KR101516691B1 - 자트로파 메틸 에스테르 및 부산물 제조를 위한 통합 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종자 외피의 가치가 통합된 자트로파 커카스의 햇볕 건조된 전종자 캡슐, 탈유 케이크 및 조 글리세롤 동시 생성물 스트림으로부터 지방산 메틸에스테르 (바이오디젤)의 제조를 위한 보다 단순하고 에너지 효율적인 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 증류를 통한 과량의 메탄올 회수를 필요로 하지 않는, 메틸 에스테르의 정제를 위한 비용 효율적인 수지 처리, 및 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 고밀도 에너지 브리케트 (briquettes) 및 폴리히드록시알카노에이트 생분해성 폴리머를 제조하기 위한 동시 증기 이용 방법에 관한 것이다.

Description

자트로파 메틸 에스테르 및 부산물 제조를 위한 통합 방법{INTEGRATED PROCESS FOR THE PRODUCTION OF JATROPHA METHYL ESTER AND BY PRODUCTS}

본 발명은 전종자 (whole seed) 캡슐로부터 자트로파 메틸 에스테르를 제조하는 향상된 통합 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 증류를 통한 과량의 메탄올 회수를 필요로 하지 않는, 메틸 에스테르의 정제를 위한 비용 효율적인 수지 처리, 및 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 고밀도 에너지 브리케트 (briquettes) 및 폴리히드록시알카노에이트 생분해성 폴리머를 제조하기 위한 동시 증기 이용 방법에 관한 것이다.

가솔린 및 디젤 엔진으로 사용하기 위한 자트로파 커카스 (Jatropha curcas) 오일에 대한 호주 특허 제 AU-A-15448/83 (Yuko Chemical Co. Ltd.에 양도됨)을 참조할 수 있다. 이러한 선구적인 노력은 자트로파 오일의 이로움을 가져왔지만, 최신 일일 디젤 엔진 내에 상당 비율로 사용하기에 원유는 지나치게 점성이라는 것이 당업자에게 잘 알려져 있다.

산 및 알칼리에 의하여 각각 촉매화되는 에스테르화 및 에스테르 교환 반응 공정의 조합을 통한 지방산 알킬 에스테르를 생산하는 관련 방법들을 개시하는, Haas et al.의 미국 특허 제 6,399,800호 및 Brunner et al.의 미국 특허 출원 제 2004/0102640 A1호를 참조할 수 있다. 본원의 요지에 대한 언급은 없다.

황산 및 파라 톨루엔 술폰산 촉매를 이용하여, 동물 지방을 포함하는 다양한 트리글리세라이드로부터 메틸 에스테르를 얻는, 독일 특허 출원 제 DE 102,43,700 A1 호를 참조할 수 있다. 본원의 요지에 대한 언급은 없다.

전종자로부터 자트로파 메틸 에스테르의 생산을 위한 통합 방법이 부산물의 회수와 통합되어 개시되는, Ghosh et al.의 특허 출원 (미국 특허 출원 제 11/00239호; PCT/IN04/00329 및 대응 국내 단계 출원들)을 참조할 수 있다. 전종자로부터 배출되는 원유를 NaOH로 중화하여 유리 지방산 함량을 감소시킨 다음, 트리글리세라이드 1 몰당 3 몰의 메탄올의 이론적 요건에 대하여 트리글리세라이드 오일 1 몰당 메탄올 5.0-5.5 몰로 메탄올성 KOH와 에스테르 교환반응시킨다. 그 후, 상기 메틸 에스테르를 순수 글리세롤 (100 kg의 메틸 에스테르 당 4-5 kg)로 세척을 통하여 정제한 다음, 물로 세척하여 >98% 순도 및 EN14214 및 ASTM 사양의 모든 요구 조건을 충족시키는 생성물을 수득한다. 조 글리세롤 층을 증류하여 메탄올을 회수한 다음, 산성화하여 K₂SO₄ 및 비누질 물질을 회수한 후, 다시 증류하여 글리세롤을 순수한 형태로 회수하고, 소량의 증류기 바닥물(still bottom)를 폐기물로서 남긴다. 이 공정의 한가지 결점은 오일 전부가 메틸 에스테르 형태로 회수되지 않고, 작은 부분이 유리 지방산 함량에 비례하여 형성되는 비누로 전환된다는 것이며, 따라서, 오일의 유리 지방산 함량이 반드시 가능한 한 낮게 유지되어야 한다. 공급 원료로서 전종자 캡슐의 이용 또는 메틸 에스테르의 무수 정제 공정 또는 조 글리세롤로부터 폴리히드록시알카노에이트의 생산 공정에 대한 언급은 없다.

S, Mandpe S. Kadlaskar, W. Degen 및 S. Keppeler (2005-26-356, Proceedings of SAEINDIA Conceference 2005)에 의한 학술 논문 "On Road Testing of Aadvanced Common Rail Diesel Vehicles with Biodiesel from the Jatropha curcas Plant"를 참조할 수 있으며, 이는 상기 인용된 문헌에서 Ghosh et al.에 의하여 개시되는 방법에 따라 제조되는 순수 (neat) 메틸 에스테르로 구동되는 C-클래스 메르세데스 자동차의 성능에 대하여 기재한다.

동일 또는 상이한 공급 원료를 이용하여 상이한 업체에 의하여 제조되는 전 세계의 메틸 에스테르에 대한 평가를 행하는, 유럽 프로젝트 "Local and Innovative Biodiesel" (Altener 계약 No. 4.1030/C/02-022; http//www.fedarene.org/publications/projects/contract/biodiesel/home.htm; 코디네이터- EREN; Austrain Biofuels Institute E.V. - 동시 계약자에 의하여 제공된 보고서)를 참조할 수 있다. Ghosh et al.의 발명(PCT/IN04/00329; 미국 특허 출원 제 11/00239호)의 방법에 따라 제조되는 자트로파 메틸 에스테르 (JME-05-728)는 얻어지는 동력, 연료 소모 및 장기간 성능의 측면에서 최상의 엔진 성능을 제공하였다.

자트로파 커카스가 바이오디젤의 적합한 급원이라는 전망에 대하여 기재하는, D. Fairless의 학술 논문 "Biofuel - The littel shrub that could - may be" (Nature, 449, 2007. pp. 652-655)을 참조할 수 있다.

연료원 및 원하는 사양으로서 바이오매스 펠릿의 가능성을 상세히 논의하는, IEA Bioenergy Task 40의 보고서 (http://www.city.northbay.on.ca/business/presentations/woodPellets/Global%20wood%20pellets%20market%20and%20industry%20Nov%2007%20report.pdf)를 참조할 수 있다.

종자 분리 후 자트로파 커카스의 전종자 캡슐로부터 브리케트를 생산할 가능성을 기재하는, Ghosh et al.의 학술 논문 "Prospects for Jatropha Methyl Ester (Biodiesel) in India" (Int . J. Environ . Stud . (Taylor & Francis, U.K.) - special issue on India's future energy options; 2007, 64, pp 659-674)를 참조할 수 있다.

상이한 바이오디젤 정제 방법들을 기재하는, M. Berrios 및 R.L. Skelton의 학술 논문 "Comparison of purification methods for biodiesel" (Chemical Engineering Journal, 2008, pp. 459-465)을 참조할 수 있다. 구체적으로, 물 세척, 이온 교환 수지 이용, 및 흡착제로서 규산 마그네슘의 이용에 대한 비교 평가가 행하여 졌다.

무수 (water-less) 공정으로 만드는 증류 공정에 의한 유채씨유의 메틸 에스테르의 제조 방법을 기재하는, Gross et al.의 독일 특허 제 DE 43 01 686 C1을 참조할 수 있다.

무수 공정을 통하여 잔여 비누 및 유리 글리세롤을 제거하기 위하여 0.6, 0.2 및 0.1 ㎛ 기공 크기의 세라믹 막을 사용하는, Wang et al.의 학술 논문 "Refining of biodiesel by ceramic membrane separation" (Fuel Processing Technology, Article in Press, 20 December 2008)을 참조할 수 있다.

두 가지 방식으로: 한 가지는 수분, 메탄올 및 글리세롤 제거를 위하여, 다른 한 가지는 수지 상의 수소 (H+)를 촉매의 나트륨 (Na+)으로 주로 교환시키는 촉매, 염 및 비누의 이온 교환을 위하여, 사용될 수 있는 수지 PD206 [Purolite Application note/Purolite PD-206]에 대하여 언급하는, Purolite의 웹 사이트 (http://www.desmoparts.com/filters/purolite/HBD-Purolite%20Regeneration.pdf)를 참조할 수 있다. 바이오디젤로부터 물, 메탄올 및 글리세롤 흡착 후, 수지 부피가 수지의 건조 부피의 두 배로 팽창하는 것으로 보고된다. 더욱이, 제1 재생에서 비드 파손으로 인한 10% 마모가 추정된다. 비드 파손 및 작용기 손실은 PD206이 재생될 수 있는 횟수를 결정하는 제한 요인이며, 현재 2-4 재생 후 PD206을 교체하여야 할 필요가 있다. 수지의 사용은 메틸 에스테르 내 불순물 양이 최소일 경우에만 실행가능하다고 할 수 있다.

메틸 에스테르의 정제 및 조 글리세롤 층의 이용을 개시하는, Bam et al.의 미국 특허 제 5,424,467호를 참조할 수 있다. 글리세롤 층 내 모노- 및 디글리세라이드 불순물이 추가적인 양의 메탄올과의 반응을 통하여 원하는 메틸 에스테르로 전환될 수 있는 것으로 기재되어 있다. 본 발명에 개시되는 트리글리세라이드 오일과의 추가적인 반응 공정을 통한 메탄올 회수에 대한 언급은 없다.

메틸 에스테르 내 잔여 불순물을 최소화하면서 조 글리세롤 층 내 그들을 강화시키는, 매우 소량의 순수 글리세롤 (메틸 에스테르 100 kg 당 ca. 3 kg)을 사용하여 조 메틸 에스테르를 세척하는 효율적인 방법을 제공하는, Ghosh et al.의 특허 출원 (미국 출원 제 11/00239호; PCT/IN04/00329)를 다시 참조할 수 있다. 그 결과, 메틸 에스테르로부터 메탄올 회수가 요구되지 않으며, 글리세롤 층으로부터 이러한 회수가 증류에 의하여 행하여 진다. 보고된 메탄올 회수는 사용되는 과량의 메탄올의 ca/ 70-80%이다. 글리세롤 층으로부터 메탄올을 회수하는 다른 가능한 방법, 또는 동시 생성물 스트림으로부터 폴리히드록시알카노에이트 (PHAs)를 제조하는 것에 대한 언급은 없다.

특허 출원 제 WO/2006/084048 호는 일반적으로 바이오디젤 연료, 보다 구체적으로 전형적인 에스테르 교환 반응에 의하여 생성되는 폐 글리세롤을 바이오디젤 연료의 혼화가능하고 연소가능한 성분으로 전환시키는 방법에 관한 것이다.

글리세롤로부터 유도되는 다양한 생성물, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 1,2-프로판디올, 비누, 약물, 폭약, 세제, 화장품, 디히드록시-아세톤 (DHA), 아크롤레인, 에피클로로히드린, 합성가스-연료, 글리세롤 카보네이트, 부동제, 폴리머로의 촉매 전환 등이 기재되는, Pagliaro et al.의 학술 논문 "From glycerol to value-added products" (Angew, Chem. Int. Ed. (2007), 46, 4434 -4440)을 참조할 수 있다. 그러나, 바이오폴리머 (PHAs) 생산에 대한 참조는 없다.

바이오디젤 공정의 조 글리세롤 부산물로부터 메탄올을 제조하는 방법을 개시하는, Goetsch et al.의 미국 특허 제 7,388,034 호를 참조할 수 있다.

PHA의 제조 및 특성에 관한 많은 종래 기술을 인용하는, "Biopolymers for Medical and Pharmaceutical Applications", Vol. 1&2, A. Steinbuchel and R. H. Marchessault, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA (2005) 및 그 안의 참조 문헌들을 참조할 수 있다. 본 발명에 속하는 PHA 제조에의 접근에 대한 언급은 없다.

유사한 모노머 조성을 가지는 PHA를 생산하는, E2 배지 내 상이한 탄수화물 유사 글루코스 (2%), 프럭토오스 (2%) 및 글리세롤 (4%)을 이용하여 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) KT2442의 재조합 균주의 증식을 연구하는, G.N.M.Huijberts et al.의 논문 "Pseudomonas putida KT2442 cultivated on glucose accumulates poly(3-hydroxyalkanoates) consisting of saturated and unsaturated monomers"을 참조할 수 있다. PHA 수율은 세포 건조 중량 기준으로 20.5% (w/w)였다.

Taniguichi et al.의 논문 "Microbial production of poly(hydroxyalkanoate)s from waste edible oils" (Green Chem. 2003, 5, pp 545-548)을 참조할 수 있다. 상기 논문은 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha)를 이용하는 2-단계 발효 공정(하나는 배양 증식을 위한 것이고, 다른 하나는 폴리히드록시알카노에이트 생산을 위한 것임)에서 얻어지는 결과를 기재하며, 이는 팜(palm)과 라드(lard)를 이용할 때 세포 건조 중량 기준으로 83%의 최대 PHA 수율을 제공한다. 생산 배지는 또한 무기 영양소/미량 영양소를 함유하였으며, 증식 배지는 고비용의 영양 배지를 함유하였다.

R.D. Ashby et al.의 연구 논문 "Bacterial poly(hydroxyalkanoate) polymer production from the biodiesel co-product stream." (Journal of Polymers and the Environment, 2004, volume 12, pp 105-112)을 참조할 수 있으며, 상기 논문에서 2-단계 발효 공정에서 글리세롤, 지방산 비누 및 잔여 지방산 메틸 에스테르를 1% 내지 5% 농도로 함유하는 콩 (soya) 기제 바이오디젤 생산 (CSBP) 스트림의 동시 생성물 스트림으로부터 PHA 생산을 위하여 슈도모나스 올레오보란스 (Pseudomonas oleovorans) 및 슈도모나스 코루가타 (Pseudomonas corrugata)를 이용하였다. 상기 알칼리 동시 생성물 스트림 (pH 13)을 기질로 사용하기 전에 1 N HCl로 pH 7로 중화한다. 박테리아를 펩톤을 포함하는 몇 가지 고비용의 구성 성분을 포함하는 Luria-Bertani (LB) 배지 내에서 증식시킨 후, 세포를 중화된 동시 생성물 스트림 및 부가적인 영양소/미량 영샹소를 함유하는 생산 배지 내로 이동시켰다. 폴리머 세포 생산성은 슈도모나스 코루가타에 대하여 세포 건조 중량 (CDW)의 단지 42%였으며, 글리세롤에 대한 폴리머 수율은 최적화된 조건 하에서도 < 5%였다. 이러한 조건은 고비용의 영양소가 강화된 특별 배지의 이용을 포함한다.

E.J.Bormann 및 M.Roth의 연구 논문 "The production of polyhydroxybutyrate by Methylobacterium rhodesianum and Ralstonia eutropha in media containing glycerol and casein hydrolysates" (Biotechology Letters, 1999, Volume 21, pp1059-1063)을 참조할 수 있으며, 상기 논문에서 상기 박테리아에 의한 폴리히드록시부티레이트 (PHB)의 생산은 카제인 펩톤 또는 카사미노산과 조합된 글리세롤을 함유하는 배지 내에서였다. 글리세롤은 2.5%, 5% 및 7.5%의 농도로 사용되었다. 폴리머 수율은 글리세롤에 대하여 17% (w/w)로 보고되었으며, 폴리머 함량은 세포 건조 중량의 백분율로서 39±6%였다.

Koller M., et al.의 연구 논문 "Production of polyhydroxyalkanoates from agricultural waste and surplus materials" (Biomacromolecules, 2005, Volume 6, pp 561-565)를 참조할 수 있으며, 상기 논문에서 폴리히드록시알카노에이트를 호삼투성 생물에 의하여 육분 및 골분이 보충된 유청 가수분해물 (0.55%) 및 글리세롤 액상 (1.6%)으로부터 얻었다. PHA 수율은 글리세롤에 대하여 23%였으며, 폴리머는 253 kDa의 분자량 및 128℃ 및 139℃에서 용융 흡열을 가졌다.

Ito et al.의 논문 (J. Bioscience & Bioengineering, 2005, 100, pp 260-265)을 참조할 수 있으며, 상기 논문은 바이오디젤 제조 공정 후 배출되는 글리세롤-함유 폐기물로부터 수소 및 에탄올의 생화학적 생산에 대하여 기재한다. 폐기물 내 높은 염 농도의 존재로 인하여 순수 글리세롤보다 생화학적 활성이 훨씬 낮은 것으로 보고된다.

바이오디젤 동시 생성물 스트림으로부터 PHA를 생산하기 위한 비용 효율적인 공정은 종래 기술로부터 분명하지 않으며, 고비용의 보조 영양소 및 번거로운 2-단계 공정을 사용하여도 세포 건조 중량에 대한 PHA 수율은 <50%로 대개 보고된다. 종래 기술은 또한 글리세롤-함유 폐기물의 사용은 순수 글리세롤보다 훨씬 더 낮은 생화학적 생산성을 초래하며, 이는 높은 염 수준의 존재에 기인하는 것임을 교시한다. 본 발명은 이러한 모든 근본적인 한계를 극복하고, 자트로파 전종자 캡슐로부터 출발하여 메틸 에스테르 공정의 글리세롤 동시 생성물 스트림으로부터 PHA를 제조하는 신규한, 단순하고 비용 효율적인 공정을 발견하려 한다. (i) 문제로 되는 폐기물, 특히 오일의 기계적 배출 중에 생성되는 오일 슬러지 및 글리세롤 증류 공정의 증류기 바닥물(still bottom)의 최상의 이용, (ii) 조 글리세롤 층으로부터 메탄올의 증류에 대한 대안적인 해결책, 및 (iii) 글리세롤-세척된 메틸 에스테르의 비용 효율적인 수지 처리와 같은 공정에 몇몇 기타 관련되는 개선점 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명의 주요 목적은 자트로파 커카스의 전종자로부터 지방산 메틸 에스테르 (바이오디젤)의 제조를 위한 개선되고 통합된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 최소의 에너지 인풋으로 폐수가 방출되지 않는 바이오디젤을 제조하는 것이다.

다른 목적은 종래 기술에서 개시된 글리세롤 세척 공정을 통하여 에스테르 교환 반응에 사용되는 거의 모든 KOH 촉매 및 0.58 몰 당량 과량의 메탄올의 90%가 글리세롤 층에 있음을 보이는 것이다.

다른 목적은 칼륨 및 나트륨 이온이 글리세롤 세척 후 메틸 에스테르 층 내에 소량으로만 존재하므로, 이온 교환 수지 처리를 통하여 잔여 양의 이들 양이온을 제거함으로써 그 농도를 요구되는 사양 수준으로 낮출 수 있음을 보이는 것이다.

다른 목적은 그 회수를 위하여 메탄올 증류를 필요로 하지 않도록 하는 것이다.

다른 목적은 부가적인 양의 트리글리세라이드 오일과 순차적인 반응을 통하여 글리세롤 층 내 메탄올의 70-90%를 제거하는 것이다.

다른 목적은 메탄올 제거 후 조 글리세롤을 비용 효율적인 방식으로 생분해성 폴리히드록시알카노에이트 폴리머의 미생물 합성을 위한 증식 및 생산 배지 내에 탄소 및 영양소원으로서 이용하는 것이다.

다른 목적은 자트로파 종자로부터 오일을 배출시킨 후 얻어지는 케이크를 증식 배지 내 아미노산 및 기타 영양소원으로 이용함으로써 King's B 배지 및 Zobell's 해양 배지와 같은 고비용의 배지를 사용할 필요가 없도록 하는 것이다.

다른 목적은 오일 케이크 내에 존재하는 것으로 나타나는 포르볼 에스테르 및 큐르신 (curcin)과 같은 독성 불순물이 본 발명의 공정에서 PHA 생산을 방해하지 않음을 보이는 것이다.

다른 목적은 표준 PHA와 유사한 물리-화학적 특성을 가지는 PHA 폴리머의 효율적인 제조를 입증하는 것이다.

다른 목적은 아라비아 해로부터 분리되는 해양 세균 (할로모나스 히드로써말리스(Halomonas hydrothermalis)와 99.63% 서열 유사성)이 그 배양균을 알칼리 조 글리세롤 층 및 탈유 자트로파 케이크로부터 유도되는 가수분해물을 함유하는 배지 내로 직접 접종함으로써, 기타 영양소/미량 영양소를 사용하지 않고, 스파징(sparging), pH 조정, 온도 조절 등과 같은 기타 중재 없이, 세포 건조 중량 기준으로 75% PHA 수율을 제공함을 보이는 것이다.

다른 목적은 가장 간단하고 저비용 방식으로 및 가능한 최단 시간 내에 이러한 PHA 제조를 달성하는 것이다.

발명의 개요

본 발명에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 1.06% 유리 지방산 (FFA)을 함유하는 캡슐화된 자트로파 종자로부터 자트로파 메틸 에스테르 (JME) 및 부산물을 제조하기 위한 통합 방법이 제공된다:

(i) 탈외피기 내에서 자트로파의 캡슐화된 종자를 기계적으로 탈외피시켜 자트로파 외피 및 자트로파 종자를 얻는 단계;

(ii) 착유기를 이용하여, 단계 (i)에서 얻어지는 자트로파 종자로부터 자트로파 오일, 4-6% 질소를 가지는 자트로파 오일 케이크 및 폐유 슬러지를 배출시키는 단계;

(iii) 단계 (ii)에서 얻어지는 자트로파 오일을 염기로 중화시키는 단계;

(iv) 단계 (iii)에서 얻어지는 중화된 자트로파 오일의 한 부분을 10 내지 20 분 동안 교반하면서 알콜 및 염기와 에스테르 교환반응시키고, 조 글리세롤 층 GL1 및 조 자트로파 메틸 에스테르 (JME)를 분리하는 단계;

(v) 단계 (iv)에서 얻어지는 조 JME을 순수 글리세롤 층으로 3회 세척하여 메탄올 및 KOH를 함유하는 세 개의 순수하지 않은 글리세롤 층들 GL2, GL3 및 GL4를 분리하여 글리세롤 세척된 JME-G₃W를 얻는 단계;

(vi) 단계 (v)에서 얻어지는 JME-G₃W를 정제하여 알칼리 금속 불순물을 제거하는 단계;

(vii) 단계 (iii)에서 얻어지는 나머지 중화 오일의 부분을 단계 (iv) 및 (v)에서 얻어지는 글리세롤 층들 GL5 (GL1+GL2+GL3)로 처리하여 JME 및 글리세롤 층 GL6을 얻는 단계;

(viii) 단계 (vii)에서 얻어지는 JME 및 글리세롤 층 GL6을 분리하는 단계:

(ix) 단계 (viii)에서 얻어지는 글리세롤 층 GL6을 메탄올 제거를 위하여 중화 오일의 나머지 부분으로 처리하여 JME 및 글리세롤 층 GL7을 수득하는 단계;

(x) 단계 (ix)에서 수득되는 JME 및 글리세롤 층 GL7을 분리하는 단계;

(xi) 단계 (x)에서 수득되는 글리세롤 층 GL7을 폴리히드록시알카노에이트 (PHAs)의 생산 또는 황산으로 알칼리의 중화를 위하여 직접 사용하여 순수 글리세롤 및 증류기 바닥물 GL8을 얻는 단계;

(xii) 단계 (vi)에서 얻어지는 JME-G₃W와 단계 (viii) 및 (x)에서 얻어지는 JME를 결합하여 결합 메틸 에스테를 얻는 단계; 및

(xiii) 단계 (xii)에서 얻어지는 결합된 메틸 에스테르를 메탄올성 KOH와 에스테르 교환반응시켜 총 글리세를 0.088% 및 유리 글리세롤 0.005%를 가지는 순수 자트로파 메틸 에스테르 (바이오디젤)를 생산하는 단계.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 부산물의 제조를 위한 통합 방법을 제공한다:

a) 단계 (i)에서 얻어지는 자트로파 외피를 단계 (ii)에서 얻어지는 폐유 슬러지를 첨가하면서 브리케팅 기계 내에서 브리케팅하여 부산물로서 1.05-1.10 g/cm³ 밀도를 가지는 자트로파 브리케트를 얻는 단계;

b) 단계 (ii)에서 얻어지는 4-6% 질소를 가지는 자트로파 오일 케이크를 H₃PO₄, H₂SO₄로 가수분해하여 부산물로서 자트로파 오일 케이크 가수분해물 (JOCH)을 얻는 단계.

본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 부산물 폴리히드록시알카노에이트 (PHAs)의 제조를 위한 통합 방법을 제공한다:

I. 1-10%의 토양 세균 MTCC 5343 또는 해양 세균 MTCC 5345, 더 바람직하게 해양 세균 MTCC 5345 종균을 2-10% (w/v) 증류기 바닥물 GL8 또는 GL7 또는 이의 조합을 함유하는 증식 겸 생산 배지 내로 접종시키고, 25-40℃ 범위의 온도에서 pH 7.0-8.0에서 24-96 시간의 기간 동안 인큐베이션하여 발효시키는 단계;

II. 상기 발효물의 원심분리에 의하여 세포를 수확하여 펠릿을 수득하는 단계;

III. 상기 펠릿의 원심분리에 의하여 고체 폴리머를 회수하는 단계;

IV. 상기 고체 폴리머를 물 및 메탄올로 세척하여 PHA를 수득하는 단계; 및

V. 클로로포름 내에 0.5 내지 5%의 PHA를 용해시켜 PHA 필름을 수득하는 단계.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 햇볕에 말린(sun dried) 전종자 캡슐이 유지 특성을 증진시키고, 종자가 캡슐화될 때 오일은 단지 0.5-2.0%의 유리 지방산 함량을 가짐으로써 메틸 에스테르 수율을 증가시킨다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 탈외피는 (i) 상기 종자를 손상시키지 않고 정지 표면을 이용하여 마모에 의하여 개방 외피를 파쇄하는 회전 드럼으로 이루어지는 캡슐 파쇄기, (ii) 상기 외피로부터 종자를 분리하고 종자를 외피와 반대 방향으로 이동시키기 위한 경사진 진동체, 및 (iii) 외피 내 종자 손실 없이 별도로 수집되는 외피를 분출시키기 위한 송풍기를 포함하는, 특별히 고안되는 탈외피기 내에서 수행된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 염기는 수산화칼륨 및 수산화나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 더 바람직하게 수산화칼륨이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 알콜은 메탄올 및 에탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 더 바람직하게 메탄올이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, JME-G₃W 층은 매크로 다공성 양이온 교환 수지를 이용하여 정제되어 알칼리 금속 불순물을 제거한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 매크로 다공성 양이온 교환 수지는 스티렌-디비닐벤젠 코폴리머 및 황산을 이용하여 제조된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 스티렌-디비닐벤젠 코폴리머는 다공화제로서 세틸 알콜을 이용하여 스티렌의 현탁 중합에 의하여 제조된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 수지 처리되는 JME-G₃W 층은 15-30 ppm 내지 <0.5 ppm의 최대 [Na⁺] 및 [K⁺] 불순물 수준, 0.4-0.6% (w/w)의 메탄올 불순물 수준, 500-1500 ppm의 수분 함유량, 0.2-0.3% (w/w)의 총 글리세롤 함량 및 0.15-0.25% (w/w)의 낮은 유리 지방산 함량을 가진다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 증류기 바닥물은 추가적으로 증류가능한 용매/생성물의 측면에서 중요하지 않은 고체 및 자유 (free) 액체로 주로 이루어지는, 성공적인 사이클 후 잔류물로서 정의된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 브리켓팅은 (i) 경사진 스크류 피더, (ii) 교반기 및 첨가제 공급을 위한 개구를 구비하는 혼합 장치, (iii) 브리케트를 성형하기 위한 다이 및 압밀을 위한 고압을 발생시키기 위한 유압 시스템으로 구성되는 압축 시스템, 및 (iv) 형성되는 브리케트를 냉각시키기 위한 브리케트 이송 시스템을 포함하는 브리케팅 기계 내에서 수행된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 얻어지는 외피는 0.08 g/cm³의 부피 밀도 및 3700 kcal/kg의 발열량을 가진다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 증식 배지는 King's B 배지, Zobell's 해양 배지, 및 GL7 및 GL8과 탈유 자트로파 오일 케이크 가수분해물 (JOCH)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 세포 건조 중량을 기준으로 하여 상기 PHA 수율은 69% 내지 77% 범위 내이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 얻어지는 PHA는 표준 PHA의 NMR 프로필에 부합하고, DSC 융점은 166.2℃이고, GPC 데이터는 각각 35990, 24583 및 1.46의 Mw, Mn 및 Mw/Mn (다분산 지수)를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단계들은 다양한 트리글리세라이드 오일에 동등하게 적용될 수 있다.

발명의 이점

1. 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 고밀도 에너지 브리케트 및 폴리히드록시알카노에이트 생분해성 폴리머의 제조를 위한 동시 스트림의 이용.

2. 메틸에스테르 정제를 위한 글리세롤 세척 공정은 메틸에스테르 내 메탄올을 거의 남기지 않으며, 그 대신, 이는 글리세롤 층 내에 90-95%까지 넣어진다.

도 1은 본 발명의 자트로파 커카스의 전종자 캡슐로부터 메틸 에스테르 및 관련 생성물의 제조에 대한 개략적인 도면이다.
도 2는 조 글리세롤 층 내 메탄올 측정을 위하여 사용되는 글리세를 내 메탄올 함량의 검정 곡선이다 (실시예 5-8, 실시예 8은 분석 방법을 기재한다).
도 3은 메틸 에스테르 내 메탄올 함량의 검정 곡선이다 (실시예 5-8, 실시예 8은 분석 방법을 기재한다).
도 4는 메틸 에스테르 내 미량의 나트륨에 대한 검정 곡선이다 (실시예 7&10, 후자는 분석 방법을 기재한다).
도 5는 메틸 에스테르 내 미량의 칼륨에 대한 검정 곡선이다 (실시예 7&10, 후자는 분석 방법을 기재한다).
도 6은 실시예 12.1의 방법에 의하여 제조되는 PHA의 시차주사열량 프로필을 나타낸다.
도 7은 실시예 13.3의 방법에 의하여 제조되는 PHA의 시차주사열량 프로필을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 목적은 단순한 장치 작업을 이용하여 분산 제조를 최대한 주의하여 자트로파 메틸 에스테르의 제조 공정에서의 전반적인 개선을 가져오는 것이다. 전형적으로, 농부들은 건조된 전과 (whole fruit)를 탈외피하나, 이는 외피의 무-활용을 초래하며, 결과적으로, 종자만이 과일의 탈외피에 수반되는 노동 비용 외에도 비용의 타격을 받기 때문에 종자 가격이 더 높다. 본 발명에서는, 외피가 제2 보호층을 제공하며 이는 이들을 깨끗하게 유지시키는 것 이외에도 종유의 특성을 보존하므로, 종자를 캡슐화된 채로 두는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 이는 메틸 에스테르가 염기 촉매 작용을 통하여 얻어질 때 특히 중요하며, 이는 과량의 유리 지방산이 중화를 통하여 제거되어야 하며 이는 메틸 에스테르 수율 감소를 초래하기 때문이다. 따라서, 햇볕에 말린 캡슐을 종자가 외피로부터 손상되지 않고 깨끗하게 분리되고 그러한 종자가 곧 사용되는 방식으로 기계적으로 탈외피할 수 있는 기계를 고안할 필요가 있다. 또한, 외피는 이제 단일 지점에서 수집되므로, 단지 0.08 g/cm³의 부피 밀도 및 3700 kcal/kg의 발열량을 가지는 이러한 외피를 브리케팅하여 이들이 용이하게 이송되고 농부가 장작 또는 더 비용이 드는 대안보다 이들을 직접 이용할 수 있도록 할 강한 동기가 있다. 또한, 빈 외피의 고에너지 밀도를 제공하는 견고한 브리케트로 원하는 수준의 압축을 허용하는 적합한 공정들을 고안할 동기가 있다. 이러한 작업들 모두 본 발명에 성공적으로 개시되며, 본 발명에서는 종자로부터 오일의 기계적 배출 동안 생성되는 소량의 폐유를 적절히 활용하고, 또한 원하는 사용에 따른 1.05-1.15 g/cm³의 밀도 및 ca. 4000 kcal/kg의 발열량을 가지는 브리케트를 생산하는데에 소량의 탈유 케이크를 활용한다.

최상의 종래기술은 매우 효율적인 자트로파 메틸 에스테르의 에스테르 교환 반응 및 에스테르 교환 반응 후의 공정들을 개시하나, 메탄올 이용은 상대적으로 낮으며 (단지 0.55-0.75 몰 당량 과량), 그럼에도 불구하고, 이러한 메탄올을 가능한 한 최대한 회수하는 것이 중요하다. 종래 기술에 개시되는 메틸 에스테르를 정제하기 위한 글리세롤 세척 공정은 메틸 에스테르 내 메탄올을 거의 남기지 않으며; 그 대신, 이는 글리세롤 층 내에 90-95% 까지 있게 된다. 글리세롤 세척 후 메틸 에스테르는 본 발명에서 이온 크로마토그래피 측정을 통하여 확인되는 바와 같이 또한 매우 낮은 수준의 잔류 알칼리 촉매를 가지므로, 메틸 에스테르의 수 세척이 필요한지 여부에 대한 의문이 발생한다. 그 대신, 이온 교환 수지의 이용에 근거하는 건조 공정이 개시된다. 본 발명의 공정은 수지 상의 적재가 매우 낮으며, 따라서 상당량의 메틸 에스테르가 재생 없이 적은 층 부피의 수지로 처리될 수 있다는 사실에 있다.

조 글리세롤 층에 대하여, 그 효과적인 이용에 있어서 가능한 최고 수준의 단순화는 무엇인지에 대한 의문이 발생한다. 본원에 개시되는 바와 같이, 글리세롤 층 내 과량이 메탄올이 단순한 수단에 의하여 제거될 수 있다면, 나머지 매스를 단순하고 비용 효율적인 방식으로 폴리히드록시알카노에이트의 제조를 위하여 직접 이용할 수 있다. 이어서, 글리세롤 층으로부터 메탄올 증류 - 이는 냉각 장치가 구비되지 않으면 상당한 손실을 수반한다 - 만이 선택할 수 있는 것인지에 대한 의문이 발생한다. 본원에 개시되는 바와 같이, 새로운 로트의 자트로파 오일 내로 메탄올의 역-흡수가 메탄올의 80-95%가 이러한 방식으로 이롭게 이용될 수 있는 정도로 실행가능하다. 이는 글리세롤 층 또한 부분적으로 활성인 알칼리 촉매 (KOH)를 함유하고 있으며, 따라서 새로운 오일이 첨가되고 적합한 교반이 제공되면 메틸 에스테르 형성을 어느 정도 촉진시키는 모든 성분들 가지기 때문이다. 그러나, 메탄올 및 촉매 양은 완전한 메틸 에스테르를 구현하기에 불충분하며, 이러한 단계 후 <0.15% (w/w) 총 글리세롤을 가지는 순수 에스테르의 생산을 가능케 하는 제2 작업이 뒤따른다. 실제 결과는 회수불가능한 형태의 과량의 메탄올의 전체 요건이 임의의 증류 단계 없이 및 메틸 에스테르 품질을 위협하는 방식 없이 <0.15 몰 당량이 되도록, 메탄올이 대폭 감소된 글리세롤 층 및 제2 단계에서 메탄올 이용의 감축의 실현이다.

메탄올이 제거되면, 글리세롤 층은 본 발명에서 분리된 해양 세균 배양에 의한 폴리히드록시알카노에이트의 효율적이고 비용 효율적인 제조를 위한 우수한 영양소원이다. 고온 인산/황산을 이용하여 반응성 추출을 통하여 얻어지는 자트로파 탈유 케이크로부터 생산되는 가수분해물은 조 글리세롤에 대한 이상적인 상호 보완적 파트너이며, 이들 둘은 동시에 의도적인 온도 조절 없이 해양 세균 배양에 의한 PHA 생산을 위하여 요구되는 영양소를 제공한다. 이들 둘은 또한 함께 서로를 어느 정도 중화(산-염기)하는 것을 보조함으로써 중화 비용을 낮춘다. 통상적인 2-단계 공정의 단일 단계로의 통합, 필수적인 인산 완충액 및 필수 요소를 탄소 및 질소 이외에도 가수분해물 및 글리세롤로부터 유도함으로써 모든 영양소/미량 영양소를 전적으로 필요로 하지 않는 것과 같은 몇몇 부가적인 발명들이 있다. 플랜트가 농업 지역 근처에 설립되는 분산 작업에서는, 수확가능한 바이오매스의 수확 후 상청액을 토양 관비를 위하여 그 지역 내로 직접 배출하거나 또는 엽면 살포로서 이용될 수 있다.

글리세롤 층의 많은 부분이 이러한 방식으로 이용될 수 있으나, 글리세롤의 적은 부분은 필수적인 글리세롤 세척 단계를 위하여 순수 글리세롤 (100 kg의 메틸 에스테르 당 2-4 kg 글리세롤)을 회수하는 것이 요구된다. 글리세롤 회수 후 남은 증류기 바닥물은 토양 세균 배양에 의한 PHA 생산을 위한 동등하게 효과적인 영양소 및 촉진제이며, 생산 효율은 순수 글리세롤을 이용하는 것보다 거의 두 배 더 높은 것으로 나타난다. 따라서, 문제가 되는 폐기물은 이상적인 영양소원인 것으로 밝혀진다. 이러한 공정에 의하여 얻어지는 PHA는 1.46의 낮은 다분산 지수를 가지면서, 표준 PHA와 유사한 NMR 패턴을 나타낸다.

증류기 바닥물은 또한 나머지 조 글리세롤과 조합 사용됨으로써 두 가지 별개의 작업에 대한 요구를 피하고 이러한 조성물 내 MTCC 5345를 활용할 수 있다.

이러한 발명들이 함께 동시 생성물 스트림을 이롭게 이용하면서 자트로파 커카스의 햇볕 건조된 전종자 캡슐로부터 메틸 에스테르의 제조를 위한 개선된 통합 공정을 가져온다. 본 발명의 통합 공정을 도 1에 도시한다.

본 발명의 특징:

(i) 전종자 캡슐의 확립이 유리 지방산 함량 측면에서 탈외피된 종자보다 나은 오일 품질의 유지를 보조한다.

(ii) 소량의 슬러지 형태의 폐유 - 이는 기계적 배출 공정 중 불가피하게 생성되며 처리 문제를 야기함 - 를 이용하여 빈 외피로부터 더 조밀하고 강한 브리케트를 생산하며 또한 브리케트의 발열량을 증가시킴.

(iii) 탈유 케이크의 일부를 이용하여 외피만으로 얻어지는 것보다 더 나은 브리케트를 형성할 수 있음을 인식함.

(iv) 추가적인 양의 정제된 자트로파 오일과의 에스테르 교환반응을 위하여 취하여지는 부분적으로 활성인 촉매 및 과량의 메탄올을 함유하는 글리세롤 층을 2 단계로 반응시켜 이러한 메탄올의 70-90%를 제거함. 그 다음, 오일/메틸 에스테르 혼합물을 알칼리 및 메탄올과 추가적으로 반응시켜 미반응 및 부분적으로 반응된 오일이 메틸 에스테르로 완전히 전환되도록 하고, 이러한 글리세롤 층으로부터 메탄올 제거에 이은 완전한 생성물로의 에스테르 교환반응의 사이클을 조 글리세롤 층으로부터 메탄올 증류가 필요 없도록 연속적으로 반복한다.

(v) 글리세롤 세척 공정이 메틸 에스테르층으로부터 거의 모든 이용한 촉매를 제거시킴을 확인한 후, 글리세롤-세척 메틸 에스테르층을 양이온 교환 수지 처리하여 다량의 메틸 에스테르를 최소 층 부피의 수지로 처리할 수 있도록 하면서 물 세척 필요없이 원하는 서브 ppm 수준을 달성하는 것이 매력적인 제안일 수 있음을 인지함.

(vi) 메탄올이 대폭 감소된 조 글리세롤 층을 1:3 부피 비로 나누고 워크업 후 더 작은 분획으로부터 증류된 글리세롤을 회수하여, 종래 기술에 기재된 바와 같은 글리세롤 세척을 위한 연이은 배치 내 재사용될 수 있도록 함.

(vii) PHA가 탄소원으로서 순수 글리세롤을 이용하는 것보다 더 유리한 방식으로 증류기 바닥물로부터 생산될 수 있도록 함으로써 문제가 되는 폐기물을 PHA 생산을 위한 유용한 원료로 전환시키는, 토양으로부터 세균 MTCC 5343 분리.

(viii) 세포 건조 중량 기준으로 75-80%의 수율로 PHA의 생산을 가져오는 발효 공정에서의 유일한 영양소로서, 자트로파 탈유 케이크의 가수분해물과 함께, 더 큰 부피의 조 글리세롤 층을 직접적으로 효율적으로 이용하는 잠재적인 분리균을 해양 세균의 스크리닝 공정을 통하여 동정함. 또한, 전형적인 PHA 제조 공정에서 별개로 수행되는 증식 및 생산 단계를 단일 작업으로 조합함으로써 공정을 단순화함. 나아가, I으로부터의 증류기 바닥물을 더 큰 분획의 글리세롤 층 내로 첨가하고, 결과 생성되는 매스를 MTCC 5345로 발효시킴. 또한, 28-38℃를 초과하는 온도 변화에 대한 공정의 내성 입증 후 온도 조절에 대한 필요성이 없음.

(ix) 발효 공정에 사용되는 탈유 케이크의 가수분해물 제조에서, 인산을 사용한 후 상기 산 추출물을 알칼리 글리세롤 층 자체 - 및 필요에 따라 부가적인 KOH/Mg(OH)₂로 중화하여, 결과 생성되는 염이 PHA 생산을 방해하는 것이 아니라 이를 지지하도록 하는 것이 유리함을 인식함.

이하 실시예들은 예시를 위하여 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예 1

3 개월 된 50 kg의 햇볕 건조된 자트로파 종자 캡슐을 함유하는 마대를 개방되도록 절개하여, 대부분의 캡슐이 미손상이나 일부 캡슐이 파손되고 종자가 밖으로 나왔음을 발견하였다. 무작위로 수집된 이러한 종자 50-100g을 분말로 파쇄하고, n-헥산을 이용하여 Soxhlet 추출을 위하여 25g을 취했다. 종자를 또한 무작위로 샘플링된 미손상 캡슐로부터 제거하고, 유사하게 추출하였다. 노출된 종자는 3.68% (w/w)의 유리 지방산 (FFA) 함량을 가지는 반면, 캡슐화된 종자는 1.06%의 FFA 함량을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 다른 마대를 개방하고 상기한 바와 같이 샘플링을 수행하였다. 노출 및 캡슐화된 종자는 각각 2.46% 및 1.09%의 FFA 값을 나타냈다, 즉, 두 관찰은 유사하며 전종자 캡슐이 오일을 더 잘 보존함을 나타낸다. 더 높은 FFA는 알칼리 촉매를 이용하는 종래 기술의 에스테르 교환 반응에서와 같이 메틸 에스테르 수율을 감소시키므로, 이 실시예는 종자를 캡슐화된 형태로 두고 메틸에스테르 제조 직전에 종자를 탈외피하는 것이 나음을 교시한다.

실시예 2

상기 실시예 1의 전종자 캡슐을 특별히 고안된 기계 내에서 기계적으로 탈외피하였다. 상기 1 시간당 톤 (TPH 캡슐) 기계는 (a) 상기 종자를 손상시키지 않고 정지 표면을 이용하여 마모에 의하여 개방 외피를 파쇄하는 회전 드럼으로 이루어지는 캡슐 파쇄기, (b) 상기 외피로부터 종자를 분리하고 종자를 외피와 반대 방향으로 이동시키기 위한 경사진 진동체, 및 (c) 외피 내 종자 손실 없이 별도로 수집되는 외피를 분출시키는 송풍기로 구성되었다. 오일을 전종자로부터 기계적으로 배출시켰으며, 외피를 특별히 고안된 기계 내에서 브리케팅하였다. 브리케트는 (a) 경사진 스크류 피더, (b) 교반기 및 첨가제 공급을 위한 개구를 구비하는 혼합 장치, (c) 브리케트를 성형하기 위한 다이 및 압밀을 위한 고압을 발생시키기 위한 유압 시스템으로 구성되는 압축 시스템, 및 (d) 형성되는 브리케트를 냉각시키기 위한 브리케트 이송 시스템을 포함하는 TPH 브리케팅 기계 내에서 행하였다. 브리케트는 손상되기 쉬우나, 오일의 기계적 배출 공정에서 생성되는 폐유 슬러지를 외피 내로 첨가함에 따라, 브리케트가 견고하여지고 오일의 첨가 없이 빈 외피에 대하여 기록되는 1.07-1.15 g/cm³의 밀도 및 3700 kcal/kg 보다 높은 발열량을 가지는 것으로 밝혀졌다. 얻어지는 브리케트는 6 cm 직경 및 14 cm 길이의 크기를 가졌다.

실시예 3

상기 실시예 2에서와 같이 배출된 자트로파 오일을 수성 NaOH로 중화시켜 유리 지방산 (FFA) 함량을 0.21% (w/w)으로 낮추었다. 64.5 g MeOH (1.58 몰 당량) 및 8.33 g KOH를 함께 취하여 둥근 바닥 플라스크 내에서 370 g의 중화된 자트로파 오일 내로 첨가하고, 내용물을 실온에서 15 분 동안 오버헤드 교반기로 교반하여 에스테르 교환반응을 실행하였다. 63.87 g 무게의 조 글리세롤 층를 분리한 다음, 메틸 에스테르층을 5.53 g, 5.76 g 및 5.56 g의 순수 글리세롤로 연속적으로 3회 세척하였으며, 이러한 세척은 각각 11.69 g, 7.10 g 및 6.29 g의 글리세롤 (불순물로서 메탄올 및 KOH)을 생성하였다. 단계 2에서, 조 글리세롤 및 첫번째 두 세척물을 결합시키고, 16.01 g 메탄올을 함유하는 결합층을 다시 300 g의 중화된 자트로파 오일과 100-300 rpm으로 연속 교반 (패들형 피치 블레이트 교반기) 하에 2 시간 동안 반응시켰다. 두 층들을 다시 분리하고, 글리세롤층을 다시 70 g의 추가적인 중화 오일로 2 시간 동안 강하게 오버헤드 교반하면서 처리하였다. 사용된 글리세롤 층은 3.15 g의 메탄올을 함유하였다, 즉, 글리세를 층 내 메탄올 80.3%가 이러한 공정을 통하여 제거될 수 있었다. 단계 2에서 얻어지는 조 메틸에스테르 층을 추가적인 양의 메탄올 KOH (63.6 g MeOH 및 8.2 g KOH)로 처리한 후, 단계 1에서와 같이 글리세롤로 세척한 다음 물 세척하였다. 두 단계로부터 결합된 메틸에스테르 수율은 710 g (총 중화된 오일을 기준으로 95.9% 수율)이었으며, 총 글리세롤 및 유리 글리세롤 값은 각각 0.10% (w/w) 및 0.01% (w/w)였다. 단계 2에서 얻어지는 글리세롤 층들을 유사한 방식으로 중화된 오일로 처리하여 메탄올을 제거하였다. 이 실시예는 조 글리세롤 층으로부터 메탄올을 제거함에 따라 메탄올 증류를 필요로 하지 않도록 하는 방법을 교시한다.

실시예 4

실시예 3의 실험을 파일럿 플랜트 내에서 수천 배로 확대시켰다. 740 kg의 중화된 오일을 취하였다. 상기 오일의 반을 도 1의 반응기 II 내에서 실온에서 15 분 동안 교반 하에 메탄올 KOH 용액 [KOH (78.8% 순도) 8.33 kg; 메탄올 64.5 kg (1.58 몰 당량)]과의 반응을 통하여 단일 단계로 에스테르 교환반응시켰다. 글리세롤 층 (GL1)을 분리하였으며, 그 무게는 79.55 kg이었다. 다음, 메틸에스테르 층 (조 JME)을 글리세롤 5.55 kg으로 각각 3회 처리하고, 글리세롤 층들을 매회 분리하였으며, 최종 분리는 초원심기를 이용하여 행하였다. 분리된 글리세롤 세척 층들의 무게는 각각 11.28 kg (GL2), 8.06 kg (GL3) 및 6.11 kg (GL4)이었다. 이 단계까지 메탄올, KOH 및 총 K 밸런스를 이하 표 1에 나타낸다. 상기 데이터로부터, 취하여진 과량의 메탄올 89.3%가 글리세롤 층들 (GL1-GL4) 내에 있게 되며, 따라서 본 발명의 방법에 의하여 증류에 의지하지 않고 이러한 과량의 메탄올을 글리세롤 층들로부터 회수할 수 있음을 알 수 있다. 그 후, 글리세롤-세척된 메틸에스테르 층 (JME-G₃W로 나타냄)의 일부를 이온 교환 수지로 처리하여 이하 기재하는 바와 같이 잔류 알칼리를 제거하였으며, 나머지 부분은 종래 기술에 따라 프로세싱하여 0.12%의 총 글리세롤 및 0.01%의 유리 글리세롤을 가지는 순수 메틸에스테르를 제공하였다.

실시예 1의 정제된 자트로파 오일의 370 kg의 제1 로트의 에스테르 교환반응 겸 글리세롤 세척을 위한 MeOH 및 K 밸런스
샘플 no.	표시	메탄올/kg	K (염광 광도계)/kg	K에 근거한 추정된 이론적 KOH /kg	적정에 의한 실제 KOH /kg
1	GL1	19.07	5.43	7.79	3.67
2	GL2	0.83	0.10	0.15	0.11
3	GL3	0.45	0.02	0.03	0.02
4	GL4	0.24	-	-	0.01
5	JME-G3W	2.54	0.006 (물 세척 IC에 의함)
6	총	23.13
7	예상 (0.58 몰당량 과량에 근거함)	23.68

첨가된 메탄올 = 64.50 kg 및 첨가된 KOH = 8.33 kg (적정에 의한 78% 알칼리도)

바이오디젤 형성에 소모될 것으로 예상되는 메탄올 = 40.82 kg

따라서, 23.68 kg이 남아야 한다. 실험에 의한 측정: 23.13 kg

상기 글리세롤 층들 GL1, GL2 및 GL3를 결합하였으며 (GL5로 나타냄), 총 무게는 98.89 kg이었다. 그 다음, 이들을 실시예 3의 중화된 자트로파 오일 300 kg을 추가하면서 함께 취하고, 내용물을 도 1의 반응기 I 내에서 실온에서 2 시간 동안 강하게 교반하였다. 상기 두 층들을 분리되도록 하고, 조 메틸에스테르를 추가적인 에스테르 교환반응을 위하여 반응기 II 내로 옮겼다. 반응기 내 글리세롤 층 (GL6)을 다시 실시예 3으로부터의 정제된 자트로파 오일의 나머지 70 kg과 반응시키고, 두 층들이 분리되도록 하였으며, 메틸에스테르층을 상부로부터 옮겨 이미 조 메틸에스테르의 제1 로트를 함유하는 반응기 II 내로 첨가하였다. 이하의 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 결과 생성되는 글리세롤 층 (GL7)의 분석은 GL5 내 메탄올의 71.3%가 두 로트의 오일로 처리함에 의하여 제거되었음을 보였다. 그 후, 결합된 조 메틸에스테르 층들을 다시 반응기 II 내에서 메탄올성 KOH [KOH (78.8% 순도) 8.33 kg; 메탄올 64.5 kg (1.59 몰 당량)]으로 처리하고, 글리세롤 세척 후 물 세척하여 0.088% 총 글리세롤 및 0.005% 유리 글리세롤을 가지는 순수 메틸에스테르를 생산하였다. 조 글리세롤을 세척물과 함께 다시 오일로 처리하여 상기와 같이 메탄올을 제거할 수 있다. 이 실시예는 조 글리세롤로부터 메탄올 제거 공정을 규모 확대할 수 있음을 교시한다. 또한, 표 2의 데이터는 글리세롤 층 내에 KOH 분획이 또한 제거됨을 교시한다.

	글리세롤 층의 중량 (kg)	MeOH (kg)	K (염광 광도계에 의함)/kg	K에 근거한 추정 이론적 KOH / kg	적정에 의한 실제 KOH /kg
GL5	98.89	20.35	5.55	7.97	3.80
GL6	96	9.09	5.23	7.51	3.14
GL7	90	5.83	4.74	6.81	2.36

상기 실시예에서 GL5와 반응 후 얻어지는 조 메틸에스테르를 다시 1.58 몰 당량의 메탄올과 처리하였으나, 제거되는 메탄올에서 조 메틸에스테르 층을 감하여 이하 실시예 6에 나타내는 바와 같이 전체 1.58 몰비의 메탄올 대 중화된 오일을 유지할 수 있음이 주목된다.

실시예 5

JOCH를 다음과 같이 제조하였다: 실시예 3 및 4에서와 같은 전종자로부터 오일을 기계적으로 배출시킨 후에 얻어지는, 4-6% 질소를 가지는 자트로파 오일 케이크 100 g을 삼각 플라스크 내에 취하고 8N H₃PO₄ 및 2N H₂SO₄를 함유하는 산성 용액 350 mL를 첨가하였다. 상기 플라스크를 (캡 없이) 고온 플레이트 상에서 100℃에서 5 시간 동안 유지시켰다. 그 후, 실온으로 냉각시켰다. 그 다음, 현탁액을 고체 Mg(OH)₂ 19.1 g이 첨가된 KOH (알칼리 GL7로 중화를 실행할 수도 있음) 148 g을 함유하는 용액 330 ml로 중화시켰다. 이로써 완충 작용을 가지며 가수분해물의 영양소 가치에 기여하는 염을 생산하였다. 그 후, 내용물들을 흡인 여과기 (Buchner funnel) 상에서 진공 여과하였다 (Whatman No. 40 여과지). pH를 5.5-8.5 범위로 조정하였다. 가수분해물 내 탄소 내용물은 2.31% (w/v)였으며, 결합 질소 함량은 0.48% (w/v)였다. 4-6% (w/w) N을 가지는 자트로파 오일 케이크를 H₃PO₄/H₂SO₄의 고온 산성 수용액으로 처리하였다.

실시예 6

실시예 4의 실험을 반복하되, 제2 로트의 오일을 GL4로 처리한 후 대략 370 kg에 달하는 결합층들을 전과 같이 8.33 kg의 KOH과 반응시켰으나, 실시예 4에 사용된 64.5 kg 대신 50.57 kg의 메탄올과 반응시켜, 총 메탄올 양, 즉 GL4로부터 제거된 메탄올 + 첨가된 메탄올이 370 kg의 제1 로트에 대하여 사용된 대략 64.5 kg (1.58 몰당량)이 되도록 하였다. 344.8 kg의 메틸에스테르를 0.075% 총 글리세롤 및 0.01% 유리 글리세롤을 가지는 제1 단계에서 얻었으며, 339 kg의 메틸에스테르를 0.17% 총 글리세롤 및 0.02% 유리 글리세롤을 가지는 다음 단계에서 얻었다. 이 실시예는 메탄올 증류를 피함으로써 얻어지는 유리한 점 이외에도 메탄올 사용의 실제 감소를 교시한다. 메탄올은 조 글리세롤 층으로부터 다시 회수될 수 있으므로, 메탄올의 순 사용은 증류를 통한 회수 없이 메틸에스테르를 기준으로 1.22 당량이며, 이는 생산되는 정제된 메틸에스테르 100 kg 당 2.66 kg의 회수불가능한 메탄올로 계산된다.

실시예 7

상기 실시예 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 메틸에스테르 층의 글리세롤 세척은 KOH 촉매를 매우 효율적으로 제거한다. 따라서, 미량의 잔류 알칼리 금속 불순물을 이온 교환법에 의하여 제거하는 것이 유리할 것이며, 이는 물 세척을 필요로 하지 않게 한다.

1. 매크로다공성 양이온 교환 수지의 제조: 다공성 구조의 스티렌-디비닐벤젠 (스티렌-DVB) 코폴리머를 세틸 알콜을 다공화제로 사용하여 현탁 중합에 의하여 제조하였다. 중합 공정을 가변 속도 기계적 교반기, 온도계 및 환류 응축기를 구비하는 1 L 3구 둥근 바닥 플라스크 내에서 수행하였다. 스티렌 66 ml, DVB 18.5 ml 및 세틸 알콜 (70 g)을 함유하는 모노머 상을 개시제 (벤조일 퍼옥사이드; 모노머의 1 중량%)와 함께 현탁 매질 수용액을 함유하는 반응기 내로 부었다. 이 합성에 사용되는 현탁제는 물 420 ml 내 히드록시 에틸 셀룰로오스 (0.6 g), 리그노술폰산 나트륨 (0.6 g) 및 염화칼슘 (5.3 g)였다. 중합을 80±5℃에서 3 시간 동안 및 90±5℃에서 추가적인 3 시간 동안 수행하였다. 비드 형태의 코폴리머가 얻어졌다. 그 다음, 이러한 비드를 분리하고, 세척 및 건조하고, 용매 추출하여 다공화제를 제거하였다. 상기 합성된 코폴리머 비드를 술폰화하여 -SO3^-H⁺ 기를 코폴리머 매트릭스 내에 도입하였다. 술폰화에 사용된 코폴리머 대 황산의 부피 비는 1:7였다. 반응을 95±5℃에서 10 시간 동안 수행하였다. p-니트로페놀 흡착법에 의한 표면적은 104.3 m²/g로 밝혀졌다. 양이온 교환 성능은 동적 조건 하에 1.8-2.1 meq/ml 및 정적 조건 하에 4.5 내지 5.0 meq/g이었다.

2. 조 자트로파 메틸에스테르의 정제: 매크로다공성 수지를 4.6cm 내부 직경 및 110cm 높이의 유리 컬럼 내로 적재하였다. 상기 컬럼은 하부에 글라스 울 플러그를 가지는 스톱 콕 및 상부에 B-24 조인트를 가졌다. 수지 층 높이는 65 cm였으며 수지 층 부피는 1.08 L였다. 수지 층은 메탄올을 통과시켜 수분이 없도록 하였다. 실시예 3의 글리세롤-세척된 메틸에스테르 층 (JME-G₃W)을 5 층 부피/시간의 서비스 유속으로 수지 층 위로 통과시켰다. 각각 10 L의 용출액 분획을 별개로 수집하고, 얻어지는 결과를 이하 표 3에 나타낸다. [Na⁺] 및 [K⁺] 수준이 21.37 mg/L에서 메틸에스테르에 대한 표준 사양을 충족시키는 0.42 mg/L로 감소됨을 알 수 있다. 수분 및 메탄올 모두 건조 공기로 스파징하여 제거할 수 있다. 수지 통과 후 더 높은 양의 MeOH를 함유하는 처음 10 L의 메틸에스테르를 에스테르 교환반응에서 재활용할 수 있다. 종래 기술에서 보고된 기타 흡착제를 추가적으로 별개의 컬럼 내에 취하여 알칼리 금속 이온 이외에 기타 불순물들을 감소시킬 수 있다.

수지에 의하여 처리되는 양/L	Na+ (mg/L)	K+ (mg/L)	[Na+ + K+] (mg/L)	MeOH (% w/w)	H2O (%)	총 글리세롤/(유리 글리세롤)% w/v/(%w/v)	FFA (%w/w)	탁도 (NTU)
유입액	5/07	16.3	21.37	0.6071	0.0984	0.30 (0.03)	0.1872	0.30
0-10 L	0.31	0.89	1.20	2.6344	0.1742	0.40 (0.01)	0.183	0.3
10-20 L	0.31	0.11	0.42	0.7831	0.1502	0.43 (0.01)	0.183	0.31
20-30 L	0.27	0.15	0.42	0.8849	---	-	---	0.16

실시예 8: 실시예 5-7의 실험에 대한 메틸에스테르 및 조 글리세롤 층 내 메탄올 측정

그 자체가 다음과 같이 제조된 원액 (10.0% w/w)을 연속 희석하여 표준 용액을 제조하였다: 18 g KOH 및 50 g MeOH를 스토퍼형 플라스크 내로 첨가하였다. 13.76g의 메탄올 KOH를 글리세롤로 100 g으로 희석시켰다(A). 그 후, 10 g의 (A)를 글리세롤로 100 g으로 희석시켰다(B). 그 다음, 원액을 물로 희석시켜 표준 용액을 생산하였다. 샘플 제조를 위하여, 1.0 g의 샘플 및 1.0 mL의 0.13 N 빙초산을 스토퍼형 플라스크 내에 취하고 재증류수로 100.0g으로 희석시켰다.

메탄올 내용물의 GC-MS 분석을 헤드스페이스 분석기 (AOC 5000 오토인젝터)가 장착된 Shimadzu QP 2010 기체 크로마토그래피 질량 분석기를 이용하여 수행하였다. HP PLOT U 용융 실리카 모세관 컬럼 (0.53mm ID x 30m 길이 x 20 um 필름 두께)을 운반 기체로서 헬륨과 함께 사용하였다 (1 mL/분 유속). 상기 컬럼 온도를 100℃에서 10 분 동안 유지시켰다 (등온성). 질량 분석기를 70 eV의 전자 이온화 에너지에서 작동시켰다. 1 ml의 샘플/표준 용액을 기밀 폐쇄 유리 병 내에 유지하고 오토인젝터 내에 유지하였다. 샘플을 65℃에서 가열하고 인큐베이터 내에서 5 분 동안 회전시켰다. 250 ul의 기체를 150℃의 스플릿-스플릿없는 인젝터 내로 주입하였다. 세 개의 표준 용액을 이용하여 작성된 검정 곡선은 0.9998의 회귀 계수 (R²)를 가졌다 (도 2). 유사한 검정 곡선을 메틸에스테르 내 MeOH에 대하여 작성하였다 (도 3).

실시예 9: 실시예 5-7의 실험에 대한 조 글리세롤 층 및 메틸에스테르 내 총 K 및 알칼리도의 측정

수용성 샘플에 대하여 기지 중량의 샘플을 용해하여 고정 부피의 수용액을 얻었으며, 불용성 샘플에 대하여 기지 중량의 샘플을 기지 부피의 증류수로 세척하여 수산화칼륨/염을 물 내로 추출하였다. 그 다음, 이들 샘플들을 예정된 검정 후 총 K에 대하여 염광 광도계로 분석하였다. 알칼리도를 산-염기 적정을 통하여 측정하였다 (표 3).

실시예 10: 실시예 4-7의 실험에 대한 이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 자트로파 메틸에스테르 내 미량의 K 및 Na 의 측정

바이오디젤 물 세척액 내 나트륨 및 칼륨 양이온의 농도를 Ion Pac CS12 (2mm) 분석 컬럼 및 용리액으로 0.25 mL/분의 유속으로 20 mM 메탄 술폰산을 이용하여 전도성 검출기로 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 측정하였다. NaCl 및 KBr 혼합물을 함유하는 (각각 0.1, 0.2, 0.5 및 1.0 ppm) 표준 용액을 사용하여 정량을 행하였다. 상대 표준 편차, 상관계수 및 기울기는 각각 나트륨에 대하여 1.0191, 1.0000 및 0.7313, 및 칼륨에 대하여 0.6605, 1.0000 및 0.5341이었다. 나트륨 및 칼륨에 대한 검정 곡선 및 샘플의 크로마토그램을 도 4 및 5에 나타낸다.

실시예 11

실시예 4의 사용된 글리세롤 층 GL7을 두 부분으로 나누었다. 한 부분을 황산으로 알칼리 중화를 위하여 취한 다음, 비누 물질과 K₂SO₄를 종래 기술의 공정에 따라 분리하였다. 그 다음, 정제된 글리세롤 층을 증류하여 메틸에스테르 층의 세척을 위하여 요구되는 것과 동량의 글리세롤을 회수하였다. 어두운 갈색의 증류기 바닥물 (GL8로 나타냄)을 이하 실시예 12에 기재되는 바와 같이 폴리히드록시알카노에이트 (PHA)의 미생물 생산을 위한 영양소원으로 이용하였다. GL7의 더 큰 분획을 이하 실시예 13에 기재되는 바와 같이 PHA의 제조를 위하여 직접 이용하였다. 자트로파 오일 케이크 가수분해물 (JOCH)을 4-6% (w/w) N을 가지는 자트로파 오일 케이크를 H₃PO₄/H₂SO₄의 고온 산성 수용액으로 처리한 후 pH를 조 글리세롤 층, 수산화칼륨 및 수산화마그네슘과 같은 알칼리성 물질로 적절히 조정함으로써 추출하여, 완충 작용을 가지며 또한 가수분해물의 영양소 가치에 기여하는 염을 생산하였다. 그램 부정 (Gram variable), 그램 +ve (바실러스 속, 아조토박터 속) 및 그램 -ve 세균 (슈도모나스 속; 할로모나스 속)을 토양 및 해양 환경으로부터 분리하고, PHA 생산을 위한 스크리닝을 행하였다.

실시예 12

실시예 12.1:

30 토양 세균을 인도 토양으로부터 분리하고, PHA 생산을 위하여 실험실 내에서 스크리닝하였다. 세균 MTCC 5343이 가장 효율적인 것 중 하나로 밝혀졌으며, 본 발명에서 사용되었다. 1 리터의 증류수 내 용해된 펩톤 20g, 글리세롤 15g, 인산수소이칼륨 1.5g 및 황산 마그네슘 1.5g을 포함하는 King's B 증식 배지 100 ml를 준비하였다. 그 다음, 상기 배지를 121℃에서 20 분 동안 가압 증기 멸균(autoclave)시켰다. 종균 1 ml를 상기 배지 내에 접종하고, 진탕기 내에서 35±2℃에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 상기 배양균을 원심분리에 의하여 수확하였다. 상기 실시예 11의 2% (w/v) GL8, 0.05g (NH₄)₂SO₄, 0.04g MgSO₄.7H₂O, 0.965g Na₂HPO₄.12H₂O, 0.265g KH₂PO₄를 함유하는 생산 배지 100 ml를 준비하고, 증류수 내 SO₄.7H₂O (2.78 g/l), MnCl₂.4H₂O (1.98g/l), CoSO₄.7H₂O (2.81 g/l), CaCl₂/2H₂O (1.47 g/l), CuCl₂.2H₂O (0.17 g/l) 및 ZnSO₄.7H₂O (0.29 g/l) 미량 영양소를 함유하는 미량영양소 원액 0.1 m을 상기 배지 내로 첨가하였다. 그 다음, 상기 배지를 121℃에서 20 분 동안 가압 증기 멸균시켰다. 그 다음, 증식 배지로부터 얻어진 수확된 배양균을 생산 배지 내로 접종하고, 진탕기 상에서 (120 rpm) 35±5℃에서 96 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의하여 수확하고, 얻어진 펠릿을 세포 건조 중량 0.38 g으로 오븐 건조시켰다. 그 다음, 펠릿을 하이드로클로라이트 (4-6% 염소) 용액으로 15 분 동안 처리하여 세포를 분해시켰다. 고체 폴리머를 원심분리에 의하여 회수하였다. 그 다음, 물 및 메탄올로 연속적으로 세척하여 부착 불순물을 제거하고 0.27 g의 PHA를 얻었으며, 이는 세포 건조 중량 71.05%에 달하였다.

이러한 결과는 콩 (soya-based) 바이오디젤 공정의 동시 생성물 스트림을 이용할 때 PHA 축적이 세포 건조 중량의 42%인 것으로 밝혀진 종래 기술의 Ashby et al.의 결과와 비교할 수 있다.

상기 실험을 2% (w/w) GL8 대신 생산 배지 내에서 2% (w/w) 순수 글리세롤을 이용하여 반복하였다. 이하 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포 건조 중량을 기준으로 한 PHA 수율은 GL8에 대한 71.1%와 비교하여 순수 글리세롤에 대하여 52.6%에 불과하였다. PHA 생산에 대한 탄소 이용 효율은 글리세롤 및 GL8에 대하여 각각 11.45% 및 20.8%였다.

파라미터	GL8 (2%)	순수 글리세롤 (2%)
부피	100 ml	100 ml
온도	35℃	35℃
취한 샘플의 중량	2g	2g
가압증기멸균 후 배지 내 탄소 함량	0.72	0.76
수확 시간	90 시간	90 시간
세포 건조 중량	0.38g	0.30g
PHA 수율	0.270g	0.158g
세포 건조 중량을 기준으로 한 PHA 수율	71.1%	52.6%
PHA 내 탄소 함량	0.15g	0.087g
PHA 내로 들어가는 배지 내 탄소 %	20.8%	11.45%

다른 방법으로는 폐기하기 어려운 실시예 11의 증류기 바닥물은 심지어 순수 글리세롤을 이용한 것보다도 더 효율적으로 PHA를 생산하며, 이는 아마도 불순물이 PHA 생산을 위한 촉진제로 작용하기 때문일 것이다. GL7 및 GL8 내 금속 불순물을 이하 표 5에 상세히 기재한다.

분석 물질 (mg/L)	GL7	GL8
칼슘	3.263	8.189
카드뮴	0.002	0.002
코발트	0.000	0.002
크롬	0.005	0.023
구리	0.075	0.046
철	0.360	0.554
칼륨	48.90	21.63
마그네슘	2.183	3.552
망간	0.022	0.040
몰리브덴	0.004	0.004
나트륨	17.21	38.24
니켈	0.006	0.022
납	0.015	0.152
아연	0.814	0.131

GL8 로부터 얻어지는 폴리히드록시알카노에이트의 특성 규명:

GL8을 이용하여 얻어지는 PHA는 1.4640의 다분산 지수 (M_w/M_n), 및 각각 35990 및 24583의 M_w 및 M_n을 가지는 것으로 밝혀졌다. 양성자 및 ¹³C NMR은 표준 PHA (Sigma)의 것에 부합하였다. 그러나, DSC 융점은 표준 PHA에 대한 146.9℃ (넓음) 값과 비교하여 166.2℃ (좁음) (도 6)였다. (폴리머 물리적 특성에 대한 상기 모든 데이터는 Solvay Specialties India Private Limited에 의하여 제공되었다). 본 발명의 폴리머로부터 제조된 필름을 내하중 용량에 대하여 측정하였다. 내하중 용량은 40.5 mm 직경 및 0.05 mm 두께의 필름에 대하여 7-8 psi인 것으로 밝혀졌다. 상기 필름은 캡슐, 파우치로 변환될 수 있었으며, 열 밀봉될 수 있었다. 이러한 필름은 습기 있는 정원 토양 내에 묻을 경우 50일 후 생분해의 증거를 나타냈다. 필름 두께를 증가시키거나 본 발명의 PHA를 폴리메틸메타크릴레이트와 블렌딩함으로써 더 질긴 필름을 제조할 수 있었다.

실시예 12.2

실시예 12.1의 실험을 생산 배지 내에서 다음의 변화를 제외하고 동일한 방식으로 반복하였다: (i) 2% GL8을 2% GL7로 대체하고, 배지의 pH를 배양균 접종 전에 85% H₃PO₄로 중성으로 만들고, GL7 첨가 후 배지를 스파징하여 GL7 내 잔류 메탄올을 제거하였고 (달리 기재하지 않으면, GL7이 사용될 때 이러한 스파징에 의존함을 주목), 및 (ii) 실시예 12.1의 생산 배지 내에 첨가되는 Na₂HPO₄.12H₂O 및 KH₂PO₄를 제외시켰다. PHA 함량은 GL8에 대한 71.1%와 비교하여 세포 건조 중량의 49.3% (w/w)인 것으로 밝혀졌다. 따라서, MTCC-5343 배양균은 조 글리세롤 분획의 조성에 변화가 있을 경우 동일하게 반응하지 않을 것이다.

실시예 12.3

King's B 배지는 고비용이며 또한 펩톤 및 글리세롤을 함유하고 있으므로, 실시예 12.1의 실험을 King's B 증식 배지를 아미노산으로서 질소를 제공하는 10% (v/v) 자트로파 오일 케이크 가수분해물 (JOCH) 및 글리세롤을 제공하는 2% (w/v) GL7로 대체한 것을 제외하고 동일한 방식으로 반복하였다. 그러나, 상기 증식 배지 내에서 증식한 배양균을 실시예 12.2의 생산 배지 내에 접종할 때, PHA 수율은 세포 건조 중량의 28.2% (w/w)로 더 감소되는 것으로 나타났다.

King's B 배지는 원칙적으로 바이오디젤 공정 자체의 부산물로부터 유도되는 더 비용 효율적인 배지로 대체될 수 있으나, 이러한 대체는 MTCC-5343의 경우 세포 건조 중량 기준으로 PHA 수율에 악영향을 미친다.

실시예 13

실시예 13.1

실시예 12.2의 실험을 할로모나스 히드로써말리스와 99.63% 서열 동일성을 가지는 Adari (위도 20°57.584', 경도 70°16.759'), Gujarat India의 Veraval 해안으로부터 분리된 해양 세균을 이용하여 반복하였다. 상기 세균을 60 해양 세균 중에서 스크리닝하였으며, 이는 더 높은 양의 PHA를 생산하는 것으로 나타났다. King's B 증식 배지를 pH 7.6±0.2로 유지되는 1 리터의 배지 내에 펩톤 5.0g, 효모 추출액 1.0 g, 구연산철 0.1g, 염화나트륨 19.45g, 염화마그네슘 8.8g, 황산나트륨 3.24g, 염화칼슘 1.8g, 염화칼륨 0.55g, 중탄산나트륨 0.16g, 브롬화칼륨 0.08g, 염화스트론튬 34.0mg, 붕산 22.0mg, 규산나트륨 4.0mg, 불화나트륨 2.4mg, 질산암모늄 1.6mg 및 인산이나트륨 8.0mg을 포함하는 Zobell's 해양 배지로 대체하였다. 상기 해양 세균을 이러한 배지 내에서 배양하여 1.7-1.9의 O.D.를 가지는 종균을 얻었다. 원심분리된 바이오매스를 실시예 12.2에서와 동일한 생산 배지 내에 접종하였다. 세포 건조 중량을 기준으로 한 PHA 수율은 71.2% (w/w)였다.

PHA 생산을 위한 GL7의 사용은 토양으로부터 분리된 MTCC 5343보다 본 발명에서 분리된 해양 세균 MTCC 5345를 이용할 때 더 효과적인 것으로 나타났다.

실시예 13.2

Zobell's 해양 증식 배지를 10%(v/v) JOCH 및 2% (w/v) GL7로 대체한 것을 제외하고, 해양 세균 (MTCC 5345)을 이용하는 실시예 13.1의 실험을 반복하였다. 세포 건조 중량 기준으로 PHA 수율은 6.98% (w/w), 즉 실시예 13.3에서와 거의 동일하였다. PHA 내로 들어가는 배지 내 탄소 백분율은 11.30%(w/w)였다. 실험 데이트를 이하 표 6에 상세히 기재한다.

단계 1 발효 - 증식
JOCH	10 mL
GL7	2 g
중화 산	85% H3PO4
pH	7.2
종균 (Zobell's 해양 배지 내 증식)	1 mL
증식 배지의 총 부피	100 mL
증식 배지의 온도	35±2℃
증식 기간	48 시간
단계 2 발효 - PHA 생산
GL7	2 g
접종원	증식 배지로부터 수확된 총 배양균
황산암모늄	0.05 g
황산마그네슘	0.04 g
미량영양소 용액 (실시예 6 참조)	0.1 mL
총 부피	100 mL
온도	35±2℃
배지 내 탄소 양	0.69 g
pH	7.00
인큐베이션 시간	96 시간
세포 건조 중량	0.20 g
세포 건조 중량에 근거한 PHA 수율	69.8%
PHA의 절대 수율	0.1396 g
얻어지는 PHA 내 C 중량 (CHN-S 원소 분석에 의한 55.58% 탄소 함량)	0.078 g
PHA 내로 들어가는 발효 공정에서 소모되는 탄소의 %	11.30%

실시예 13.3

해양 세균 (MTCC 5345)을 이용한 실시예 13.2의 실험을 다음과 같이 단순화하여 반복하였다: (i) 증식 및 생산 단계들을 단일 단계로 결합하고, (ii) GL7 및 JOCH 이외에 다른 영양소/미량 영양소를 제공하지 않았으며, (iii) GL7과 JOCH 사이의 내부 중화를 통하여 pH가 자기 조정되도록 하여 (7.7로 되었다), 이와 같이, pH에 대한 임의적인 조정이 행하여지지 않았고, (iv) GL7 내 메탄올 제거를 위하여 스파징을 수행하지 않았으며, 밤/이른 아침에 28℃에서 점심 때 37℃로 변하는 주위 온도에서 인큐베이션을 수행하였다. 1-10% (v/v)의 종균을 단계 (xiii)의 조 글리세롤 2-10% (w/v) 및 실시예 3에서 제조된 바와 같은 자트로파 오일 케이크 가수분해물 5-20% (v/v)을 함유하는 증식 겸 생산 배지 100 mL 내로 직접 접종하였다. 이하 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, PHA 생산은 세포 건조 중량 기준으로 75.1% (w/w)였다. PHA의 절대 중량은 실시예 13.2에서보다 89% 높았으며, 96 시간 인큐베이션 후 PHA 내로 들어가는 배지 내 탄소 백분율 또한 18.8%로 더 높았다. 정제된 PHA의 DSC 융점은 172℃였다 (도 7). 따라서, 방법의 단순화 (GL7의 워크업을 완전히 피함; 단일 단계 발효; 시간 절약; 주위 조건 프로세싱)는 PHA 생산의 효율성을 증가시킴과 동시에 더 큰 비용 효율성을 가지는 것으로 (영양소가 GL7 및 자트로파 메틸에스테르 공정의 JOCH 동시 생성물 스트림에 의해서만 제공됨; 에너지 절약) 이 실시예를 통하여 입증되었다.

단일 단계 PHA 생산
JOCH	10 mL
GL7	2.00 g
pH	7.7
총 부피	100 mL
가압 증기 멸균 후 배지 내 탄소 함량	0.78 g
가압 증기 멸균 후 배지 내 질소 함량	0.097 g
증식 배지의 온도	28-37℃
종균 (Zobell's 해양 배지 내 증식)	1 mL
인큐베이션 시간	96 시간
세포 건조 중량	0.353 g
분리된 PHA의 중량	0.265 g
세포 건조 중량을 기준으로 한 PHA 수율	75.1%
생산된 PHA의 탄소 함량 (@55.58 % w/w)	0.147 g
PHA 내로 들어가는 배지 내 탄소의 %	18.8%

실시예 13.4

진탕기 내 주변 조건 하에 남겨진, 5 L 플라스크 내에 취해진 발효액 4 L를 이용하여 실시예 13.3의 실험을 수행하였다. 96 시간 후 수확된 습기 있는 바이오매스의 무게는 39 g이었으며, 건조 바이오매스의 수율은 5.57 g이었고, PHA의 수율은 4.3 g(세포 건조 중량 기준으로 77% PHA)이었다.

실시예 13.5

2 g GL7을 GL7과 GL8의 9:1 혼합물 2 g으로 대체하고 인큐베이션 시간이 1주인 것을 제외하고, 실시예 13.3의 실험을 반복하였다. 수확된 건조 마이오매스 수율은 0.615 g이었으며, PHA 수율은 0.425 g, 즉, PHA 수율은 세포 건조 중량 기준으로 69% (w/w)이었고 배지 내 탄소 함량 기준으로 30.2%이었다.

실시예 13.6

실시예 11 내지 13.5에서 얻어진 PHA 샘플 중 일부를 클로로포름 내 용해시키고, 깨끗하고 건조된 유리판 위에 주조함으로써 필름으로 제작하고, 클로로포름을 서서히 증발시켰다. 0.5 내지 5% PHA를 클로로포름 내에 (w/v)용해시킴으로써 PHA 필름을 제조하였다. 상기 필름을 공기 건조시켰으며; 완전 증발은 필름 형성을 초래하였다. 필름 두께는 마이크로미터로 측정하여 0.016-0.28 mm였다. 습기 있는 정원 토양 내 묻은 필름은 50일 후 생분해가능한 것으로 나타났다.

Claims (18)

1. 하기 단계를 포함하는, 1.06% 유리 지방산 (FFA)을 함유하는 캡슐화된 자트로파 종자로부터 자트로파 메틸 에스테르 (JME) 및 부산물을 제조하기 위한 통합 방법:
   (i) 탈외피기 내에서 캡슐화된 자트로파 종자를 기계적으로 탈외피시켜 자트로파 외피 및 자트로파 종자를 얻는 단계;
   (ii) 착유기를 이용하여, 단계 (i)에서 얻어지는 자트로파 종자로부터 자트로파 오일, 4-6% 질소를 가지는 자트로파 오일 케이크 및 폐유 슬러지를 배출시키는 단계;
   (iii) 단계 (i)에서 얻어지는 자트로파 외피를 단계 (ii)에서 얻어지는 폐유 슬러지를 첨가하면서 브리케팅 기계 내에서 브리케팅하여 부산물로서 1.05-1.10 g/cm³ 밀도를 가지는 자트로파 브리케트를 얻는 단계;
   (iv) 단계 (ii)에서 얻어지는 4-6% 질소를 가지는 자트로파 오일 케이트를 H₃PO₄, H₂SO₄로 가수분해하여 부산물로서 자트로파 오일 케이크 가수분해물 (JOCH)을 얻는 단계;
   (v) 단계 (ii)에서 얻어지는 자트로파 오일을 염기로 중화시키는 단계;
   (vi) 단계 (v)에서 얻어지는 중화된 자트로파 오일의 일부를 10 내지 20 분 동안 교반하면서 알콜 및 염기와 에스테르 교환반응시키고, 조 글리세롤 층 GL1 및 조 자트로파 메틸 에스테르(JME)를 분리하는 단계;
   (vii) 단계 (vi)에서 얻어지는 조 JME을 순수 글리세롤 층으로 3회 세척하여 메탄올 및 KOH를 함유하는 세 개의 순수하지 않은 글리세롤 층들 GL2, GL3 및 GL4를 분리하여 글리세롤 세척된 JME-G₃W를 얻는 단계;
   (viii) 단계 (vii)에서 얻어지는 JME-G₃W를 수지 처리에 의해 정제하여 알칼리 금속 불순물을 제거하는 단계;
   (ix) 단계 (v)에서 얻어지는 나머지 중화 오일 부분과 단계 (vi) 및 (vii)에서 얻어지는 글리세롤 층들 GL5 (GL1+GL2+GL3)을 혼합하여 JME 및 글리세롤 층 GL6을 얻는 단계;
   (x) 단계 (ix)에서 얻어지는 JME 및 글리세롤 층 GL6을 분리하는 단계:
   (xi) 단계 (x)에서 얻어지는 글리세롤 층 GL6과 중화 오일의 나머지 부분을 혼합하여, 메탄올 제거를 위한 JME 및 글리세롤 층 GL7을 얻는 단계;
   (xii) 단계 (xi)에서 얻어지는 JME 및 글리세롤 층 GL7을 분리하는 단계;
   (xiii) 단계 (xii)에서 얻어지는 글리세롤 층 GL7을 폴리히드록시알카노에이트 (PHAs)를 생산하기 위해 직접 사용하거나, 순수 글리세롤 및 증류기 바닥물 GL8을 얻기 위하여 황산으로 알칼리 중화하기 위해 사용하는 단계;
   (xiv) 단계 (viii)에서 얻어지는 JME-G₃W와 단계 (x) 및 (xii)에서 얻어지는 JME를 결합하여 결합 메틸 에스테르를 얻는 단계; 및
   (xv) 단계 (xiv)에서 얻어지는 결합된 메틸 에스테르를 메탄올성 KOH와 에스테르 교환반응시켜 총 글리세롤 0.088% 및 유리 글리세롤 0.005%를 가지는 순수 자트로파 메틸 에스테르 (바이오디젤)를 생산하는 단계.
2. 제1항에 있어서,
   단계 (i)에서, 상기 캡슐화된 자트로파 종자는 햇볕에 말린 것인, 방법.
3. 제1항에 있어서,
   단계 (i)에서, 탈외피는 (i) 상기 종자를 손상시키지 않고 정지 표면을 이용하여 마모에 의하여 개방 외피를 파쇄하는 회전 드럼으로 이루어지는 캡슐 파쇄기, (ii) 상기 외피로부터 종자를 분리하고 종자를 외피와 반대 방향으로 이동시키기 위한 경사진 진동체, 및 (iii) 외피 내 종자 손실 없이 별도로 수집되는 외피를 분출시키기 위한 송풍기를 포함하는, 탈외피기 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서,
   단계 (vi)에서, 염기는 수산화칼륨 및 수산화나트륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서,
   단계 (vi)에서, 알콜은 메탄올 및 에탄올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   단계 (viii)에서, JME-G₃W 층은 매크로 다공성 양이온 교환 수지를 이용하여 정제되어 알칼리 금속 불순물을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서,
   수지 처리되는, 단계 (vii)에서의 JME-G₃W 층은 15-30 ppm 내지 <0.5 ppm의 최대 [Na⁺] 및 [K⁺] 불순물 수준, 0.4-0.6% (w/w)의 메탄올 불순물 수준, 500-1500 ppm의 수분 함유량, 0.2-0.3% (w/w)의 총 글리세롤 함량 및 0.15-0.25% (w/w)의 낮은 유리 지방산 함량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서,
   단계 (iii)에서, 브리켓팅은 (i) 경사진 스크류 피더, (ii) 교반기 및 첨가제 공급을 위한 개구를 구비하는 혼합 장치, (iii) 브리케트를 성형하기 위한 다이 및 압밀을 위한 고압을 발생시키기 위한 유압 시스템으로 구성되는 압축 시스템, 및 (iv) 형성되는 브리케트를 냉각시키기 위한 브리케트 이송 시스템을 포함하는 브리케팅 기계 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서,
   단계 (i)에서, 얻어지는 외피는 0.08 g/cm³의 부피 밀도 및 3700 kcal/kg의 발열량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 단계들을 트리글리세라이드 오일에 동등하게 적용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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