KR101549148B1

KR101549148B1 - 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부세포 보호용 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101549148B1
Application number: KR1020130129529A
Authority: KR
Inventors: 임혜원; 임창진
Original assignee: 주식회사 세바바이오텍; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2015-09-03
Also published as: KR20150049246A

Abstract

본 발명은 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 인간 피부각질세포 보호용 조성물에 관한 것으로서, 가신새 에탄올 추출물이 인간 HaCaT 피부각질세포에서 자외선으로 인한 세포 손상에 대해 광보호 효과가 있고 활성산소의 생성을 억제하는 효과가 있어 궁극적으로 자외선으로부터 세포를 보호하는 활성을 나타냄으로써 자외선에 의해 유도된 세포 사멸을 감소시키고, 세포를 보호하여 세포 생존력을 회복시킬 수 있으므로 자외선에 의한 피부 세포 보호용 화장품 및 의약품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부세포 보호용 및 치료용 조성물{Composition for protecting and curing human keratinocyte against UV-B comprising Phryma leptostachya var. asiatica Hara ethanol extract}

본 발명은 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부세포 보호용 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 태양광에 포함된 자외선은 피부에 직접적으로 과도하게 조사되는 경우, 홍반 형성이나 피부세포 내의 멜라닌색소 생성을 촉진시켜 기미나 잡티 발생의 원인이 되기도 하며, 표피에 분비되는 피지와 반응하여 과산화지질을 생성함으로써 피부트러블을 발생시키기도 하고, 심할 경우 피부암 발생의 원인이 되기도 한다. 자외선은 파장에 따라 UV-A (320~400 nm), UV-B (280~320 nm), UV-C (200~280 nm)로 구분되며, 이 중 지표에 도달하여 인체에 영향을 주는 자외선은 UV-A 및 UV-B로 알려져 있다.

특히 UV-B에 의한 노출은 피부 내에서 자유라디칼(free radical) 형성과 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)의 발생을 증가시키고, DNA, 세포막 및 단백질 등 세포성분들에 대한 산화적 스트레스를 유발시켜 피부노화를 일으키는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, 최근 천연 항산화제의 UV-B로 유도된 피부 손상을 막기 위한 다양한 연구가 진행 중이다(Joshi et al., 2012; Gonzales-Castaet al., 2011; Petrova et al., 2011; Ho et al., 2010).

한편, 가신새(Phryma leptostachya var. asiatica Hara)는 가신새과의 여러해살이풀로서 우리나라 각처의 산과 들에서 나는 다년생 초본이다. 생육환경은 반그늘 혹은 양지의 토양이 비옥한 곳에서 자라며 키는 약 70이고, 잎은 길이가 7~9, 폭이 4~7로 잎자루가 길며 양면 특히 맥 위에 털이 많고 가장자리에 톱니가 있으며 넓은 난형이고 마주난다. 유독식물로서 뿌리의 즙을 종이에 먹여서 파리를 죽이기 때문에 가신새라고 하며, 뿌리 또는 포기 전체를 짓찧어서 종기옴 벌레 물린 데 등에 붙이면 해독하는 효능이 있다. 한국, 일본, 중국, 히말라야 산맥, 동시베리아 등지에 분포한다.

이러한 가신새는 종래에 유충제거제, 살충제, 구충제 및 해독제로서 사용되어져 왔다. 또한 가신새에서 분리된 리그난 성분(phrymarolins Ⅰ, Ⅱ, haedoxan A)이 천연 살충 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 우르솔릭산은 몇몇 쥣과 및 인간 암세포에 세포독성을 갖는다는 정도가 보고되고 있을 뿐이다.

이에 본 발명자들은 피부에 대한 자외선 차단 효과가 우수한 새로운 천연소재를 모색하던 중, 가신새 추출물에 주목하여 그 기능을 실험해 본 결과, 가신새의 에탄올 추출물이 자외선에 대한 피부세포 보호 활성이 우수하고 세포에 대한 독성을 유발시키지 않아 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 화장품의 용도 및 약학적 용도로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. 일본 공개특허공보 제(평)6-16531호 2. 일본 공개특허공보 제(평)10-101543호

그러므로 본 발명의 목적은 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 치료용 약제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부보호용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가신새 에탄올 추출물은 70% 에탄올을 사용하여 수득한 추출물로서 상기 조성물에 10~200ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자외선은 UV-B일 수 있다.

또한, 본 발명은 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 치료용 약제를 제공한다.

도 1은 본 발명의 가신새 에탄올 추출물을 농도별로 전 처리한 후, UV-B로 조사한 다음, 피부세포 내에서 생성되는 활성산소종(ROS)의 수준을 각각 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 가신새 에탄올 추출물을 농도별로 전 처리한 후, UV-B로 조사한 다음, 피부세포 내에서 생성되는 산화질소의 수준을 각각 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 가신새 에탄올 추출물을 농도별로 전 처리한 후, UV-B로 조사한 다음, 세포의 생존율을 MTT 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 가신새 에탄올 추출물이 ultraviolet B(UVB)에 의해 유발되는 활성 산소종의 생성을 억제하고 세포의 산화 스트레스를 억제하는 활성이 있어 세포(인체 각질형성세포)를 자외선으로부터 보호하고 세포 생존율을 향상시켜, 궁극적으로 자외선에 의한 세포 보호 활성이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

UV-B는 활성산소종을 생성하여 산화적 스트레스를 유발함으로써 다양한 피부 구성 세포에 손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이는 궁극적으로 광노화 과정을 가속화시킨다. 본 발명에서는 가신새 에탄올 추출물이 UVB 조사로 인한 세포내 활성산소종의 생성을 효과적으로 억제하여 UVB로부터 세포를 보호하는 활성이 있음을 실험을 통해 확인하였다.

또한, 본 발명에서는 가신새 에탄올 추출물이 UVB로 인한 세포 사멸을 억제 해 세포의 생존율을 향상시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

참고로, UV-B는 세포자연사의 강한 유도제로 ROS 생성을 촉진시키고, 산화 스트레스를 유도하는 것으로 알려져 있다(Heck, et al., 2003; Jin et al., 2007). 따라서 본 발명의 가신새 에탄올 추출물을 처리하는 것은 피부 각질세포를 UVB에 의해 유도되는 산화 스트레스를 막는데 효과적이다. 가신새 에탄올 추출물을 처리하면 UVB 조사된 세포에서 가신새 에탄올 추출물이 ROS를 제거하므로 ROS의 생산을 감소시킬 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 가신새 에탄올 추출물은 자외선에 의한 피부손상을 억제하고 자외선으로부터 피부를 보호하는데 유용하게 사용될 수 있어, 가신새 에탄올 추출물은 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부치료용 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 가신새 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 가신새로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 가신새의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 바람직하게는 가신새의 뿌리에서 추출한 추출물일 수 있다.

상기 가신새로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 가신새 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 가신새 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 가신새 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 일실시예에 따른 가신새 추출물을 제조하는 방법을 조금 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

본 발명에서는 건조된 가신새 뿌리를 분쇄하여 분말화한 후, 상기 분말에 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 일주일동안 추출한 다음, 이러한 에탄올 추출물을 진공에서 증발시켜 건조된 파우더로 제조하는 과정을 거쳐 가신새 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명에 따른 가신새 에탄올 추출물의 약학적으로 유효한 양은 10 ~ 200ug/ml, 바람직하게는 200ug/ml일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 피부 손상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있고, 또는 자외선 흡수용 화장료 조성물로서 자외선 차단제 등으로 활용할 수도 있다.

본 발명의 피부외용 약제학적 조성물은 자외선으로부터 피부보호 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부손상 억제 및 피부 보호용 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 가신새 에탄올 추출물 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 가신새 에탄올 추출물 이외에, 가신새 에탄올 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 가신새 에탄올 추출물의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 10 ~ 200ug/ml이며, 바람직하게는 200ug/ml이다. 상기 가신새 에탄올 추출물의 함량이 10ug/ml 미만이면 자외선 흡수 효과가 크게 감소되고, 200ug/ml를 초과하는 경우에는 피부 자극을 초래할 수 있으며, 제형상의 문제점이 발생할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 가신새 에탄올 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시켜 안정화하여 제형화할 수도 있다. 상기 추출물을 나노리포좀 내부에 함유시키면, 추출물이 안정화되어 제형화시 침전형성, 변색, 변취 등의 문제점을 해결할 수 있으며, 성분의 용해도 및 경피흡수율을 높일 수 있어 상기 추출물로부터 기대되는 효능을 최대로 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 나노리포좀은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로서 평균 입자 지름이 10~500nm인 리포좀을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 나노리포좀의 평균 입자 지름은 50~300nm이다. 나노리포좀의 평균 입자 지름이 300nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다. 본 발명에 따라 상기 가신새 에탄올 추출물을 안정화하는데 사용되는 나노리포좀은 폴리올, 유성성분, 계면활성제, 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 나노리포좀에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자일리톨, 솔비톨 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 10~80중량%, 바람직하게는 30~70중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 유성(oil) 성분은 당업계에 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계 오일, 에스테르계의 합성오일, 디메치콘 및 사이크로메치콘계와 같은 실리콘 오일, 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유 및 어유와 같은 동식물성 오일, 에톡시레이티드 알킬에테르계오일, 프로폭시레이티드 알킬에테르계오일, 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질, 세레브로사이드 콜레스테롤, 시토스테롤 콜레스테릴설페이트, 시토스테릴설페이트, C₁₀-₄₀지방알콜 및 이의 혼합물이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여1.0~30.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 3.0~20.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 바람직하게는 음이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제이다. 음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트 및 트리알킬포스페이트를 포함한다. 비이온성 계면활성제의 구체적인 예는 알콕시레이티드 알킬에테르, 알콕시레이티드 알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르를 포함한다. 특히 바람직한 계면활성제는 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트류이다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~5.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 또 다른 성분인 인지질은 양쪽친화성 지질이 이용되며, 천연 인지질(예를 들어, 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예를 들어, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴이다. 특히, 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이 바람직하다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜콜린의 양이 23~95%, 그리고 포스파디딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 나노리포좀의 제조에 있어서, 인지질의 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.5~20.0중량%이며, 바람직하게는 2.0~8.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C₁₂-₂₂알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%이다.

본 발명의 나노리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

시약

하기 실시예를 위해 사용한 시약들은 다음과 같다. 먼저, SDS(sodium dodecyl sulfate), HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MTT(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), DCFH-DA(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate) 및 Griess 시약은 Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA)로부터 구입한 것을 사용하였다. 또한, DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), FBS(fetal bovine serum), 페니실린-스테렙토마이신 및 트립신-EDTA는 Gibco-BRL(Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입한 것을 사용하였으며, 모든 시약들은 상용되고 있는 최상의 품질의 것을 사용하였다.

세포배양

인간 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCat 및 쥐과 대식세포주인 RAW264.7(ATTC, Manassas, VA, USA) 세포들은 열처리로 불활성된 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO₂의 습윤 대기 및 37℃의 온도가 유지되는 조건 하에서 배양시켰다. 또한, RAW264.7 세포 성장을 위해 상기 배양 배지에 25mM HEPES(pH7.5)를 첨가하여 배양하였고, 실험에 사용한 모든 세포들은 6-웰 플레이트 상에 분주하여 사용하였다.

통계처리

실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 각 실험군들의 통계적 비교는unpaired Student's t-test를 통해 수행하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

< 실시예 1>

가신새 추출물 제조

가신새 추출물을 제조하기 위하여, 먼저 건조된 가신새 뿌리를 분쇄하여 분말화한 후, 상기 가신새 뿌리 분말에 70% 에탄올을 가하여 상온에서 일주일 동안 추출하였다. 상기 70% 에탄올 가신새 추출물은 진공에서 증발시키는 과정을 통해 감압 농축하여 건조된 파우더로 제조한 후 하기 실험에서 가신새 추출물을 70%의 에탄올에 녹여 시료로 사용하였다. 이때, 가신새 에탄올 추출물의 수득율은 13.1%이었다.

참고로 상기 건조된 가신새 뿌리는 2010년 8월 제주도의 지역 마트에서 구입하여 사용하였으며, 식물 동정은 춘천 강원대학교 생물과학부, 유기억 교수로부터 확인받았다. 본 발명의 상기 가신새 추출물 시료는 강원대학교 자연과학대학 생활과학과 식물표본관에 보관하여 승인번호로 KWNU56570을 부여받았다.

< 실시예 2>

UV -B에 의한 ROS 생성에 작용하는 가신새 추출물의 영향

본 발명자들은 실시예 1에서 제조한 가신새의 에탄올 추출물이 광노화에 의한 피부를 보호하는 활성이 있는지 확인하기 위해, UV-B 조사에 의해 발생하는 ROS의 생성을 가신새 에탄올 추출물이 어느 정도 억제하는 활성이 있는지 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.

먼저 이를 위해 2.0 x 10⁵세포수의 인간 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCat 세포를 6-웰 플레이트 상에 분주하여 배양한 후, UV-B 조사 이전에 새로운 배지로 교체하고 세포가 배양된 각 플레이트에 대해 0, 10, 50 및 200ug/ml 농도의 가신새 에탄올 추출물을 처리한 다음, 30분 동안 배양하였다. 이후 각 플레이트의 세포에 70 mJ/cm² UV-B를 조사하였다. 그런 뒤, 세포에서 생성되는 ROS의 측정은 Royall 및 Ischiropoulos에 의해 고안된 방법인 레독스-민감성 형광 프로브인 DCFH-DA를 이용하여 측정하였는데, 즉 상기 UV-B를 조사한 후, 24시간 동안 배양한 세포들에 5μM 농도의 DCFH-DA를 처리하고, 37℃에서 30분 동안 배양시킨 다음, 세포들을 모집하고 유세포 분석기를 사용하여 세포내 ROS의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, UV-B를 조사하지 않은 세포군에 비해 UV-B를 조사한 세포군의 경우 ROS의 생성이 2000배 이상 증가하는 것으로 나타난 반면, 가신새 에탄올 추출물을 전처리한 후, UV-B를 조사한 세포군에서는 가신새 에탄올 추출물을 전처리하지 않은 군에 비해 ROS의 생성이 현저하게 감소되는 것으로 나타났으며, 특히 200ug/ml의 농도를 처리한 군의 경우에는 에탄올 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 약 2배 이상으로 ROS의 생성이 억제되는 것으로 나타났다(도 1 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 가신새 에탄올 추출물이 자외선, 특히 UV-B를 효과적으로 차단할 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 본 발명의 가신새 에탄올 추출물이 피부 세포의 산화질소 생성에도 영향을 미치는지 확인하기 위해, 상기 가신새 에탄올 추출물을 전처리하고 자외선을 조사한 세포군들을 대상으로 세포 배양액을 Griess 반응(Sherman et al., 1993)분석을 통한 비색분석(colorimetric assay)으로 산화질소의 양을 측정하였으며, 이때 표준 곡선은 이미 알려진 아질산나트륨의 농도를 이용하여 작성하여 사용하였다.

분석 결과, 인간 각질형성세포주(human keratinocyte cell)인 HaCat 세포에서는 자외선 조사 유무 및 가신새 에탄올 추출물 유무와 관계없이 산화질소의 생성 정도에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 2 참조).

< 실시예 3>

가신새 에탄올 추출물의 세포독성 평가

피부에 적용되는 화장료 제품들은 피부에 대해 안정성을 확인받아야 할 필요가 있다. 따라서 본 발명자들은 본 발명의 가신새 에탄올 추출물이 피부 세포에 대해 세포독성이 있는지 확인하기 위해 1.0 x 10⁵세포수의 인간 각질형성세포(human keratinocytes)들을 6-웰 플레이트 상에 분주하고 0, 10, 50, 200ug/ml의 농도로 가신새 에탄올 추출물을 각각 처리한 다음, 30분 동안 배양 후, 70 mJ/cm²UV-B를 조사하였다. 이후 세포 생존 정도를 MTT 어세이를 통해 수행하였는데, 즉, 각 세포들에 대해 20 ㎕의 5mg/ml MTT 용액을 처리하고 2시간 동안 배양한 후, 트립신화 시키고, 세포들을 이소프로필 알콜로 용해시킨 다음, 살아있는 세포의 미토콘드리아에 의해 환원된 MTT로부터 형성된 포르마잔의 양을 540nm의 흡광도에서 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 다양한 농도로 가신새 에탄올 추출물을 처리한 인간 각질형성세포는 가신새 에탄올 추출물을 처리하지 않은 군과 비교했을 때 생존율이 거의 유사한 것으로 확인되었고, 특히 200ug/ml의 농도로 처리한 군에서도 세포사멸이 거의 일어나지 않는 것을 알 수 있었다.

참고로, 70 mJ/cm² UV-B를 조사한 세포군의 경우, 70 mJ/cm² UV-B를 조사하지 않은 세포군에 비해 세포 생존율이 다소 감소한 것으로 나타난 반면, UV-B를 조사하기 전에 가신새 에탄올 추출물을 전처리한 군에서는 세포가 거의 사멸하지 않고 UV-B를 조사하기 전의 수준으로 세포생존율을 보이고 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 가신새 에탄올 추출물이 표피 각질형성세포에 대해 세포 독성을 유발시키지 않아 비교적 세포에 대해 안정적이므로, 피부에 적용하는 화장료의 제조에 안심하고 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 제형예 1>

유연화장수(스킨로션)

하기 표에 나타난 바와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
가신새 에탄올 추출물	1.0
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
올레일알코올	0.1
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	15.0
벤조페논-9	0.05
향, 방부제	미량
정제수	to 100

< 제형예 2>

영양화장수( 밀크로션 )

하기 표에 나타난 바와 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
가신새 에탄올 추출물	3.0
프로필렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리어탄올아민	1.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔리탄세스퀴올레이트	1.0
카르복시비닐 폴리머	1.0
비에치티이	0.01
EDTA-2Na	0.01
향, 방부제	미량
정제수	to 100

<제형예 3>

영양크림

하기 표에 나타난 바와 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
가신새 에탄올 추출물	10.0
세토 스테아릴 알코올	2.0
글리세릴 스테아레이트	1.5
트리옥타노인	5.0
폴리솔베이트 60	1.2
솔리탄스테아레이트	0.5
스쿠알란	5.0
유동파라핀	3.0
싸이클론메치콘	3.0
비에치티이	0.05
델타 토코페롤	0.2
농글리세린	4.0
1.3-부틸렌글리콜	2.0
산타검	0.1
EDTA-2Na	0.5
향, 방부제	미량
정제수	to 100

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 UV-B에 의한 피부손상 억제 및 피부보호용 화장료 조성물에 있어서, 상기 가신새 에탄올 추출물은 70% 에탄올을 사용하여 수득한 추출물로서 상기 조성물에 200ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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가신새 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 UV-B에 의한 자외선에 의한 피부 손상 억제 및 피부 치료용 약제에 있어서, 상기 가신새 에탄올 추출물은 70% 에탄올을 사용하여 수득한 추출물로서 상기 약제에 200ug/ml의 농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 약제.
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