KR101555067B1

KR101555067B1 - 미백제

Info

Publication number: KR101555067B1
Application number: KR1020097019635A
Authority: KR
Inventors: 다츠야 와타나베; 겐 가토; 히로시 우에노; 유코 하루타; 노리코 우에다; 도시미츠 요시오카
Original assignee: 유키지루시 메그밀크 가부시키가이샤
Priority date: 2007-03-13
Filing date: 2008-03-10
Publication date: 2015-09-22
Also published as: AU2008225531B2; CN101616657A; EP2138159A1; NZ579687A; JP5274814B2; EP2138159A4; HK1137151A1; JP2008255090A; CN101616657B; CA2680544C; US9173902B2; WO2008111562A1; US20100135941A1; AU2008225531A1; KR20090119980A; CA2680544A1

Abstract

본 발명은 분자량분포가 10 kDa 이하이고 메인 피크 200 Da~3 kDa, APL(평균 펩티드 사슬 길이)은 2~8, 유리아미노산 함량 20% 이하, 및 항원성이 β-락토글로불린 항원성의 1/10,000 이하인 특징을 갖는 유청단백 가수분해물을 유효성분으로서 함유하는 피부의 미백효과가 우수하고, 기미, 주근깨 등의 예방 및 치료에 유효한 미백제 및 이 미백제를 함유하는 화장품, 음식품, 사료, 의약 등의 미백제품을 제공하는 것을 과제로 한다.

Description

미백제{Whitening agent}

본 발명은 피부의 미백효과가 우수하여, 기미, 주근깨 등의 예방 및 치료에 유효하며, 또한 고미(苦味)가 적고, 안정성 및 안전성이 우수한 미백제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 미백제를 함유하는 미백용 화장품, 미백용 음식품, 미백용 영양조성물, 미백용 사료 또는 미백용 의약품에 관한 것이다.

피부의 색은 주로 멜라닌, 헤모글로빈, 카로티노이드 등의 착색성분의 표피 및 진피 내에 있어서의 종류, 양에 따라서 결정되고 있다. 또한, 이들은 일정하지 않고 다양한 외적·내적 인자에 의해서 제어되고 있다. 멜라닌 색소는 피부에 있어서 주로 멜라노사이트에 의해서 합성되어, 자외선 자극, 호르몬 분비나 주위의 각화세포(角化細胞)로부터 방출되는 자극인자에 의해서 활성화된다. 멜라닌 색소의 주된 역할은 자외선에 의한 피부장애를 완화시키는 것에 있다. 그러나, 과잉으로 멜라닌 합성이 항진, 또한 그 대사이상에 의해서 국소적인 색소침착, 이른바 기미 및 주근깨 등이 생겨, 미용상 커다란 문제가 된다.

피부로의 색소침착을 개선하는 작용 메커니즘으로서, 멜라노사이트 내에서의 멜라닌 생성억제, 기성 멜라닌의 환원, 표피 내 멜라닌의 배출촉진, 멜라노사이트 에 대한 선택독성을 생각할 수 있다. 그 중에서 미백작용 물질로서 환원작용을 갖는 L-아스코르브산 및 그의 유도체가 널리 사용되고 있으나, 충분한 미백효과는 얻어지고 있지 않다.

또한, 멜라닌 합성효소인 티로시나아제의 저해물질인 히드로퀴논, 알부틴, 코지산, 감초 추출물 또는 플라센타 추출물 등이 미백제로서 사용되고 있으나, 이들의 물질에는 안정성이나 안전성 등에서 문제가 있어, 새로운 미백제의 개발이 요망되고 있다.

또한, 유단백의 가수분해물이 티로시나아제 활성 저해작용을 갖는 것은 특허문헌 1에서 보고되어 있으나, 당해 특허에서는 분해물의 수용액이 백탁되어 있기 때문에 실제로 제품에 사용할 때 제한이 있어, 투명성을 요구하는 제품에는 사용할 수 없는 결점이 있었다. 또한, 펩티드 특유의 고미가 있기 때문에, 특히 경구적으로 섭취하는 식품이나 사료, 의약품 등을 제조할 때에는 풍미상의 제한이 있었다.

한편, 유단백의 가수분해물은 우유, 유제품에 있어서의 식물(食物) 알레르기를 방지하기 때문에 다양한 제품에 사용되고 있다. 특히, 우유의 유청단백은 모유의 단백과 달리, 알레르겐이 되는 것으로 생각되고 있어, 이를 방지하기 위해 유청단백을 효소로 가수분해하는 것이 알려져, 특허문헌 2나 특허문헌 3 등의 제조방법이 보고되어 있다.

이들의 방법, 예를 들면 유청단백 가수분해물을 제조할 때, 효소처리 후에 효소를 가열 비활성화시키고, 추가적으로 효소처리를 행하는 방법에 따르면, 1) 가열 비활성화 후에 생성되는 유청단백의 침전물, 응집물에 대해 효소처리가 어려워, 항원성의 저하 및 수율향상으로 이어지지 않으며, 2) 사전에 효소처리하기 전에 유청단백을 가열처리(90℃에서 10분 이상)하면 수율은 저하되는 등 많은 문제점이 있었다.

상기 문제점을 해결하기 위해 발명자 등은, 이미 유청단백을 특정의 조건으로 내열성의 단백 가수분해효소를 첨가하여, 열변성시키면서 효소분해하여 얻을 수 있는 유청단백 가수분해물의 제조방법을 개발하여, 이미 특허로서 성립되어 있다(특허문헌 4). 그러나, 이 제조방법으로 얻어진 유청단백 가수분해물 자체는 저알레르겐성 효과를 발휘하는 것은 확인되어 있었으나, 미백제로서의 기능에 대해서는 생각도 미치지 못했다. 또한, 한외여과(UF)막이나 정밀여과(MF)막 처리에 의해, 추가적으로 미백작용이 향상되는 것을 발견하였다.

특허문헌 1: 일본국 특허공개 평4-69315호 공보

특허문헌 2: 일본국 특허공개 평2-2319호 공보

특허문헌 3: 일본국 특허공개 평2-138991호 공보

특허문헌 4: 일본국 특허공개 평4-112753호 공보

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

이에, 본 발명에서는 안전성이 우수하고, 수용액이 높은 투명성을 나타내며, 고미가 적어 풍미상의 제한이 없기 때문에, 제품에 사용할 때의 제한이 없고, 피부에 대해 미백작용을 갖는 유청단백 가수분해물로 되는 미백제를 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 미백기능을 갖고, 안전성이 우수한 미백용 화장품, 안전성이 우수하며, 풍미상에 문제가 없는 경구적으로 섭취하는 미백용 음식품, 미백용 영양조성물, 미백용 사료 또는 미백용 의약품을 제공하는 것을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

상기 과제를 해결하기 위해, 발명자 등은 전술하는 바와 같이 유청단백을 특정의 조건으로 내열성 단백 가수분해효소를 첨가하여, 열변성시키면서 효소분해하여 얻을 수 있는 유청단백 가수분해물의 물성에 대해서 예의 검토한바, 본 발명의 특허청구범위에 기재하는 바와 같은, 분자량분포는 10 kDa 이하이고 메인 피크 200 Da~3 kDa, APL(평균 펩티드 사슬 길이)은 2~8, 모든 구성성분에 대한 유리아미노산(free amino acid) 함량 20% 이하, 항원성은 β-락토글로불린 항원성의 1/10,000 이하의 유청단백 가수분해물이 상기 과제를 만족하는 미백효과를 갖는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 하기의 구성으로 되는 발명이다.

(1) 이하의 특징을 갖는 유청단백 가수분해물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 미백제.

(A) 분자량분포는 10 kDa 이하이고 메인 피크 200 Da~3 kDa

(B) APL(평균 펩티드 사슬 길이)은 2~8

(C) 유리아미노산 함량 20% 이하

(D) 항원성은 β-락토글로불린 항원성의 1/10,000 이하

(2) 유효성분으로서 함유하는 유청단백 가수분해물이, 유청단백을 pH 6~10, 50~70℃에서 내열성 단백 가수분해효소를 사용하여 열변성시키면서 효소분해하고, 이를 가열하여 효소를 비활성화시켜서 얻어지는 것인 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 미백제.

(3) 유효성분으로서 함유하는 유청단백 가수분해물이, 유청단백을 pH 6~10, 20~55℃에서 단백 가수분해효소를 사용하여 효소분해하고, 이를 50~70℃로 승온시켜, pH 6~10, 50~70℃에서 내열성 단백 가수분해효소를 사용하여 미분해 유청단백을 열변성시키면서 효소분해하고, 이를 가열하여 효소를 비활성화시켜서 얻어지는 것인 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 미백제.

(4) (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 미백제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장품, 미백용 음식품, 미백용 영양조성물, 미백용 사료 또는 미백용 의약품.

발명의 효과

본 발명의 미백제는 티로시나아제 활성 저해작용, 멜라닌 생성 저해효과 및 색소침착 예방·개선효과가 현저하고, 상기 미백제는 피부의 미백효과가 우수하며, 기미, 주근깨 등의 예방 및 치료에 유용하다.

이 미백제의 유효성분으로서 사용되는 유청단백 가수분해물은, 후술하는 바와 같이, 항원성이 β-락토글로불린에 비해 1/10,000 이하, 유청단백에 비해 1/10,000 이하가 되는 것이 확인되어 있기 때문에, 매우 안전하다.

또한, 그 수용액은 투명하고, 고미도(苦味度)도 2 정도인 것으로부터, 미백제로서 사용할 때 제한이 없고, 특히 투명성을 요구하는 미백제로의 고배합이 가능하다.

또한, 상기 미백제를 유효성분으로서 함유하는 미백기능을 갖고, 안전성이 우수한 미백용 화장품, 안전성이 우수하며, 풍미상에 문제가 없는 경구적으로 섭취하는 미백용 음식품, 미백용 영양조성물, 미백용 사료나 미백용 의약품을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 미백제는 유청단백을 원료로 하고 있기 때문에, 간편하고 또한 경제적으로 용이하게 제조할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 미백제에 함유되는 유청단백 가수분해물은, 유청단백을 pH 6~10, 50~70℃로 하고, 여기에 내열성 단백 가수분해효소를 첨가하여 열변성시키면서 효소분해하고, 이를 가열하여 효소를 비활성화시킴으로써 되는 미백작용을 갖는 유청단백 가수분해물이며, 또한 상기 효소분해를 행하기 전에, 유청단백을 pH 6~10, 20~55℃에서 단백 가수분해효소를 사용하여 효소분해하고, 이를 냉각하지 않고 바로 상기 조건으로 효소분해하면 수율을 한층 높일 수 있다.

또한, 상기와 같이 조제한 유청단백 가수분해물을 추가적으로 분획 분자량 1 kDa~20 kDa, 바람직하게는 2 kDa~10 kDa의 한외여과(UF)막 및/또는 분획 분자량 100 Da~500 Da, 바람직하게는 150 Da~300 Da의 정밀여과(MF)막으로부터 선택되는 방법으로 농축함으로써, 한층 미백효과를 높일 수 있다. 또한, 더욱 고미를 경감하고, 투명성을 향상시키는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서의 유청단백은 우유, 물소, 산양, 인간 등의 포유동물의 유청, 그의 응집물, 분말, 또는 정제 단백을 말하고, 이를 효소반응시킬 때는 수용액의 상태로 사용한다.

이 용액을 pH 6~10으로 조정하는데, 통상 유청단백은 이 범위의 pH로 되어 있기 때문에 특별히 pH의 조정을 행할 필요는 없으나, 필요한 경우는 염산, 구연산 및 젖산 등의 산용액 또는 가성소다, 수산화칼슘 및 인산소다 등의 알칼리용액을 사용하여 pH 6~10으로 한다. 가열은 50~70℃에서 행하는데, 내열성 단백 가수분해효소는, 이 온도로 하여 첨가하는 것보다도 오히려 가열 전부터 첨가하여 효소분해를 행하는 편이 수율면에서 바람직하다.

일반적인 프로테아제(Protease)의 가장 적합한 온도는 40℃ 이하이지만, 내열성 단백 가수분해효소는 45℃ 이상이고, 내열성 단백 가수분해효소로서는, 종래 이러한 가장 적합한 온도를 갖는 내열성 단백 가수분해효소로서 알려져 있는 것이면 특별히 제한없이 사용할 수 있다. 이러한 내열성 단백 가수분해효소로서 파파인, 프로테아제 S(상품명), 프로리더(상품명), 서모아제(상품명), 알칼라제(상품명), 프로틴 A(상품명) 등을 예시할 수 있다. 내열성 단백 가수분해효소는 80℃에서 30분 가열하여 잔존활성이 약 10% 또는 그 이상이 되는 것이 바람직하다. 또한, 단독보다도 복수의 효소를 병용하는 것이 보다 효과적이다. 반응은 30분~10시간 정도 행하는 것이 바람직하다.

마지막으로, 반응액을 가열하여 효소를 비활성화시킨다. 효소의 비활성화는 반응액을 100℃ 이상에서 10초간 이상 가열함으로써 행할 수 있다.

그리고 반응액을 원심분리하여 상청을 회수하고, 상청을 건조하여 분말제품으로 한다. 또한, 원심분리했을 때 발생하는 침전물은 상청에 비해 저알레르겐화의 정도가 작기 때문에, 이를 제거하는 편이 바람직하나, 물론 반응액을 그대로 건조하여 사용해도 지장없다.

이 방법으로 얻어지는 유청단백 가수분해물은 Inhibition ELISA법[일본 소아알레르기 학회지, 1,36(1987)]으로 측정하여, 항원성이 β-락토글로불린에 비해 1/10,000 이하, 유청단백에 비해 1/10,000 이하가 되는 것이 확인되어 있기 때문에 매우 안전하다. 또한, 그 수용액은 투명하고, 고미도도 2 정도인 것으로부터, 제품에 사용할 때 제한이 없다. 또한, 투명성 및 고미의 평가는 하기의 방법으로 평가하였다.

투명성 평가법: 1% 유청단백 가수분해물 용액을 조제하고, 650 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

고미 평가법: 10% 유청단백 가수분해물 용액을 조제하고, 고미물질인 염산 키니네를 첨가하여, 고미를 평가하였다. 표 1에 나타내는 바와 같이, 고미점수가 2점 이하이면 음식품 등으로서 이용 가능하다.

본 발명의 유청단백 가수분해물은 그대로 미백제로서 사용하는 것이 가능하지만, 통상적인 방법에 따라서 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제, 드링크제 등으로 제제화하여 사용하는 것도 가능하다. 또한, 추가적으로 한외여과(UF)막이나 정밀여과(MF)막 처리에 의해 얻어진 유청단백 가수분해물에 대해서도 그대로 미백제로서 사용하는 것도 가능하고, 그대로 건조해서도 사용할 수 있다. 또한, 통상적인 방법에 따라서 제제화하여 사용하는 것도 가능하다.

또한, 이들을 제제화한 후, 이를 영양제나 요구르트, 유음료, 웨하스 등의 음식품, 영양조성물, 사료 및 의약품에 배합하는 것도 가능하다.

본 발명의 미백용 음식품, 미백용 영양조성물, 미백용 사료 및 미백용 의약품이란, 이 유청단백 가수분해물만을 포함하는 경우 외에, 안정제나 당류, 지질, 플레이버, 비타민, 미네랄, 플라보노이드, 폴리페놀 등, 다른 음식품, 사료 및 의약에 통상 포함되는 원재료 등을 함유할 수 있다.

또한, 그러한 미백용 음식품, 미백용 영양조성물, 미백용 사료 또는 미백용 의약품을 원재료로 하여, 다른 음식품 등에 통상 포함되는 원재료 등을 배합하여 조제하는 것도 가능하다.

미백용 음식품, 미백용 영양조성물, 미백용 사료 및 미백용 의약품에 있어서의 유청단백 가수분해물의 배합량은 특별히 제한은 없지만, 성인 1인 1일당 유청단백 가수분해물을 5 ㎎ 이상 경구적으로 섭취시키기 위해서는, 음식품, 사료 및 의약의 형태에 따라서도 다르지만, 전체 질량에 대해 일반적으로 0.001~10(중량/중량), 바람직하게는 0.1~5(중량/중량) 함유하고 있는 것이 바람직하다.

미백용 화장품으로서는 유액, 크림, 로션, 팩 등 통상의 화장품 형태로 사용할 수 있다. 이들의 화장품은 통상적인 방법으로 제조하고, 유청단백 가수분해물은 그 제조과정에서 적절히 배합하면 된다. 또한, 그러한 화장품을 원재료로 하여, 화장품을 제조하는 것도 가능하다. 화장품에 있어서의 유청단백 가수분해물의 배합량은 특별히 제한은 없으나, 전체 질량에 대해서 일반적으로 0.001~30(중량/중량), 바람직하게는 0.1~10(중량/중량) 함유하고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 미백제는 상기의 유효성분에 적당한 보조제를 첨가하고 임의의 형태로 제제화하여, 경구 또는 비경구투여가 가능한 미백 조성물로 하는 것이 가능하다. 제제화시에 통상 사용되는 충전제, 증량제, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 활택제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.

또한, 의약제제로서는 각종 형태를 선택할 수 있고, 예를 들면 캡슐제, 정제, 과립제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 좌제, 주사제, 연고제 등을 들 수 있다. 부형제로서는, 예를 들면 자당, 젖당, 전분, 결정성 셀룰로오스, 만니트, 경질 무수규산, 알루민산마그네슘, 합성 규산알루미늄, 메타규산알루민산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 인산수소칼슘, 카르복실메틸셀룰로오스칼슘 등의 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다.

이하에 실시예, 비교예 및 시험예를 나타내 본 발명에 대해서 상세하게 설명하나, 이들은 단순히 예시하는 것일 뿐, 본 발명은 이들에 의해서 조금도 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

유청단백 10% 수용액 1 L에, 파파인 50 U/g·유청단백 및 프로리 더(Proleather: 아마노 엔자임사제) 150 U/g·유청단백을 첨가하고, pH 8로 조정하여, 55℃에서 6시간 유청단백을 변성시키면서 효소분해를 행하였다. 반응액을 100℃에서 15초간 이상 가열하여 효소를 비활성화시키고, 원심분리하여 상청을 회수하고, 이를 건조하여 유청단백 가수분해물(HW)을 얻었다.

얻어진 유청단백 가수분해물(HW)의 분자량분포는 10 kDa 이하, 메인 피크는 1.3 kDa, APL은 7.2, 모든 구성성분에 대한 유리아미노산 함량 18.9%였다.

Inhibition ELISA법으로 β-락토글로불린에 대한 항원성의 저하를 측정한바 1/10,000 이하이고, 수율(효소반응액을 원심분리하여, 첨가량의 건조중량에 대한 상청의 건조중량의 비율(%)) 80.3%, 고미도는 2였다.

이와 같이 하여 얻어진 유청단백 가수분해물은 그대로 본 발명의 미백제로서 이용 가능하다.

[실시예 2]

유청단백 10% 수용액 1 L에, 파파인 50 U/g·유청단백 및 프로리더(Proleather: 아마노 엔자임사제) 150 U/g·유청단백을 첨가하고, pH 8, 50℃에서 3시간 효소분해를 행하였다. 이를 55℃로 승온시켜, 이 온도에서 3시간 유지하고, 단백을 변성시키는 동시에, 단백의 효소분해를 행하여, 100℃에서 15초간 이상 가열하여 효소를 비활성화시켰다. 이 반응액을 분획 분자량 10 kDa의 UF막(STC사제) 및 분획 분자량 300 Da의 MF막(STC사제)처리를 행하여, 농축액 분획을 회수하고, 이를 건조하여 유청단백 가수분해물(HW)을 얻었다.

얻어진 유청단백 가수분해물(HW)의 분자량분포는 10 kDa 이하, 메인 피크는 500 Da, APL은 3.0, 모든 구성성분에 대한 유리아미노산 함량 15.2%였다.

Inhibition ELISA법으로 β-락토글로불린에 대한 항원성의 저하를 측정한바 1/10,000 이하이고, 수율 65.4%, 고미도는 2였다.

또한, 일본국 특허공개 평4-69315호 공보에서 보고되어 있는, 이하의 유단백의 가수분해물을 조제하여, 비교시료로 하였다.

[비교예 1]

유청단백 120 g을 정제수 1,800 ㎖에 용해하고, 1 M 가성소다 용액으로 pH를 7.0으로 조정하였다. 이어서, 60℃에서 10분간 가열하여 살균하고, 45℃로 유지하여 아마노 A(아마노 엔자임사제) 20 g을 첨가하여, 2시간 반응시켰다. 80℃에서 10분간 가열하여 효소를 비활성화시키고, 동결 건조하여, 유청단백 가수분해물을 얻었다.

얻어진 유청단백 가수분해물의 분해율 18%, 수율 80.6%였다.

[비교예 2]

유청단백 120 g을 정제수 1,800 ㎖에 용해하고, 1 M 가성소다 용액으로 pH를 7.0으로 조정하였다. 이어서, 60℃에서 10분간 가열하여 살균하고, 45℃로 유지하여 아마노 A(아마노 엔자임사제) 20 g을 첨가하여, 8시간 반응시켰다. 80℃에서 10분간 가열하여 효소를 비활성화시키고, 동결 건조하여, 유청단백 가수분해물을 얻었다.

얻어진 유청단백 가수분해물의 분해율 30%, 수율 80.6%였다.

[비교예 3]

카세인 200 g을 정제수 2,000 ㎖에 현탁하고, 1 M 가성소다 용액으로 pH를 8.0으로 조정하여 완전히 용해하였다. 이어서, 80℃에서 10분간 가열하여 살균하고, 50℃로 유지하여 판크레아틴 F(아마노 엔자임사제) 20 g 및 아마노 A(아마노 엔자임사제) 20 g을 첨가하여, 10시간 반응시켰다. 80℃에서 10분간 가열하여 효소를 비활성화시키고, 동결 건조하여, 카세인 가수분해물을 얻었다.

얻어진 카세인 가수분해물의 분해율 38%, 수율 77.8%였다.

[비교예 4]

카세인 200 g을 정제수 2,000 ㎖에 현탁하고, 1 M 가성소다 용액으로 pH를 8.0으로 조정하여 완전히 용해하였다. 이어서, 80℃에서 10분간 가열하여 살균하고, 40℃로 유지하여 판크레아틴 F(아마노 엔자임사제) 15 g을 첨가하여, 5시간 반응시켰다. 80℃에서 10분간 가열하여 효소를 비활성화시키고, 동결 건조하여, 카세인 가수분해물을 얻었다.

얻어진 카세인 가수분해물의 분해율 20%, 수율 79.1%였다.

[시험예 1]

(투명성 시험)

실시예 1, 2 및 비교예 1~4의 각 단백 가수분해물의 1% 수용액을 조제하고, 650 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.

실시예 1, 2의 유청단백 가수분해물(HW)은 흡광도가 낮은 것으로부터 알 수 있는 바와 같이, 투명성이 높다. 한편, 비교시료에 있어서는 실시예 1, 2의 유청단백 가수분해물에 비해, 흡광도가 높아 투명성이 낮은 것을 알 수 있었다. 또한, 막 처리를 한 실시예 2의 유청단백 가수분해물(HW)의 흡광도는 실시예 1의 유청단백 가수분해물(HW)보다 낮아, 투명성이 우수하였다.

[시험예 2]

(티로시나아제 활성 저해작용)

티로시나아제는 티로신으로부터 멜라닌을 합성하는 효소로 합성경로 중, 티로신을 도파로, 또한 도파를 도파퀴논으로 변환한다. 티로시나아제(Sigma-Aldrich사제, 버섯 유래)를 사용하여, 실시예 1, 2에서 얻어진 유청단백 가수분해물(HW) 및 비교시료(비교예 1~4)를 각각 첨가하여 37℃에서 15분간 전처리를 행하였다. 기질로서 도파(Sigma-Aldrich사제)를 첨가하고, 추가적으로 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 476 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 무첨가의 값을 100%로 하여 저해율을 산출하였다.

그 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1 및 2의 유청단백 가수분해물(HW)은 0.01%~1.0%의 농도에서 농도 의존적으로 효소활성을 억제하였다. 또한, 비교시료에 있어서도 억제효과가 확인되었다.

그러나, 실시예 1, 2의 유청단백 가수분해물(HW)에는 비교시료와 비교하여 현저한 억제효과가 확인되었다. 또한, 막 처리를 행함으로써, 보다 억제효과가 향상되는 것을 알 수 있었다.

[시험예 3]

(멜라닌 생성 저해시험)

마우스 악성 흑색종 B16-F0 세포(다이닛폰 스미토모제약사로부터 구입)를 사용하였다. 소 태아 혈청을 10% 포함하는 Eagle's MEM 배지(Sigma-Aldrich사제)를 사용하여, CO₂ 인큐베이터(5% CO₂, 37℃) 내에서 배양하였다. B16 세포를 세포농도 3×10⁵개/㎖의 현탁액으로 하고, 이 1 ㎖를 배지가 9 ㎖ 들어 있는 100 ㎜ 디쉬에 분주(分注)하였다. 익일, 0.01~1%의 실시예 1, 2에서 얻어진 유청단백 가수분해물(HW), 비교시료(비교예 1~4) 각각을 포함하는 배지로 교환하여, 4일간 배양하였다. 배양종료 후, 세포를 벗기고, 각 군의 세포수를 5×10⁶개로 일치시켜 원심하였다.

1 ㏖/L NaOH를 500 ㎖ 첨가하여 용해한 후, 그 용해액의 405 ㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다.

무첨가군을 100%로 하여 각 군의 멜라닌 생성 저해율을 산출한 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1, 2의 유청단백 가수분해물(HW)에는 0.01%~1.0%의 농도에서 농도 의존적으로 멜라닌 생성 저해효과가 확인되었다.

또한, 비교시료에 있어서도 마찬가지로 저해효과는 보였지만, 본 발명의 유청단백 가수분해물(HW)이 비교시료에 비해 우수한 저해효과를 나타내었다. 또한, 막 처리를 행함으로써, 보다 저해효과가 향상되는 것이 명확해졌다.

[시험예 4]

(동물실험)

A-1계 암컷 기니피그, 체중 약 400 g의 배부(背部)를 제모하고, 배부에 자외선(UVA(max.360 ㎚) 30.3 kJ/㎡, UVB(max.312 ㎚) 4.8 kJ/㎡) 조사를 1회/일, 4일 행하였다. 그 후, 생리식염수를 기니피그 체중 1 ㎏당 5 ㎖ 투여하는 군(A군), 실시예 2의 유청단백 가수분해물(HW)을 기니피그 체중 1 ㎏당 2 ㎎/5 ㎖ 투여하는 군(B군), HW를 기니피그 체중 1 ㎏당 5 ㎎/5 ㎖ 투여하는 군(C군), HW를 기니피그 체중 1 ㎏당 10 ㎎/5 ㎖ 투여하는 군(D군)의 4 시험군(각 군 10마리씩)으로 나누고, 각각을 매일 1회 존데로 경구투여하여 4주간 사육하였다. 시료 투여 개시시와 시료 투여 종료시에 기니피그 배부 피부의 색소침착으로의 영향을 MINOLTA사제의 색소계(CHROMA METER CR-200)로 측정하였다. 자외선조사 전의 명도와 조사 후의 명도의 차로부터 조사 전의 명도를 100%로 하여 회복률을 산출하였다.

그 결과를 표 5에 나타낸다.

표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, B~D군은 현저한 명도의 개선효과를 나타내었다. 이 결과로부터, 본 발명의 유청단백 가수분해물(HW)에는 색소침착 예방·개선효과가 확인되었다.

[시험예 5]

(동물실험)

A-1계 암컷 기니피그, 체중 약 400 g의 배부를 제모하고, 배부에 자외선(UVA(max.360 ㎚) 30.3 kJ/㎡, UVB(max.312 ㎚) 4.8 kJ/㎡) 조사를 1회/일, 4일 행하였다. 그 후, 1일 2회, 4주간 피험부위에 시료를 연속 도포하였다. 피험시료는 물, 에탄올, 프로필렌글리콜을 2:2:1의 비율로 혼화한 것에 용해하고, 이를 도포하였다.

대조군(A군), 실시예 2의 유청단백 가수분해물(HW) 0.01%(B군), 0.1%(C군), 1%(D군)의 4시험군(각 군 10마리씩)으로 나누었다. 시료 도포 개시시와 시료 도포 종료시에 기니피그 배부 피부의 색소침착으로의 영향을 각각 MINOLTA사제의 색차계(CHROMA METER CR-200)로 측정하였다. 자외선조사 전의 명도와 조사 후의 명도의 차로부터 조사 전의 명도를 100%로 하여 회복률을 산출하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.

표 6의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, B~D군에서는 현저한 명도의 개선효과를 나타내었다. 이 결과로부터, 본 발명의 유청단백 가수분해물은 도포하는 것으로도 색소침착 예방·개선효과가 확인되었다.

본 발명에 있어서 얻어지는, (A) 분자량분포는 10 kDa 이하이고 메인 피크 200 Da~3 kDa, (B) APL(평균 펩티드 사슬 길이)은 2~8, (C) 유리아미노산 함량 20% 이하, (D) 항원성은 β-락토글로불린 항원성의 1/10,000 이하의 성분조성을 갖는 유청단백 가수분해물을 유효성분으로서 함유하는 미백제는, Inhibition ELISA법[일본 소아알레르기 학회지, 1,36(1987)]으로 측정하여 항원성이 β-락토글로불린에 비해 1/10,000 이하가 되는 것이 확인되어 있기 때문에, 매우 안전하다.

또한, 그 수용액은 투명하고, 고미도도 2 정도인 것으로부터, 제품에 사용할 때 제한이 없다. 티로시나아제 활성 저해작용, 멜라닌 생성 저해효과 및 색소침착 예방·개선효과가 현저하다.

[실시예 3]

(미백용 화장품(크림)의 조제)

표 7에 나타내는 배합으로 원재료를 혼합하여, 본 발명의 미백용 화장품(크림)을 조제하였다.

[실시예 4]

(미백용 화장품(로션)의 조제)

표 8에 나타내는 배합으로 원재료를 혼합하여, 본 발명의 미백용 화장품(로션)을 조제하였다.

[실시예 5]

(미백용 정제의 조제)

표 9에 나타내는 배합으로 원재료를 혼합한 후, 통상의 방법으로 1 g으로 성형, 타정하여 본 발명의 미백용 정제를 제조하였다.

또한, 이 정제 1 g 중에는 HW가 100 ㎎ 포함되어 있었다.

[실시예 6]

(미백용 액상 영양조성물의 조제)

실시예 2에서 얻어진 HW 50 g을 4,950 g의 탈이온수에 용해하고, 50℃까지 가열한 후, TK 호모믹서(TK ROBO MICS; 특수기화공업사제)로 6,000 rpm으로 30분간 교반 혼합하여 HW 함량 50 g/5 ㎏의 HW 용액을 얻었다. 이 HW 용액 5.0 ㎏에 카세인 5.0 ㎏, 대두 단백질 5.0 ㎏, 어유 1.0 ㎏, 차조기 기름 3.0 ㎏, 덱스트린 18.0 ㎏, 미네랄 혼합물 6.0 ㎏, 비타민 혼합물 1.95 ㎏, 유화제 2.0 ㎏, 안정제 4.0 ㎏, 향료 0.05 ㎏을 배합하고, 200 ㎖의 레토르트파우치에 충전하여, 레토르트 살균기(제1종 압력용기, TYPE: RCS-4CRTGN, 히사카 제작소제)로 121℃, 20분간 살균하여, 본 발명의 미백용 액상 영양조성물 50 ㎏을 제조하였다.

또한, 이 미백용 액상 영양조성물에는 100 g당 HW가 100 ㎎ 포함되어 있었다.

[실시예 7]

(미백용 음료의 조제)

탈지분유 300 g을 409 g의 탈이온수에 용해한 후, 실시예 1에서 얻어진 HW 1 g을 용해하고, 50℃까지 가열한 후, 울트라 디스퍼서(ULTRA-TURRAX T-25; IKA 재팬사제)로 9,500 rpm으로 30분간 교반 혼합하였다. 말티톨 100 g, 산미료 2 g, 환원 물엿 20 g, 향료 2 g, 탈이온수 166 g을 첨가한 후, 100 ㎖의 유리병에 충전하여, 90℃, 15분간 살균한 후, 마개를 밀봉하여, 본 발명의 미백용 음료 10병(100 ㎖ 들이)을 조제하였다.

또한, 이 미백용 음료에는 100 ㎖당 HW가 100 ㎎ 포함되어 있었다.

[실시예 8]

(개용 미백 사료의 조제)

실시예 2에서 얻어진 HW 200 g을 99.8 ㎏의 탈이온수에 용해하고, 50℃까지 가열한 후, TK 호모믹서(MARK II 160형; 특수기화공업사제)로 3,600 rpm으로 40분간 교반 혼합하여 HW 함량 2 g/100 g의 HW 용액을 얻었다. 이 HW 용액 10 ㎏에 대두박 12 ㎏, 탈지분유 14 ㎏, 대두유 4 ㎏, 콘유 2 ㎏, 팜유 23.2 ㎏, 옥수수전분 14 ㎏, 밀가루 9 ㎏, 밀기울 2 ㎏, 비타민 혼합물 5 ㎏, 셀룰로오스 2.8 ㎏, 미네랄 혼합물 2 ㎏을 배합하고, 120℃, 4분간 살균하여, 본 발명의 개용 미백용 사료 100 ㎏을 제조하였다.

또한, 이 개용 미백 사료에는 100 g당 HW가 20 ㎎ 포함되어 있었다.

Claims

이하의 특징을 갖는 유청단백 가수분해물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 미백제로서,

(A) 분자량분포는 10 kDa 이하이고 메인 피크 200 Da~3 kDa;

(B) APL(평균 펩티드 사슬 길이)은 2~8;

(C) 유리아미노산 함량 20% 이하;

(D) 항원성은 β-락토글로불린 항원성의 1/10,000 이하;

상기 유효성분으로서 함유하는 유청단백 가수분해물이, 유청단백을 pH 6~10, 50~70℃에서 내열성 단백 가수분해효소를 사용하여 열변성시키면서 효소분해하고, 이를 가열하여 효소를 비활성화시켜서 얻어지는 것인 것을 특징으로 하는 미백제.
삭제
제1항에 있어서,

유효성분으로서 함유하는 유청단백 가수분해물이, 유청단백을 pH 6~10, 20~55℃에서 단백 가수분해효소를 사용하여 효소분해하고, 이를 50~70℃로 승온시켜, pH 6~10, 50~70℃에서 내열성 단백 가수분해효소를 사용하여 미분해 유청단백을 열변성시키면서 효소분해하고, 이를 가열하여 효소를 비활성화시켜서 얻어지는 것인 것을 특징으로 하는 미백제.
제1항 또는 제3항의 미백제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장품.
제1항 또는 제3항의 미백제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 음식품.
제1항 또는 제3항의 미백제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 영양조성물.
제1항 또는 제3항의 미백제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 사료.
제1항 또는 제3항의 미백제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 의약품.