KR101562368B1 - 생체모방복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 모방 복합물을 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 L-테아닌(L-theanine), 글루타치온(glutathione), 우유지질(milk lipid), 미네랄 워터 혼합물로 이루어지는 생체모방복합물을 유효성분으로 함유하여, 피부 항산화 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 합성 증진 효과, 멜라닌 생성 억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과, 피부주름 개선 효과 및 피부탄력 개선 효과를 나타내는 화장료조성물에 관한 것이다.

Description

생체모방복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising the biomimetic complex as active ingredient}

본 발명은 생체모방복합물을 함유하는 화장료에 관한 것으로서, 구체적으로는 생체모방복합물을 유효성분으로 함유하여 항산화, 피부노화방지, 피부주름 개선, 피부탄력 개선, 피부 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제, 피부자극 완화 및 피부보습 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체 표면을 감싸고 있는 가장 큰 조직으로 외부와 직접 접하고 있어서 온도, 습도, 세균, 공해 물질, 자외선과 같은 자극으로부터 인체를 보호하는 역할을 한다. 그러나 나이가 들면서 피부를 구성하는 세포들이 손상 되거나 기능을 상실하게 된다. 진피층의 주요 성분인 콜라겐(collagen)이 분해되고, 섬유아세포의 기능도 저하됨에 따라 피부는 점점 탄력을 잃고 주름이 증가한다. 또 강한 자외선, 스트레스, 호르몬의 불균형으로 멜라닌(melanin) 합성이 증가 되어서 기미와 같은 색소침착이 발생한다. 이와 같이 서로 연계되어있고 복합적인 문제를 해결하기 위하여, 기능성 화장료 개발에 관한 다양한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 일예로서 다양한 천연물로부터 항균, 미백, 피부보습, 항산화, 항노화 등에 효과가 있는 화장료를 개발하려는 연구가 계속되고 있다.

생체모방공학(Biomimetics)은 살아있는 생물의 행동이나 구조 또는 그들이 만들어 내는 물질 등을 모방함으로써 새로운 것을 만드는 기술에 관한 것으로, '생체(Bio)'와 '모방(mimetics)'을 합성한 단어이다. 생체모방기술은 의료용 접착제, 의류, 비행기 소재 등 다양한 분야에 활용되고 있으며 계속적으로 그 영역이 확대되고 있다.

화장품 분야에서도 이러한 생체 모방 기술을 접목하여 새로운 화장품 원료 개발을 시도하고 있지만 아직은 뚜렷한 성과가 없는 실정이다.

대한민국 공개특허 제2011-0060800호 "세포외 기질을 모사한 피부 세포 재생용 화장료 조성물"에는'글리신-프롤린-하이드록시프롤린(Gly-Pro-Hyp)으로 구성된 트리펩타이드, 저분자량 히알루론산, 미네랄 성분 및 비타민을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물'이 개시되어 있다.

본 발명자들은 다양한 성분들을 이용한 실험을 통하여 L-테아닌(L-theanine), 글루타치온(glutathione), 우유지질(milk lipid), 미네랄 워터(mineral water)를 선정하였으며, 이들을 다양한 비율로 혼합하여 가장 우수한 혼합비를 찾고자 하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 생체 중 피부 성분의 일부를 모방하여 유사한 성분으로 구성된 생체모방복합물을 유효성분으로 함유하여 항산화, 피부노화방지, 피부주름 개선, 피부탄력 개선, 피부 미백, 자외선에 의한 피부손상 억제, 피부자극 완화 및 피부보습 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, L-테아닌(L-theanine), 글루타치온(glutathione), 우유지질(milk lipid), 미네랄 워터 혼합물로 이루어지는 생체모방복합물을 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 생체모방복합물은 L-테아닌(L-theanine) 0.00001~10 중량부, 글루타치온(glutathione) 0.00001~10 중량부, 우유지질(milk lipid) 0.00001~30 중량부, 미네랄 워터(mineral water) 10~99.99997 중량부가 혼합되는 것이며, 바람직하게는 L-테아닌(L-theanine) 0.00001~0.8 중량부, 글루타치온(glutathione) 0.00001~0.8 중량부, 우유지질(milk lipid) 0.00001~0.5 중량부, 미네랄 워터(mineral water) 50~99.99 중량부가 혼합되는 것이다.

상기 생체모방복합물은 화장료 조성물 전 중량에 대하여 1~99중량%, 바람직하게는 50~99중량% 함유된다.

본 발명의 생체모방복합물을 함유하는 화장료 조성물은 항산화용, 피부노화방지용, 피부주름 개선용, 피부탄력 개선용, 피부 미백용, 자외선에 의한 피부손상 억제용, 피부자극 완화용, 피부 보습용 화장료로 사용될 수 있다.

상기 화장료조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 생체모방복합물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 항산화 효과, MMP-1 생성억제 효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제 효과, 콜라겐 합성증진 효과, 멜라닌 생성억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현억제 효과, 피부주름개선 효과 및 피부탄력개선 효과를 나타낸다.

본 발명은 L-테아닌(L-theanine), 글루타치온(glutathione), 우유지질(milk lipid) 및 미네랄 워터(mineral water)로 이루어지는 생체모방복합물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 다양한 성분들을 이용한 실험을 통하여 활성성분으로서 L-테아닌(L-theanine), 글루타치온(glutathione), 우유지질(milk lipid), 미네랄 워터(mineral water)를 선정하고, 이들의 최적의 혼합비를 찾고자 하였다.

L-테아닌(L-theanine)은 녹차의 정미성분으로서 아미노산의 일종이다. 천연에는 다엽 중에 함유되어 있다. 다이어트 식품의 성분, 착향료 등으로 사용되며, 차의 풍미향상의 목적으로 조미료로 사용된다. 테아닌은 녹차에 들어있는 아미노산 성분 중 함량이 가장 높은 성분으로 녹차에 단맛과 감칠맛을 부여한다. 녹차에 들어있는 50여종 유기화합물 중에 녹차의 효능과 맛에 가장 깊게 관련되는 성분은 카테킨류와 아미노산류인데, 이들 성분은 녹차의 종류, 재배조건, 차잎의 채엽시기에 의해 그 함량이 변한다. 카테킨류는 주로 떫고 쓴 맛을 제공하는 반면에 테아닌과 같은 아미노산류는 감칠맛과 단맛을 제공한다. 테아닌은 녹차의 뿌리에서 글루타민(L-glutamine)과 에틸아민 (Ethylamine)을 이용하여 효소매체로 생합성되어 잎에 저장되는데 햇빛을 받으면 화학적으로 분해되어 카테킨(cathechin) 전구체로 전환된다. 테아닌은 긴장완화 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 테아닌이 면역증강작용이 있다는 연구 결과가 보고되었으며, 혈압강하작용, 혈중 콜레스테롤을 저하, 스트레스 해소, 수면 보조, 집중력 강화, 항우울증 치료, 알코올 해독 등의 각종 연구결과가 보고되고 있다.

글루타치온(Glutathione)은 생체에서 뽑아낸 최초의 결정성 폴리펩티드이다. 자연계에 널리 분포하며, 효모, 간, 근육 등에 특히 많이 함유되어 있다. 1921년 효모에서 분리되었는데, 글루탐산과 황을 함유한 데서 이 이름이 붙여졌다. 자연계의 동물, 효모 등 거의 모든 생체 세포 속에 들어 있으면서, 생체 내의 산화환원 반응에 중요한 구실을 한다. 일부 미생물의 성장인자이고, 효소 글리옥살라아제의 조효소이며, 또 SH기를 가진 효소의 활성화에도 관여한다.

지질은 물에 용해되기 어려운 유기물로 화학적으로는 매우 다양한 물질의 혼합체를 지칭한다. 우유지질(milk lipid)은 에너지를 공급하는 기능 이외에도 세포막의 성분이나 호르몬합성 등 다양한 생리적 대사에 관여한다. 우유지질의 주요성분은 "트리글리세라이드"로서 지질의 97~98%를 차지한다. 우유지질을 구성하는 지방산(脂肪酸)은 그 종류가 많으며, 미량(微量)까지 포함하면 약 200종 이상이나 된다.

미네랄 워터(mineral water)는 칼슘, 마그네슘, 칼륨 등의 미네랄 성분이 미량 함유된 물로 광천수(鑛泉水)라고도 한다. 우리 몸의 여러 가지 생리기능을 조절, 유지하는 중요한 역할을 하는 필수 미네랄 구성요소에는 7가지가 있다. 칼슘(Ca), 칼륨(K), 마그네슘(Mg), 나트륨(Na), 염소(Cl), 인(P), 황(S)이 그것이다. 미네랄은 인체 구성 요소 중 4%를 차지하나 체내에서 생성되지 않으므로 물이나 음식을 통해 섭취해야 한다.

본 발명에 사용되는 미네랄 워터는 금(Au) 0.001~1 ppm, 칼슘(Ca) 0.1~100 ppm, 칼륨(K)0.01~10 ppm, 리튬(Li) 0.0001~0.1 ppm, 마그네슘(Mg) 0.015~15 ppm, 몰리브덴(Mo) 0.00001~0.01 ppm, 나트륨(Na) 0.1~100 ppm, 황(S) 0.02~20 ppm, 규소(Si)0.1~100 ppm, 아연(Zn) 0.01~10 ppm을 포함하는 물을 의미한다. 직접 취수하거나 제조하여 사용할 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들은 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.

실시예 1 ~ 5 : 생체모방복합물의 제조

하기 표 1과 같은 조성으로 혼합하여 생체모방복합물을 제조하였다. 미네랄 워터는 직접 취수하여 사용하였다. 성분분석결과, 금(Au) 0.1ppm, 칼슘(Ca) 10 ppm, 칼륨(K) 1 ppm, 리튬(Li) 0.1 ppm, 마그네슘(Mg) 5 ppm, 몰리브덴(Mo) 0.001 ppm, 나트륨(Na) 40 ppm, 황(S) 2 ppm, 규소(Si) 10 ppm, 아연(Zn) 1 ppm 정도를 함유하였다.

L-테아닌(L-theanine, Sigma), 글루타치온(Glutathione, Fluka), 우유지질(Milk lipids, Sigma)은 시판되는 것을 구매하여 사용하였다.

비교예 1 ~ 4 : 비교 복합물의 제조

미네랄 워터, L-theanine, glutathione, milk lipid를 하기 표 1과 같이 혼합하여 비교 복합물을 제조하였다.

성분 (중량%)	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	실시예5	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4
L-theanine	10	0.1	0.001	0.1	0.1	-	0.1	0.1	0.1
Glutathione	10	0.1	0.001	0.1	0.1	0.1	-	0.1	0.1
Milk Lipid	30	0.3	0.003	0.3	0.3	0.3	0.3	-	0.3
미네랄워터	50	50	50	20	99.5	50	50	50	-
정제수	-	49.5	49.995	79.5	-	39.6	39.6	39.8	99.5

시험예 1 : 생체 모방 복합물의 NBT법을 이용한 항산화효과 측정

생체 모방 복합물의 항산화 효과를 확인하기 위해 항산화 효과가있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C와 BHT(Butylated Hydroxytoluene)를 비교군으로 하여, NBT법으로 항산화 효과를(활성 산소 소거율) 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성 산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검 물질(생체 모방 복합물, 비타민 C, BHT)이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거율(%)을 평가한다. 활성 산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560 nm에서 측정하는 것으로 활성 산소 소거율(%)을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이알병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료 용액 0.1ml를 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 6 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.

⑤ 공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑥ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 시료 용액 및 6 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

활성 산소 소거율(%)은 하기식에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2와 같다.

활성 산소 소거율(%) =〔1-(St-So)/(Bt-Bo〕〕X 100

St : 시료 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료명	처리농도(%, w/v)	항산화 효과(%)
실시예 1	0.01	90.6
실시예 2	0.01	87.7
실시예 3	0.01	83.4
실시예 4	0.01	84.2
실시예 5	0.01	89.2
비교예 1	0.01	79.6
비교예 2	0.01	77.2
비교예 3	0.01	83.5
비교예 4	0.01	78.1
Vit C	0.01	85.1
BHT	0.01	90.2

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 0.01% 농도에서 시험한 실시예 모두에서 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 본 발명의 실시예 모두는 Vit C 보다 우수한 항산화 효과를 가졌으며 특히 실시예 1은 0.01% 농도에서 가장 높은 항산화 효과를 보였으며 BHT와 비교하여서도 더욱 우수한 항산화 효과를 가지고 있음이 확인되었다.

시험예 2 : 생체 모방 복합물의 DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

생체 모방 복합물의 항산화 효과를 측정하기 위해, 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C를 비교군으로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 효과(자유라디칼 소거율)를 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl), free radical 이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 피검 물질(생체 모방 복합물, 비타민 C)에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율(%)을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl), free radical(Sigma aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1 mM DPPH 용액 0.15 ml에 시료용액을 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 시료 용액의 블랭크 (Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.

④ 공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

자유라디칼 소거율(%)의 결과는 하기식에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기의 표 3과 같다.

자유라디칼 소거율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo〕〕X 100

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료명	처리농도(%, w/v)	항산화 효과(%)
실시예 1	0.01	92.6
실시예 2	0.01	91.7
실시예 3	0.01	90.8
실시예 4	0.01	90.0
실시예 5	0.01	92.2
비교예 1	0.01	82.3
비교예 2	0.01	79.4
비교예 3	0.01	85.6
비교예 4	0.01	80.6
Vit C	0.01	91.8

표 3과 같이 본 발명의 실시예들은 0.01% 농도에서 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C와 유사한 항산화 효과를 나타냈으며, 특히 실시예 1과 실시예 5는 더욱 우수한 항산화 효과를 갖고 있음이 확인되었다.

시험예 3 : 생체모방복합물의 세포재생(Cell Proliferation) 효과

24 웰 플레이트에 HaCaT Kerationcyte (German Cancer Research Institute, Germany)를 2×10⁵ cells/well의 밀도로 10% FBS가 첨가된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco)으로 접종하여 가습화된 37℃, 5% CO2 배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청(Serum-free) DMEM으로 교환 후 시료들을 1.0%(v/v) 되게 처리하여 3일 배양하였다. 배양 후 세포생성 효과를 보기 위해 MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며, 양성 대조군으로 TGF-β(10 ng/mL)을 적용하였으며 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

시료명	Abs. at 570nm
실시예 1	1.124
실시예 2	1.115
실시예 3	1.106
실시예 4	1.108
실시예 5	1.118
비교예 1	1.086
비교예 2	1.068
비교예 3	1.095
비교예 4	1.074
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	1.172
대조군	0.926

일반적으로 피부 세포 재생은 세포 활성율로 측정하는데 본 발명의 실시예들에서 세포 재생 효과가 있음을 확인하였다. 또한 세포재생 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10 ng/ml) 와의 농도차이를 감안해도 세포 재생 효과가 유사한 본 실험결과를 통해 본 발명의 실시예 1~5는 세포재생효과가 우수함을 확인하였으며, 특히 실시예 1에서 가장 세포 재생 효과가 우수함을 확인하였다.

시험예 4 : 생체모방복합물의 MMP-1 생성 억제 효과

생체 모방 복합물의 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과가 있는지 여부를 측정하기 위해, MMP-1의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10 ng/ml)를 비교군으로 하여 MMP-1의 생성을 억제하는 효과를 측정하였다.

인간 정상 피부 세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48 웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1 × 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예들을 최종 농도 100 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 시료가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.

배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 키트(Amersham, 미국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 식에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

시료명	MMP-1 생성 억제율(%)
실시예 1	75.1
실시예 2	72.2
실시예 3	71.1
실시예 4	71.4
실시예 5	73.5
비교예 1	64.2
비교예 2	62.6
비교예 3	67.5
비교예 4	68.7
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	70.1

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 실시예들은 100 ㎍/㎖ 농도에서 MMP-1 생성 억제율을 측정했을 때, 실시예들의 시료가 71.1~75.1%의 억제율로 TGF-β의 70.1% 보다 우수한 활성을 나타내었다. MMP-1 생성 억제 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10 ng/ml)와 본 발명의 시료들의 실험 농도(100 ㎍/㎖) 차이를 감안해도, 여러 종류의 물질이 혼합된 복합물 수준에서 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본 발명의 생체 모방 복합물이 MMP-1 생성 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.

시험예 5 : 생체모방복합물의 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성 억제 효과

일반적으로 MMP-1은 자외선에 의해 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 시험예에서는 생체 모방 복합물이 자외선에 의해 생성이 증가되는 MMP-1의 양을 억제하는지를 알아보고자 실험을 실시하였다. 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성 억제 효과 측정은 시료 처리에 앞서 UVB를 일정량 처리하는 것을 제외하고는 상기 시험예 4와 동일하게 실시하였다.

시료들의 MMP-1 생성 억제율(%)은 상기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10 ng/ml)를 비교군으로 사용하였고, 시료들은 0.01%(w/v) 농도로 실험을 실시하였다.

시료명	MMP-1 생성 억제율(%)
실시예 1	71.5
실시예 2	67.2
실시예 3	64.9
실시예 4	65.4
실시예 5	70.1
비교예 1	56.7
비교예 2	54.3
비교예 3	59.2
비교예 4	58.4
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	65.2

배양된 섬유아세포에 UVB 조사 후 시료들과 TGF-β를 첨가한 배양액에 분비된 콜라겐 분해효소 MMP-1의 양을 측정한 결과를 상기 표 6에 나타내었다. 본 발명의 생체 모방 복합물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 MMP-1 생성 억제율을 측정했을 때, 실시예 1이 71.5%의 억제율을 나타내어 가장 높은 억제율을 보였으며 실시예 1~5는 양성 대조군인 TGF-β와 유사하거나 더욱 우수한 억제율을 나타냈다. MMP-1 생성 억제효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10 ng/ml)와 본 발명의 시료들의 농도(0.01%(w/v)) 차이를 감안해도, 여러 종류의 물질이 혼합된 수준에서 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본 발명의 생체 모방 복합물이 MMP-1 생성 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.

시험예 6 : 생체 모방 복합물의 콜라겐 합성 증진 효과

인간 정상 상피 세포인 섬유아세포를 48 웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1 x 10⁶ 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 시료들을 최종농도 100 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 시료가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다.

본 실험의 비교군으로는 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10 ng/ml)를 비교군으로 사용하였고, 시료들은 0.01%(w/v) 농도로 실험을 실시하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 7에 나타내었다.

시료명	콜라겐 생합성 증가율(%)
실시예 1	92.5
실시예 2	86.2
실시예 3	74.9
실시예 4	79.1
실시예 5	88.5
비교예 1	60.3
비교예 2	62.1
비교예 3	71.6
비교예 4	79.5
양성 대조군 TGF-β(10 ng/ml)	89.6

표 7은 섬유아세포를 이용하여 시료들과 TGF-β를 첨가한 배양액의 콜라겐 합성 증진 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 표 7에 따르면, 본 발명의 실시예 1, 실시예 2, 실시예 5는 0.01% 농도에서 콜라겐 생합성율을 측정했을 때, 각각 92.5%, 86.2%, 88.5%로 TGF-β 보다 더욱 우수한 생합성율을 나타내었다. 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10 ng/ml)와 본 발명의 생체 모방 복합물의 농도(0.01%(w/v)) 차이를 감안해도, 여러 종류의 물질이 혼합된 수준에서 상기와 같은 정도의 콜라겐 생합성율을 나타낸 것은 본 발명의 생체 모방 복합물은 콜라겐 합성 증진 효과가 있다는 것을 보여준다.

시험예 7 : 생체 모방 복합물의 B16F10 멜라닌형성세포에 대한 멜라닌 생성 억제효과

생체 모방 복합물의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F10 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다. 본 시험예 7에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포 균주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다.

이 세포의 인공 배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색 색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 시험예에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로 부터 분양받아 사용하였다.

B16F10 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F10 멜라닌 형성 세포를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2 X 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료들을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생성 저해율(%)은 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 8에 기재하였다. 이때 멜라닌 생성 저해 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 하이드로퀴논과 알부틴을 비교군으로 사용하였다.

멜라닌 생성 저해율 (%) = [

] X 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

시료명	처리농도(%, w/v)	멜라닌 생성 저해율(%)
실시예 1	0.1	5.63
실시예 2	0.1	5.27
실시예 3	0.1	4.31
실시예 4	0.1	4.52
실시예 5	0.1	5.82
비교예 1	0.1	2.04
비교예 2	0.1	2.31
비교예 3	0.1	3.78
비교예 4	0.1	4.26
하이드로퀴논	0.1	8.19
알부틴	0.1	3.56

상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 실시예들은 B16F10 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 알 수 있다. 실시예 1~5의 생체 모방 복합물은 0.1% 농도에서 멜라닌 생성 저해율 값이 4.31~5.82%로 나타났으며, 동일한 농도에서 기존의 미백 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 알부틴 및 하이드로퀴논과 비교했을 때, 하이드로퀴논보다는 상대적으로 낮은 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내었으나, 알부틴보다는 우수한 멜라닌 생성 저해효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 생체 모방 복합물은 멜라닌 생성 억제에 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

시험예 8 : 생체 모방 복합물의 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화 효과

생체모방복합물의 자외선 조사에 의한 세포 독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다.

섬유아세포 (fibroblast)를 24 웰 시험 플레이트에 5 X 10⁴ 개씩 넣고 24 시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 1000 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B (UVB) 램프 (Model : F15T8, UV B15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지 (DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 시료들을 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간이 지난 후 배지를 제거하고, 각 웰당 세포 배양 배지 500㎕과 MTT 용액 (2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2 시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl (0.04N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5 분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96 웰 플레이트에 옮긴 후, 마이크로 플레이트 판독기에서 565 nm 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로 TGF-β를 사용하였다.

세포 생존율(%)과 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%)을 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

세포 생존율(%) =〔

〕X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%) =〔1-

〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

시료명	처리농도(%, w/v)	세포 독성 완화율(%)
실시예 1	0.0125	69
	0.025	77
	0.050	90
실시예 2	0.0125	58
	0.025	68
	0.050	82
실시예 3	0.0125	55
	0.025	66
	0.050	78
실시예 4	0.0125	58
	0.025	67
	0.050	78
실시예 5	0.0125	65
	0.025	75
	0.050	87
비교예 1	0.0125	53
	0.025	58
	0.050	67
비교예 2	0.0125	63
	0.025	64
	0.050	73
비교예 3	0.0125	63
	0.025	69
	0.050	77
비교예 4	0.0125	67
	0.025	72
	0.050	81
TGF-β	10 ng/ml	85

표 9에 따르면, 실시예 1과 실시예 5의 0.050% 농도에서 자외선에 의한 세포 독성 완화율은 90%, 87%로 TGF-β보다 우수한 완화율을 보였으며, 실시예들의 처리농도가 증가됨에 따라 농도 의존적으로 세포 독성 완화율이 증가되는 양상을 보여, 자외선에 의한 세포 독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험결과를 통해 본 발명의 생체모방복합물은 자외선 조사에 의한 세포손상을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

시험예 9 : 생체 모방 복합물의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과

생체 모방 복합물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위한 것으로서, 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포 (Fibroblast)를 24 웰 플레이트에 5 X 10⁴개씩 넣고 24 시간 동안 부착시켰다.

각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B (UVB) 램프 (Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지 (DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다.

여기에 평가하고자 하는 시료들을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로써 시료들의 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소 면역 분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 양성대조군으로 IL-1α억제물질로 알려진 케토 프로펜(Ketoprofen)를 사용하였다. 염증성 사이토카인 (IL-1α)의 발현 억제율(%)은 하기 식에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-

〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

시료명	처리농도(%, w/v)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
제조예 1	0.0125	51
	0.025	60
	0.050	72
제조예 2	0.0125	40
	0.025	51
	0.050	68
제조예 3	0.0125	37
	0.025	48
	0.050	60
제조예 4	0.0125	40
	0.025	51
	0.050	60
제조예 5	0.0125	47
	0.025	58
	0.050	69
비교예 1	0.0125	37
	0.025	41
	0.050	49
비교예 2	0.0125	45
	0.025	46
	0.050	55
비교예 3	0.0125	45
	0.025	51
	0.050	59
비교예 4	0.0125	50
	0.025	54
	0.050	63
Ketoprofen	100 μg/mL	48

표 10에 따르면, 실시예 1~5의 생체 모방 복합물이 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.025% 농도에서 Ketoprofen 보다 우수하게 억제하였다. 또한 상기 실시예들의 처리 농도가 증가됨에 따라 농도 의존적으로 염증성 사이토카인 발현 억제율이 증가되는 양상을 보여 본 발명의 생체 모방 복합물은 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

제조 실시예 1 : 유연화장수

상기 실시예 1의 생체모방복합물을 함유하는 유연화장수 제형을 하기 표 11에 나타낸 조성으로 통상의 제조 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(단위:중량%)
생체모방복합물	60.0
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트60	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100.0

제조 실시예 2 : 크림

상기 실시예 1의 생체모방복합물을 함유하는 크림 제형을 하기 표 12에 나타낸 조성으로 통상의 제조 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(단위:중량%)
생체모방복합물	50.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
세테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에타올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
계	100.0

이상으로 본 발명을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. L-테아닌(L-theanine), 글루타치온(glutathione), 우유지질(milk lipid) 및 미네랄 워터 혼합물로 이루어지는 생체모방복합물을 함유하는 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 생체모방복합물은 L-테아닌(L-theanine) 0.00001~10 중량부, 글루타치온(glutathione) 0.00001~10 중량부, 우유지질(milk lipid) 0.00001~30 중량부, 미네랄 워터(mineral water) 10~99.99997 중량부가 혼합되어 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 생체모방복합물은 화장료 조성물 전 중량에 대하여 1~99중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 항산화용임을 특징으로 하는 화장료조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 피부주름 개선용임을 특징으로 하는 화장료조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 피부미백용임을 특징으로 하는 화장료조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화장료조성물은 피부자극 완화용임을 특징으로 하는 화장료조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.