KR101632580B1 - 비만 억제 효과를 갖는 건강기능식품 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 물 100 중량부를 기준으로 법제된 삼백초 3.0 내지 4.0 중량부, 법제된 민들레 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 생강 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 엉겅퀴 0.5 내지 1.0 중량부, 법제된 함초 0.5 내지 1.0 중량부 및 법제된 감초 0.5 내지 1.0 중량부를 포함하는 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품 및 물 100 중량부를 기준으로 법제된 생강 2.0 내지 4.0 중량부, 법제된 마카 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 옥수수 1.0 내지 2.0 중량부, 법제된 마테잎 1.0 내지 2.0 중량부, 및 법제된 녹차잎 1.0 내지 2.0 중량부를 포함하고, 법제된 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상을 1.0 내지 2.0 중량부를 포함하는 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

비만 억제 효과를 갖는 건강기능식품 및 이의 제조방법{FUNCTIONAL FOOD AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 비만 억제 효과를 갖는 건강기능식품 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

현대인들에게는 불규칙한 식사, 스트레스, 과다한 음주 및 흡연 등으로 인하여 간 기능이 손상되거나, 심하면 간질환으로 발전하는 경우가 빈번하게 일어나고 있다. 한국 통계청이 최근 발표한 ‘사망원인 통계조사’따르면 한국 성인 40대에서 간질환으로 인한 사망률이 가장 높게 나타났다. 또는 이와 더불어 식생활 서구화 되면서 섭취하는 열량이 늘어나고, 그에 따라 비만 인구도 증가하는 추세이다. 세계보건기구(WHO)는 비만은 ‘21세기 신종 전염병’으로 지목할 정도로 위협적인 질병으로 대두되고 있으며, 2015년 전 세계 인구의 약 23.4%가 비만이 되고 10년 후에는 비만인구가 현재보다 50% 증가할 것으로 전망하고 있다. 그리고 한국 비만 인구도 급증하고 있어 2008년 체질량지수(Body Mass Index, BMI)가 25 (kg/m²) 이상인 비만 인구가 30.7%를 차지하여 한국인 3명 중 1명이 비만인 시대에 도래하였다.

현대인에게 식품섭취는 영양공급이나 기호성 충족을 목적으로 하는 고전의 개념과 더불어 질병예방 차원에서 생체기능을 조절하는 것으로 새롭게 조명되고 있다. 최근에는 생체 리듬에 대한 식품의 생리조절능력인 ‘3차기능’이 주목되면서 건강한 삶의 질적 향상을 위한 건강기능성식품의 소비가 증가하고 있는 실정이다. 건강기능식품이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조(가공을 포함)한 식품을 말한다. 한국뿐 아니라 미국과 일본 등 전세계적으로 건강보조식품에 관한 법률이 제정, 시행되면서 이러한 건강기능성 식품에 대한 시장규모가 확대되고 있다. 뿐만 아니라, 건강기능식품의 기능성 및 유용성을 과학적인 방법으로 입증하고자 하는 연구가 활성화되고 있어 국민의 건강기능성식품에 대한 신뢰가 향상되고 있다.

건강에 관한 동양의학의 생각 방법으로 의약과 음식물은 같은 근원을 가진 “약식동원”(葯食同源)이라는 생각이 여러 가지 동양의학 고전에서 나타났다. 의약품이나 일상의 음식물은 모두 인간의 생명을 보양하고 생명을 유지 건강을 보유하는데 불가결로 궁극적으로는 자연의 것에 의한 것이 좋다는 것이다. 동양의학의 근간은 ‘치미병(治未病)’이라고 하나 대중요법(大衆療法)을 기본으로 하는 서양의학에도 최근에는 예방의학의 분야가 중시되게 되어 약식동원의 생각을 받아들이게 되었다.

태명청은 “산가요록”, “산림경제”, “도문대작”, “임원경제지”, “동국세시기”, “경도잡지” 등의 고문서와 동양 옛 선조들의 음양오행(陰陽五行), 상생상극(相生相剋)사상과 양반가에서 구전되어 내려오는 방법을 참조하여 오랜 세월에 걸친 실질적인 임상적 경험인 민간요법 및 한의학을 바탕으로, 여러 가지 종류의 식재료 및 한약재를 법제라는 한의약에서 사용하는 약재의 처리 방법으로 약재의 독성을 감소하고 약재의 효과를 높이는 가공과정을 처리한 후에 물로 추출하여 제조하는 전통 식품이다.

태명청에 대한 실험적 연구로는 항산화, 대장염, 위염 등에 대한 효과가 보고된 바 있으나, 간 손상 방지 효과와 비만 억제 효과에 관한 효과는 보고된 바가 없다.

또한, 한국의 전통적인 식품에 대한 기호를 만족하면서도, 최근 관심도가 높아지고 있는 간 손상과 비만을 저감하는데 효과적인 건강기능성식품에 대한 수요가 매우 증가하고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 하나의 과제는 간 손상 억제 및 간 기능 보호 효과가 있는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 비만 억제 효과가 있는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 쓴맛을 효과적으로 저감시키고, 전통식품에 대한 기호를 만족시킬 수 있는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예는 물 100 중량부를 기준으로 법제된 삼백초 3.0 내지 4.0 중량부, 법제된 민들레 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 생강 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 엉겅퀴 0.5 내지 1.0 중량부, 법제된 함초 0.5 내지 1.0 중량부 및 법제된 감초 0.5 내지 1.0 중량부를 포함하는 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구현예는 물 100 중량부를 기준으로 법제된 생강 2.0 내지 4.0 중량부, 법제된 마카 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 옥수수 1.0 내지 2.0 중량부, 법제된 마테잎 1.0 내지 2.0 중량부 및 법제된 녹차잎 1.0 내지 2.0 중량부를 포함하고, 법제된 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상을 1.0 내지 2.0 중량부로 포함하는 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품에 관한 것이다.

상기 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품은 삼백초, 민들레, 생강, 엉겅퀴, 함초 및 감초를 각각 별도로 법제하는 단계; 가마솥에 물 100 중량부를 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제된 삼백초 3.0 내지 4.0 중량부, 법제된 민들레 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 생강 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 엉겅퀴 0.5 내지 1.0 중량부, 법제된 함초 0.5 내지 1.0 중량부 및 법제된 감초 0.5 내지 1.0 중량부를 투입하고 1차 가열하는 단계; 및 80℃ 내지 100℃에서 2차 가열하는 단계;로 이루어진 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품은 생강, 마카, 옥수수, 마테잎, 및 녹차잎과, 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상을 각각 별도로 법제하는 단계; 가마솥에 물 100 중량부를 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제된 생강 2.0 내지 4.0 중량부, 법제된 마카 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 옥수수 1.0 내지 2.0 중량부, 법제된 마테잎 1.0 내지 2.0 중량부 및 법제된 녹차잎 1.0 내지 2.0 중량부를 투입하고, 법제된 현호색 또는 법제된 대나무잎 중 하나 이상을 1.0 내지 2.0 중량부 투입하여 1차 가열하는 단계; 및 80℃ 내지 100℃에서 2차 가열하는 단계;로 이루어진 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 법제하는 단계는 생강, 청주, 솔잎, 민들레, 쑥, 진피, 밤, 막걸리, 부추, 식염, 연잎, 국화, 양파, 무, 아카시아, 냉이, 감잎, 갈대, 도라지, 싸리나무잎, 마늘, 은행잎, 대나무잎, 보리, 사과, 청주 및 된장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 종 이상의 열수 추출물을 이용하여 각 재료를 찌는 1차 법제; 및 상기 1차 법제된 각 재료를 청주, 식염, 녹차, 솔잎, 매실, 황설탕, 식초, 막걸리, 탱자, 천연소금, 깨, 갈대, 칡 및 감잎차로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 종 이상을 첨가하여 덖는 2차 법제;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 간 손상 억제 및 간 기능 보호 효과와 비만억제 및 체중감소 효과가 있고, 새로운 기호를 만족시킬 수 있는 건강기능식품 및 이러한 효과를 증대시킬 수 있는 전통적인 제조 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 실험예 A1의 세포 사멸 및 증식 억제 정도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험예 A6의 간 조직의 병리학적 관찰 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 실험예 B1의 세포 사멸 및 증식 억제 정도 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 B1의 in vitro 세포염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 실험예 B1의 글리세롤 정량 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 B2의 체중 및 식이섭취 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험예 B5의 간 조직의 변화 관찰 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 실험예 B5의 고환 지방 조직의 변화 관찰 결과를 나타낸 사진이다.

물을 이용하는 한약재의 가공 처리 방법은 약재를 물 또는 술 액체 보조재 속에 넣고 찌꺼기를 제거하거나 거품을 제거 혹은 이물질을 씻어버리는 지(漬), 포(泡), 세(洗)의 3가지가 있다.

물과 불을 이용하는 한약재의 가공 처리 방법은 약재를 증기로 찌는 증(蒸)과 삶는 자(煮)가 있다.

이러한 한약재의 가공처리 방법은 한약의 효능이나 독성 및 안전성을 변하게 하므로 예로부터 중시되어온 과정이다. 한약재의 생품을 가공 처리하여 사용한 기록은 이미 신농본초경(神農本草經)에서부터 볼 수 있으며, 기원전 1, 2세기경에 쓰여진 뇌공포자론은 최초의 포제 전문서적이다. 근대 한의학에서 포제학은 현대과학과 포제의 전통기술을 연구하고 개선하여 새로운 제조기법을 발전시켰으며, 동서의학의 결합과 발전의 실현을 위해서 중요한 의의를 가지고 있다.

본 발명에서는 산가요록, 산림경제, 도문대작, 임원경제지, 동국세시기, 경도잡지, 음식디미방, 규합총서, 증보산림경제, 주촌신방, 향약본초 등의 고문서와 오행의 원리에 의해 사물을 대응시켜 음양과 상생(常生)과 상극(相剋)의 원칙을 적용하여 생명현상의 밸런스를 유지하는 음양오행과 오랜 세월에 걸친 실질적인 임상적 경험인 민간요법 및 한의학 등을 조사하였다. 이를 바탕으로 여러 재료들을 각각 법제 처리하고, 이 재료들을 물로 추출하여 제조하여 태명청을 제조한다.

본 발명의 실시예들에 따른 건강기능식품은 전통적인 방법으로 법제(法製) 처리된 재료를 후술하는 조성 및 방법을 통해 제조되었다. 또, in vitro와 in vivo 에서 건강기능성 효과를 평가하였다. 이에 따라, 본 발명은 전통적인 제조방법으로 제조된 시료의 우수성을 과학적으로 증명하고, 전통적인 방법을 이용한 건강기능성 식품의 개발 가능성을 제시한다.

본 발명의 일 실시예는 물 100 중량부를 기준으로 법제된 삼백초 3.0 내지 4.0 중량부, 법제된 민들레 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 생강 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 엉겅퀴 0.5 내지 1.0 중량부, 법제된 함초 0.5 내지 1.0 중량부 및 법제된 감초 0.5 내지 1.0 중량부를 포함하는 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품에 관한 것이다.

이러한 일 실시예의 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품은 삼백초에 포함되어 있는 lignan, 생강에 포함되어있는 gingerol, 민들레 및 엉겅퀴에 포함되어 있는 Pectolinarin, Pectolinarigenin, 함초에 포함되어 있는 3-caffeoyl, 4-dihydrocaffeoyl quinic acid, 감초에 포함되어 있는 glycyrrhizin 등이 복합적으로 작용하여 종래보다 뛰어난 간세포에 대한 항산화 효과가 있고, 간 독성으로 인해 유발되는 산화적인 손상을 방지하는 효과가 있다.

또한, 일 실시예의 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품은 생강에 포함되어 있는 phytochemicals중의 하나인 6-gingerol, 민들레에 함유되어 있는 Luteolin, luteolin-7-O-glucoside는 감초에 함유되어 있는 glycyrrhetenic acid가 복합적으로 작용하여 NF-kB 활성화, Inos의 발현 및 COX-2 발현을 억제시키는데 뛰어난 효과를 발휘할 수 있다. 이러한 경우, 상기 성분들의 합에 의해 항염증 활성이 더욱 향상될 수 있다.

일 구체예의 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능 식품에서, 법제된 삼백초, 법제된 민들레, 법제된 생강, 법제된 엉겅퀴, 법제된 함초 및 법제된 감초는 예를 들면, 3.4~3.6 : 2.0~2.2 : 1.9~2.1 : 0.8~1.0 : 0.8~1.0 : 0.5~0.7 의 중량비로 포함될 수 있다. 이러한 경우, 전술한 유효성분들의 복합적인 발현에 의한 간 손상 억제 및 간 기능 보호 효과가 더욱 향상될 수 있다.

또한, 일 실시예의 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품은 상기 조성 및 후술하는 법제과정을 통해, 각 식물들을 단일로 사용하거나, 상기 중 1~3 종만을 혼합하여 사용하는 경우에 비하여 각 유효성분들 간의 분자친화성을 이용한 시너지 효과를 발휘할 수 있다. 이러한 경우, 상기 일 실시예의 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 건강기능식품은 상기 조성으로 인한 여러 가지 화합물들의 복합적인 효과에 의해 간 조직 내의 혈중 효소(ALT, AST, ALP, LDH) 수치 및 변성 간세포수, 침윤된 염증세포의 수를 유의하게 감소시키고, 간내 항산화 효소(catalase, SOD, GSH-Px)와 GSH를 유의하게 증가시키며, 염증 관련 cytokines 혈중 수준 및 mRNA 발현 수준을 감소시키는 간 손상 억제 및 간 기능 보호 효과를 구현할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는 물 100 중량부를 기준으로 법제된 생강 2.0 내지 4.0 중량부, 법제된 마카 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 옥수수 1.0 내지 2.0 중량부, 법제된 마테잎 1.0 내지 2.0 중량부 및 법제된 녹차잎 1.0 내지 2.0 중량부를 포함하고, 법제된 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상을 1.0 내지 2.0 중량부로 포함하는 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품에 관한 것이다.

이러한 다른 실시예의 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품은 녹차의 카페인과 폴리페놀류 화합물, 마테의 멜라노이딘 및 폴리페놀류 화합물, 마카의 알칼로이드 및 아미노산 화합물, 옥수수의 피토스테롤, 생강추출물 및 대나무잎 또는 현호색 추출물이 복합적으로 작용하여 종래보다 뛰어난 비만 억제효과를 구현할 수 있다. 특히, 지방의 분해 및 산화를 촉진하고, 지질 흡수 및 당이 지방으로 축정되는 것을 방지하며, 혈중 지질 수준의 감소의 효과가 더욱 향상될 수 있다.

또한, 다른 실시예의 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품은 상기 조성 및 후술하는 법제과정을 통해, 각 식물들을 단일로 사용하거나, 상기 중 1~3 종만을 혼합하여 사용하는 경우에 비하여 각 유효성분들간의 분자친화성을 이용한 시너지 효과를 발휘할 수 있다. 이러한 경우, 상기 비만 억제용 건강기능식품은 상기 조성으로 인한 여러 가지 여러 가지 화합물들의 복합적인 효과에 의해 항비만 및 체지방 축적 억제효과, 체중 감소, 장기 내 체지방 축적 감소, 식이 효율 감소, 혈중 지질(TG, TC, LDL-C, HDL-C) 수준 개선, 혈중 glucose, insulin, adiponectin, leptin수준 개선 체지방 축적 억제와 더불어 지방생성 관련 mRNA 및 단백질 발현 억제 등의 효과가 더욱 향상될 수 있다.

일 구체예의 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품에서, 법제된 생강, 법제된 마카, 법제된 옥수수, 법제된 마테잎 및 법제된 녹차잎; 및 법제된 대나무잎 또는 법제된 현호색 중 하나 이상은 2.5~2.7 : 2.1~2.3 : 1.5~1.6 : 1.3~1.5 : 1.0~1.2 : 1.0~1.2 의 중량비로 포함될 수 있다. 이러한 경우, 전술한 유효성분들의 복합적인 발현에 의한 비만억제 효과가 더욱 향상될 수 있다.

이러한 실시예들의 건강기능식품은 후술하는 태명청 함유 건강기능식품의 제조방법에 따라 제조된다.

일 실시예의 상기 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품은 삼백초, 민들레, 생강, 엉겅퀴, 함초 및 감초를 각각 별도로 법제하는 단계; 가마솥에 물 100 중량부를 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제된 삼백초 3.0 내지 4.0 중량부, 법제된 민들레 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 생강 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 엉겅퀴 0.5 내지 1.0 중량부, 법제된 함초 0.5 내지 1.0 중량부 및 법제된 감초 0.5 내지 1.0 중량부를 투입하고 1차 가열하는 단계; 및 80℃ 내지 100℃에서 2차 가열하는 단계;로 이루어진 방법에 의해 제조될 수 있다.

일 실시예의 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품은 생강, 마카, 옥수수, 마테잎 및 녹차잎과, 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상을 각각 별도로 법제하는 단계; 가마솥에 물 100 중량부를 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제된 생강 2.0 내지 4.0 중량부, 법제된 마카 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 옥수수 1.0 내지 2.0 중량부, 법제된 마테잎 1.0 내지 2.0 중량부 및 법제된 녹차잎 1.0 내지 2.0 중량부를 투입하고, 법제된 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상을 1.0 내지 2.0 중량부로 투입하여 1차 가열하는 단계; 및 80℃ 내지 100℃에서 2차 가열하는 단계;로 이루어진 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 법제하는 단계는 생강, 청주, 솔잎, 민들레, 쑥, 진피, 밤, 막걸리, 부추, 식염, 연잎, 국화, 양파, 무, 아카시아, 냉이, 감잎, 갈대, 도라지, 싸리나무잎, 마늘, 은행잎, 대나무잎, 보리, 사과, 청주 및 된장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 종 이상의 열수 추출물을 이용하여 각 재료를 찌는 1차 법제를 수행한 후, 상기 1차 법제된 각 재료를 청주, 식염, 녹차, 솔잎, 매실, 황설탕, 식초, 막걸리, 탱자, 천연소금, 깨, 갈대, 칡 및 감잎차로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 종 이상을 첨가물을 혼합하여 덖는 2차 법제를 수행하는 방법일 수 있다.

구체적으로, 법제하는 단계는 먼저 법제를 하고자 하는 각 재료에 묻은 불순물을 제거하기 위하여 흐르는 물로 세척하는 재료 세척한다. 재료의 세척 후 물기를 말려 재료를 건조 시킨 후 각각의 재료에 대한 법제를 수행한다.

상기 법제 과정을 통해서 재료의 이롭지 못한 성분, 자극성, 부작용을 없애거나 감소시키고, 재료의 효능을 강화시키거나 변화시키며, 재료를 분말화하기 쉽게 하고, 유효성분의 추출이 잘 되게 된다. 그리고, 보관하는 과정에서 재료가 변질되지 않도록 하고, 혼합되어 있는 불순물 등을 없애고 깨끗하게 하여 효과를 높이며, 사용하는데 편리하게 한다.

이하, 본 명세서에서는 법제를 수행하고자 하는 대상 재료를 단순히 「재료」 또는 「대상 재료」라고 표기한다. 또한, 법제하는 단계에서 사용되는 상기 열수 추출물의 제조 또는 함께 덖기 위해 사용되는 상기 첨가물은 「보조재료」로 표기한다.

상기 법제하는 단계 중 1차 법제는 먼저 가마솥에 물과 조합된 보조재료를 넣고 끓여 보조재료의 열수 추출물을 제조한다. 이 후, 열수 추출물이 끓어 증기가 생성되면 대나무 받침을 가마솥에 넣고 채반을 얹은 후, 채반 위에 대상 재료를 배열하여 3 내지 5분, 예를 들면 4분 동안 찌는 1차 법제 과정을 수행한다.

상기 1차 법제 처리된 대상 재료는 1 시간 내지 3 시간 예를 들면 2 시간 동안 건조를 수행한 후, 2차 법제를 수행할 수 있다.

상기 법제하는 단계 중 2차 법제는 가마솥 뚜껑을 뒤집은 후, 1차 법제 처리된 대상 재료를 덖는 과정을 의미한다. 2차 법제 과정에서는 대상 재료를 덖으면서 보조재료를 함께 뿌려 혼합하는 과정을 수행한다.

본 명세서에서, 재료를 「덖는다」는 의미는 볶아서 익히는 것을 의미할 수 있다. 다만, 덖는 과정은 전통적인 약재 처리 방법 중의 하나로, 열이 재료에 서서히 전달되도록 재료들을 쉼 없이 교반해 주는 과정을 포함하는 의미이다.

상기 법제하는 단계는 찌는 과정인 1차 법제와 덖는 과정인 1차 법제를 1일 1회씩 작업하여 2회 내지 4회 반복 하는 과정인 3차 법제를 추가로 수행할 수 있다.

또한, 상기 3차 법제 후 법제가 완료된 대상 재료를 최종적으로 건조하여 태명청을 포함하는 건강기능성 식품의 제조에 사용할 수 있다.

상기 최종 건조온도는 50℃ 내지 60℃일 수 있다. 상기 범위에서, 법제된 재료들의 추출효율을 더욱 향상시킬 수 있다.

일 구체예에서, 상기 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품은 하기 표 1에 표시되는 보조재료의 조합으로 1차 법제가 수행될 수 있다.

구분	대상 재료	열수 추출에 사용된 보조재료의 조합	1차 법제 수행 시간
1	삼백초	생강, 청주, 황설탕, 식염	3분 ~ 4분
2	민들레	마늘, 국화잎, 식염, 청주, 사과	3분 ~ 4분
3	생강	밤, 막걸리, 부추, 식염, 연잎	3분 ~ 4분
4	엉겅퀴	보리, 생강, 사과, 식염, 국화잎	3분 ~ 4분
5	함초	죽염, 청주, 대잎 쑥	3분 ~ 4분
6	감초	솔잎, 냉이, 감잎, 갈대	3분 ~ 4분

상기 표 1에 나타낸 보조재료와 대상재료의 조합을 이용하여, 1차 법제를 수행하는 경우, 포제학의 숙즉효증의 원리에 의해 각 대상 재료로부터 강한 쓴맛을 내는 성분을 분리하고, 유효성분의 추출율을 더욱 향상시킬 수 있다.

상기 1차 법제에 사용되는 보조 재료의 사용양은 특별히 제한되지는 않으나 예를 들면, 대상재료 100 중량부를 기준으로 50 내지 150 중량부일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청 함유 건강기능식품은 하기 표 2에 표시되는 보조재료의 조합으로 2차 법제가 수행될 수 있다.

구분	대상 재료	2차 법제에 사용된 보조재료의 조합	2차 법제 수행 시간
1	삼백초	청주, 황설탕, 식염	2분 ~ 3분
2	민들레	청주, 식염, 매실, 식초	2분 ~ 3분
3	생강	매실, 황설탕, 식초, 막걸리	2분 ~ 3분
4	엉겅퀴	청주, 매실, 식염, 감잎	2분 ~ 3분
5	함초	청주, 대잎 쑥	2분 ~ 3분
6	감초	청주, 식초, 깨	2분 ~ 3분

상기 표 2에 나타낸 보조재료와 대상재료의 조합을 이용하여, 2차 법제를 수행하는 경우, 포제학의 숙즉효감의 원리에 의해 각 대상 재료로부터 강한 쓴맛을 내는 성분을 열로 변성시키켜 저감하고, 유효성분의 추출율을 더욱 향상시킬 수 있다.

상기 2차 법제에 사용되는 보조 재료의 사용양은 특별히 제한되지는 않으나 예를 들면, 대상재료 100 중량부를 기준으로 10 내지 100 중량부일 수 있다. 이러한 경우, 보조 재료에 의한 향미력 향상 및 효능 향상효과가 더욱 우수하다.

또한, 상기 표 1 및 표 2의 조합에 의해 1차 및 2차 법제가 수행되는 경우, 포제학의 생준숙완의 원리에 의해 각 대상 재료의 유효 성분 중, 보조재료와의 상용성이 우수한 성분들의 추출효율이 향상된다. 이를 통해, 본 발명의 건강기능식품은 추출 성분들의 추출밸런스가 향상되어 성분 조화가 향상될 수 있다. 이러한 경우, 상기 건강기능식품은 향미가 자연스러운 전통식품의 기호를 만족할 수 있으며, 쓴맛, 떫은맛 등을 저감할 수 있다. 또한, 대상재료의 추출 성분들과 보조재료의 추출성분들 간의 염농도, 분자친화성 등에 의해 유효성분의 추출률을 더욱 향상시킬 수 있다.

일 구체예에서, 상기 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품은 하기 표 3에 표시되는 보조재료의 조합으로 1차 법제가 수행될 수 있다.

구분	대상 재료	열수 추출에 사용된 보조재료의 조합	1차 법제 수행 시간
1	생강	밤, 막걸리, 부추, 식염, 연잎	3분 ~ 4분
2	마카	뽕잎, 생강, 청주, 식초	3분 ~ 4분
3	옥수수	청주, 감잎, 솔잎, 생강	3분 ~ 4분
4	마테잎	감잎,, 삼백초, 막걸리, 청주	3분 ~ 4분
5 (1)	대나무잎	청주, 생강, 식염, 대추	3분 ~ 4분
5 (2)	현호색	뽕잎, 생강, 막걸리, 식초	3분 ~ 4분
6	녹차잎	정향, 뽕잎, 청주, 생강	3분 ~ 4분

상기 표 3에 나타낸 보조재료와 대상재료의 조합을 이용하여, 1차 법제를 수행하는 경우, 포제학의 숙즉효증의 원리에 의해 각 대상 재료로부터 강한 쓴맛을 내는 성분을 분리하고, 유효성분의 추출률을 더욱 향상시킬 수 있다.

상기 1차 법제에 사용되는 보조 재료의 사용양은 특별히 제한되지는 않으나 예를 들면, 대상재료 100 중량부를 기준으로 50 내지 150 중량부일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품은 하기 표 4에 표시되는 보조재료의 조합으로 2차 법제가 수행될 수 있다.

구분	대상 재료	2차 법제에 사용된 보조재료의 조합	2차 법제 수행 시간
1	생강	매실, 황설탕, 식초, 막걸리	2분 ~ 3분
2	마카	청주, 황설탕, 식초	2분 ~ 3분
3	옥수수	막걸리, 청주, 식초	2분 ~ 3분
4	마테잎	청주 식염, 황설탕	2분 ~ 3분
5 (1)	대나무잎	청주, 생강, 식염, 대추	2분 ~ 3분
5 (2)	현호색	청주, 생강, 식초	2분 ~ 3분
6	녹차잎	청주, 매실, 식염	2분 ~ 3분

상기 표 4에 나타낸 보조재료와 대상재료의 조합을 이용하여, 2차 법제를 수행하는 경우, 포제학의 숙즉효감의 원리에 의해 각 대상 재료로부터 강한 쓴맛을 내는 성분을 열로 변성시키켜 저감하고, 유효성분의 추출률을 더욱 향상시킬 수 있다.

상기 2차 법제에 사용되는 보조 재료의 사용양은 특별히 제한되지는 않으나 예를 들면, 대상재료 100 중량부를 기준으로 10 내지 100 중량부일 수 있다. 이러한 경우, 보조 재료에 의한 향미력 향상 및 효능 향상효과가 더욱 우수하다.

또한 전술한 표 3 및 표 4의 조합에 의해 1차 및 2차 법제가 수행되는 경우, 포제학의 생준숙완의 원리에 의해 대상 재료의 유효 성분 중, 보조재료와의 상용성이 우수한 성분들의 추출효율이 향상된다. 이를 통해, 본 발명의 건강기능식품은 추출 성분들의 추출밸런스가 향상되어 성분 조화가 향상될 수 있다. 이러한 경우, 상기 건강기능식품은 향미가 자연스러운 전통식품의 기호를 만족할 수 있으며, 쓴맛, 떫은맛 등을 저감할 수 있다. 또한, 대상재료의 추출 성분들과 보조재료의 추출성분들 간의 염농도, 분자친화성 등에 의해 유효성분의 추출률을 더욱 향상시킬 수 있다.

본 발명의 실시예들은 전술한 보조재료의 조합을 이용한 법제를 수행한 재료들을 본 명세서에 기재된 특정의 조성 및 비율로 사용함으로써, 간 손상 억제 및 간 기능 보호의 효과, 비만 억제의 효과가 있는 태명청을 포함하는 건강기능식품을 제조할 수 있다.

특히, 전술한 구체예들에 보조재료의 조합을 이용하여 법제를 수행할 경우, 법제 대상 성분들의 약용성분의 추출률을 높이는 동시에 강한 쓴맛을 효과적으로 저감할 수 있다. 또한, 동시에 향미력을 높여 한국 전통 식품으로서의 기호도를 향상시킬 수 있다.

본 발명에서는 약식동원(藥食同源)이라는 동양전통 의학의 사상과 이론에 근거하여 식품이 가지고 있는 영양적인 특징과, 한약재의 기능적 특징을 조화시키고, 질병을 예방하는 샘플을 만들고자 하였다.

식품조성물의 각 재료는 법제, 음양오행, 고문서, 민간의학 등을 참고하여 전통적인 방법으로 구성하였다.

삼백초는 해열, 이뇨, 거담, 건위, 소종 등의 효능을 가지고 있다. 또한, 소변이 잘 나오지 않는 증세, 수종, 각기, 임질, 위장병, 간염, 황달 등을 해소하는 효능이 있고, 간질환을 예방하는 효과가 있다. 민들레는 해열, 정혈, 건위, 발한, 이뇨, 소염 등의 효능이 있고 담즙의 분비를 촉진한다. 또한, 감기로 인한 열, 기관지염, 늑막염, 간염, 담낭염, 소화불량, 변비, 유방염 등을 해소하는 효능이 있다. 엉겅퀴는 해열, 지혈, 소종 등의 효능을 가지고 있다. 또한, 감기, 백일해, 고혈압, 장염, 신장염, 토혈, 혈뇨, 혈변, 산후에 출혈이 멎지 않는 증세, 대하증 등을 해소하는 효능이 있다. 생강은 항히스타민 작용, 진정, 진통, 위 운동억제,　프로스타글란딘　생합성 저해작용(6-gingerol), 진해 등의 효능이 있다. 함초는 고혈압, 당뇨에 효능이 있고, 위장 기능을 활성화시킬 수 있다. 감초는 해독작용,　간염,　두드러기,　피부염,　습진　등에 효과가 있다. 또한, 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염작용이 있으며 소화성궤양을 억제하는 효과가 있다.

종래의 삼백초, 민들레 또는 엉컹퀴를 포함하는 식품은 특유의 쓴맛이 강해 기호 및 선호도를 높이기 어려웠다. 그러나, 본 발명의 실시예들은 전술한 방법으로 법제를 수행하고, 삼백초, 민들레, 생강, 엉겅퀴, 함초 및 감초를 특정의 비율로 조합하여 사용함으로써, 각각의 효능을 증대시키는 동시에 향미를 증진하여 기호도를 높일 수 있다.

마카는 칼슘, 아연, 철분, 아르기닌의 함량이 우수하고, 모발성장, 골다공증, 불명 등에 효능이 있다. 옥수수는 부종제거, 장운동 향상, 피부건조예방 등에 효과가 있다. 마테잎은 비타민 및 철분, 칼슘, 마그네슘 등의 미네랄의 함량이 매우 높고, 식욕을 억제하는 효능이 있다. 대나무잎은 맛은 달고 싱거우며 성질은 차고 독이 없다. 심, 폐, 담, 위경에 작용한다. 열을 내리고 번조(煩躁)를 제거하며 진액을 생성하고 이뇨하는 효능이 있다. 현호색은 어혈을 제거하고, 혈액순환을 향상시키며, 통증 완화의 효능이 있다. 녹차는 콜레스테롤 및 혈당을 낮추는 효과가 있다.

종래의 대나무잎 또는 현호색, 마카, 생강을 포함하는 식품은 특유의 향이 강해 기호 및 선호도를 높이기 어려웠다. 그러나, 본 발명의 실시예들은 전술한 방법으로 법제를 수행하고, 생강, 마카, 옥수수, 마테잎, 대나무잎 또는 현호색, 및 녹차잎을 특정의 비율로 조합하여 사용함으로써, 각각의 효능을 증대시키는 동시에 상기 조합에 의해 향미를 증진하여 기호도를 높일 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예들에 따른 태명청을 함유하는 건강기능식품은 전술한 제조방법으로 제조된 상태 그대로 식품으로 적용할 수 있으며, 이외에도 동결건조한 분말의 형태, 상기 분말을 용해시켜 제조한 음료의 형태 등으로 적용할 수도 있다.

실시예 1

삼백초(Saururus chinensis), 민들레(Taraxacum officinale), 생강(Zingiber officinale), 엉겅퀴(Cirsium setidens), 함초(Salicornia herbacea) 및 감초(Glycyrrhizae)를 각각 별도로 1차 법제 처리 및 2차 법제 처리하였다. 각 대상 재료의 법제 방법은 상기 표 1 및 표 2에 따라 실시하였으며, 전체 법제 처리는 총 3회 반복하였다.

가마솥에 물 1,000g을 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제된 삼백초 34.6g, 법제된 민들레 21.0g, 법제된 생강 20.4g, 법제된 엉겅퀴 9g, 법제된 함초 9g 및 법제된 감초 6g을 넣어 1차 가열 단계를 수행하였다. 상기 1차 가열 단계는 3시간 동안 강한 불(약 130 ~250℃)에서 수행하였다.

1차 가열 단계 후, 가열온도를 낮추어(약 80~100℃) 가열하는 2차 가열 단계를 1시간 30분 동안 수행하여 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청을 포함하는 건강기능식품을 제조하였다.

실시예 2

생강(Zingiber officinale), 마카(Lepidium meyenii), 옥수수(Zea mays), 마테잎(Ilex paraguayensis leaf), 현호색(Corydalis turtschaninovii var. linearis) 및 녹차잎(Camellia sinensis leaf)을 각각 별도로 1차 법제 처리 및 2차 법제 처리하였다. 각 대상 재료의 법제 방법은 상기 표 3 및 표 4에 따라 실시하였으며, 전체 법제 처리는 총 3회 반복하였다.

가마솥에 물 1,000g을 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제된 생강 26.8g, 법제된 마카 21.5g, 법제된 옥수수 15.5g, 법제된 마테잎 14.3g, 법제된 현호색 11.0g, 및 법제된 녹차잎 10.9g을 넣어 1차 가열 단계를 수행하였다. 가열시간은 3시간, 가열은 강한 불(약 130 ~250℃)에서 수행하였다.

1차 가열 단계 후, 가열온도를 낮추어(약 80~100 ℃) 가열하는 2차 가열 단계를 1시간 30분 동안 수행하여 비만 억제용 태명청 함유 건강기능식품을 제조하였다.

비교예 1

가마솥에 물 1,000g을 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제하지 않은 삼백초(Saururus chinensis) 34.6g, 민들레(Taraxacum officinale) 21.0g 및 엉겅퀴(Cirsium setidens) 9g을 넣고, 강한 불(약 200℃)에서 1시간 동안 가열하여 추출물을 제조하였다.

비교예 2

가마솥에 물 1,000g을 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제하지 않은 마카(Lepidium meyenii) 21.5g, 현호색(Corydalis turtschaninovii var. linearis) 11.1g을 넣고, 강한 불(약 200℃)에서 1시간 동안 가열하여 추출물을 제조하였다.

<<효능 평가>>

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 태명청 함유 건강기능식품을 영하 80℃에서 동결 건조한 후, 분말화하여 동결건조분말을 제조하였다.

상기에서 제조된 동결건조분말을 실험에 필요한 농도로 D.D.W에 용해시켜 실험예에 사용하기 위한 시료를 제조한 후, 각각의 효능평가 실험을 수행하였다.

<실시예 1의 태명청을 포함하는 건강기능식품의 효능 평가A>

실험예 A1. In vitro 실험에 의한 항암 효능 평가(MTT assay)

실시예 1의 동결건조분말을 각각 0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L 농도의 시료로 제조하였다.

인체 간 정상세포와 대사가 유사한 인체간암세포인 HepG2 cell을 10% FBS(fetal bovine serum), 100 unit/ml penicillin streptomycin가 함유된 DMEM medium을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 4~5일 만에 PBS으로 세척한 후 0.05% trypsin-EDTA로 부착된 세포를 분리하여 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양 시 각각의 passage number를 기록하여 passage 2-8회의 세포를 사용하였다.

배양된 HepG2 세포를 96well plate에 각 well 당 1.0×10⁴cells/ml이 되도록 100 ul씩 분주하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 새 배지와 미리 제조한 0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L 농도의 시료를 혼합하여 첨가하여 동일한 조건에서 48시간 배양하였다. 48시간 후 시료를 제거한 다음 PBS에 5mg/ml의 농도로 제조한 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)용액과 배지를 혼합하여 4시간 추가 배양 하였다. 배양 후 생성된 formazan 결정을 DMSO에 녹여 ELISA reader(model 680, Bio-Rad, Tokyo, Japan)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정값을 하기 식 1을 통해 MTT가 환원되어 formazan crystal로 침전되는 정도로 산출하여 세포가 사멸 또는 증식 억제 되는 정도를 확인하였다. 결과는 도 1에 그래프로 나타내었다.

[식 1]

Cytotoxicity (%)=[1-(Sample absorbance/Control absorbance)]×100

인체간암세포 HepG2 cell에 실시예 1의 시료를 처리한 결과, 0.5 mg/ml 농도의 시료는 21.3%, 1 mg/ml 농도의 시료는 23.1%, 2 mg/ml 농도의 시료는 34.7%의 성장 저해 효과를 나타내었다. 이를 통해, 실시예 1의 건강기능식품이 인체간암세포에 대한 invitro 성장 저해 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 A2 ~A7. 동물 실험에 의한 간 손상 억제 및 간 기능 보호 효능 평가

(1) 실험동물의 준비

평균 체중 25±2g의 6주령 ICR계 수컷 흰쥐로 사육기간 중 온도는 22±2℃, 상대습도 55±5%, 조명시간은 12시간을 동물 사육 실험실에서 사육하였다. 1주일간 고형배합사료(SAM ＃3, ㈜ 샘타코)를 사용하여 적응시킨 후 실험하였고 기간 동안 사료 및 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다.

상기의 실험 동물을 꼬리 표시법으로 10마리씩을 한 군으로 정하여, 하기와 같이 6 군으로 분류하였다.

가. 정상군(Nor): Acetaminophen(APAP) 간 손상을 유발시키지 않음

나. 음성대조군(Con): Acetaminophen(APAP) 간 손상을 유발시킨 후, 아무 시료도 처리하지 않음.

다. 저농도 투여군(T-L): Acetaminophen(APAP) 간 손상을 유발시킨 후, 실시예 1의 태명청을 100mg/kg의 농도로 포함하는 시료를 투여함.

라. 중농도 투여군(T-M): Acetaminophen(APAP) 간 손상을 유발시킨 후, 실시예 1의 태명청을 250mg/kg의 농도로 포함하는 시료를 투여함.

마. 고농도 투여군(T-H): Acetaminophen(APAP) 간 손상을 유발시킨 후, 실시예 1의 태명청을 500mg/kg의 농도로 포함하는 시료를 투여함.

바. 양성대조군(S): Acetaminophen(APAP) 간 손상을 유발 후, Silymarin 100mg/kg 을 투여함.

상기에서, 시료 조제는 매일 경구투여 직전에 체중을 측정하여 체중 당 시료투여농도를 산출하여 각시료를 D.D.W에 용해시켜 1일 1회 200ul씩 14일간 같은 시간에 경구 투여 하였다.

(2) Acetaminophen(APAP)에 의한 간 손상 유발

Acetaminophen(APAP)는 최종 단계에서, 경구투여하여 실험동물의 급성 간 손상을 유발하였다. Poulsen 등의 방법에 따라 12시간 동안 절식시킨 후 acetaminophen 800mg/kg를 1% Tween 80에 현탁하여 복강 주사하여 간 손상을 유발하였다.

(3) 실험을 위한 혈장 및 장기의 분리

실험동물에 Acetaminophen으로 간 손상을 유발하고, 16시간 후에 부검을 실시하였다. 실험동물을 가볍게 마취한 후 개복하여 복부 대동맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액은 tube에 수집한 후 3000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈청을 얻은 후 -70℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 채혈 직후 간, 비장, 고환, 신장을 떼어 생리식염수로 겉에 묻은 혈액과 조직 등을 제거하고 흡습지에 수분을 제거하여 무게를 측정한 후 병리학적 결과를 검사할 조직은 10% 중성 포르말린 용액(NBF: natural buffered formalin, pH7.4)에 고정시키고 다른 것은 -70℃에 보관하여 실험에 사용하였다.

실험예 A2. 혈청에서 간 기능 관련 지표 측정

분리한 혈청은 ASAN의 체외 측정용 시액 kit (AM 157SK, Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)를 이용하여 간 기능 관련 지표인 alanine aminotransferase(ALT)활성, aspartate aminotransferase(AST)활성, alkaline phosphatase(ALP) 함량, Total Cholesterol (TC)함량, Total Triglyceride(TG) 함량을 측정하였다. 또한, LDH Cytotoxicity assay kit(No. 10008882, Cayman, USA)를 이용하여 lactate dehydrogenase(LDH) 함량을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.

	정상군	음성대조군	저농도 투여군	중농도 투여군	고농도 투여군
AST 활성	66.9±5.8 Karmen/ml	158.1±9.6 Karmen/ml	136.7±9.1 Karmen/ml	119.3±5.3 Karmen/ml	100.4±6.2 Karmen/ml
ALT 활성	57.5±4.0 Karmen/ml	137.2±8.5 Karmen/ml	97.1±4.8 Karmen/ml	83.5±7.0 Karmen/ml	79.6±3.6 Karmen/ml
ALP 함량	9.1±0.5 K-A	15.1±1.0 K-A	13.4±0.6 K-A	11.8±1.0 K-A	10.6±0.4 K-A
LDH 활성	910.6±21.1 IU/L	1615.4±36.6 IU/L	1547.4±132.3 IU/L	1363.2±83.6 IU/L	1321.7±89.3 IU/L
TG 함량	62.5±2.2 mg/dl	152.1±3.5 mg/dl	130.2±3.5 mg/dl	129.1±3.5 mg/dl	102.3±3.5 mg/dl
TC 함량	86.7±3.4 mg/dl	57.7±3.9 mg/dl	69.4±3.9 mg/dl	75.1±3.9 mg/dl	82.5±3.9 mg/dl

상기 표 5에서 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 태명청 함유 건강기능식품을 투여한 각 저농도, 중농도, 고농도 투여군은 음성 대조군에 비하여 alanine aminotransferase(ALT) 활성, aspartate aminotransferase(AST) 활성이 낮아, 간 세포의 괴사와 간 조직의 파괴를 방지하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한, alkaline phosphatase(ALP) 함량, Total Triglyceride(TG) 함량이 낮아 간 손상에 의한 지질대사 이상을 방지하는 효과가 있음을 알 수 있었으며, Total Cholesterol (TC)함량이 높아 간 손상을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한, lactate dehydrogenase(LDH) 함량이 낮아, 간세포의 변성 및 괴사를 방지하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 A3. 혈청에서 염증전구사이토카인의 측정(Serum pro-inflammatory cytokines)

효소 면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA MAX Deluxe Sets, Biolegend, San Diego, CA, USA)을 이용하여 혈청 내 target cytokines인 IL-6, TNF-α을 정량하였다. 96-wells plate에 각 cytokines의 capture antibody를 coating buffer에 희석하여 100ul 분주하고 4℃에서 20시간 방치하였다. 그리고 plate를 세척용 완충액(PBS+ 0.05% tween20, pH 7.4)을 이용하여 4번 세척한 후 1×assay diluent A 200ul을 분주하고 실온에서 1시간 동안 shaking하며 방치하였다. 이를 세척용 완충액으로 4회 세척하고 각 well에 dilute standards와 시료 100ul를 분주하고, 실온에서 2시간 shaking하면서 방치하였다. 세척용 완충액으로 4번 세척하고 detection antibody를 100ul을 분주한 후 실온에서 1시간 shaking하면서 방치하였다. 이를 세척용 완충액으로 4번 세척하고 avidin-horse-radish peroxidase용액을 100ul 가하고 실온에서 30분 shaking하면서 방치하였다. 세척용 완충액으로 5번 세척하고 TMB substrate solution이 포함된 용액을 100ul을 가하여 실온에서 15분 방치한 후 2N H2SO4 100ul으로 반응을 정지시켰다. OD값은 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 통해 IL-6 및 TNF-α측정하여 표 6에 나타내었다.

	정상군	음성대조군	저농도 투여군	중농도 투여군	고농도 투여군
IL-6	198.6±10.0 pg/mL	743.0±15.9 pg/mL	696.3±33.3 pg/mL	629.5±18.3 pg/mL	567.8±15.3 pg/mL
TNF-α	250.5±17.4 pg/mL	703.2±20.1 pg/mL	699.1.2±20.1 pg/mL	523.2±20.1 pg/mL	475.2±21.1 pg/mL

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 태명청 함유 건강기능식품을 투여한 투여군은 음성대조군에 비하여 IL-6 및 TNF-α낮음을 알 수 있었다. 이에 따라, 실시예 1에 따른 태명청 함유 건강기능식품이 간 손상 및 간 내 염증 세포 침윤을 방지하고, IL-6의 발생을 낮추어 염증 반응을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 1에 따른 태명청 함유 건강기능식품이 TNF-α에 의한 조직의 손상 및 상피세포의 사멸을 방지하고, 점막층의 파괴를 방지하여 염증 반응을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 A4. 체중 및 장기무게 변화

실험동물 각 군의 체중, 간 무게 및 간의 무게를 체중으로 나누어 계산한 상대적 간 무게를 측정하여 하기 표 7에 나타내었다.

	체중(g)	간 무게(g)	상대적 간 무게(g/100g)
정상군	32 ±1.2	1.3 ±0.03	4.1 ±0.02
음성대조군	31.8 ±1.4	1.8 ±0.13	5.6 ±0.05
저농도 투여군	32 ±1.0	1.6 ±0.10	4.9 ±0.004
중농도 투여군	32.5 ±1.6	1.5 ±0.06	4.5 ±0.003
고농도 투여군	33.4 ±1.0	1.4 ±0.05	4.1 ±0.003
양성대조군	31.6 ±0.9	1.4 ±0.04	4.3 ±0.002

상기 표 7과 같이, 3주의 사육기간 중 군간의 통계적인 체중차이는 나타나지 않음을 통해 본 실험에 사용된 acetaminophen이나 시료는 동물의 정상적인 체중증가에 지장을 주지 않는 농도임을 알 수 있었다. 부검시점에서 체중은 각 군당 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 간의 무게는 acetaminophen 투여 군에서 유의하게 증가되었다. 간의 무게를 체중으로 나누어 계산한 상대적 간 무게 역시 acetaminophen 투여에 의하여 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다. 또한, 이를 통해 본 발명 실시예 1의 시료는 간 손상에 의한 간 무게 증가를 방지할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 A5. 간 조직 효소 활성 측정

실험동물로부터 적출한 간을 조직 2g당 4배량의 0.1M phosphate buffer(pH 7.4)를 가하고 beed로 마쇄하였다. 이 마쇄액을 homoganate 분획으로 하였으며, 이 분획을 3000rpm에서 10분간 원심 분리하여 핵 및 미 마쇄 부분을 제거한 상층액을 다시 13000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 침전물을 mitochondira 분획으로 사용하였다. 이러한 분획에 대하여, 하기의 방법으로, 효소 활성을 측정하여 결과를 표 8에 나타내었다.

가. Catalase: Aebi(Aebi H. 1974. Catalase. In method of enzymatic analysis. Academic press. 2: 673-684.)의 방법에 준하여 Catalase assay kit(No. 707002, Cayman, USA)를 사용하여 측정하였다.

나. Superoxide Dismutase(SOD): Oberley와 Oyanagui의 방법(Oberley LW, Spitz PR. 1984. Methods in Enzymology. Acad. Press. 105: 457-464. Oyanagui Y. 1984. Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase acticity. Anal. Biochem. 42: 290-296)으로 적용한 Superoxide Dismutase assay kit (No. 706002, Cayman, USA)를 사용하여 측정하였다.

다. Glutathione Peroxidase(GSH-Px): Paglia와 Lawrence의 방법(Paglia DE, Valentine WN. 1967. Studies on quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. Lab. Clin. Med. 70: 158. Larwrence RA, Burk BF. 1976. Glutathione peroxidase activity in selenium-dificient rat liver. Biochem. Biophysi. Res. Comm. 71: 952)에 준하여 Glutathione Peroxidase assay kit(No. 703102, Cayman, USA)를 사용하여 측정하였다.

라. Glutathione(GSH): 간 조직 중 glutathione 함량 측정은 Higach의 방법(Higach T. 1988. Critical review on the determination of glutathione in biological perparation. Protein, Nucleic Acid and Enzyme. 33: 1370)을 적용한 Glutathione assay kit(No. 703002, Cayman, USA)를 사용하여 측정하였다.

	정상군	음성대조군	저농도 투여군	중농도 투여군	고농도 투여군
Catalase 활성	6.2±1.5 U/mg protein	2.8±0.7 U/mg protein	2.9±0.6 U/mg protein	4.2±0.8 U/mg protein	4.7±0.8 U/mg protein
SOD 활성	2.2±0.2 U/mg protein	1.1±0.2 U/mg protein	1.4±0.5 U/mg protein	1.6±0.7 U/mg protein	2.1±0.3 U/mg protein
GSH-Px 활성	8.6±1.5 U/mg protein	1.7±0.4 U/mg protein	3.4±0.5 U/mg protein	6.2±0.4 U/mg protein	6.9±0.5 U/mg protein
GSH 활성	18.9±0.3 umol/g tissue	9.1±0.3 umol/g tissue	11.7±0.7 umol/g tissue	14.7±0.3 umol/g tissue	16.7.7±0.4 umol/g tissue

상기 표 8에서 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 태명청 함유 건강기능식품을 투여한 투여군은 음성대조군에 비하여 Catalase 활성, SOD 활성, GSH-Px 활성, GSH 활성이 우수함을 알 수 있었다. 이에 따라, 실시예 1에 따른 태명청 함유 건강기능식품이 산화적 간 세포 손상을 방지하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 A6. 간 조직의 병리학적 관찰

적출된 간의 동일한 엽에서 일정 부분을 잘라 10% 중성 포르말린 용액(NBF: natural buffered formalin, pH7.4)에 1주 동안 침적, 고정한 후 수세하고, 농도가 높은 ethanol로 탈수 하고 xylene으로 투명한 시킨 후 파라핀으로 포매하였다. 이를 5 ㎛의 두께로 절단하여 조직표본을 만들어 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 한 후 Canada balsam으로 봉입 한 뒤 광학현미경으로 200배에서 관찰하여 평가하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.

간손상이 유발된 Con군의 경우 간세포의 공포화, 염증세포 침윤, 지방변성 등 같은 소엽중심성 괴사를 관찰할 수 있었다. 반면 본 발명 실시예 1의 태명청 투여군의 병리사진을 살펴보면, 태명청 고농도군과 태명청 중농도군은 염증이나 괴사가 거의 관찰되지 않아 Nor군과 양성대조물질인 Silymarin군에 가까운 보호효과를 나타냈다. 이를 통해, 실시예 1의 시료의 투여 농도가 상승할수록 간 보호 효과가 상승하는 경향이 있음을 확인하였다.

실험예 A7. 간 조직 내 유전자 발현 분석

실험동물의 간 조직을 각 군별로 선별하여 trizol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA를 spectrophotometer (Shimadzu UV-2401PC, Kyoto, Japan)를 이용하여 정량한 후 oligo dT primer (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2㎍의 RNA에서 mRNA에 상보적인 cDNA로 역전사 시켰다. 이 cDNA를 template로 사용하여 COX-2, iNOS, TNF-α IL-1β, IL-6 유전자를 PCR 방법으로 특정 유전자 부위를 증폭하였다. 이 때, internal control로 housekeeping 유전자인 GAPDH를 사용하였다. 각 PCR 산물들을 2% agarose gel (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 염색한 후 UV로 관찰하였다.

음성대조군에서는 염증인자 모두의 발현이 크게 증가하였으나, 실시예 1의 시료를 처리한 투여군에서는 투여농도에 따라서 다른 발현양상을 나타내었다. 특히, 고농도 투여군은 Con군보다 TNF-α IL-1β, IL-6, COX-2, iNOS의 발현이 각 84%, 89%, 85%, 88%, 87%를 감소됨을 관찰 할 수 있었다.

이를 통해, 실시예 1의 시료가 항염증 작용 가지는 동시에 우수한 간 손상 보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

상기의 효능 평가를 통해, 실시예 1에서 제조한 태명청 함유 건강기능식품의 간 손상 억제 및 간 기능 보호 효과를 확인하였다. 실시예 1의 간 손상 억제 및 간 기능 보호용 태명청을 포함하는 건강기능식품을 100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg 농도로 ICR 마우스에 2주간 투여하고 고농도 acetaminophen을 복강 주사하여 급성 간 손상을 유도하여 간 손상 억제 및 간 기능 보호 효과를 검토한 결과, 유의적으로 간 조직 무게가 감소하였고, 아세트아미노펜에 의해 증가된 혈중 효소(ALT, AST, ALP, LDH) 수치 및 변성 간세포수, 침윤된 염증세포의 수를 유의하게 감소시켰으며, 간 내 항산화 효소(catalase, SOD, GSH-Px)와 GSH를 유의하게 증가시켰고, 또한 염증 관련 cytokines 혈중 수준 및 mRNA 발현 수준을 감소시켰다. 또한, 투여 농도가 상승할수록 보호 효과가 점차 증가하여 특히 500 mg/kg 농도로 투여할 경우 간 손상 치료약제인 silymarin과 유사한 수준의 보호효과를 나타낼 수 있었다.

이러한 효과를 통해, 본 발명의 실시예 1에 따른 건강기능식품의 함유되어 있는 여러 가지 화합물들의 복합적인 효과에 의해 간 손상으로 인한 염증에 억제효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

<실시예 2의 태명청을 포함하는 건강기능식품의 효능 평가 B>

실험예 B1. In vitro 항비만 효능 평가

실시예 1의 동결건조분말을 각각 0.25 mg/L, 0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L 농도의 시료로 제조하였다.

전구지방세포인 3T3-L1 preadipocyte를 10% BCS와 1%(v/v) penicillin-streptomycin을 함유한 high-glucose DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator 에서 배양하였다. 2일마다 배양액을 교환하였고 세포가 80% 이상 부착(confluent stage)하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척한 후, 0.25% trypsin-EDTA를 첨가한 다음 배양기에서 3분간 방치하여 세포를 분리하였다. 그 후 원심분리기(Lager capacity Union 32R, (주)한일과학산업, 강릉, Korea)를 사용하여 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 하여 세포를 모았다. 3T3-L1 preadipocyte를 6well plate에 1.5ml씩 균등하게 분주하여 100% confluency 2일 후, 10% FBS와1%(v/v) penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM에 분화유도 호르몬인 IBMX(0.5 mM), dexamethasone (1.25μM) 그리고 insulin(4mg/mL)을 혼합하여 분화 유도를 시작하였다. 분화유도 3일 후, feeding medium을 insulin(4mg/mL)이 포함된 DMEM으로 교환하였고, 이후에는 2일 간격으로 10% FBS를 첨가한 DMEM으로 교환하여 배양하였다.

(1) MTT assay

3T3-L1 지방전구세포를 96well plate에 각 well 당 1.0×10⁴cells/ml이 되도록 분주하여 지방세포로 분화시켰다. 분화 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 새 배지와 시료를 혼합하여 첨가하여 동일한 조건에서 48시간 배양하였다. 48시간 후 시료를 제거한 다음 PBS에 5mg/ml의 농도로 제조한 MTT용액과 FM배지를 혼합하여 4시간 추가배양 하였다. 배양 후 생성된 formazan 결정을 DMSO에 녹여 ELISA reader로 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정값을 통해 하기 식 1을 통해 MTT가 환원되어 formazan crystal로 침전되는 정도를 산출하여 세포가 사멸 또는 증식 억제 되는 정도를 확인하였다. 결과는 도 3에 그래프로 나타내었다.

[식 1]

Cytotoxicity (%)=[1-(Sample absorbance/Control absorbance)]×100

(2) Oil red O 염색

세포 배양액을 버리고 PBS로 3회 세척하고 10% formaldehyde를 500ul씩 각 well에 넣고 4℃에서 4시간동안 고정시켰다. 그 후에 formaldehyde를 버리고 PBS로 세 번 씻은 후 Oil red O 염색약(Oil red O(Sigma, St. Louis, MO, USA) 0.25g을 isopropyl alcohol 50ml에 녹인 용액을 증류수와 3:2의 비율로 섞은 후 0.45uM filter로 여과한 용액)을 500ul씩 넣고 다시 상온에서 1시간 동안 염색한 후 PBS로 3번 씻어내었다. 염색이 된 세포는 현미경(CK2, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 지방에 염색된 염색시약을 isopropyl alcohol로 30분간 탈염을 실시하고 염색약을 회수해 540nm에서 OD값을 측정하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

실시예 2의 시료를 0.10. 0.25, 0.5, 1, 2mg/ml 의 농도로 3T3-L1 cell에 처리했을 때 지방세포의 크기와 수는 농도가 높을수록 대조군에 비해 감소함을 관찰할 수 있었으며 OD값도 농도 증가에 따라 대조군에 비해 감소함을 관찰할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명 실시예 2의 시료는 지방세포 내의 지방축적 억제 효능을 가짐을 알 수 있었다.

(3) Glycerol 정량

샘플을 feeding medium에 녹여서 0.2uM의 filter로 여과한 후 완전히 분화된 지방세포에 처리하였다. 시료처리 후 24시간이 지난 후 배지를 collect하였고 glycerol 분석을 하였다.

Glycerol 정량은 효소 반응법을 이용하여 free glycerol reagent(Sigma)를 반응시켜 측정하였다. 37℃로 pre-warmed된 free glycerol reagent 1ml에 collect한 배지 10ul를 넣어 37℃의 water bath에서 5분간 incubation시켰다. Glycerol의 정량을 위해서는 standard glycerol (Sigma) 12.5ug, 25ug을 위와 동일한 방법으로 반응시켰다. 이 모든 과정을 진행시킨 후 96well에 200ul씩 옮겨서 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.

실시예 2의 시료를 각각 0.10. 0.25, 0.5, 1, 2mg/ml의 농도로 처리하였을 때, 대조군에 비하여 각각 약 1.1배, 1.5배, 3.5배, 4.8배, 4.9배가 증가하였다. 이를 통해, 실시예 2의 시료가 지방세포 내의 중성지방 분해 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 B2 ~B7. 동물 실험에 의한 항비만 효능 평가

(1) 실험동물의 준비

평균 체중 18±2g의 4주령 웅성 C57BL/6J mouse로 사육기간 중 온도는 22±2℃, 상대습도 55±5%, 조명시간은 12시간을 동물 사육 실험실에서 사육하였다. 1주일간 고형배합사료(SAM ＃3, ㈜ 샘타코)를 사용하여 적응시킨 후 실험하였고 기간 동안 사료 및 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다.

(2) 저지방식이 및 고지방식이의 공급(비만유도)

상기의 실험 동물을 꼬리 표시법으로 10마리씩을 한 군으로 정하여, 하기와 같이 5 군으로 분류하였다.

가. 정상식이군(Nor / LFD)

나. 고지방식이군(Con / HFD)

다. 저농도 투여군(HFD+T-L): 비만 유도 후, 실시예 2의 태명청을 100mg/kg의 농도로 포함하는 시료를 투여함.

라. 중농도 투여군(HFD+T-M): 비만 유도 후, 실시예 2의 태명청을 250mg/kg의 농도로 포함하는 시료를 투여함.

마. 고농도 투여군(HFD+T-H): 비만 유도 후, 실시예 2의 태명청을 500mg/kg의 농도로 포함하는 시료를 투여함.

상기에서, 정상식이군은 10% 저지방식이를 공급하였고, 나머지는 45% 고지방식이를 공급하여 5주간 비만 유도하였다. 6주부터 10주까지는 실시예 2에 따른 시료의 비만 억제 효과를 확인하기 위해 45% 고지방식이를 공급하면서 실시예 2의 시료를 경구투여 하였다. 사료의 조성은 하기 표 9에 표시하였다.

시료 조제는 매일 경구투여 직전에 체중을 측정하여 체중 당 시료투여농도를 산출하여 실시예 2에서 제조된 동결건조분말을 D.D.W에 용해시켜 1일 1회 200ul씩 5주간 같은 시간에 경구 투여 하였다.

식이 조성 성분	(10/Fat)	(45/Fat)
Casein	210	245
L-Cystine	3	3.5
Corn Starch	280	85
Maltodextrin	50	115
Sucrose	325	200
Lard	20	195
Soybean Oil	20	30
Cellulose	37.15	58
Mineral Mix, AIN-93G-MX (94046)	35	43
Calcium Phosphate, dibasic	2	3.4
Vitamin Mix, AIN-93-VX (94047)	15	19
Choline Bitartrate	2.75	3
Food Color	0.1	0.1

실험예 B2. 체중 및 식이섭취 측정

실험동물의 체중은 1주에 한번씩 측정하여 체중의 증가를 확인하였고 희생 전에 최종 무게를 측정하였다. 주 2회 각 군별 사료섭취량을 측정하였다. 체중측정 예정일 전일 오후 3시 전후에 급여량을 측정한 후 체중측정 당일 오후 3시 전후에 체중측정과 함께 사료잔량을 측정하여 개체 별 사료섭취량을 계산한 결과를 도 6에 그래프로 나타내었다.

사료 효율(FER: The feed efficiency ratio)은 하기 식 2에 따라 실험 기간에 증가한 체중 증가량을 같은 기간 동안에 섭취한 식이량으로 나누어 산출하였다.

[식 2]

FER=(body weight change(g)/food intake(g))×100

비만이 유도된 마우스에 5주 동안 실시예 2의 시료의 투여농도에 따라, 저농도, 중농도, 고농도 군에서 각 6.9±0.3 g, 6.5±0.3 g, 5.9±0.2 g의 체중이 증가해 10.5±0.1 g의 체중 증가를 보인 고지방식이군보다 유의하게 적은 체중 증가를 나타내었다. 이에 따라, 실시예 2의 시료가 투여농도의 상승에 따라 체중증가 억제의 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한, 식이 효율은 고지방식이군에 비하여 실시예 2의 시료의 투여농도에 따라, 저농도, 중농도, 고농도 군의 투여군에서 식이 효율이 각 63%, 60%, 52%를 감소되었다. 이에 따라, 실시예 2의 시료가 투여농도의 상승에 따라 식이 효율 저하의 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 B3. 장기 무게 및 지방조직 무게의 변화

최종경구 투여한 후에 해부하기 직전에 체중을 측정하고 절식 없이 부검을 실시하였다. 실험동물을 가볍게 마취한 후 개복하여 복부 대동맥으로부터 채혈하였다. 채취한 혈액은 tube에 수집한 후 3000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 혈청을 얻은 후 -70℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 채혈 직후 간, 비장, 고환, 신장, 심장, 고환지방, 신장지방을 떼어 생리식염수로 겉에 묻은 혈액과 조직 등을 제거하고 흡습지에 수분을 제거하여 무게를 측정한 후 병리학적 결과를 검사할 조직은 10% 중성 포르말린 용액(NBF: natural buffered formalin, pH7.4)에 고정시키고 다른 것은 -70℃에 보관하여 실험에 사용하였다.

해부한 후에 각 군의 장기 무게 및 지방 조직 무게를 비교하였다. 신장, 비장, 심장 무게는 유의성 차이 없는 반면에 간 조직의 무게는 고지방식이군(1.9±0.3 g)은 정상식이군(1.2±0.1 g)에 비하여 유의하게 증가하였으며, 실시예 2에 따른 시료를 저농도, 중농도, 고농도로 투여한 군에서 간 무게는 각 1.8±0.3 g, 1.4±0.1 g, 1.3±0.1 g으로 고지방식이군보다 유의하게 적었다. 이를 통해, 실시예 2의 시료가 간 조직에서 지방이 축적되는 것을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

부고환 지방조직의 무게는 고지방식이군(2.6±0.3 g)에 비하여 실시예 2에 따른 시료를 저농도, 중농도, 고농도로 투여한 군에서 각 2.2±0.3 g, 1.7±0.4 g, 1.3±0.1 g으로 감소하였다. 이를 통해, 실시예 2의 시료가 부고환 등과 같은 내부 장기 조직에서 지방이 축적되는 것을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 B4. 혈청 분석

(1) 콜레스테롤의 측정

총콜레스테롤(total cholesterol), HDL-cholesterol 농도를 아산제약(Asan pharm, Seoul, Korea) 상업용 kit을 이용하여 측정하였다. 혈액 내의 leptin, adiponectin, insulin, LDL-cholesterol 농도는 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용한 효소면역측정법으로 정량하였다. 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

	정상식이군	고지방식이군	저농도 투여군	중농도 투여군	고농도 투여군
총콜레스테롤 (total cholesterol)	127.4±5.1 mg/dl	202.8±9.7 mg/dl	186.5±5.3 mg/dl	164.5±5.9 mg/dl	152.9±4.4 mg/dl
HDL-cholesterol	101.5±4.6 mg/dl	72.3±3.6 mg/dl	89.2±3.9 mg/dl	92.5±4.4 mg/dl	95.2±4.9 mg/dl
LDL-cholesterol	35.6±3.8 mg/dl	95.1±5.0 mg/dl	58.4±4.8 mg/dl	56.2±4.9 mg/dl	47.3±4.8 mg/dl

상기 표 10에서 나타난 바와 같이, 실시예 2에 따른 태명청 함유 건강기능식품을 투여한 투여군은 고지방식이군에 대하여 총 콜레스테롤의 저하, HDL-cholesterol의 증가 및 LDL-cholesterol의 저하 효과가 있음을 알 수 있었다.

(2) Serum glucose 및 insulin 수준 측정

비만에서 당대사의 이상을 검사하기 위해 혈중 glucose, insulin 수준을 측정하였다. 고지방식이의 섭취로 인해 혈중 glucose 수준이 상승한 반면에 농도별 태명청의 투여에 따라, 혈중 glucose 수준이 감소하였다. 특히 고농도 투여군에서 391.5±6.5 mg/dl로 가장 낮았다.

또한 고지방식이의 섭취에 따라 혈중 insulin 수준 증가하였다. 혈중의 insulin 증가는 지방세포에서 간으로의 유리지방산 이동을 증가시켜 지방합성을 촉진시키는 반면, 지방산화는 억제시킨다. 고지방식이군의 혈청 insulin 농도는 38.6±0.9 mg/dl로 정상식이군 30.1±1.3 mg/dl에 비하여 유의적으로 증가하였으나, 태명청 투여군, 특히 태명청 고농도군에서 31.2±1.0 mg/dl로 고지방식이군보다 유의하게 감소시켰다(p<0.05).

이를 통해 실시예 2의 태명청을 포함하는 시료는 혈중 glucose와 insulin 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

(3) Serum adiponectin 및 leptin 수준 측정

혈중 adiponectin 수준은 고지방식이군(2.3±0.2 ng/ml)은 정상식이군(2.9±0.1 ng/ml)보다 유의하게 감소되었고, 태명청 투여군인 저농도 투여군, 중농도 투여군, 고농도 투여군에서는 각 2.6±0.1 ng/ml, 2.8±0.1 ng/ml, 2.8±0.1 ng/ml로 고지방식이군보다 유의하게 증가되었다(p<0.05).

고지방식이를 섭취한 마우스의 혈중 leptin 농도(10.6±1.1 ng/ml)는 정상식이군(3.9±0.7 ng/ml)보다 높았고, 태명청 투여군, 특히 태명청 고농도군(6.8±0.5 ng/ml)에서는 고지방식이군에 비해 유의하게 낮아졌다(p<0.05).

실험예 B5. 간 및 지방 조직의 조직학적 변화 관찰

적출된 간과 고환 지방을 일정 부분을 잘라 10% 중성 포르말린 용액(NBF: natural buffered formalin, pH7.4)에 1주 동안 침적, 고정한 후 수세하고, 농도가 높은 ethanol로 탈수 하고 xylene으로 투명한 시킨 후 파라핀으로 포매하였다. 이를 5 ?의 두께로 절단하여 조직표본을 만들어 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 한 후 Canada balsam으로 봉입 한 뒤 광학현미경으로 200배에서 관찰하여 평가하였다. 간과 지방조직의 H&E staining 결과를 도 7 및 도 8에 제시하였다. 간 조직의 경우(도 7), 고지방식이 섭취에 따른 간세포 내 지방 축적이 뚜렷이 나타나 비정상적인 형태를 나타내었다. 이에 반하여 태명청 투여군에서는 지방공포의 수와 크기가 감소하여 지방침착이 억제되었다. 위의 결과는 간 조지 무게의 측정 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 부고환 지방 조직의 경우(도 8), 고지방식이군이 정상식이군에 비해 지방세포의 크기가 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 이는 실시예 2의 태명청 투여군에서 감소하였다. 이 결과는 부고환 지방 조직 무게 측정 결과와 일치하였다.

이를 통해, 실시예 2의 태명청을 함유하는 시료가 간 및 지방조직 내 지방 축적을 억제시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 B6. 간 및 지방 조직 내 유전자 발현 분석

실험동물의 간 및 지방 조직을 각 군별로 선별하여 PBS로 세척한 후 trizol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 total RNA를 spectrophotometer (Shimadzu UV-2401PC, Kyoto, Japan)를 이용하여 정량한 후 oligo dT primer (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 ㎍의 RNA에서 mRNA에 상보적인 cDNA로 역전사 시켰다. 이 cDNA를 template로 사용하여 SREBP-1c, PPAR-γ, C/EBPα, FAS와 CPT-1 유전자를 polymerase chain reaction (PCR)의 방법으로 특정 유전자 부위를 증폭하였다. 이 때 internal control로 housekeeping 유전자인 GAPDH를 사용하였다. 각 PCR 산물들을 2% agarose gel (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 염색한 후 UV로 관찰하였다.

고지방식이군의 간과 지방조직에서 PPAR-γ, C/EBPα, SREBP-1c 및 FAS의 발현은 증가한 반면에 실시예 2의 시료 투여군에서는 감소하였다. 태명청 처리했을 때 농도 의존적으로 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있었고 특히 실시예 2를 고농도로 투여한 군은 가장 현저하게 감소하였다. 이는 앞에서 관찰된 간 및 지방 조직 무게와 지방 세포의 크기 감소가 지방생성 유전자의 발현과 크게 연관되어 있음을 나타내고 있다.

이를 통해, 고지방식이군의 간조직에서 CPT-1의 발현은 감소한 반면에 실시예 2의 시료를 투여한 모든 투여군에서는 증가하였다. 특히, 실시예 2의 고농도 투여군은 가장 현저하게 증가하였다.

실험예 B7. 간 조직 내 단백질 발현 분석

간 조직을 일정량 채취하여 lysis buffer를 넣고 균질화 하여 13000 pm에서 4℃, 10분간 원심분리 하였다. 단백질 농도는 Bradford법을 이용하여 정량하였다. 추출한 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동 한 뒤 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 5% skim mik로 blocking한 뒤 PBS-T로 1분간 2번, 5분간 3번 washing하였다. membrane를 1차 항체에 반응시킨 다음 horseradish peroxidase linked 2차 항체에 노출시켰다. 항체에 결합된 단백질의 signal은 ECL(Intron, Seongnam, Korea)을 사용하여 현상하였다. 항체 SREBP-1c, PPAR-γ, C/EBPα, β-actin은 Santa Cruz 제품(Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였다.

이를 통해, 고지방식이군의 간 조직에서 PPAR-γ, SREBP-1c의 단백질 발현은 증가한 반면에 실시예 2에 따른 시료의 투여군에서는 감소함을 알 수 있었다. 또한, 실시예 2의 시료를 처리했을 때 농도 의존적으로 발현량이 감소되는 것을 확인할 수 있었고 고농도 투여군에서는 지방생성이 가장 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다.

상기와 같은 효능 평가를 통해, 실시예 2에서 제조한 태명청 함유 건강기능식품의 항비만 및 체지방 축적억제에 효과를 확인하였다. 특히, 고지방식이에 의해 유도된 비만 마우스에서 실시예 2의 비만 억제용 태명청을 포함하는 건강기능식품을 100 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg 농도로 5주간 투여한 결과, 유의적으로 체중 감소, 장기 무게 감소, 식이 효율 감소, 혈중 지질(TG, TC, LDL-C, HDL-C) 수준 개선, 혈중 glucose, insulin, adiponectin, leptin수준 개선 체지방 축적 억제와 더불어 지방생성 관련 mRNA 및 단백질 발현 억제 등에 긍정적 영향을 미치는 것으로 나타났다. 투여 농도가 상승할수록 비만 억제 효과가 점차 증가하여 특히 고농도 투여군에서 비만 억제 효과가 가장 뚜렷하게 나타났다.

<관능 평가>

실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 2에서 제조된 건강기능식품에 대하여 하기의 방법으로 관능평가를 실시하였다.

관능 평가는 나이가 30 대 내지 50 대에 속하는 성인 남녀 25명을 대상으로, 실험의 취지를 설명하고, 하기의 기준에 따른 5점 척도법으로 평가한 후 평균적인 값을 하기 표 11에 나타내었다.

1) 쓴맛의 평가

5: 쓴맛 또는 떫은 맛이 매우 약하게 느껴지거나 전혀 느껴지지 않는다.

4: 쓴맛 또는 떫은 맛이 약하게 느껴진다.

3: 쓴맛 및 떫은 맛이 보통의 정도로 느껴진다.

2: 쓴맛이 강하게 느껴지나 떫은 맛은 느껴지지 않는다.

1: 쓴맛 및 떫은 맛이 매우 강하게 느껴진다.

2) 향미에 대한 기호도 평가

5: 시식에 대한 거부감이 전혀 없고, 향미가 매우 우수하다.

4: 시식에 대한 거부감이 전혀 없고, 향미가 우수하다.

3: 시식에 대한 거부감이 전혀 없고, 향미가 보통이다.

2: 시식에 대한 거부감이 약간 들지만, 시식이 가능하다.

1: 시식에 대한 거부감이 매우 든다.

	실시예 1	실시예 2	비교예 1	비교예 2
쓴맛	3.84	3.96	1.68	2.08
향미에 대한 기호도	3.44	3.76	2.04	2.48

Claims (6)

1. 생강, 마카, 옥수수, 마테잎 및 녹차잎; 및 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상;을 포함하는 대상재료를 각각 별도로 법제하는 단계;
   가마솥에 물 100 중량부를 넣은 후 끓이고, 이 끓인 물에 법제된 생강 2.0 내지 4.0 중량부, 법제된 마카 1.5 내지 2.5 중량부, 법제된 옥수수 1.0 내지 2.0 중량부, 법제된 마테잎 1.0 내지 2.0 중량부, 법제된 녹차잎 1.0 내지 2.0 중량부를 투입하고, 법제된 대나무잎 또는 현호색 중 하나 이상을 1.0 내지 2.0 중량부를 투입하여, 130℃ 내지 250℃에서 3 시간 동안 1차 가열하는 단계; 및
   상기 1차 가열하는 단계 이후 80℃ 내지 100℃에서 1시간 30분 동안 2차 가열하는 단계;로 이루어진 것을 특징으로 하고,
   상기 법제하는 단계는 상기 각 대상재료를 제1차 법제용 보조재료의 열수추출물 증기로 3분 내지 4분 동안 쪄서 1차 법제하고, 1시간 내지 3시간 동안 건조 후, 2분 내지 3분 간 덖으면서 제2차 법제용 보조재료를 함께 뿌려 혼합하는 제2차 법제 및 상기 제1차 법제와 제2차 법제를 3회 반복하는 제3차 법제를 포함하고,
   상기 대상재료 중 생강의 제1차 법제용 보조재료는 밤, 막걸리, 부추, 식염 및 연잎이고, 제2차 법제용 보조재료는 매실, 황설탕, 식초 및 막걸리이며,
   상기 대상재료 중 마카의 제1차 법제용 보조재료는 뽕잎, 생강, 청주 및 식초이고, 제2차 법제용 보조재료는 청주, 황설탕 및 식초이며,
   상기 대상재료 중 옥수수의 제1차 법제용 보조재료는 청주, 감잎, 솔잎 및 생강이고, 제2차 법제용 보조재료는 막걸리, 청주 및 식초이며,
   상기 대상재료 중 마테잎의 제1차 법제용 보조재료는 감잎, 삼백초, 막걸리 및 청주이고, 제2차 법제용 보조재료는 청주, 식염 및 황설탕이며,
   상기 대상재료 중 녹차잎의 제1차 법제용 보조재료는 정향, 뽕잎, 청주 및 생강이고, 제2차 법제용 보조재료는 청주, 매실 및 식염이며,
   상기 대상재료 중 대나무잎의 제1차 법제용 보조재료는 청주, 생강, 식염 및 대추이고, 제2차 법제용 보조재료는 청주, 생강, 식염 및 대추이며,
   상기 대상재료 중 현호색의 제1차 법제용 보조재료는 뽕잎, 생강, 막걸리 및 식초이고, 제2차 법제용 보조재료는 청주, 생강 및 식초인 것을 포함하는
   지방세포의 크기 및 수 감소를 위한 비만 억제용 건강기능식품의 제조방법.
   
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