KR101895202B1

KR101895202B1 - 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 pb 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR101895202B1
Application number: KR1020170051181A
Authority: KR
Inventors: 민병선; 김정아; 이정형
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2018-09-05

Abstract

본 발명은 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 상기 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시키고, 멜라닌 형성을 억제함으로써, 우수한 피부 미백 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

Description

관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 포함하는 피부 미백용 조성물 {Composition comprising Norflavaspidic acid PB isolated from Dryopteris crassirhizoma for skin whitening}

본 발명은 관중(Dryopteris crassirhizoma)으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB(Norflavaspidic acid PB) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

피부는 우리 몸을 보호하는 생물학적 피부의 작용뿐만 아니라 미적인 기능과 감정 표현을 나타내는 사회적 피부로도 매우 중요한 역할을 하고 있다. 따라서 최근 피부의 미백 및 주름에 대한 사회적인 관심이 증가하고 있다.

피부색은 멜라닌(melanin), 혈관분포와 혈색소, 각질층의 두께 및 카로틴(carotene) 등 여러 가지에 의해 좌우되며, 이 중 멜라닌이 주된 역할을 한다. 멜라닌은 자외선과 물리·화학적 외부 독성물질로부터 피부를 보호하지만 과잉생성이 일어나게 되면 기미, 주근깨, 과색소침착, 피부 노화와 같은 문제를 야기한다.

멜라닌은 멜라닌 형성 세포(melanocyte)에 내재되어 있는 멜라노솜(melanosome)에서 멜라닌 생합성 과정을 통해 생성되는 것으로, 티로시나아제(tyrosinase), TRP-1(tyrosinase related protein-1) 및 TRP-2(tyrosinase related protein-2)와 같은 멜라닌 생성 효소에 의해 조절된다. 보다 자세하게는 자외선에 의해 각질 형성 세포(keratinocyte)와 멜라닌 형성 세포에서 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)가 세포막 수용체와 결합, 세포내 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 양을 증가시켜 PKA(protein kinase A), 티로시나아제의 활성을 유도한다. 티로시나아제는 티로신(tyrosine)을 도파(Dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환시키고, 도파퀴논은 자동 산화 효소 반응으로 도파크롬(dopachrome)을 거쳐 TRP-1과 TRP-2에 의해 멜라닌이 생성된다.

피부 미백은 피부를 밝고 하얗게 하는 것으로 정의된다. 미백의 작용기작은 여러 단계로 나뉘게 되는데, 멜라닌 합성 단계에서 진행을 억제하거나 차단함으로써 피부에서 멜라닌이 과도하게 침착하는 것을 억제하고, 피부 내의 색소 함량을 줄일 수 있다. 이러한 방법으로는 티로시나아제 유전자 발현 억제, 티로시나아제 효소에 대한 당전이(glycosylation) 저해, 티로시나아제 효소 활성 저해, 티로시나아제 효소 분해 촉진, 멜라닌 형성 세포에서 각질 형성 세포로의 멜라닌 전달 억제, 멜라닌 형성 세포에 대한 직접적인 세포 독성, 각질 제거와 각질 형성 주기 가속화에 의한 미백 등이 있다. 따라서 피부의 미백에 대해서 검정하기 위해서는 멜라닌 형성 억제 여부를 밝히는 것이 필요하다.

관중(Dryopteris crassirhizoma)은 면마과에 속하는 다년생 초본으로서, 우리나라 각지의 깊은 산골짜기 또는 나무숲의 그늘진 습한 땅에서 자란다. 세계적으로는 아시아 동부, 중국, 일본에도 분포되어 있다. 관중의 뿌리와 줄기는 한방약재로 쓰이며, 뿌리는 일반적으로 살충작용이 있으며, 해독, 해혈, 지혈 작용과 자궁수축 작용, 감기바이러스 억제 작용 등이 있으며, 예로부터 기생충 감염, 감기, 암을 치료하기 위한 전통적인 한방치료제로 사용되어 왔다. 관중은 또한, 항산화 작용(Shin, S.L., et al., 2010)과 항바이러스 작용 및 항균 작용, 항암 작용을 한다고 알려져 있다. 또한, 최근 연구에 따르면 관중이 충치 유발균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Sterptococcus mutans)의 성장을 억제하여 충치 예방 효과가 있다고 보고되었다.

이에 본 발명자들은, 관중 추출물의 미백 효과를 확인하는 과정에서, 관중 추출물로부터 분리한 화합물이 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시키고, 멜라닌 형성을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

종래선행기술인 한국공개특허 제2011-0101308호에는 관중 추출물을 포함하는 미백용 화장료 조성물이 기재되어 있고, 일본공개특허 제05-331041호에는 관중을 포함하는 식물 추출물의 미백 화장료가 기재되어 있으나, 본 발명의 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물은 전혀 언급 및 기재되어 있지 않다.

한국공개특허 제2011-0101308호, 관중 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물, 2011. 09. 16. 공개. 일본공개특허 제05-331041호, 미백 화장료, 1993. 12. 14. 공개.

Shin, S.L., et al., Antioxidant effects of the methanol extracts obtained from aerial part and rhizomes of ferns native to Korea, Korean J. Plant Res., 23(1), 38-46, 2010.

본 발명의 목적은 관중(Dryopteris crassirhizoma)으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB(Norflavaspidic acid PB) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 관중(Dryopteris crassirhizoma)으로부터 분리한 하기 화학식 1의 노르플라바스피딕산 PB(Norflavaspidic acid PB) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화장료 조성물은 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 억제할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 멜라닌의 생성을 억제하거나 기생성 된 멜라닌의 양을 감소시킬 수 있다.

상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼 및 바디클린저로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 관중으로부터 분리한 하기 화학식 1의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 약학 조성물은 티로시나아제의 활성을 억제할 수 있다.

상기 약학 조성물은 멜라닌의 생성을 억제하거나 기생성 된 멜라닌의 양을 감소시킬 수 있다.

상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 임신성 갈색 반점, 노인성 반점, 자외선 노출로 인한 반점, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과색소 또는 약물 사용 후의 과색소 침착일 수 있다.

상기 약학 조성물은 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 겔제 및 젤 중에서 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물은 관중 추출물로부터 분리할 수 있다.

상기 관중 추출물은 관중 뿌리줄기를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있다. 또한, 상기 관중 추출물은 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있으며, 상기 유기용매로는 헥산, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 등일 수 있다.

상기 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물은 관중 추출물을 크로마토그래피로 분획하여 얻을 수 있으며, 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 실리카겔 진공 액체 컬럼 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid column chromatography), HP-20 컬럼 크로마토그래피(HP-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 조제용 역상-고성능 액체 크로마토그래피(preparative reversed-phase high performance chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다.

본 발명은 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 노르플라바스피딕산 PB 화합물은 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~50중량%, 바람직하게는 0.001~30중량%가 함유될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼 및 바디클린저로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 또는 염료를 함유할 수 있다.

상기 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.001~50중량%, 바람직하게는 0.001~70중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며, 또한, 정해지지 않은 기간 동안에도 사용할 수 있고, 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 제형에 특별한 제한을 두지는 않으나, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 겔제 및 젤 중에서 선택되는 1종의 제형을 갖는 피부 외용제로 사용될 수 있으며, 상기 피부 외용제를 피부에 도포하여 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있고, 경피 흡수를 증가시키는 제제, 예를 들면 비한정적인 의미로 특히 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드, 계면활성제, 알코올, 아세톤, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 도포 빈도는 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 상당히 변할 수 있으며, 도포 빈도는 매달 내지 1일 10회, 바람직하게는 매주 내지 1일 4회, 더 바람직하게는 1주당 3회 내지 1일 3회, 보다 더 바람직하게 는 1일 1회 또는 2회가 제안된다.

상기 약학 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 피부, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

상기 화장료 조성물 또는 약학 조성물은 티로시나아제의 활성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화장료 조성물 또는 약학 조성물은 멜라닌의 생성을 억제하거나 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 관중(Dryopteris crassirhizoma)으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB(Norflavaspidic acid PB) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시킬 뿐만 아니라, 멜라닌 형성을 억제하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 이용하여 피부 미백 효과가 우수한 화장품 및 미백용 치료제 개발이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 농도 의존적으로 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시키는 것을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물의 티로시나아제 억제 활성을 확인한 결과를 보여주고 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 관중 추출물 및 화합물의 분리>

본 발명에서 사용된 관중(Dryopteris crassirhizoma)의 뿌리줄기는 서울의 경동한약시장에서 구입하였다.

건조된 관중의 뿌리줄기 9㎏에 25ℓ 메탄올을 넣어 상온에서 추출하는 과정을 3회 반복(25ℓ×3)한 후, 진공상태에서 농축하여 검은색의 고무진(gum) 형태의 관중 추출물 1.3㎏을 얻었다.

관중 추출물 1.3㎏을 물에 녹이고, 클로로포름(chloroform) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 가하여 클로로포름 분획물(738.4g), 에틸아세테이트 분획물(68.1g) 및 물 분획물(504.5g)을 얻었다. 이중, 클로로포름 분획물을 헥산(hexane):디클로로메탄(dichloromethane)(1:0→0:1[v:v]) 및 디클로로메탄:메탄올(1:0→0:1[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 실리카겔 진공 액체 컬럼(silica gel vacuum liquid column)을 수행하여 분획물 9개(Fr.1~Fr.8)를 얻었다. 분획물 Fr.8(115.3g)을 헥산:디클로로메탄(1:1→1:9[v:v]), 디클로로메탄:아세톤(1:99→1:9[v:v]) 및 디클로로메탄:메탄올(9:1→0:1[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 실리카겔 진공 액체 컬럼을 수행하여 6개의 소분획물(Fr.8-1~Fr.8-6)을 얻었다.

소분획물 Fr.8-3(30.4g)을 클로로포름:메탄올(99:1→0:1[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 가한 후, 다시 메탄올:증류수(1:1[v:v]) 등용매 조건에 따라 RP-18 컬럼 크로마토그래피를 가하여 노르플라바스피딕산 AB화합물(98.5㎎)과 소분획물 Fr.8-3-1을 얻었다.

상기 소분획물 Fr.8-3-1을 메탄올:증류수(3:7→10:0[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)(YMC Pak ODS-A column, 컬럼크기:20×250㎜, 입자크기:5㎛, 유속 6㎖/min, 60분)를 수행하여 머무름 시간(retention time, t_R)이 26분에서 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물(7.4㎎)을 얻었다.

<실시예 2. 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물의 물리화학적 구조 확인>

Norflavaspidic acid PB;

흰색 비정형 분말;

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 1 참조.

Position	δ_H	δ_c
1		106.5
2		198.4
3		109.4
4		196.9
5		47.1
6		184.6
7	3.36, 2H, s	18.4
8		202.3
9	2.88, 2H, q	32.6
12	1.26, 3H, s	25.4
13	1.26, 3H, s	25.4
1'		104.7
2'		164.6
3'		106.3
4'		161.6
5'	5.82, 1H, s	97.0
6'		165.3
8'		208.0
9'	1.70, 2H, dd	53.6
10'	3.11, 2H, m	19.6
11'	1.00, 3H, t	14.4

< 실험예 1. 세포 배양>

쥐의 멜라닌 세포주(murine melanoma cell)인 B16F10세포를 10% FBS(fetal bovine serum)와 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양액을 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂) 조건의 세포 배양기에서 배양하였다.

< 실험예 2. 멜라닌 감소 활성 확인>

B16F10 세포에 상기 실시예 1에서 분리한 노르플라바스피딕산 AB 화합물 및 노르플라바스피딕산 PB 화합물의 농도가 3, 10, 30uM이 되도록 각각 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로 이용하였다. 48시간 후에 세포를 PBS(phosphate buffer saline)로 2회 세척한 다음 세포를 수집(harvest)하였다. 수집한 세포에 1N NaOH를 넣고 80℃에서 반응시켜 세포를 완전히 용해시켰다. 용해시킨 세포 용해물을 이용하여 405㎚의 파장에서 흡광도를 측정한 후, 대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 각 화합물의 멜라닌 함량을 계산하였고, 그 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.

화합물	멜라닌 감소율 (IC₅₀, uM)
노르플라바스피딕산 AB	181.3
노르플라바스피딕산 PB	35.7

도 1에서 보여주듯이, 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 AB 화합물 및 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 농도 의존적으로 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시키며, 특히나 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 멜라닌 감소 활성이 더 높은 것을 확인하였다.

또한, 상기 표 2에서 알 수 있듯이, 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물의 멜라닌양 감소 활성이 노르플라바스피딕산 AB 화합물에 비해 현저히 높다는 것을 알 수 있었다.

이를 통해, 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시킴으로써 피부 미백 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 3. 멜라닌 형성(melanogenesis) 억제 확인>

IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)는 멜라닌 형성을 촉진하는, cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 포스포디에스테르가수분해효소(phosphodiesterase) 억제제로 멜라닌 생성 과정에 관여하는 세포 내 cAMP의 양을 증가시킨다.

B16F10 세포에 0.1mM의 IBMX를 처리한 후, 상기 실시예 1에서 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 농도가 3, 10, 30uM이 되도록 각각 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로, IBMX만을 처리한 것을 음성대조군으로 이용하였다. 48시간 후에 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 세포를 수집하였다. 수집한 세포에 1N NaOH를 넣고 80℃에서 반응시켜 세포를 완전히 용해시켰다. 용해시킨 세포 용해물을 이용하여 405㎚의 파장에서 흡광도를 측정한 후, 대조군의 흡광도 값을 100%로 하여 각 화합물의 멜라닌 함량을 계산하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보여주듯이, IBMX만을 처리한 음성대조군의 경우에는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 멜라닌 함량이 2배 이상 증가한 반면에, 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 처리한 경우에는 처리 농도 의존적으로 멜라닌의 양이 감소하는 것을 확인하였으며, 이때, 노르플라바스피딕산 PB 화합물의 멜라닌 합성 관련 IC₅₀값이 5.9uM이었다.

이를 통해, 본 발명의 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물이 멜라닌 형성 과정에 작용하여 멜라닌 형성을 억제함으로써 피부 미백 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

<실험예 4. 티로시나아제 억제 활성 확인>

멜라닌 합성 과정에 중요하게 작용하는 효소인 티로시나아제의 억제 활성을 확인하였다.

B16F10 세포에 0.1mM의 IBMX를 처리한 후, 상기 실시예 1에서 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물의 농도가 3, 10, 30uM이 되도록 각각 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로, IBMX만을 처리한 것을 음성대조군으로 이용하였다. 48시간 후에 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 세포를 수집하였다. 수집한 세포에 세포 용해버퍼(cell lysis buffer, 50mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM sodium orthovanadate, 1% NP-40, protease inhibitors cocktail)를 넣고 세포를 용해시킨 후, 4℃에서 15,000rpm으로 30분간 원심 분리하여 상층액을 확보하였다.

상층액의 단백질 양을 정량한 후 50㎍의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분리하였고, PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인으로 이동시켰다(transfer). 상기 멤브레인은 실온에서 1시간 동안 5% 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹(blocking)한 후 2시간 동안 티로시나아제의 1차 항체에 반응시켰다. 이때, 로딩 대조군으로 튜불린(tubulin) 항체를 이용하였다. 이후에는 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합된 2차 항체를 반응시켰고, 화학발광시스템(chemiluminescence system)을 이용하여 티로시나아제의 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 보여주듯이, 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 처리한 경우에, 처리 농도에 의존적으로 티로시나아제의 양이 감소하는 것을 확인하였다.

상기 실험예 2 내지 실험예 4의 결과를 통해, 본 발명의 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물은 피부 내의 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시킬 뿐만 아니라 멜라닌 형성 과정을 억제함으로써 피부의 미백 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

<실험예 5. 독성실험>

실험예 5-1. 급성독성

본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군은 10마리, 실험군은 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 아무것도 투여하지 않았으며, 실험군은 본 발명의 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 2.0g/㎏(일반적인 동물실험에서 사용되는 양의 50배 정도)의 농도로 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2.0g/㎏ 농도의 본 발명의 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 투여한 실험군은 모두 생존하였다.

실험예 5-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 관중으로부터 분리한 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<제제예 1. 화장료 제조>

제제예 1-1. 크림 제조

본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물 5g에 시토스테롤 4g, 폴리글리세릴 2-올레이트 3g, 세라마이드 0.7g, 세테아레스-4 2g, 콜레스테롤 3g, 디세틸포스페이트 0.4g, 농글리세린 5.0g, 선플라우어오일 22g, 카르복시비닐폴리머 0.5g, 트리에탄올아민 0.5g, 방부제 및 향료 미량 및 정제수를 총 무게가 100g이 되도록 혼합하였고, 통상의 크림 제조 방법에 따라 영양 크림을 제조하였다.

제제예 1-2. 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피롤리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 혼합 생약의 추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.

제제예 1-3. 유액 제조

세틸알코올 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 유액을 제조하였다.

제제예 1-4. 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.

<제제예 2. 약학적 제제>

제제예 2-1. 정제의 제조

본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 이용하여, 하기 표 3에 기재된 성분을 혼합한 후, 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

원료명	중량(㎎)
노르플라바스피딕산 PB 화합물	100
옥수수 전분	100
유당	100
스테아린산 마그네슘	2

제제예 2-2. 친수성 연고제의 제조

본 발명의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 이용하여, 하기 표 4에 기재된 조성에 따라, 통상의 방법으로 친수성 연고제를 제조하였다.

원료명	함량(중량%)
노르플라바스피딕산 PB 화합물	8
백색 바세린	35
스테아릴 알콜	30
에칠(또는 메칠)p-옥시벤조에이트	미량
프로필렌글리콜	20
라우릴 황산 나트륨	3.4
프로필 p-옥시벤조에이트	미량

Claims

관중(Dryopteris crassirhizoma)으로부터 분리한 하기 화학식 1의 노르플라바스피딕산 PB(Norflavaspidic acid PB) 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 멜라닌의 생성을 억제하거나 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼 및 바디클린저로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
관중으로부터 분리한 하기 화학식 1의 노르플라바스피딕산 PB 화합물을 유효성분으로 포함하는 주근깨, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 임신성 갈색 반점, 노인성 반점, 자외선 노출로 인한 반점, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과색소 또는 약물 사용 후의 과색소침착인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 티로시나아제의 활성을 억제하는 주근깨, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 임신성 갈색 반점, 노인성 반점, 자외선 노출로 인한 반점, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과색소 또는 약물 사용 후의 과색소침착인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항에 있어서,
상기 약학 조성물은 멜라닌의 생성을 억제하거나 기 생성된 멜라닌의 양을 감소시키는 주근깨, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 임신성 갈색 반점, 노인성 반점, 자외선 노출로 인한 반점, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과색소 또는 약물 사용 후의 과색소침착인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물은 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 겔제 및 젤 중에서 선택되는 하나 이상의 제형을 갖는 주근깨, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 임신성 갈색 반점, 노인성 반점, 자외선 노출로 인한 반점, 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과색소 또는 약물 사용 후의 과색소침착인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.