에이트[ethyl 4-(naphthalen- 3-yloxy)-3-oxobutanoate의 합성
25mL 둥근바닥 플라스크에 2-나프탈렌 옥시 아세트산(2-naphthalenoxyacetic acid) (4b, 404.4 mg, 2.0 mmol, 제조사: Fluka)을 넣고 무수 벤젠 28ml에 녹인 후 옥살일 클로라이드(oxalyl chloride, 0.338 mL, 4.0 mmol, 제조사:Aldrich)을 천천히 넣고 촉매로 DMF를 소량 넣은 후 실온에서 2시간 교반하고, 농축한 후 염화메틸렌으로 녹였다.
이후, 온도를 0℃으로 냉각시킨 후, Meldrum's acid (323 mg, 2.24 mmol)을 2 mL의 염화메틸렌에 녹인 용액을 천천히 넣고 1 mL의 피리딘을 천천히 넣은 후 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. TLC로 반응 완결을 확인 후 1.5 mL의 2M HCl과 얼음을 첨가하여 반응을 종결시키고 포화소금물로 씻어준 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고 농축시켰다. 이후, 용매를 모두 제거하기 위하여 진공건조를 시킨 후, 30 mL의 에탄올로 녹인 후 냉각 콘덴서를 꽂고 60℃에서, 20시간 동안 가열 환류시켰다. 반응 혼합물을 농축하여 에탄올을 제거하고 에틸아세테이트로 추출하고 포화소금물로 씻어준 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고 농축한 후 column chromatography (n-Hex/EtOAc=10/1(v/v))로 정제하여 에틸 4-(나프탈렌-3-일옥시)-3-옥소부타노에이트를 제조하였다.
수율 61%
단계 2: 3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올의 합성
25mL 둥근바닥 플라스크에 에틸 4-(나프탈렌-3-일 옥시)-3-옥소부타노에이트(5a, 1.2 g, 5.4 mmol)을 넣고 10 mL의 에탄올로 녹인 후 100℃에서 2-히드라지노피리딘 (0.55 g, 5.0 mmol)을 5mL의 에탄올에 녹인 용액을 30분 동안 천천히 첨가한 후, 20시간동안 교반시켰다. 이후, TLC로 반응 종결을 확인하고 반응 용액을 evaporation 시켜 농축시킨후, 에틸아세테이트로 추출하고 포화소금물로 씻어준 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고 농축한 후 column chromatography (n-Hex/EtOAc=9/1(v/v))로 정제하여, 화학식 7의 화합물을 수득하였다.
수율 65.2%;
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.76 (br, 1H) 8.29-8.27 (m, 1H), 7.97-7.87 (m, 2H), 7.79-7.74 (m, 3H), 7.49-7.41 (m, 1H), 7.37-7.15 (m, 4H), 5.76 (s, 1H), 5.15 (s, 2H); EIMS m/z (rel intensity) 317 (M+, 100), 174 (99), 106 (7)
실시예 7: 3-(2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올[3-(2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)phenyl)-1-(pyridin- 2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]의 합성(이하 18-177 화합물)
Figure 112012068995262-pat00009
...[화학식 8]
한국공개특허 제10-2011-0025149호에 개시된 합성방법에 따라 화학식 8의 화합물을 제조하였다.
실시예 8: 3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H- 피라졸 -5-올 [3-(biphenyl-4-yl)-1-(pyrimidin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]의 합성(이하 18-186 화합물)
Figure 112012068995262-pat00010
...[화학식 9]
한국공개특허 제10-2011-0025149호에 개시된 합성방법에 따라 화학식 9의 화합물을 제조하였다.
실시예 9: 3-{2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)비닐}-4-프로필-1-(2-피리딘일)피라졸-5-올[3-{2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)vinyl}-4-propyl-1-(2-pyridinyl)pyrazol-5-ol]의 합성(이하 18-273 화합물)
Figure 112012068995262-pat00011
...[화학식 10]
(E)-에틸 5-[4-(터트-부틸디메틸실릴옥시)-3-메톡시페닐]-3-옥소-2-프로필 펜타노에이트{(E)-ethyl 5-[4-(tert-butyldimethylsilyloxy)-3-methoxyphenyl]-3-oxo-2-propyl pentanoate} (1.02 g, 2.42 mmol)을 아세틱에시드(acetic acid) [5 mL]에 녹인 용액에 2-히드라지노피리딘(2-hydrazinopyridine) [266 mg, 2.44 mmol]를 넣고 가열 환류하에 2일동안 동안 교반시켰다. 반응 용액을 감압증류하여 농축한 뒤 에틸아세테이트 (15 mL)와 물 (5 mL)를 넣고 추출한다 (x 3회). 유기층은 무수황산나트륨으로 건조한 뒤 컬럼 크로마토그라피 [헥세인(Hex): 에틸아세테이트(EtOAc) = 15:1]하여 3-{2-(4-터트-부틸디메틸실릴옥시-3-메톡시페닐)비닐}-4-프로필-1-(2-피리디닐)피라졸-5-올[3-{2-(4-tert-butyldimethylsilyloxy-3-methoxyphenyl)vinyl}-4-propyl-1-(2-pyridinyl)pyrazol-5-ol] (676 mg, 69% )을 얻었다.
상기 화합물 (99 mg, 0.21 mmol)을 메탄올(MeOH) [1 mL]에 녹인 후, 진한 염산 (0.02 mL, 0.25 mmol)을 가하였다. 반응용액을 하루 동안 교반하였다. 감압하여 용매를 제거하여 고체를 얻었다. 얻은 고체를 진공건조하면 상기화합물(74 mg, 98%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.46 (1H, m), 8.30 (1H, d, J = 9.0 Hz), 7.95 (1H, m), 7.43-6.81 (6H, m), 3.72 (3H, s), 2.42 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.53 (2H, q, J = 9.0 Hz), 0.91 (3H, t, J = 9.0 Hz).
비교예: 3-페닐-4-벤질-5-벤질옥시-1-(2-피리딘일)피라졸[3-phenyl-4-benzyl-5-benzyloxy-1-(2-pyridinyl)pyrazole]의 합성(이하 18-233 화합물)
Figure 112012068995262-pat00012
...[화학식 11]
10 mL 둥근바닥 플라스크에 3-페닐-4-벤질-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올[3-phenyl-4-benzyl-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol] (100 mg, 0.30 mmol), 탄산칼륨(potassium carbonate) [58 mg, 0.42 mmol], DMF (1 mL)을 넣고 상온에서 10분간 교반하였다. 벤질브로마이드(benzyl bromide) [55 ㎕, 0.46 mmol]을 넣고 2시간 교반하였다. H2O (3 mL)을 넣고 에틸아세테이트 (3 x 5 mL)로 추출하였다. MgSO4로 물 제거하여 여과하였다. 컬럼크로마토그래피(Hex:EtOAc = 2:1)로 분리하여 상기 화학식 11의 화합물 (65 mg, 52%)을 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.61-8.59 (m, 1H), 8.06 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.80 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 7.58-7.48 (m, 5H), 7.21-7.07 (m, 7H), 6.96 (d, 2H J = 7.9 Hz), 6.55 (d, 2H, J = 7.1 Hz), 4.91 (s, 2H), 3.69 (s, 2H); EI-MS (70eV) m/z (rel intensity) 417 (M+, 6), 339 (39), 326 (61), 296 (40), 206 (26), 193 (85), 121 (15), 91 (100)
실시예 10: 본원발명의 화합물에 의한 실험동물의 상태 변화 확인
모든 동물 실험은 이화 동물실험윤리위원회의 규정을 따라 진행하였다. 제1형 당뇨 모델에서 본원발명의 화합물의 효과를 알아보기 위해, 스트렙토조신(streptozotocin)을 50 mg/kg로 5일간 투여한 C57BL/6J 8주령 생쥐의 혈중 당 수치를 확인 후(Hwang I, Lee J , Park J, Huh JY, Lee HB, Ho YS, Ha H: Catalase deficiency accelerates diabetic renal injury through peroxisomal dysfunction. Diabetes:728-738, 2012), 본원발명의 실시예 1의 화합물인 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl을 10 mg/kg/일(day)로 12주간 경구 투여하였다. 12주 후에 희생하여 분석하였고 혈액을 채취하여 혈당, 헤모글로빈 A1c(hemoglobin A1c; HbA1c), 혈장 크레아틴(plasma creatinine)을 측정하고, 뇨(尿)를 수거하여 요단백(urine protein)을 측정하였다. 혈당, HbA1c, 혈장 크레아틴, 요단백은 각각 존스앤존슨 사의 ONETOUCH Ultra, SIEMENS 사의 DCA2000+ Analyzer, Arbor Assays 사의 Detect X Serum Creatinine Detection kit 및 Bio-Rad Laboratories　사의 Bio-Rad protein assay kit을 사용하여 측정하였다. 대조군(WT), 당뇨군(DM) 및 실시예 1의 화합물 처리군(DM+실시예 1의 화합물)은 각각 제1형 당뇨 비유발군, 제1형 당뇨 유발군 및 제1형 당뇨 유발 후 실시예 1의 화합물 처리군을 의미한다.
본원발명의 화합물에 의한 실험동물의 상태 변화는 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112012068995262-pat00013
상기 표 1의 데이터는 군당 8 내지 12마리의 마우스의 평균(mean)±표준오차(SE)이다. 각 군 간의 통계학적인 비교는 분산 분석(ANOVA)과 Fisher's least significant difference 법으로 검정하였다. P값이 0.05 미만인 값에서만 의미가 있는 것으로 판정하였다. *P<0.05 vs WT, †P<0.05 vs DM
표 1에 나타난 바와 같이, 대조군(WT)에 비해 당뇨군(DM)에서 몸무게가 감소하고, 혈당 및 hemoglobin A1c가 증가한 점으로 보아 제1형 당뇨 유발 후 12 주 동안 고혈당 상태가 유지되었음을 알 수 있었다. 그리고 신장 무게 및 몸무게 당 신장 무게 비율 또한 증가한 것으로 보아 신장비대증(hypertrophy)이 나타났음을 알 수 있었다. 혈중(혈장) 크레아티닌은 대조군과 차이를 보이지 않았지만, 알부민 배설은 증가한 것을 알 수 있었다. 반면에, 당뇨를 유발하고 본원발명의 실시예 1의 화합물인 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl를 투여한 쥐(실시예 1의 화합물 처리군)에서는 몸무게, 혈당, hemoglobin A1c, 신장 무게, 몸무게 당 신장 무게, 혈중 크레아티닌이 당뇨군에 비하여 아무런 차이를 보이지 않았지만, 알부민 배설은 오히려 감소한 것을 관찰할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 화합물(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl)은 당뇨병성 신증에 동반되는 단백뇨(알부민 등의 배설)를 감소시켜 신장 보호 효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 사구체 비대 및 사구체혈관간 세포 형성 정도 확인
사구체 비대 및 사구체혈관간 세포 형성 정도 확인을 위한 형태학적 분석에 논문(Lee EA, Seo JY, Jiang Z, Yu MR, Kwon MK, Ha H, Lee HB: Reactive oxygen species mediate high glucose-induced plasminogen activator inhibitor-1 up-regulation in mesangial cells and in diabetic kidney. KidneyInt.67:1762-71, 2005)에 개시된 염색기술방법이 이용되었다.
실시예 10에 개시된 방법에 따라 당뇨를 유발하고 본원발명의 실시예 1의 화합물인 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl를 처리하고 12주 후에 희생하여 0.1 M PBS(phosphate-buffered saline)로 심장 관류(perfusion)을 시행한 뒤 2 % PLP(paraformaldehyde-lysine-periodate)로 하룻밤 동안 조직을 고정 하였다. 70% 에탄올 1시간, 80% 에탄올 1시간, 90% 에탄올 1시간, 95% 에탄올 1시간 2회, 100% 에탄올 1시간 3회, 자일렌(xylene) 30분 2회, 파라핀 30분 처리, 파라핀 1시간 30분 처리 순으로 처리하여 파라핀 조직으로 만들어서 4 μm 두께의 파라핀 절편을 제작하였다. 그리고 PAS(periodic acid-Schiff) 염색을 통해 기저막과 글리코겐(glycogen) 침전을 확인하였다. 하나의 신장 조직에서 30 개의 사구체를 스캔하고 사구체의 크기와 사구체혈관간 세포의 형성 정도를 Image-Pro Plus 4.5 소프트웨어(MEDIA CYBERNETICS 사)를 이용하여 측정하였다. 이때 사구체 크기는 하기 식 1에 의해 계산되었다.
[식 1]
사구체 크기 = (사구체 단면적)3/2 × B/K
상기 식에서 B (=1.38)는 구체의 형상계수이며 k (=1.1)는 입도 분포 계수이다.
상기 실험결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서, A는 PAS(periodic acid-Schiff)로 염색한 사구체를 보여주는 사진이고 B는 사구체 부피(glomerular volume)를 보여주는 그래프이며 C는 사구체혈관간질 부분(fractional mesangial area)을 보여주는 그래프이다. 도 1에서 대조군(WT), 당뇨군(DM) 및 실시예 1의 화합물 처리군(실시예 1의 화합물)은 각각 제1형 당뇨 비유발군, 제1형 당뇨 유발군 및 제1형 당뇨 유발 후 실시예 1의 화합물 처리군을 의미한다. 도 1의 데이터는 군당 8 내지 12마리의 마우스의 평균(mean)±표준오차(SE)이다. 각 군 간의 통계학적인 비교는 분산 분석(ANOVA)과 Fisher's least significant difference 법으로 검정하였다. P값이 0.05 미만인 값에서만 의미가 있는 것으로 판정하였다. *P<0.05 vs WT, †P<0.05 vs DM
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 화합물 투여군은 사구체 크기가 대조군에 비해 증가했지만 당뇨군에 비해서는 유의하게 감소하였고, 사구체혈관간 세포 형성이 당뇨군에 비해서 대조군 수준으로 감소한 경향을 보였다
따라서, 본 발명의 화합물들은 신장 근위세뇨관 세포에서 세포외기질인 콜라겐 Iα1 발현량을 감소시켜 세뇨관 간질 내에 콜라겐이 축적되는 것을 억제함으로써 신장 섬유화를 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 화합물(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl)은 당뇨병성 신증이 유발된 동물모델에서 사구체 크기와 사구체혈관간 세포 형성의 감소시켜 신장 보호 효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 12: 콜라겐 축적 억제 및 대식세포 감소 확인
면역조직화학염색
면역조직화학염색은 논문(Noh H, Kim JS, Han K-H, Lee GT, Song JS, Chung SH, Jeon JS, Ha H, Lee HB: Oxidative stress during peritoneal dialysis: implications in functional and structural changes in the membrane. Kidney Int. 69: 2022-2028, 2006)에 개시된 방법을 이용하였다.
간단히 설명하면, 실시예 11에 개시된 방법에 따라 당뇨를 유발하고 본원발명의 실시예 1의 화합물인 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl를 처리하고 12주 후에 희생하여 0.1 M PBS(phosphate-buffered saline으)로 심장 관류(perfusion)을 시행한 뒤 2 % PLP(paraformaldehyde-lysine-periodate)로 하룻밤 동안 조직을 고정 하였다. 70% 에탄올 1시간, 80% 에탄올 1시간, 90% 에탄올 1시간, 95% 에탄올 1시간 2회, 100% 에탄올 1시간 3회, 자일렌(xylene) 30분 2회, 파라핀 30분 처리, 파라핀 1시간 30분 처리 순으로 처리하여 파라핀 조직으로 만들어서 4 μm 두께의 파라핀 절편을 제작하여 알코올 과정으로 파라핀을 제거한 신장 조직은 항체의 침투를 높이기 위해 10 mM 구연산완충액(citrate buffer, pH 6.0)에 담그어 마이크로웨이브에서 가열(700와트 5분 처리 후, 100와트 5분 처리함)한 후, 최종적으로 상온 30분 처리하였다. 내재성 페록시다아제를 제거하기 위해 peroxidase blocking reagent(Dakocytomation 사의 Peroxidase Blocking Reagent Ready-To-Use)로 30분간 반응시키고, protein block serum-free 용액(Dakocytomation 사의 Protein Blocking Serum-Free Ready-To-Use)으로 15분간 반응시킨 후 1차 항체(Santa Cruz 사의 F4/80)로 4℃에 하룻밤 반응시키고, ABC kit(Santa Cruz 사)를 이용하여 ABC(avidin-biotin-enzyme complex)법으로 증폭시켰다. Liquid DAB substrate chromogen system(Dakocytomation 사)로 발색한 후 광학현미경으로 발현을 확인하였다.
Masson's trichrome 및 picrosirius red 염색
조직손상 정도를 확인하기 위하여 Masson's trichrome(Sigma-Aldrich 사) 및 picrosirius red 염색(Sigma-Aldrich 사)을 공급자의 지침에 따라 수행하였다. 조직손상 정도를 세뇨관 간질 내 콜라겐 축적(collagen accumulation) 면적당 비율로 비교하였다.
면역조직화학염색(IHC F4/80), 및 Masson's trichrome 및 picrosirius red 염색 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 대조군(WT), 당뇨군(DM) 및 실시예 1의 화합물 처리군(실시예 1의 화합물)은 각각 제1형 당뇨 비유발군, 제1형 당뇨 유발군 및 제1형 당뇨 유발 후 실시예 1의 화합물 처리군을 의미한다. 도 2에서 IHC F4/80에 해당하는 도면에서 검은 색이 F4/80가 발현된 것을 보여주며, Masson's trichrome 및 picrosirius red에 해당하는 도면에서 각각 파란색과 붉은색이 콜라겐이 발현된 것을 보여준다.
도 2에서 나타난 바와 같이, Masson's trichrome 염색하면 대조군에 비해 당뇨군은 파란색으로 염색된 부위가 많음을 확인할 수 있었다. 또한 Masson's trichrome 염색하면, 실시예 1의 화합물 처리군이 당뇨군에 비해서는 파란색으로 염색된 부위가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. picrosirius red 염색하면 대조군에 비해 당뇨군이 붉은색으로 염색된 부위가 많음을 확인할 수 있었다. 또한 picrosirius red 염색하면, 실시예 1의 화합물 처리군이 당뇨군에 비해서는 붉은색으로 염색된 부위가 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 면역조직화학염색(F4/80) 하면(F4/80) 대조군에 비해 당뇨군은 검은색으로 염색된 부위가 많음을 확인할 수 있었다. 또한 면역조직화학염색(F4/80) 하면, 실시예 1의 화합물 처리군이 당뇨군에 비해서는 검은 색으로 염색된 부위가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, Masson's trichrome과 picrosirius red 염색으로 세포외기질 축적을 확인하였을 때, 대조군에 비해 당뇨군에서 콜라겐 축적이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 면역조직화학염색으로 확인한 결과, 대조군에 비해 당뇨군에서 대식 세포(F4/80) 역시도 증가함을 확인할 수 있었다. 반면에, 당뇨를 유발하고 본원발명의 실시예 1의 화합물인 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl를 투여한 쥐(실시예 1의 화합물 처리군)에서는 콜라겐 축적 증가 및 대식세포(F4/80)가 증가가 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 화합물(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl)은 당뇨병성 신증이 유발된 동물모델에서 콜라겐 축적을 억제하고 대식세포(F4/80)를 감소시킴으로써 신장 보호 효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 13: 신장 섬유화 억제 효과의 확인[실시간 PCR(realtime polymerase chain reaction) 분석]
Trizol 용액(Invitrogen 사)을 이용하여 제조자의 지침에 따라 총 RNA를 분리하였다. 그리고 분리된 총 RNA를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
간단히 설명하면, 실시예 10에 개시된 방법에 따라 당뇨를 유발하고 본원발명의 실시예 1의 화합물인 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl를 처리하고 12주 후에 희생하여 얻은 신장 조직에 Trizol 용액(Invitrogen 사)을 지정된 양만큼 투여(500 μl)하여 조직 분쇄 후 원심 분리(13,000 rpm, 10 분)로 상층액을 따로 수거하였다. 클로로포름(Chloroform) 200 μl를 넣고 15분간 반응시킨 후 원심분리 하였다. 수거한 총 RNA는 이소프로필 알콜(Isopropyl alchol)로 침전시키고, 75% 에틸 알콜(Ethyl alcohol)로 세척하여 실험에 사용하였다. 2 μg의 총 RNA를 역전사 kit(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를 합성하고 SYBR Green PCR Master Mix kit로 ABI 7300 real-time PCR thermal cycler(Applied Biosystems)를 사용하여 공급자의 지침에 따라 선택적인 mRNA 양을 정량 하였다. 매 실험마다 20 μl의 양으로 2회(dulplicate)로 실험하고, 표준곡선(standard curve)과 해리곡선(dissociation curve)을 확인하여 정량의 적절성과 얻어진 결과가 단일산물에 대한 결과임을 확인하였다. PCR 반응은 95℃에서 15초간, 56 ℃에서 1분간 40회 반복하였다. 증폭을 위해 사용한 각각의 프라이머는 표 2와 같으며, 바이오니아 (대전, 한국)에 제작 의뢰한 것을 이용하였다. 실시간 PCR 결과를 도 3에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112012068995262-pat00014
도 3에서 A는 18S rRNA에 대한 TGF-β1 mRNA 발현량 비율, B는 18S rRNA에 대한 피브로넥틴 mRNA 발현량 비율, C는 18S rRNA에 대한 콜라겐 IV mRNA 발현량 비율, D는 18S rRNA에 대한 콜라겐 Iα1 mRNA 발현량 비율 및 E는 18S rRNA에 대한 F4/80 mRNA 발현량 비율을 보여주는 그래프이다. 도 3에서 대조군(WT), 당뇨군(DM) 및 실시예 1의 화합물 처리군(실시예 1의 화합물)은 각각 제1형 당뇨 비유발군, 제1형 당뇨 유발군 및 제1형 당뇨 유발 후 실시예 1의 화합물 처리군을 의미한다. 도 3의 데이터는 군당 8 내지 12마리의 마우스의 평균(mean)±표준오차(SE)이다. 각 군 간의 통계학적인 비교는 분산 분석(ANOVA)과 Fisher's least significant difference 법으로 검정하였다. P값이 0.05 미만인 값에서만 의미가 있는 것으로 판정하였다. *P<0.05 vs WT, †P<0.05 vs DM
도 3에서 나타낸 바와 같이, 당뇨를 유발하고 본원발명의 실시예 1의 화합물인 1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl를 투여한 쥐(실시예 1의 화합물 처리군)에서는 신장 섬유화에 관련되는 인자인 TGF-β1과 세포외기질 단백으로 잘 알려진 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen) Iα1 및 콜라겐 IV, 염증성 인자인 F4/80 발현량이 당뇨군에 비해 현저하게 감소하는 경향을 보였다.
따라서, 본 발명의 화합물(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl)은 신장 섬유화를 억제시킴으로써 신장 보호 효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 14: 본원발명의 화합물에 의한 신장 근위세뇨관 세포에서의 콜라겐 Iα1 억제의 효과 확인
C57BL6/J 성인 쥐 신장의 미세 세절된 성인 쥐 근위관세뇨관 세그먼트에서 유도된 신장 근위세뇨관 세포인 mProx24는 일본 가나자와현 마리아나 의과대학의 Sugaya 교수로부터 공급받았다. mProx24는 10% 신생우아혈청(FCS; Gibco), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 및 44 mM NaHCO3이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. RNA 발현 정도를 측정하기 위하여 세포를 6-well plate에서 배양하였다. 세포가 배양 용기의 90% 정도를 채우면 0.15% 신생우아혈청(FCS; Gibco)이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 24시간 배양함으로써 세포 성장을 정지시키고 성장 주기를 동일화하였다. 각각의 실시예 1 내지 9의 화합물 및 비교예의 화합물을 DMSO(dimethylsulfoxide)에 50 mM로 녹인 후, 10 mM, 1mM, 0.1 mM, 0.01 mM로 계열 희석하였다. 각각의 실시예 1 내지 9의 화합물 및 비교예의 화합물 10 mM, 1 mM, 0.1 mM, 0.01 mM을 0.15% 신생우아혈청(FCS; Gibco)이 포함된 DMEM 배지로 1000배 희석하여 최종 농도 10 μM, 1 μM, 0.1 μM, 0.01 μM, 0 μM (DMSO 1 μL)로 1시간 동안 배양한 후, recombinant human transforming growth factor-β1 (hTGF-β1, R&D Systems) 5 ng/ml을 각각 첨가하여 6시간 동안 배양하였다. 대조군(Control)에는 hTGF-β1을 넣지 않았다. Trizol (Invitrogen)을 이용하여 mProx24에서 총 RNA를 추출하였다. mRNA 발현은 cDNA transcripts, 프라이머쌍(primer pairs), 및 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 이루어진 20 μL 반응부피와 함께 StepOnePlus (Applied Biosystems)를 이용하여 real-time PCR법으로 측정하였다(실시간 PCR 조건: 95℃ 10분 → denaturation 과정으로 95℃에서 15 초, primer annealing 과정으로 60℃에서 1분을 40번 반복 → melting curve를 측정하기 위해 95℃에서 15초, 60℃에서　1분, 95℃에서 15초). 정량은 18S rRNA 발현량으로 표준화시켰다. 생쥐 콜라겐 Iα1 프라이머쌍의 서열은 5'-GAACATCACCTACCACTGCA-3' 과 5'-GTTGGGATGGAGGGAGTTTA-3' 였다. 또한 생쥐 r18S rRNA 정방향 프라이머 서열는 5'-CGA AAG CAT TTG CCA AGA AT-3', 역방향 프라이머 서열은 5'-AGT CGG CAT CGT TTA TGG TC-3' 였다.
상기 실험결과를 표 3 내지 12 및 도 4 내지 도 13에 나타내었다. 표 3 및 12 내지 도 4 내지 도 13은 각각 실시예 1 내지 9의 화합물 및 비교예 1의 화합물에 의한 신장 근위세뇨관 세포에서의 콜라겐 Iα1 억제의 효과를 보여준다.
표 3 내지 12 및 도 4 내지 도 13의 데이터는 각 농도 당 3 내지 5회의 반복실험의 결과이다. 또한 하기 표 3 내지 12 및 도 4 내지 도 14의 데이터는 평균(mean)±표준오차(SE)로 나타낸다. 각 군 간의 통계학적인 비교는 분산 분석(ANOVA)과 Fisher's least significant difference 법으로 검정하였다. P값이 0.05 미만인 값에서만 의미가 있는 것으로 판정하였다. *P<0.05 vs WT, †P<0.05 vs DM
표 3 내지 12는 각 군의 18S rRNA 발현량(18S)에 대한 콜라겐 Iα1(Col1α)의 발현량의 비율의 평균(mean), 콜라겐 Iα1의 발현 억제율(% of inhibition) 및 IC50값(μM)을 나타낸다. 이때 억제율은 대조군의 억제율을 100%, hTGF-β1 처리하고 본원발명의 실시예에 따른 화합물 또는 비교예에 따른 화합물을 처리하지 않은 군(TGF-β1)의 억제율을 0%로 할 때 상대적인 억제율을 의미한다.
도 4 내지 도 13은 각 군의 18S rRNA 발현량(18S)에 대한 콜라겐 Iα1(Col1α)의 발현량의 비율[상대적 증가(relative increase)]를 보여준다.
[표 3]
Figure 112012068995262-pat00015
[표 4]
Figure 112012068995262-pat00016
[표 5]
Figure 112012068995262-pat00017
[표 6]
Figure 112012068995262-pat00018
[표 7]
Figure 112012068995262-pat00019
[표 8]
Figure 112012068995262-pat00020
[표 9]
Figure 112012068995262-pat00021
[표 10]
Figure 112012068995262-pat00022
[표 11]
Figure 112012068995262-pat00023
[표 12]
Figure 112012068995262-pat00024
상기 도 4 및 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본원발명의 실시예에 따른 화합물을 처리할 경우 신장 근위세뇨관 세포에서 세포외기질인 콜라겐 Iα1(Col1α)의 발현량이 감소하였다. 또한, 신장 근위세뇨관 세포에서 세포외기질인 콜라겐 Iα1(Col1α)의 발현량은 대체적으로(예를 들어, 실시예 9의 화합물 제외) 본원발명의 실시예에 따른 화합물 처리 농도에 의존적으로 억제되었다. 비교예에 따른 화합물도 농도 의존적으로 세포외기질인 콜라겐 Iα1(Col1α)의 발현량이 감소시켰다.
그러나, 본원발명의 실시예에 따른 화합물의 IC50 값이 비교예에 따른 화합물의 IC50 값 보다 최소 3배 이상 낮아 세포외기질인 콜라겐 Iα1(Col1α)의 발현량을 좀더 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 화합물들은 신장 근위세뇨관 세포에서 세포외기질인 콜라겐 Iα1 발현량을 감소시켜 세뇨관 간질 내에 콜라겐이 축적되는 것을 억제함으로써 신장 섬유화를 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (4)

  1. 하기 열거된 화합물 중에서 선택된 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올;
    1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올의 염산염(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl);
    3-(3-메톡시페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5(4H)-온;
    3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
    3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 아세테이트;
    3-(3-요오도페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
    3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
    3-(2-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
    3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H-피라졸-5-올; 및
    3-{2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)비닐}-4-프로필-1-(2-피리딘일)피라졸-5-올.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신장질환은 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환 및 신부전증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신장질환인 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 하기 열거된 화합물 중에서 선택된 화합물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올의 염산염(1-(피리딘-2-일)-3-페닐-4-프로필-1H-피라졸-5-올·HCl);
    3-(4-브로모페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 아세테이트;
    3-(3-요오도페닐)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올;
    3-((나프탈렌-3-일옥시)메틸)-1-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올; 및
    3-(비페닐-4-일)-1-(피리미딘-2-일)-1H-피라졸-5-올.
  4. 제3항에 있어서, 상기 신장질환은 당뇨병성 신증, 고혈압성 신증, 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 다낭성 신장질환 및 신부전증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 신장질환인 신장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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