KR101587923B1 - Ｔｄｐ―４３ 관련 질환 진단 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TDP-43 발현 관련 질환의 진단을 위한 신규 펩타이드의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 페이지 디스플레이 기법을 통해 TDP-43 단백질을 고감도로 인지하는 특정 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

ＴＤＰ―４３ 관련 질환 진단 마커{A Marker for Diagnosis related to TDP 43}

본 발명은 TDP-43 발현 관련 질환의 진단을 위한 신규 펩타이드의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 페이지 디스플레이 기법을 통해 TDP-43 단백질을 고감도로 인지하는 특정 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

전 세계적으로 고령화 시대에 접어들면서 해마다 퇴행성 신경질환자 및 노인성 질환자가 늘어나고 있다. 우리나라의 경우 생활수준의 향상으로 건강한 노후의 삶과 고품질의 의료 서비스에 대한 욕구가 증가하고 있으나 타 선진국에 비해 치매를 비롯한 퇴행성 신경질환 관련 환자에 대한 국가적 지원이 아직 미약한 수준이다. 치매와 퇴행성 신경질환 조기진단을 통한 치료 및 예방은 국가 의료비의 전체 비용을 감소시킬 수 있을 것으로 기대된다.

현재 퇴행성 신경질환의 대부분은 발병원인을 비롯한 명확한 진단법이나 치료법이 명시되지 않아 원인 규명 및 조기 진단법에 대한 과학적 기술 개발이 시급하다. 따라서 병의 임상 증상이 나타나지 않는 Pre-Symptomatic 단계부터 극미량의 바이오마커도 검역할 수 있는 초민감도의 진단법을 사용한다면 조기 진단과 질병 예방이 가능할 것이다.

그 중에서도, 루게릭병 또는 근위축측상경화증이라고 부르는 ALS는 알츠하이머 병, 파킨슨 병과 함께 3대 신경계 퇴행성 질환 중 하나로 병 발생 후 급속히 진행하여 전신 마비 및 호흡마비로 고생하다가 비교적 짧은 기간(3-7년)에 사망하는 난치성 희귀질환이다. 이 병의 유병기간이 짧은데다가, 증상 발생 후 진단까지 1년 이상이 소요되므로 진단의 지연성 문제가 발생한다. 이처럼 임상 경과 후 단기간 내에 사망하는 루게릭병은 환자 개개인의 임상자료를 짧은 연구 기간 동안 후향적으로 정확히 분석할 수 없는 특수 질환이다.

전측두엽성 치매는 전측두엽 퇴행증으로 인해 전두엽과 측두엽의 위축이 두드러져 사망에 이르게 되는 퇴행성 뇌질환으로 언어와 수행기능이 손상되고 판단력 장애와 사회적으로 부적절한 행동이나 감정을 표출하는 증상이 나타난다. 일반적인 치매와는 달리 전측두엽성 치매는 기억력은 보존된다는 특징이 있으며 평균 생존기간이 6-8년으로 짧은 편이다.

현재 루게릭병이나 전측두엽성 치매를 명확히 진단하거나 치료할 수 있는 방법은 없다. 그러나 국내와 국외 연구자들이 이 두 질환의 대표적 질병지표물질인 TDP-43 단백질에 대한 연구의 중요성을 부각하고 진행함에 따라 두 질환의 진단 및 치료의 가능성이 제안되어지고 있다.

최근 여러 연구자들이 루게릭병과 전측두엽성 치매 환자에서 TARDBP의 유전자 변이를 분리하고 이 환자들에게서 TDP-43 단백질이 생산되는 것을 확인하였다.이러한 TDP-43 병리의 발견은 루게릭병과 전측두엽성 치매에 대한 새로운 분석을 가능하게 하였고, TDP-43에 기반을 둔 질병지표물질의 도입은 루게릭병과 전측두엽성 치매 진단에 획기적인 계기를 제공함과 더불어 임상시험 개발에도 도움이 될 것이다.

현재 치매를 포함한 여러 질병에 사용되는 조기 진단 기술은 혈액과 뇌척수액에서 특정 질병을 나타내는 성분을 측정하는 방법이다. 진단 기술의 대부분은 위의 PCR 방법 외에 면역분석(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA)을 토대로 하며, 환자의 혈액이나 뇌척수액에서 질병 유발 성분을 인지하는 항체와 같은 생물학적 성분들에 의존하여 분석이 이루어진다. ELISA 기술은 특정 단백질에 대한 특이적 결합을 하는 항체를 인식용 질병지표물질로 사용하여 혈액, 소변 등의 검체로부터 진단 대상체를 분리하고 이를 효소 결합 항체를 이용한 반응(ECL)으로 많은 수의 검체를 처리할 수 있으며 항체가 갖는 특이적 결합으로 시료 전처리 과정이 없는 장점이 있다. 그러나 ELISA의 경우 PCR 진단법에 비해 비교적 낮은 수준의 민감도를 가지므로 이를 극복하기 위한 많은 연구가 진행 중이다.

아직까지도 TDP-43 단백질의 X-ray나 NMR 데이터, 그리고 확증된 TDP-43 binding DNA 서열이 규명되지 않아서 진단이나 치료 분야의 발전이 저조한 상태다. 또한 2012년 현재 미국 FDA가 승인한 소수의 인지기능 개선제는 Donepezil과 Galantamin과 같이 오랜 기간 연구된 알츠하이머병에 대한 약물들이고 전측두엽성 치매에 대한 이 약물들의 효과는 불명확하다.

특히 최근 국외 연구 결과에 따르면, 뇌척수액 (Cerebrospinal Fluid; CSF) 내 TDP-43의 증가가 루게릭병과 전측두엽성 치매 조기 진단 척도 중 하나로 제시된 진단법은 환자에게서 추출한 뇌척수액 속 TDP-43을 항원-항체 시스템을 기반으로 한 ELISA로 검출하고, 이로써 병의 진행 정도의 파악과 검출한계를 구하는 것이다.

그러나 이 시스템은 항체가 하나의 진단 대상체에만 결합한다는 문제점이 있어서 이를 개선하기 위해 하나의 진단 대상체의 여러 부위에 동시에 결합할 수 있는 다중 인식 신규 펩타이드 고분자를 이용한 획기적인 기술이 필요하다. 즉, 보다 나은 루게릭병이나 전측두엽성 치매 진단 및 치료법을 구사하기 위해 적합한 ALS/FTLD 질병지표물질인 TDP-43의 탐침자가 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 현재 루게릭병이나 전측두엽성 치매 진단을 위하여 사용되는 TDP-43 마커를 효과적으로 인지할 수 있는 저분자 진단탐침으로서 새로운 펩타이드를 동정했으며, 이를 TDP-43 탐지물질로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 TDP-43 탐지 기능을 가지는 특정 펩타이드 서열에 관한 것으로,

본 발명의 목적은 서열 번호 1 내지 13 중 어느 하나 이상의 서열을 함유하는, TDP-43 발현 관련 질환의 진단을 위한 마커용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 서열 번호 1 내지 13으로 표시되는 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 이용한 TDP-43 발현 관련 질환 진단 용도를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서열들을 이용하여 TDP-43 발현 관련 질환의 치료기능을 가지는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 일 구체예로서, TDP-43와 특이적으로 결합하는 서열 번호 1 내지 13 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 함유하는, TDP-43 관련 질환의 진단을 위한 마커용 조성물을 제공한다. 이 때, 바람직하게는 서열번호 7 및 10인 서열을 사용한다.

TDP-43 발현 관련 질환은 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS) 또는 전측두엽성 치매 (Frontotemporal Lobar Dementia; FTLD)를 대표적인 예로 들 수 있다.

특히, 상기 조성물은 다중인식 펩타이드 고분자 사슬인 PDL(poly-D-lysine)-SPDP[N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate]를 추가로 함유하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 다른 구체예로서, TDP-43와 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드들로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, TDP-43 발현 관련 질환 진단용 조성물을 제공한다.

이 때도 역시, 상기 펩타이드는 서열번호 7, 서열번호 10, 또는 서열번호 7 및 10의 조합으로 사용되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는, 상기 펩타이드가 다중인식 펩타이드 고분자 사슬(Polyvalent-directed Peptide Polymer; PDPP)과 결합되어 있는 것을 사용한다. 이러한 다중인식 펩타이드 고분자 사슬은 PDL(poly-D-lysine)-SPDP[N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate]으로 구성되어 있는 것을 사용할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 일 례로서, 상기 조성물은 서열번호 7의 펩타이드-PDL-SPDP, 서열번호 10의 펩타이드-PDL-SPDP, 또는 서열번호 7, 10의 펩타이드-PDL-SPDP의 형태를 구성할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 TDP-43 발현 관련 질환 진단용 키트를 제공할 수 있는데, 예를 들어, RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트 등의 형태로 이용할 수 있다.

또 다른 구체예로써, 본 발명은 다음을 포함하는 TDP-43 발현 관련 질환에 관한 정보의 제공 방법을 제공할 수 있다.

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터, TDP-43과 결합하는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 펩타이드의 발현 수준을 정상 대조구 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계.

또한, 다음 단계를 포함하는 TDP-43 발현 관련 질환 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

(a) 후보 물질의 존재하에, TDP-43과 결합하는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드를 발현시키는 단계; 및

(b) 후보물질이 없이 TDP-43과 결합하는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드를 발현시킨 경우에 비하여, 상기 펩타이드의 발현이 억제되는 경우의 후보물질을 TDP-43 발현 관련 질환 치료용 물질로 선택하는 단계.

상기 방법들에 있어서, 바람직하게는 서열번호 7 또는 10의 펩타이드를 이용하거나 서열번호 7 및 10 펩타이드를 조합하여 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 다중인식 펩타이드 고분자 사슬인 PDL(poly-D-lysine)-SPDP[N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate]을 결합시켜 사용할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 TDP-43 발현 관련 질환, 바람직하게는 루게릭병이나 전측두엽성 치매 진단을 위해, 상기 TDP-43를 탐지하는 신규 펩타이드 및 이의 다양한 용도를 제공한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 TDP-43 단백질을 효과적으로 인지하는 특정 펩타이드의 신규 기능에 관한 것으로, 루게릭병이나 전측두엽성 치매와 같은 TDP-43 발현 관련 질환에 대하여, 현행 항체를 기반으로 하는 진단법을 대체할 수 있는 차세대 퇴행성 신경질환의 효과적인 진단 및 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

특히, 항체 중심의 진단법을 대체할 본 발명의 다중 인식 신규 펩타이드 고분자를 이용한 차세대 기술은 극미량의 질병 지표물질 검출에 따른 질병의 조기 진단 가능성을 제시할 수 있다. TDP-43과 같이 아직은 많은 정보가 밝혀지지 않은 뇌척수액이나 혈청 속 극미량의 질병지표물질을 신규한 펩타이드가 연결된 고분자를 활용하여 단백질 미스폴딩 응집과 응집체 이상의 생체 분석의 가능성 또한 제시할 수 있다.

그러므로, 민감도와 특이성을 극대화시킨 본 발명의 펩타이드를 이용한 진단은 신경 질환을 조기에 모니터링하여 치료적 접근의 다양화 및 질병 발생을 예방하거나 전파를 제어할 수 있는 시스템을 구축할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 TDP-43 단백질과 결합하는 페이지 펩타이드를 스크리닝하기 위한 M13 페이지 스크리닝의 계획을 나타낸 모식도이다.
도 2는 형광이 합성된 단일 펩타이드 (TDPRP1-FITC와 TDPRP2-FITC ), 각각의 단일 펩타이드가 연결된 고분자 사슬 (TDPRP1-PDPP와 TDPRP2-PDPP), 그리고 두 펩타이드 (TDPRP1과 TDPRP2) 각각을 같은 농도로 고분자 사슬에 합성한 혼합 펩타이드 고분자(TDPRP1,2-PDPP)와 TDP-43과의 결합력 비교 분석 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 급성 심근경색 발병 여부를 확인하는 것이다. 그 중에서도 특히 급성 ST분절 상승 심근경색증 발병 여부에 유용하다.

"진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)" 란 급성 심근경색 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 허혈 질환을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, TDP-43 관련 질환 진단 마커는 TDP-43와 특이적으로 결합하는 서열 번호 1 내지 13 중 어느 하나 이상의 펩타이드 서열 및 이의 유전자들이다.

"상향조절"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 활성화된 세포에서 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다.

"코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다.

"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.

" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 퇴행성 신경질환인 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS)과 전측두엽성 치매 (Frontotemporal Lobar Dementia; FTLD)의 대표적 바이오마커인 비정상 TAR DNA binding protein-43(TDP-43)의 효과적이고 정확한 진단 방법을 제시한다.

TDP-43은 루게릭병(ALS) 또는 전측두엽성 치매 등이 있는 환자에서 상향조절되어 발현되는 것을 특징으로 하는데, 현존하는 TDP-43 연구동향은 항체를 기반으로 하는 진단법이었다. 항체를 이용한 시스템들은 모두 항체의 물리, 화학적 구조에 의한 크기적 제한으로 인하여 결합수가 제한될 뿐만 아니라, 여러 가지의 화학적 반응 하에서 구조변성으로 인한 불안정성을 보인다는 큰 단점이 있다. 특히 초기에는 극미량으로 발견되는 혈액이나 뇌척수액의 TDP-43을 검출하기에는 항체의 크기가 너무 크므로 질병의 조기 진단이 어려웠다. 이와 같이 기존 진단 방법이 갖는 한계인 상대적으로 많은 시료량과 긴 측정시간, 그리고 항체를 이용한 시스템의 문제점과 같은 단점을 극복하기 위해, 항체를 대체할 수 있는 안정적인 진단용 탐침자가 필요하였다.

이에, 본 발명자들은 기존의 항체 인식 방식에서 벗어나 페이지 디스플레이 (Phage Display) 기법을 통한 항체보다 면역원이 낮고, 생체 내(in vivo)에서 더 안정적이며, 합성비용이 적게 드는 펩타이드를 스크리닝하였다.

본 발명은 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝을 실시하여 TDP-43에 결합하는 펩타이드, 특히, 이하의 서열번호 1 내지 13의 펩타이드를 선별 후 이들의 결합지역 및 결합력을 분석하여 TDP-43 탐침으로서의 수행력을 확인하며, 이때 파지는 통상적으로 입수가능한 phage λ나 M13 등의 박테리오파지를 사용할 수 있으며, 이중에서 M13을 사용하는 것이 보다 바람직하다

서열번호 1 : LMNPNNHPRTPA

서열번호 2 : PHHHLQLALPSP

서열번호 3 : ILMSKHKHHIHR

서열번호 4 : PVGRWWTRIKQP

서열번호 5 : RPRLPLTHSDQT

서열번호 6 : NYSHLRVKLPTP

서열번호 7 : IRNPNNHPRTPA

서열번호 8 : QADPPRYYPHDI

서열번호 9 : HKLATSPWWPPI

서열번호 10 : WPHNWWPHCKVK

서열번호 11 : FSQGSTFINPLQ

서열번호 12 : WPHNGWPHLNLK

서열번호 13 : RPHNWWPHFKVK

본 발명에서 진단하고자 하는 질병은 TDP-43가 바이오 마커로서 기능할 수 있는 질환이다.

예를 들어, 퇴행성 신경질환인 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS)과 전측두엽성 치매 (Frontotemporal Lobar Dementia; FTLD) 등을 포함한다.

TDP-43 단백질은 유비퀴틴 양성 봉입체가 43kDa의 분자량을 갖는 단백질로써 유전자 발현 조절에서 다양한 역할을 수행한다. 병적 TDP-43 단백질의 특성 중 하나는 과인산화(hyperphosphorylation)인데, 이 과인산화로 인한 병적 TDP-43은 정상적인 TDP-43에 비해 용해도가 낮아 불용성으로 인해 응집체로 존재한다. 병적 TDP-43은 활성을 갖는 생쥐, zebrafish 모델에서 운동장애와 운동신경세포의 구조 이상을 일으키며, TARDBP 돌연변이를 적용한 트랜스제닉 (transgenic) 동물 모델에서도 선택적 신경세포의 변성을 유발하여 루게릭병 혹은 전측두엽성 치매와 유사한 신경변성을 일으킨다.

본 발명의 서열번호 1 내지 13의 펩타이드들은 효과적인 TDP-43의 탐침들로서, TDP-43 관련 질환의 진단의 요구에 매우 적합하므로, 기존의 항원-항체 반응을 이용한 진단 마커와는 차별화된, 극미량의 질병 지표물질 TDP-43 검출에 따른 관련 질환의 조기 진단 마커로서 매우 유용하다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 TDP-43와 특이적으로 결합하는 서열 번호 1 내지 13 중 어느 하나 이상의 펩타이드 서열을 함유하는, TDP-43 발현 관련 질환의 진단을 위한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 구체예로서, 상기 펩타이드를 함유하는 TDP-43 인지를 위한 마커용 조성물 및 이의 이용방법을 들 수 있다.

특히, 상기 마커 서열들을 TDP-43 탐침으로 이용함에 있어서, 개별적인 서열들이 TDP-43을 인지하여 결합함을 확인하는 것도 무방하지만, 바람직하게는 상기 서열들 중 서열번호 7 또는 10의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 7 및 10 서열의 조합으로 측정할 수 있다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 TDP-43 발현 관련 질환 진단 마커는, 예를 들어, 루게릭병(ALS)과 전측두엽성 치매의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 증가하는 TDP-43 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

동일한 관점에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, TDP-43 발현 관련 질환 진단용 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 서열들 중 서열번호 7 또는 10의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 7 및 10 서열의 조합으로 측정할 수 있다.

생물학적 시료 중의 상기 펩타이드들의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.

“생물학적 시료”란 급성 심근경색 발병에 의해 급성 심근경색 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는 조직,세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

“mRNA 발현수준 측정”이란 생물학적 시료에서 상기 TDP-43 마커와 결합하는 펩타이드 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

이에, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, 서열 번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 펩타이드 서열의 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 TDP-43 발현 관련 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 상기 프라이머는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있고, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소,형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

또한, “단백질 발현수준 측정”이란 생물학적 시료에서 TDP-43와 특이적으로 결합하는 펩타이드 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.

이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 이 때, 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 단백질 양 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

“항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 마커 펩타이드가 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 펩타이드 서열의 발현 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 TDP-43 관련 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

이처럼, 본 발명에서는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 펩타이드를 이용하여 TDP-43를 효과적으로 인지함으로써, 루게릭병이나 전측두엽성 치매의 진단이 가능하다. 앞서 언급한 바와 같이, 특히, 서열번호 7 및/또는 10의 펩타이드를 이용하는 것이 가장 바람직하다.

한편, 본 발명은 상기 펩타이드 탐침자의 민감도를 극대화시키는 방법 및 조성물도 포함한다.

펩타이드의 경우 항체에 비해 크기도 작고 합성의 용이성과 같은 많은 장점이 있지만, 목표 단백질과의 결합력이 그에 비해 낮다는 단점이 있다. 이 단점을 보완하기 위해, 본 발명은 생체 고분자 형태인 poly-peptide chain을 기본으로 한 다중 인식 펩타이드 고분자 사슬(Polyvalent-directed Peptide Polymer; PDPP)을 제작하여 이를 본 발명의 펩타이드 마커와 결합시켜 사용할 수 있다.

예를 들어, 상기 고분자 사슬을 만들기 위해 체내 L-입체이성질체와 차이를 둔 PDL(poly-D-lysine)을 사용하고, 이에 서로 다른 작용기를 가지는(heterobifunctional) SPDP (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)를 연결시킨다. 상기 SPDP의 한 쪽에 위치한 N-hydroxysuccinimide ester과 PDL의 아미노기의 치환반응으로 인해 PDL-SPDP를 연결시키고, SPDP의 다른 한 쪽에 위치한 2-pyridyl disulfide와 펩타이드 서열의 칼복시말단 부근에 첨가된 시스테인의 설프히드릴기(sulfhydryl group)의 치환 반응에 의해 가교결합(cross-linking)이 일어나, 고분자 백본에 본 발명의 펩타이드가 연결되는 형태, 즉 PDL-SPDP-펩타이드 형태를 이용할 수 있다. 상기 조성물에 검출 표지자 등을 선택적으로 함유시킬 수 있다.

이러한 고분자 사슬을 결합시키는 구성을 통해, TDP-43와 본 발명의 펩타이드 간의 결합력을 현저히 상승시킬 수 있다. 즉, 탐침자의 민감성 및 효율성를 극대화시킬 수 있는 것이다.

[진단키트]

유사한 관점에서 본 발명은 TDP-43 관련 질환, 예를 들어 루게릭병이나 전측두엽성 치매의 진단용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 펩타이드의 발현을 분석하여 루게릭병이나 전측두엽성 치매의 유무를 판단하는데 쓰이는데, 이는 크게 두 가지 방법으로 실시할 수 있다: 유전적 분석(genetic analysis) 및 면역분석(immunoassay).

이를 위해, 상기 키트는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열의 유전자 중 선택되는 1종 이상의 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 혹은 프로브; 또는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열에 의한 단백질들 중 선택되는 1종 이상단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

즉, 본 발명의 TDP-43 관련 질환 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 그리고, 본 발명의 TDP-43 관련 질환 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 TDP-43 관련 질환 진단용 조성물을 포함하는 TDP-43 관련 질환 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 펩타이드 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트들은 당업계의 통상적인 지식을 이용하여 다중 인식 펩타이드 고분자 사슬(Polyvalent-directed Peptide Polymer; PDPP), 예를 들어 PDL-SPDP-펩타이드 구성에 의한 검출이 가능하도록 변형이 가능하다.

[진단방법]

본 발명은 일 관점에서, 이러한 발견에 기초하여 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열의 유전자 중 선택되는 1종 이상의 펩타이드 발현수준을 측정하는 것을 포함하는 TDP-43 관련 질환, 예를 들어 루게릭병이나 전측두엽성 치매 진단 방법 또는 이을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

일 구체예로서,

환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터, TDP-43과 결합하는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 펩타이드의 발현 수준을 정상 대조구 시료에서의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

기타 사항은 앞서 설명한 바와 같다.

즉, 상기 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열의 유전자 중 선택되는 1종 이상의 펩타이드들은 TDP-43을 인지하는 탐침임을 특징으로 하고, 바람직하게는 서열번호 7 및 10의 서열을 탐침으로 사용한다. 이 때, 진단 효율을 높이기 위해, 다중 인식 펩타이드 고분자 사슬(Polyvalent-directed Peptide Polymer; PDPP), 예를 들어 PDL-SPDP-펩타이드 구성에 의한 발현 수준을 측정할 수 있다.

다시 말해, 상기 TDP-43 관련 질환 진단방법은, 특정 펩타이드 마커의 발현을 조사하는 것에 관한 것이고, 본 명세서에 개시된 방법은 TDP-43 관련 질환 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것이다.

서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열의 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준 측정에 관한 구체적인 사항은 앞서 설명한 바를 참조할 수 있다.

[스크리닝방법]

한편, 다른 관점에서 본 발명은 앞서 설명한 사실을 기반으로 하여, 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열의 유전자 중 선택되는 1종 이상의 펩타이드 발현을 억제시키는 TDP-43 관련 질환 치료용 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 일 구체예로,

(a) 후보 물질의 존재하에, TDP-43과 결합하는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드를 발현시키는 단계; 및

(b) 후보물질이 없이 TDP-43과 결합하는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩타이드를 발현시킨 경우에 비하여, 상기 펩타이드의 발현이 억제되는 경우의 후보물질을 TDP-43 발현 관련 질환 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.

이 때에도, 서열번호 7 및/또는 10으로 표시되는 펩타이드 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드 서열중에서 선택되는 1 개 이상의 펩타이드 발현과 관련하는 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절에 대한 유전적 접근까지 확장한다. 일반적으로, 유전자 사일런싱 예컨대 전사 전 또는 전사후 유전자 사일런싱을 유도하기 위해 유전적 수단을 사용하는 것이 보다 편리하다. 그러나, 발현을 상향 조절하는데 사용되는 일반적 기법은 유전자 복제수를 증가시키거나 또는 유전자 발현의 억제제를 길항시키는 것이다.

이처럼, 본 발명에서는 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 펩타이드, 특히 서열번호 7 및 10으로 표시되는 펩타이드가 TDP-43와 효과적으로 결합하는, TDP-43 인지용 탐침으로서 기능한다는 것을 확인하였고, 이에 따라 루게릭병이나 전측두엽성 치매 등의 TDP-43 관련 질환 진단 마커로서의 상기 펩타이드들의 용도를 활용하여, TDP-43 관련 질환 진단 및 치료제를 개발 또는 스크리닝하기 위한 표적으로서, 본 발명에 의해 특성이 규명된 상기 펩타이드를 이용할 수 있음을 시사한다.

항체가 갖는 생체 내 면역 반응성을 배제한 작은 분자로 구성된 본 발명의 펩타이드는 그 크기가 작기 때문에 점막을 쉽게 통과하고 체액 내 극미량의 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 펩타이드는 국소 주사를 통해 안정성을 확보하고 면역 반응성을 최소화 할 수 있기 때문에 퇴행성 뇌질환에 대한 항체 대체 진단탐침자로서 사용할 수 있는 커다란 잠재성을 가진다.

[실시예]

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: TDP-43를 인지하는 M13 페이지 펩타이드 라이브러리 스크리닝( Phage Display )

Phage display란 박테리오페이지(bacteriophage)의 캡시드 단백질에 외래 펩타이드와 단백질을 삽입 및 융합시켜 페이지 표면에 외래 단백질을 발현되도록 하는 기술이다.

본 발명자들은 현재 상용되고 있는 여러 박테리오페이지 중에서 M13을 페이지로 사용하여 TDP-43에 결합하는 펩타이드를 선별 후 이들의 결합력을 분석하여 탐침으로서의 수행력을 확인하였다.

페이지 디스플레이를 통한 M13 페이지 펩타이드 라이브러리 스크리닝법은 도 1에서 나타낸 바와 같이 진단 대상 단백질을 플레이트 표면에 고정시킨 후 M13 페이지 펩타이드 라이브러리(12개의 아미노산 서열을 가지도록 제작된 펩타이드 라이브러리-Ph.DTM phage display peptide lirary kit, New England Biolabs(NEB). 약 2.7 × 10⁹ 개의 아미노산 서열을 지님)를 넣어주어 진단 대상 단백질에 결합하는 페이지 펩타이드를 선별해 내는 것으로서, 본 발명에서도 이 스크리닝법을 TDP-43 단백질에 적용시켰다.

우선, 플레이트의 각 well에 TDP-43을 고정시키고(도 1-a), M13 페이지 표면에 12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드들이 발현된 페이지 라이브러리를 첨가하였다 (도 1-b). 이에 다양한 세척 조건과 결합 시간의 조절을 적용시켜 (도 1-c) 추출해 낸 결과, TDP-43에 특이적으로 결합하는 페이지 펩타이드만이 최종적으로 확보되었다 (도1-d).

도 1-a에서 1-d까지를 한 단계(round)라고 보고, 하기 표 1의 조건과 같이 각 단계마다 세척 용액의 NaCl의 농도를 높이고, 이에 반면 결합 시간은 각 단계마다 더 짧게 하여 마지막 단계(4 round)에서 극한 조건에서도 TDP-43에 가장 높은 결합력을 나타내는 페이지 펩타이드를 확보하였다. 상기와 같은 과정의 반복을 바이오 패닝(biopanning)이라 칭한다.

[표 1]

바이오 패닝을 통해 얻어진 페이지 펩타이드를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시키고 LB 배지에 증폭시켜서 총 42개의 페이지 플라그(총 13 종류의 서로 다른 페이지 펩타이드군)를 얻었다.

그 후, 이 42개 페이지 플라그의 M13 페이지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하여 유전자 염기서열을 확인한 다음, TDP-43과 결합하는 페이지 표면 단백질(gp3 minor coat)에 발현된 12개의 아미노산 염기서열로 이루어진 펩타이드를 규명하였다(표 2).

[표 2]

실시예 2 : 수득한 페이지 펩타이드의 결합력 분석

실시예 1에서와 같이 스크리닝하여 얻어진 TDP-43 표적 특이적인 페이지 펩타이드의 결합력 분석을 위해 우선 각각의 펩타이드가 발현된 페이지를 증폭시킨 뒤에 타이터링 (titering) 작업을 통하여 페이지 용액의 농도를 측정하였다. 그 후 TDP-43을 고정시킨 각 well에 페이지 펩타이드를 농도별로 희석시켜 넣어주어 결합한 페이지 양을 측정함으로써 각 페이지 펩타이드의 결합력을 추론했다.

구체적으로, TDP-43 단백질(5 ug/ml, 100 ul/well)을 clear bottom 96-well polystyrene plate에 고정시킨 후 세척용액(0.05 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.05% Tween-20 in dH2O, pH 7.5)으로 3번 세척해 준 뒤, TDP-43 단백질이 코팅이 안 된 부분을 메우기 위해 TBS-T에 녹인 2% BSA, 100 ul/well을 넣어주었다. 1시간 후 5번 세척을 해 준 뒤 증폭된 페이지를 넣어주어 다시 1시간 동안 TDP-43과의 결합반응을 시켰다. 그 후 5번의 세척 과정을 거치고 마우스 항-M13 단일클론항체(mouse anti-M13 monoclonal antibody, TBST에 1:5000으로 희석, Amersham Bioscience)를 1시간 동안 붙여주었다. 세척용액으로 다시 5번 씻어낸 후 마우스 항-M13 단일클론항체에 결합하는 2차 항체(mouse IgG-HRP, TBST에 1:4000으로 희석, Santacruz)를 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 5번의 세척 작업을 거친 다음 TMB 기질 용액(3,3’ 5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)/H2O2, Chemicon)을 넣고 15분 뒤 1M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다.

이 전체 과정을 항체를 이용한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbant assay)라 칭하고 이 실험의 결과로 얻는 Kd값은 각 well의 고정된 단백질에 반응시킨 페이지 펩타이드의 해당 농도에 따른 ELISA 신호 강도를 450nm에서 측정하여 나타낸 포화곡선으로 정해진다.

그 결과, 표 2에 기재한 13 종류의 서로 다른 페이지 펩타이드군 중에서도 두 가지 페이지 펩타이드 서열(IRNPNNHPRTPA과 WPHNWWPHCKVK)이 picomolarity에서 femtomolarity (10-12~10-15M) 수준으로, TDP-43 단백질과의 유난히 높은 결합력을 나타내었다.

실시예 3: 합성된 두 개의 펩타이드 서열과 TDP -43 단백질의 결합력 분석

실시예 2에서 수득한, 페이지 펩타이드 상에서 TDP-43 단백질을 높은 결합력으로 특이적으로 인지하는 두 서열에 각각 신호를 나타낼 형광 물질(FITC; fluorescein isothiocyanate 사용)을 붙여 합성하였고, 그 서열은 다음과 같다.

TDPRP1-GCGK-FITC: Ac-IRNPNNHPRTPAGCGK-FITC

TDPRP2-GCGK-FITC; Ac-WPHNWWPHCKVKGCGK-FITC

표기된 아미노산 서열은 아미노 말단부터 나타낸다. N-말단에는 아미노말단의 반응성 제거를 위해 아세틸화(Acetylation)를 시켰고 C-말단에는 칼복시말단에 FITC를 부착하기 위해 아미노산 K(Lysine, 라이신)를 첨가하였다. 각각의 아미노산 서열의 칼복시말단 부근에는 GCG가 첨가되었는데, 이는 형광 펩타이드 탐침자 TDPRP1-GCGK-FITC와 TDPRP2-GCGK-FITC의 민감도를 극대화시키기 위한 과정을 위해서다(실시예4에서 설명).

TDPRP1-GCGK-FITC와 TDPRP2-GCGK-FITC의 TDP-43 단백질에 대한 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드를 TDP-43 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 넣어주었다. 각 well의 TDP-43 단백질에 결합한 펩타이드 양을 측정함으로써 각 펩타이드의 결합력을 추론하는 방법은 실시예3에서 설명한 바와 유사하다.

그러나 FITC가 합성된 펩타이드의 경우, 1차 항체, 2차 항체, TMB 기질 용액의 첨가 등 페이지 펩타이드 실험에서와 같이 신호를 나타낼 표지자가 별개로 필요하지 않아서 TDP-43 단백질과 펩타이드를 결합시킨 후 세척하여 fluorometer로 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation @495nm, Emission @520nm)에서 각 펩타이드 농도의 형광세기를 측정하였다.

TDPRP1-GCGK-FITC와 TDPRP2-GCGK-FITC 두 펩타이드 모두 같은 조건에서 실험을 진행하였고, 각 펩타이드의 해당 농도의 FITC 신호강도는 그래프화 시켜서 펩타이드의 Kd 값을 정하였다

실시예 4: 민감도와 결합력을 높이기 위한 다중 인식 펩타이드 고분자 제작

펩타이드의 경우 항체에 비해 크기도 작고 합성의 용이성과 같은 많은 장점이 있지만, 목표 단백질과의 결합력이 그에 비해 낮다는 단점이 있다. 이 단점을 보완하기 위해 본 발명자들은 생체 고분자 형태인 poly-peptide chain을 기본으로 한 다중 인식 펩타이드 고분자 사슬(Polyvalent-directed Peptide Polymer; PDPP)을 제작하고 이와 단일 펩타이드와의 결합력 및 민감도 비교에 중점을 두고 실험을 했다.

우선 고분자 사슬을 만들기 위해 체내 L-입체이성질체와 차이를 둔 poly-D-lysine(PDL)을 사용하고, 이에 heterobifunctional한 SPDP (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)를 연결시켰다.

SPDP의 한 쪽에 위치한 N-hydroxysuccinimide ester과 PDL의 amine group의 치환반응으로 인해 PDL-SPDP를 연결시키고, SPDP의 다른 한 쪽에 위치한 2-pyridyl disulfide와 실시예3의 각각의 아미노산 서열의 칼복시말단 부근에 첨가된 Cystein의 sulfhydryl group의 치환 반응에 의해 cross-linking이 일어나 고분자 backbone에 펩타이드가 연결되는 형태, 즉 PDL-SPDP-TDPRP-GCGK-FITC(이하 TDPRP1-PDPP, TDPRP2-PDPP)가 된다. 이 완성된 펩타이드 고분자 사슬로 TDP-43 단백질에 대한 결합력 실험을 하였다.

실험 방법은 실시예3과 같으나 실시예3의 TDPRP1-GCGK-FITC와 TDPRP2-GCGK-FITC 두 단일 펩타이드 대신 각각의 펩타이드 고분자 사슬을 결합시켜서 해당 농도의 FITC 신호강도로 각 고분자 사슬의 Kd 값을 정하였고, 그 결과 표 3에서 보는 바와 같이 단일 펩타이드보다 결합력이 6배에서 8배 정도로 증가한 것을 볼 수 있다.

이후 이 펩타이드 고분자 사슬에 다중 인식 기능을 첨가하기 위해 TDP-43 단백질의 서로 다른 부위에 결합하는 두 펩타이드 (TDPRP1과 TDPRP2) 각각을 같은 농도로 고분자 사슬에 합성시켰다 (TDPRP1,2-PDPP). 실험 방법은 상기에 제시한 PDPP 실험과 동일하게 하였다.

실시예 3 및 실시예 4에서의 실험 결과를 도 4 및 표 3에 나타내었다.

[표 3]

도 4 및 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 3의 TDPRP1-GCGK-FITC와 TDPRP2-GCGK-FITC 두 단일 펩타이드는 TDP-43 단백질에 특이적으로 결합하고, 나아가, 고분자 사슬을 결합시킨 경우는 그 결합력이 더욱 우수해졌다. 즉, 단일 펩타이드보다 결합력이 6배에서 8배 정도로 증가하였다. 특히, TDPRP1,2-PDPP의 경우 각각의 단일 펩타이드 형태인 TDPRP1-GCGK-FITC나 TDPRP2-GCGK-FITC보다 각각 약 70배, 약 80배정도 결합력이 우수해 진 것을 볼 수 있었다.

<110> HANYANG UNIVERSITY INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION <120> A Marker for Diagnosis related to TDP 43 <130> 2012-P-195 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 1 Leu Met Asn Pro Asn Asn His Pro Arg Thr Pro Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 2 Pro His His His Leu Gln Leu Ala Leu Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 3 Ile Leu Met Ser Lys His Lys His His Ile His Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 4 Pro Val Gly Arg Trp Trp Thr Arg Ile Lys Gln Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 5 Arg Pro Arg Leu Pro Leu Thr His Ser Asp Gln Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 6 Asn Tyr Ser His Leu Arg Val Lys Leu Pro Thr Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 7 Ile Arg Asn Pro Asn Asn His Pro Arg Thr Pro Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 8 Gln Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Tyr Pro His Asp Ile 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 9 His Lys Leu Ala Thr Ser Pro Trp Trp Pro Pro Ile 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 10 Trp Pro His Asn Trp Trp Pro His Cys Lys Val Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 11 Phe Ser Gln Gly Ser Thr Phe Ile Asn Pro Leu Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 12 Trp Pro His Asn Gly Trp Pro His Leu Asn Leu Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 phage display peptide of TDP-43 <400> 13 Arg Pro His Asn Trp Trp Pro His Phe Lys Val Lys 1 5 10

Claims (18)

1. TDP-43와 특이적으로 결합하는 서열 번호 1 내지 13 중 어느 하나 이상의 펩타이드를 함유하는, 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS) 또는 전측두엽성 치매(Frontotemporal Lobar Dementia; FTLD)의 진단을 위한 마커용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 서열은 서열번호 7 및 10인 서열인 것을 특징으로 하는 마커용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 다중인식 펩타이드 고분자 사슬인 PDL(poly-D-lysine)-SPDP[N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate]를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 마커용 조성물.
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