CN102597199B - 制备麻疯树油甲酯和副产物的综合方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于由太阳晒干的麻疯树整粒种荚制备脂肪酸甲酯(生物柴油)的更简单和具有更高能量效率的方法，所述方法结合了种子壳、除油饼和粗甘油共产物流的附加价值。更具体地，本发明涉及一种无需通过蒸馏回收过量甲醇、经济的树脂处理用于甲酯精制和利用共流以高效和经济的方式制备高密度能量砖和聚羟基链烷酸酯可生物降解聚合物的方法。

Description

制备麻疯树油甲酯和副产物的综合方法
技术领域
本发明涉及一种由整粒种荚(seed capsule)制备麻疯树油甲酯(Jatropha methyl ester)的改进的综合方法。更具体地，本发明涉及一种无需通过蒸馏回收过量甲醇、经济的树脂处理来精炼甲酯和利用共流以高效和经济的方式制备高密度能量砖(energy briquette)和聚羟基链烷酸酯可生物降解聚合物的方法。
背景技术
麻疯树(Jatropha curcas)油用于汽油和柴油发动机可参考澳大利亚专利No.AU-A-15448/83(授予Yuko Chemical Co.Ltd.)。虽然该开创性的努力显示出麻疯树油的优势，但本领域技术人员熟知对于现代柴油发动机中大量使用而言，粗制油过于黏稠。
可参考Haas等的美国专利No.6399800和Brunner等的美国专利申请No.2004/0102640A1，其公开了通过分别用酸和碱催化的酯化和酯交换过程的结合制备脂肪酸烷基酯的相关方法。这些发明都没有提及本申请的主题。
还可参考德国专利申请No.DE10243700A1，其中通过使用硫酸和对甲苯磺酸催化剂由一系列甘油三酯(包括动物油脂)获得甲酯。其未提及本申请的主题。
可参考Ghosh等的专利申请(美国专利申请号11/00239；PCT/IN04/00329和随附的国家阶段申请文件)，其中公开了一种由整粒种子制备麻疯树油甲酯的综合方法，其结合了副产物的回收。用NaOH中和从整粒种子排出的粗制油以减少游离脂肪酸含量，然后与化KOH甲醇溶液交换，和每摩尔甘油三酸酯3摩尔甲醇的理论要求相比，每摩尔甘油三酸酯油使用5.0-5.5摩尔甲醇。随后通过用纯甘油(4-5kg每100kg甲酯)洗涤和然后用水洗涤纯化甲酯以得到纯度＞98％和满足EN 14214和ASTM规格的所有要求的产物。粗甘油层进行蒸馏以回收甲醇，然后酸化以回收K2SO4和皂样物质，并然后再次蒸馏以回收纯化形式的甘油，从而留下作为废物的少量釜脚(still bottom)。该方法的一个缺点是并非所有的油都以甲酯的形式回收，一小部分被转化成皂(其的形成与游离脂肪酸的含量成比例)，因此将油的游离脂肪酸含量保持尽可能低是必要的。该文献未提及利用整粒种荚作为原料，也未提及任何精制甲酯的少用水的方法，且未提及任何由粗甘油制备聚羟基链烷酸酯的方法。
可参考S.Mandpe，S.Kadlaskar，W.Degen和S.Keppeler的名称为“On Road Testing of Advanced Common Rail Diesel Vehicles with Biodieselfrom the Jatropha curcas Plant”的文章(2005-26-356，Proceedings ofSAEINDIA Conference 2005)，其叙述了用纯净甲酯驱动的C级梅赛德斯车的性能，所述甲酯按照如前引用的参考文献Ghosh等所公开的方法制备。
可参考名称为“Local and Innovative Biodiesel”的欧洲项目(AltenerContract No.4.1030/C/02-022；http//www.fedarene.org/publications/projects/contract/biodiesel/home.htm；Coordinator-EREN；Report courtesy Austrian Biofuels InstituteE.V.-Co-contractor)，其中评估了来自世界各地、使用相同或不同原料由不同机构制备的甲酯。按照Ghosh等的发明的方法(PCT/IN04/00329；美国专利申请号11/00239)制备的麻疯树油甲酯(JME-05-728)在产生功率、燃料消耗和长期性能方面给出了最好的发动机性能。
可参考D.Fairless的名称为“Biofuel-The little shrub that could-maybe”的文章(Nature，449，2007，652-655页)，其叙述了麻疯树作为合适的生物柴油来源的前景。
可参考国际能源署生物能项目40(IEA Bioenergy Task 40)的报告(http://www.city.northbay.on.ca/business/presentations/woodPellets/Global ％20wood％20pellets％20market％20and％20industry％20Nov％2007％20rep ort.pdf)，其详尽地论述了生物质颗粒作为燃料来源的前景和所需的规格。
也可参考Ghosh等的名称为“Prospects for Jatropha Methyl Ester(Biodiesel)in India”的文章(Int.J.Environ.Stud.(Taylor & Francis，U.K.)-special issue on India′s future energy options；2007，64，659-674页)，其陈述了在分离种子之后由麻疯树的整粒种荚制砖的可能性。然而，其未提及任何制备该砖的方法及其规格。
可参考M.Berrios和R.L.Skelton的名称为“Comparison ofpurification methods for biodiesel”的文章(Chemical Engineering Journal，2008，459-465页)，其中描述了纯化生物柴油的不同方法。具体地，进行了水洗涤、使用离子交换树脂和使用硅酸镁作为吸附剂的比较评估。
可参考Gross等的德国专利No.DE4301686C1，其公开了一种通过蒸馏过程制备油菜籽油甲酯的方法，所述蒸馏过程使该方法成为一个少用水的方法。
可参考Wang等的名称为“Refining ofbiodiesel by ceramic membraneseparation”的文章(Fuel Processing Technology，Article in Press，2008年12月20日)，其中尝试使用孔尺寸为0.6、0.2和0.1μm的陶瓷膜以通过少用水的方法移除残留皂和游离甘油。
可参考Purolite网站(http://www.desmoparts.com/filters/purolite/HBD-Purolite％20Regeneration.pdf)，其提及了树脂PD206[Purolite应用说明书/Purolite PD-206指南]，其可以两种方式使用：一种是用于移除水分、甲醇和甘油，另一种是用于催化剂、盐和皂的离子交换，从而主要地将催化剂的钠(Na+)与树脂上的氢(H+)交换。据报道，在从生物柴油吸附水、甲醇和甘油之后，树脂体积膨胀到树脂干体积的两倍。此外，估计在第一再生阶段中由于珠破损而存在10％的消耗。珠破损和官能团的损失是决定PD206可再生的次数的限制因素，且目前需要在2-4次再生后替换PD206。这足以说明只有当甲酯中杂质的加载量为绝对最小值时使用树脂才是可行的。
可参考Bam等的美国专利No.5424467，其中公开了甲酯的纯化和粗甘油层的利用。文中指出甘油层中的甘油单酯和甘油二酯杂质可通过与额外量的甲醇的反应而转化为所需的甲酯。通过蒸馏回收甘油层中的甲醇。该文献未提及通过本发明所公开的与甘油三酯油的进一步反应的方法而回收甲醇。
再次参考Ghosh等的专利申请(美国专利申请号11/00239；PCT/IN04/00329)，其中提供了一种有效的方法，其使用非常少量的纯甘油(约3kg每100kg甲酯)洗涤粗制甲酯，该过程使甲酯中的残留杂质最少化而同时使它们富集于粗甘油层中。结果，从甲酯回收甲醇变得不必要，而从甘油层的这种回收通过蒸馏进行。报道的甲醇回收量为所使用的过量甲醇的约70-80％。该文献未提及任何从甘油层回收甲醇的其他可能方法，也未提及从共产物流制备聚羟基链烷酸酯(PHA)。
专利申请No.WO/2006/084048一般涉及生物柴油燃料，且更具体地涉及一种将由传统酯交换过程产生的废甘油转化为生物柴油燃料的可混溶和可燃烧成分的方法。
可参考M.Pagliaro等的名称为“From glycerol to value-addedproducts”的文章(Angew.Chem.Int.Ed.(2007)，46，4434-4440)，其中描述了衍生自甘油的各种产物，例如丙二醇、1，2-丙二醇、皂类、药物、炸药、洗涤剂、化妆品、二羟基丙酮(DHA)、丙烯醛、表氯醇、合成气燃料、甘油碳酸酯、抗冻剂，催化转化成聚合物等。然而，其未提及生物聚合物(PHA)的制备。
可参考Goetsch等的美国专利No.7388034，其中公开了一种由生物柴油过程的粗甘油副产物制备甲醇的方法。
可参考“Biopolymers for Medical and Pharmaceutical Applications”，Vol.1&2，A.Steinbuchel和R.H.Marchessault，Wiley-VCH Veriag GmbH& Co.KgaA(2005)和文中的参考文献，其引用了许多涉及PHA制备和性质的现有技术。其未提及关于本发明的PHA制备方法。
可参考G.N.M.Huijberts等的名称为“Pseudomonas putida KT2442cultivated on glucose accumulates poly(3-hydroxyalkanoates)consisting ofsaturated and unsaturated monomers”的论文(Applied and EnvironmentalMicrobiology，1992年2月，第58卷，第2版，536-544页)，其中在E2培养基中使用不同碳水化合物如葡萄糖(2％)、果糖(2％)和甘油(4％)来研究恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2442重组菌株的生长，从而产生具有相似的单体组成的PHA。相对于细胞干重的PHA产率为20.5％(w/w)。
可参考Taniguchi等的名称为“Microbial production ofpoly(hydroxyalkanoate)s from waste edible oils”的论文(Green Chem.2003，5，545-548页)。该论文描述了用真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)在两阶段发酵过程中(一个用于培养物的生长，另一个用于制备聚羟基链烷酸酯)所获得的结果，当使用棕榈叶和猪油时得到相对于细胞干重83％的最大PHA产率。制备培养基还含有无机营养物/微量营养物，而生长培养基含有昂贵的营养肉汤。
可参考R.D.Ashby等的名称为“Bacterial poly(hydroxyalkanoate)polymer production from the biodiesel co-product stream”的研究论文(Journal of Polymers and the Environment，2004，第12卷，105-112页)，其中食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)和皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)用于在两阶段发酵过程中由含有甘油、脂肪酸皂和浓度为1％-5％的残留脂肪酸甲酯的大豆基生物柴油制备(CSBP)流的共产物流制备PHA。在用作基质之前，用1N HCl中和碱性共产物流(pH 13)至pH 7。细菌最初在Luria-Bertani(LB)液体培养基中生长，所述Luria-Bertani(LB)液体培养基包含几种昂贵的组分(包括蛋白胨)，之后细胞被转移至含中和的共产物流和额外的营养物/微量营养物的制备培养基中。皱纹假单胞菌的聚合物细胞产率仅为细胞干重(CDW)的42％，而即使在优化条件下相对于甘油的聚合物产率＜5％。这些条件包括使用富含昂贵营养物的特殊培养基。
可参考E.J.Bormann和M.Roth.的名称为“The production ofpolyhydroxybutyrate by Methylobacterium rhodesianum and Ralstoniaeutropha in media containing glycerol and casein hydrolysates”的研究论文(Biotechnology Letters，1999，第21卷，1059-1063页)，其中通过这些细菌生产聚羟基丁酸酯(PHB)在含与酪蛋白胨或酪蛋白氨基酸结合的甘油的培养基中进行。甘油以2.5％、5％和7.5％的浓度使用。聚合物的产率报道为相对于甘油的17％(w/w)，而作为细胞干重百分数的聚合物含量为39±6％。
可参考Koller M.等的名称为“Production of polyhydroxyalkanoatesfrom agricultural waste and surplus materials”的研究论文(Biomacromolecules，2005，第6卷，561-565页)，其中聚羟基链烷酸酯通过嗜高渗有机体由补充有肉和骨粉的乳清水解产物(0.55％)和甘油液体相(1.6％)获得。相对于甘油的PHA产率为23％，且聚合物的分子量为253kDa，在128℃和139℃吸热熔化。
可参考Ito等的论文(J.Bioscience & Bioengineering，2005，100，260-265页)，其中描述了由生物柴油制备过程后排出的含甘油废物生化制备氢和乙醇。据报道其生物化学活性远低于采用纯甘油的情况，原因在于废物中高盐含量的存在。
由现有技术明显可见还未公开用于由生物柴油共产物流制备PHA的经济的方法，且即使是使用昂贵的共营养物和繁琐的两步法，相对于细胞干重的PHA产率通常报道为＜50％。现有技术也教导我们使用含甘油废物的尝试导致较纯甘油而言低得多的生物化学产率，这归因于高水平盐的存在。本发明试图克服所有这些基本限制，并演变出了新颖、简化和经济的由从麻疯树整粒种荚开始的甲酯过程的甘油共产物流制备PHA的方法。所述方法中的若干其它相关改进，例如(i)有问题的废物的最佳利用，尤其甘油蒸馏过程的油和釜脚的机械排除过程中产生的油泥，(ii)由粗甘油层蒸馏甲醇的替代方案，和(iii)经甘油洗涤的甲酯的经济的树脂处理，也形成了本发明的部分。
发明目的
本发明的主要目的是提供由麻疯树整粒种子制备脂肪酸甲酯(生物柴油)的改进和综合的方法。
本发明的另一目的是以最小能量输入和零污水排放制备生物柴油。
另一目的是表明酯交换反应方法中使用的90％的0.58摩尔当量过量的甲醇和几乎所有KOH催化剂通过现有技术公开的甘油洗涤过程而限制于甘油层中。
另一目的是表明，由于在甘油洗涤之后的甲酯层中仅存在痕量的钾离子和钠离子，通过离子交换树脂处理移除残留量的这些离子从而将其浓度降低至指定的要求水平可能是可行的。
另一目的是无需为了回收而蒸馏甲醇。
另一目的是用额外量的甘油三酯油通过后续反应去除甘油层中70-90％的甲醇。
另一目的是利用去除甲醇之后的粗甘油作为用于以经济的方式微生物合成可生物降解的聚羟基链烷酸酯聚合物的生长和制备培养基中的碳源和营养源。
另一目的是利用麻疯树种子榨油之后得到的渣饼作为生长培养基中氨基酸和其它营养物的来源，从而无需使用昂贵的培养基例如King’s B培养基(King’s B medium)和Zobell’s海洋培养基(Zobell’s marinemedium)。
另一目的是表明据显示存在于油饼中的有毒杂质(例如佛波醇酯和泻果素)不妨碍本发明方法中PHA的制备。
另一目的是证明具有类似于标准PHA的理化性质的PHA聚合物的有效制备。
另一目的是表明通过使培养物直接接种到含有碱性粗甘油层和得自脱油的麻疯油渣饼的水解产物的培养基中而不使用任何其他的营养物/微量营养物和没有任何其他干预(例如喷射、pH调节、温度控制等)，来自阿拉伯海的海洋细菌分离物(与热水管盐单胞菌(Halomonashydrothefmalis)存在99.63％的序列相似性)产生相对于细胞干重75％的PHA产率。
另一目的是以最简单、最廉价的方式和在可能的最短时间内实现这种PHA制备。
附图说明
图1代表根据本发明由麻疯树整粒种荚制备甲酯和共生产物的示意图。
图2代表用于评估粗甘油层中甲醇的甘油中甲醇含量的校准曲线图(实施例5-8，其中实施例8描述了分析方法)。
图3代表甲酯中甲醇含量的校准曲线图(实施例5-8，其中实施例8描述了分析方法)。
图4代表甲酯中痕量钠的校准曲线图(实施例7&10，其中后者描述了分析方法)。
图5代表甲酯中痕量钾的校准曲线图(实施例7&10，其中后者描述了分析方法)。
图6代表通过实施例12.1的方法制备的PHA的差示扫描量热曲线。
图7代表通过实施例13.3的方法制备的PHA的差示扫描量热曲线。
发明概述
因此，本发明提供一种由含有1.06％游离脂肪酸(FFA)的麻疯树包壳种子(capsulated seed)制备麻疯树油甲酯(JME)和副产物的综合方法，所述方法包括如下步骤：
(i)在去壳机器中将麻疯包壳种子机械去壳以获得麻疯树种壳和麻疯种子；
(ii)使用榨油机，从步骤(i)获得的麻疯种子中压榨麻疯树油、具有4-6％氮的麻疯树油渣饼和废油泥；
(iii)用碱中和步骤(ii)中获得的麻疯树油；
(iv)在搅拌下使一部分步骤(iii)中获得的中和麻疯树油与醇和碱进行酯交换反应10-20分钟，并分离粗甘油层GL1和粗麻疯树油甲酯(JME)；
(v)用纯甘油层洗涤步骤(iv)中获得的粗JME三次以分离三个含甲醇和KOH的不纯甘油层GL2、GL3和GL4，从而获得经甘油洗涤的JME-G3W；
(vi)纯化步骤(v)中获得的JME-G3W以移除碱金属杂质；
(vii)用步骤(iv)和(v)中获得的甘油层GL5(GL1+GL2+GL3)处理剩余的步骤(iii)中获得的中和油的部分以获得JME和甘油层GL6；
(viii)分离步骤(vii)中获得的JME和甘油层GL6；
(ix)用中和油的剩余部分处理步骤(viii)中获得的甘油层GL6从而去除甲醇以获得JME和甘油层GL7；
(x)分离步骤(ix)中获得的JME和甘油层GL7；
(xi)直接将步骤(x)中获得的甘油层GL7用于制备聚羟基链烷酸酯(PHA)或用于用硫酸中和碱以获得纯甘油和釜脚GL8；
(xii)将步骤(vi)中获得的JME-G3W与步骤(viii)和(x)中获得的JME混合以获得混合甲酯；和
(xiii)用KOH甲醇溶液对步骤(xii)中获得的混合甲酯进行酯交换以获得具有0.088％总甘油和0.005％游离甘油的纯麻疯树油甲酯(生物柴油)。
在本发明的一种实施方案中，本发明提供一种制备副产物的综合方法，所述方法包括如下步骤：
a.通过加入步骤(ii)获得的废油泥，在压块机中将步骤(i)中获得的麻疯树种壳压块以获得作为副产物的麻疯砖，其密度为1.05-1.10g/cm3；
b.用H3PO4、H2SO4水解步骤(ii)中获得的具有4-6％氮的麻疯树油渣饼以获得作为副产物的麻疯树油渣饼水解产物(JOCH)。
在本发明的另一种实施方案中，本发明提供一种制备副产物聚羟基链烷酸酯(PHA)的综合方法，所述方法包括如下步骤：
I.将1-10％土壤细菌MTCC 5343或海洋细菌MTCC 5345更优选海洋细菌MTCC 5345种子培养物接种在含2-10％(w/v)釜脚GL8或GL7或其组合的生长和制备培养基中，并在25-40℃温度范围中、pH 7.0-8.0下培养24-96小时的时间以使其发酵；
II.通过离心发酵物以获得细胞沉淀而收获细胞；
III.通过离心所述细胞沉淀回收固体聚合物；
IV.用水和甲醇洗涤所述固体聚合物以获得PHA；
V.将0.5-5％PHA溶于氯仿中以获得PHA薄膜。
在本发明的再另一种实施方案中，太阳晒干的整粒种荚增强了保持特性，并且当种子包有壳时油的游离脂肪酸含量仅为0.5-2.0％，从而增加了甲酯的产率。
在本发明的再另一种实施方案中，其中去壳在特别设计的去壳机中进行，所述去壳机包括(i)由转鼓构成的破荚器，其通过固定表面的磨擦开壳而不损坏种子，(ii)倾斜振荡筛，用于将种子与壳分离和指引种子向与壳相反的方向移动，和(iii)使用吹风机以吹去壳，壳单独收集而壳中种子无损失。
在本发明的再另一种实施方案中，碱选自由氢氧化钾或氢氧化钠组成的组，更优选氢氧化钾。
在本发明的再另一种实施方案中，醇选自由甲醇或乙醇组成的组，更优选甲醇。
在本发明的再另一种实施方案中，通过使用大孔阳离子交换树脂纯化JME-G3W层以移除碱金属杂质。
在本发明的再另一种实施方案中，通过使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物和硫酸制备大孔阳离子交换树脂。
在本发明的再另一种实施方案中，使用十六烷醇作成孔剂，通过苯乙烯的悬浮聚合制备苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
在本发明的再另一种实施方案中，进行树脂处理的JME-G3W层具有15-30ppm-＜0.5ppm的最大[Na+]和[K+]杂质水平、0.4-0.6％(w/w)的甲醇杂质水平、500-1500ppm的含水量、0.2-0.3％(w/w)的甘油总含量和0.15-0.25％(w/w)的更低的游离脂肪酸含量。
在本发明的再另一种实施方案中，釜脚定义为成功循环之后遗留的残余物，主要由在进一步可蒸馏溶剂/产物方面不具价值的固体和自由液体组成。
在本发明的再另一种实施方案中，压块在压块机中进行，所述压块机包括(i)倾斜螺旋给料机，(ii)配备有搅拌器和进料添加剂的开口的混合装置，(iii)由模制所述砖的模具和产生高压以压实的水压系统组成的压制系统，和(iv)用于冷却所形成的砖的砖传输系统。
在本发明的再另一种实施方案中，所得的壳具有0.08g/cm3的容积密度和3700kcal/kg的热值。
在本发明的再另一种实施方案中，生长培养基选自由King’s B培养基、Zobell’s海洋培养基和与GL7和GL8一起的除油麻疯树油渣饼水解产物(JOCH)组成的组。
在本发明的再另一种实施方案中，相对于细胞干重，PHA产率为69％-77％。
在本发明的再另一种实施方案中，所得的PHA与标准PHA的NMR谱图相符，通过DSC测得的熔点为166.2℃，和GPC数据给出的Mw、Mn和Mw/Mn(多分散指数)值分别为35990、24583和1.46。
在本发明的再另一种实施方案中，上述步骤同样可应用于多种甘油三酯油。
发明详述
本发明的目的是为麻疯树油甲酯的制备方法带来全面改进，其中最大地关注使用简单的单元操作的分散化生产。传统上，农民将干燥的整颗果实去壳，但这导致不能利用壳，因此种子的价格更高，因为单单种子必然承担除果实去壳过程中必需的人工成本以外的成本压力。在本发明过程中，还发现使种子保持于包壳状态是有利的，因为种壳提供了第二保护层，其保持油种的特性并保持种子干净。当通过碱催化获得甲酯时这尤其重要，因为过量的游离脂肪酸必须通过中和去除，从而导致甲酯产率的降低。因此，有必要设计能够以获得完整并干净地与壳分离的种子以及稍后使用该种子的方式将太阳晒干的种荚机械去壳的机器。此外，现在既然壳在单个点收集，则具有强烈的动机以确保这些具有仅0.08g/cm3容积密度和3700kcal/kg热值的外壳可被压砖，以使它们易于运输和可被农民直接使用而不使用木柴或更贵的替代物。而且还有动机以确保设计合适的方法而允许将空壳以所需水平压实成提供高能量密度的硬砖。这些操作均在本发明中成功地披露，使得良好利用由种子机械榨油期间产生的少量废油，以及利用小部分除油渣饼按所需规格制备具有1.05-1.15g/cm3密度和约4000kcal/kg热值的砖。
虽然最佳的现有技术公开了非常有效的麻疯树油甲酯的酯交换和酯交换后(post-transesterification)方法，且甲醇用量也相对较低(仅0.55-0.75摩尔当量过量)，然而尽最大可能回收该甲醇是很重要的。现有技术公开的用来纯化甲酯的甘油洗涤过程使非常少量的甲醇遗留于甲酯中；相反，其被限制在甘油层中达到90-95％的程度。由于如在本发明过程中通过离子色谱测量证实甘油洗涤后的甲酯也具有极低水平的残留碱催化剂，便出现了水洗甲酯是否有必要的问题。作为替代，公开了一种基于使用离子交换树脂的干式方法。使本方法具有创造性的是树脂上的负载非常低，并因此可在小的树脂床体积上处理大量甲酯而无需再生的这一事实。
就粗甘油层而言，出现了在其有效使用中可能的最高水平简化是什么的问题。如本发明所公开的，如果甘油层中的过量甲醇可通过简单的方式移除，那么剩余的量可直接用于以简单和经济的方式制备聚羟基链烷酸酯。随之而来的问题是从甘油层蒸馏甲醇(除非提供冷却单元，否则甲醇蒸馏将导致相当大的损失)是否是唯一的选择。如本发明所公开的，将甲醇反向提取到新鲜批次的麻疯树油中是可行的，以达到80-95％的甲醇可以这种方式被有益地利用。这是因为甘油层还含有部分活性碱催化剂(KOH)，并因而一旦加入新鲜的油且提供适当的搅拌，该甘油层具有促进一定程度的甲酯形成的所有成分。然而，甲醇和催化剂量不足以实现理想的甲酯，且该步骤之后是得以制备具有＜0.15％(w/w)总甘油的纯酯的第二操作。净结果是实现甘油层耗竭甲醇并在第二步骤中减少甲醇用量，以致在没有任何蒸馏步骤且没有损害甲酯的质量的任何形式的情况下，不可回收形式的过量甲醇的总体需求＜0.15摩尔当量。
一旦甲醇被去除，甘油层被证明是对通过在本发明过程中分离的海洋细菌培养物高效和经济地制备聚羟基链烷酸酯而言极好的营养物来源。由通过用热磷酸/硫酸反应萃取获得的麻疯树榨油渣饼产生的水解产物被证明是粗甘油的理想补充伴体，这两种物质协力提供通过海洋细菌培养物制备PHA所需的营养物，而无需任何精细的温度控制。这两种物质一起也有助于彼此中和(酸-碱)达到一定程度从而降低中和成本。还有若干另外的发明，例如将常规的两阶段过程合并成单步骤、外通过由水解物和甘油层获得除碳和氮外的必要磷酸盐缓冲剂和必要元素而免除所有营养物/微量营养物。在分散化操作中，在这样的工厂将建在农田附近的情况下，在回收可收获的生物质之后的上清液可被直接排入田间以给土壤施肥或甚至可用作叶面喷施物。
虽然可以这种方式应用大比例的甘油层，但仍需要少部分甘油层以回收纯甘油(2-4kg甘油每100kg甲酯)，这对关键的甘油洗涤步骤是必要的。进一步证明甘油回收后保留的釜脚对通过土壤细菌培养物制备PHA而言是同样有效的营养物和促进剂，其制备效率高于纯甘油近两倍。因此，发现成问题的废物是理想的营养物源。通过该方法获得的PHA具有低的多分散指数1.46，同时显示与标准PHA相似的NMR谱。
该釜脚也可用于与保留的粗甘油组合，从而不需要两个单独操作并在组合物中利用MTCC 5345。
所有这些发明合起来形成由太阳晒干的麻疯树整粒种荚制备甲酯并有益地利用共生产物流的改进的综合方法。本发明的整体流程示于图1中。
创造性特征：
(i)在游离脂肪酸含量方面，确定整粒种荚较去壳种子更有助于维持油的质量。
(ii)利用少量淤泥形式的废油以由空壳制备更致密和强度更高的砖同时还增加了砖的热值，所述废油在机械除油过程期间不可避免地产生并引起处理问题。
(iii)进一步认识到部分除油渣饼可用于制造较仅仅以壳得到的砖而言更好的砖。
(iv)使含部分活性催化剂和用于酯交换反应的过量甲醇的甘油层与额外量的精制麻疯树油分两阶段反应以去除70-90％的该甲醇。然后，使所述油/甲酯混合物进一步与碱和甲醇反应以使未反应的和部分反应的油完全转化成甲酯，并且连续重复从甘油层去除甲醇、随后通过酯交换制成完善的产物的这种循环以避免从粗甘油层蒸馏甲醇。
(v)确定甘油洗涤过程从甲酯层移除了几乎全部用过的催化剂，并随后认识到以下吸引人的提议：对经甘油洗涤的甲酯层进行阳离子交换树脂处理以实现所需的钠和钾杂质达亚ppm水平而无需进行水洗，同时确保大量的甲酯可用最小树脂床体积进行处理。
(vi)将除尽甲醇的粗甘油层分成1∶3体积比，并在处理后从该小部分回收蒸馏的甘油，以使其可如现有技术所描述的在后续批次的甘油洗涤中再次使用。
(vii)从土壤中分离细菌MTCC 5343，其使得能够以比用纯甘油作为碳源而言更为有利的方式由1的更底PHA层，并因此将成问题的废物转化成有用的制备PHA的原料。
(viii)通过筛选海洋细菌的过程鉴定有效地直接利用较大体积的粗甘油层与麻疯树种除油渣饼的水解产物一起作为发酵过程中仅有的营养物的高效分离物(MTCC 5345)，从而导致制备的PHA相对于细胞干重的产率为75-80％。此外，将PHA制备的常规过程中分别进行的生长和生产步骤合并成单个操作，并因此简化了工艺。再进一步地，将来自1的釜脚加入较大部分的甘油层中并用MTCC 5345使所得物质发酵。在证明该过程对在28-38℃内的温度变化的耐受性之后，其也无需进行温度控制。
(ix)认识到在制备用于发酵过程的除油渣饼水解产物的过程中，有利的是使用磷酸并之后用碱性甘油层本身(可能需要额外的KOH/Mg(OH)2)来中和酸萃取物，以便所得盐有助于而非阻碍PHA的制备。
具体实施方式
作为例证给出以下实施例，其不应解释为对本发明范围的限制。
实施例1
将含有50kg太阳晒干的3个月大的麻疯种荚的黄麻袋切开，且发现虽然大部分种荚是完整的，但有些种荚已经破损而种子已经露出。随机收集的50-100g这种种子碾成粉末，使用正己烷对25g进行索式萃取(Soxhlet extraction)。也从随机取样的完整种荚中移出种子，并进行类似的萃取。发现暴露种子的游离脂肪酸(FFA)含量为3.68％(w/w)，而包壳种子的FFA含量为1.06％。打开另一袋并如上进行取样。暴露种子和包壳种子的FFA值分别为2.46％和1.09％，也就是说，这两次观察相似，表明整粒种荚更好地保持油。由于按照现有技术以碱催化剂进行酯交换反应，较高的FFA降低了甲酯产率，这个实施例教导我们使种子保持包壳形式并在制备甲酯之前去壳是更好的。
实施例2
在特别设计的机器中将上述实施例1的整粒种荚机械去壳。该1吨每小时(TPH种荚)机器包括(a)转鼓组成的破荚器，其通过用固定表面磨擦开壳而不损坏种子，(b)倾斜振荡筛，其将种子与壳分离并指引种子向与壳相反的方向移动，和(iii)吹风机，其吹去壳，壳单独收集而壳中种子无损失。从整粒种子机械榨油，而将壳在特别设计的机器中压块。块在0.5TPH压块机中制造，所述机器包括(a)倾斜螺杆给料机，(b)装备有搅拌器和进料添加剂的开口的混合装置，(c)由模具组成以模制砖的压制系统和产生用于压制的高压的水压系统和(d)砖输送系统，其也冷却所形成的砖。据发现该砖是易碎的，但在将机械榨油过程中产生的废油泥加入壳中之后，该砖变得更加坚硬并具有1.07-1.15g/cm3的密度和高于未如此添加油的空壳所记录的3700kcal/kg的热值。所得砖具有直径6cm和长度14cm的尺寸。
实施例3
用NaOH水溶液中和如上述实施例2中榨去的麻疯树油以将游离脂肪酸(FFA)含量降至0.12％(w/w)。将64.5g MeOH(1.58摩尔当量)和8.33g KOH混合到一起并加入到370g置于圆底烧瓶中的经中和麻疯树油中，室温下用置顶式搅拌器搅拌内容物15分钟以实现酯交换反应。分离重63.87g的粗甘油层，然后用5.53g、5.76g和5.56g纯甘油连续洗涤甲酯层三次，这些洗涤分别产生11.69g、7.10g和6.29g甘油(含有甲醇和KOH杂质)。在步骤2中，粗甘油和前两次洗涤液合并，并在100-300rpm持续搅拌(桨式倾斜刀片搅拌器)下使该含有16.01g甲醇的合并层再次与300g中和麻疯树油反应2小时。两层再次分离，并再次在剧烈置顶搅拌下用70g额外的中和油处理甘油层2小时。所耗甘油层含3.15g甲醇，也就是说，甘油层中80.3％的甲醇可通过该方法去除。用额外量的KOH甲醇溶液(63.6g MeOH和8.2g KOH)处理步骤2所得的粗甲酯层，并随后如步骤1所述用甘油洗涤，接着水洗。两步骤的综合甲酯产量为710g(相对于所使用的总中和油的产率为95.9％)，同时总甘油和游离甘油值分别为0.10％(w/w)和0.01％(w/w)。可用中和油以类似方式处理步骤2所得的甘油层以去除甲醇。该实施例教导我们如何从粗甘油层去除甲醇，从而无需蒸馏甲醇。
实施例4
在试验工厂将实施例3的实验放大上千倍。使用740kg中和的油。在室温搅拌下，一半的油在图1的反应器II中通过与KOH甲醇溶液[KOH(纯度为78.8％)8.33kg；甲醇64.5kg(1.58摩尔当量)]以单步骤反应15分钟而被酯交换。分离甘油层(GL1)，并重79.55kg。然后用各5.55kg的甘油处理甲酯层(粗JME)三次，并每次都分离甘油层，最终分离使用超级离心机进行。分离的甘油洗涤层分别重11.28kg(GL2)、8.06kg(GL3)和6.11kg(GL4)。该阶段的甲醇、KOH和总体K余量示于下表1中。由数据可见，所用的过量甲醇的89.3％最终于甘油层(GL1-GL4)中，且因此，具有通过本发明的方法从甘油层回收该过量甲醇(而无需使用蒸馏)的好机会。然后，用离子交换树脂处理部分的经甘油洗涤的甲酯层(称为JME-G3W)以去除如下所述的残留碱，同时剩余部分按照现有技术进行处理以得到具有0.12％总甘油和0.01％游离甘油的纯甲酯。
表1
Figure BPA00001547216700161
加入的甲醇＝64.50kg，加入的KOH＝8.33kg(通过滴定测得碱度为78％)
预期在生物柴油形成中消耗的甲醇＝40.82kg
所以应当剩余23.68kg。实验评估：23.13kg
将上述的甘油层GL1、GL2和GL3合并(称为GL5)，总重为98.89kg。然后将其与额外的300kg实施例3的中和麻疯树油混合在一起，在图1的反应器I中在室温下剧烈搅拌该混合物2小时。使得两层分离，将粗甲酯倒入反应器II中以进行进一步的酯交换反应。反应器中的甘油层(GL6)再次与剩余的来自实施例3的70kg精制麻疯树油反应，使得两层分离，并从顶部倾倒出甲酯层并加入到已经含有第一批粗甲酯的反应器II中。如可从下表2看出的，对所得的甘油层(GL7)的分析显示71.3％的GL5中的甲醇通过用两批油处理而去除。随后，在反应器II中再一次用KOH甲醇溶液[KOH(纯度为78.8％)8.33kg；甲醇64.5kg(1.58摩尔当量)]处理粗甲酯的合并层，并进行甘油洗涤、随后水洗以得到具有0.088％总甘油和0.005％游离甘油的纯甲酯。粗甘油连同洗涤液一起可再次用油处理以去除如上所使用的甲醇。该实施例教导我们从粗甘油中去除甲醇的方法适于放大。表2数据进一步教导我们甘油层中的KOH部分也被去除。
表2
Figure BPA00001547216700171
可以注意到，虽然在上述实施例中用1.58摩尔当量的甲醇对与GL5反应后所得的粗甲酯进行再一次处理，但可以减去被粗甲酯层去除的甲醇以维持甲醇与中和油的总体1.58的摩尔比，如以下实施例6所阐明的。
实施例5
如下制备JOCH：取如实施例3和4中由整粒种子机械榨油后获得的100g具有4-6％氮的麻疯树油渣饼放入锥形瓶中，加入350mL含8NH3PO4和2N H2SO4混合物的酸溶液。所述烧瓶(无盖)在100℃热板上保持5小时。随后冷至室温。用330ml含148g KOH(也可以用碱性GL7实现中和)(其中还加入了19.1g固体Mg(OH)2)的溶液中和悬浮液。如此处理以得到具有缓冲作用并也对水解产物的营养值有所贡献的盐。随后用布氏漏斗(Whatman No.40滤纸)真空过滤内容物。将pH调节至5.5-8.5。水解产物的碳含量为2.31％(w/v)，结合氮含量为0.48％(w/v)。用H3PO4/H2SO4热酸性水溶液处理具有4-6％(w/w)N的麻疯树油渣饼。
实施例6
重复实施例4的实验，除了在用GL4处理第二批油之后，总计约370kg的合并层如前所述的与8.33kg KOH反应，但仅与50.57kg而非实施例4中所用的64.5kg的甲醇反应，以致甲醇总量，也就是从GL4去除的甲醇+加入的甲醇约等于用于370kg第一批的64.5kg(1.58摩尔当量)。第一步骤获得具有0.075％总甘油和0.01％游离甘油的344.8kg甲酯，且下一阶段获得具有0.17％总甘油和0.02％游离甘油的339kg甲酯。该实施例教导我们除避免了甲醇蒸馏这一改进外，还减少了甲醇的实际用量。由于可以从粗甘油层再次回收甲醇，无任何蒸馏回收的甲醇的净使用量为相对于甲酯的1.22当量，这产生每100kg制备的精制甲酯2.66kg不可回收的甲醇。
实施例7
如由上述实施例4可见的，甲酯层的甘油洗涤非常有效地去除了KOH催化剂。因此这对通过离子交换方法去除痕量残留碱金属杂质是有利的，这避免了对水洗的需求。
1.制备大孔阳离子交换树脂：使用十六烷醇作成孔剂，通过悬浮聚合制备具有多孔结构的苯乙烯-二乙烯基苯(苯乙烯-DVB)共聚物。共聚合过程在装配有变速机械搅拌器、温度计和回流冷凝器的1L三颈圆底烧瓶中进行。将含有苯乙烯66ml、DVB 18.5ml和十六烷醇(70g)的单体相与引发剂(过氧化苯甲酰；单体重量的1％)倒入包含悬浮介质水溶液的反应器中。合成中所用的悬浮剂为420ml水中的羟乙基纤维素(0.6g)、木素磺酸钠(0.6g)和氯化钙(5.3g)。聚合反应在80±5℃下进行3小时，且在90±5℃下再进行3小时。共聚物以珠状形式获得。然后将这些珠分离、洗涤、干燥和溶剂萃取以移除成孔剂。使上述合成的共聚物珠磺化，从而在共聚物基质中引入-SO3 -H+基团。磺化中所用的共聚物与硫酸的体积比为1∶7。反应在95±5℃下进行10小时。通过对硝基酚吸附法测定的表面积为104.3m2/g。动态条件下阳离子交换能力为1.8-2.1meq/ml和静态条件下阳离子交换能力为4.5-5.0meq/g。
2.纯化粗麻疯树油甲酯：将大孔树脂装入内径4.6cm和高110cm的玻璃柱中。该柱在底部具有带玻璃纤维塞的旋阀，在顶部具有B-24接头。树脂床高为65cm，且树脂床体积为1.08L。使甲醇通过而使树脂床不含水分。使实施例3的经甘油洗涤的甲酯层(JME-G3W)以5倍床体积/小时的使用流速通过树脂床。独立收集各10L流出级分，所得结果示于下表3中。可以看出[Na+]和[K+]水平从21.37mg/L降至0.42mg/L，这满足了甲酯的标准规格。水分和甲醇都可通过以干燥空气喷射来去除。通过树脂后含较大量MeOH的第一个10L的甲酯可循环回酯交换过程。现有技术中报道的其他吸附剂可额外地在一个单独的柱中使用以减少除碱金属离子外的其他杂质。
表3
Figure BPA00001547216700191
实施例8：实施例5-7实验的甲酯和粗甘油层中甲醇的评估
使用连续稀释的原液(10.0％w/w)制备标准品，所述原液本身按如下方法制备：将18g KOH和50g MeOH加入到带塞的烧瓶中。用甘油(A)将13.76g KOH甲醇溶液稀释至100g。之后用甘油(B)将10g(A)稀释至100g。然后用水稀释原液以得到标准溶液。对于样品制备，将1.0g样品和1.0mL的0.13N冰醋酸加入到带塞的烧瓶中，并用双蒸水稀释至100.0g。
使用配备有顶空分析器(AOC 5000自动进样器)的Shimadzu QP2010气相色谱质谱仪进行甲醇含量的GC-MS分析。使用HP PLOT U熔融石英毛细管柱(0.53mm ID x 30m长x 20um膜厚度)，以氦气作为载气(1mL/min流速)。柱温保持在100℃10分钟(等温)。以70eV电子电离能操作质谱仪。将1ml样品/标准品置于气密性封闭的玻璃小瓶中并保持在自动进样器中。将样品加热至65℃，并在温箱中旋转5分钟。向150℃下的分流-不分流进流器(split-split less injector)注入250ul气体。用三个标准品绘出的校准曲线具有0.9998的回归系数(R2)(图2)。对甲酯中的MeOH制作类似的校准绘图(图3)。
实施例9：实施例5-7实验的粗甘油层和甲酯中总K和碱度的评估
对于水溶性样品，溶解已知重量的样品以获得固定体积的水溶液，而对于不溶性样品，用已知体积的蒸馏水洗涤已知重量的样品以将氢氧化钾/盐萃取入水中。然后用火焰光度计在应有校准后分析这些样品的总K。通过酸碱滴定法评估碱度(表3)。
实施例10：使用离子交换色谱法对实施例4-7实验的麻疯树油甲酯中痕量K和Na的评估
通过具有电导率检测器的离子交换色谱测定生物柴油水洗液中钠和钾阳离子的浓度，所述离子交换色谱使用Ion Pac CS 12(2mm)分析柱，以20mM甲烷磺酸作为洗脱液，流速为0.25mL/min。使用含NaCl和KBr(各为0.1、0.2、0.5和1.0ppm)混合物的标准溶液进行定量。相对标准差、相关系数和斜率分别为(对于钠1.0191、1.0000和0.7313，对于钾0.6605、1.0000和0.5341)。钠和钾的校准曲线和样品的色谱图示于图4和5中。
实施例11
将实施例4中的用过的甘油层GL7分成两部分。一部分用于使用硫酸进行碱中和，随后按照现有技术的方法分离皂类物质和K2SO4。然后，将纯化的甘油层蒸馏以回收用于洗涤甲酯层的相同量的甘油。深棕色的釜脚(称为GL8)用作如以下实施例12所述的微生物制备聚羟基链烷酸酯(PHA)的营养物源。GL7的大部分直接用于如以下实施例13所述的PHA制备。通过用热的H3PO4/H2SO4酸性水溶液处理具有4-6％(w/w)N的麻疯树油渣饼并然后用碱性物质(如粗甘油层、氢氧化钾和氢氧化镁)适当地调节pH而萃取麻疯树油渣饼水解产物(JOCH)，以得到具有缓冲作用并也对水解产物的营养价值有所贡献的盐。从土壤和海洋环境分离出革兰氏染色不定菌、革兰氏阳性菌(芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，固氮菌属(Azotobacter sp.))和革兰氏阴性菌(假单胞菌属(Pseudomonassp.)；盐单胞菌属(Halomonas sp.))，并进行PHA制备的筛选。
实施例12
实施例12.1：
在实验室中筛选30种从印度土壤分离的土壤细菌的PHA制备。发现细菌MTCC 5343是最有效的细菌之一，并已被用于本发明中。制备100ml King’s B生长培养基，其包含溶于1升蒸馏水中的蛋白胨20g、甘油15g、磷酸氢二钾1.5g和硫酸镁1.5g。然后将该培养基在121℃下高压灭菌20分钟。将1ml种子培养物接种在上述培养基中，并在摇床中于35±2℃下培养48小时。然后，通过离心过滤收获培养物。制备100ml制备培养基，其含有2％(w/v)上述实施例11的GL8，然后向该培养基中加入蒸馏水中的0.05g(NH4)2SO4、0.04g MgSO4·7H2O、0.965gNa2HPO4·12H2O、0.265g KH2PO4且0.1mL微量营养物原液接着加入培养基中，所述原液含有蒸馏水中的FeSO4·7H2O(2.78g/l)、MnCl2·4H2O(1.98g/l)、CoSO4·7H2O(2.81g/l)、CaCl2·2H2O(1.47g/l)、CuCl2·2H2O(0.17g/l)和ZnSO4·7H2O(0.29g/l)微量营养物。然后将该培养基在121℃高压灭菌20分钟。然后，将由生长培养基获得的收获培养物接种在制备培养基中，并在摇床(120rpm)上于35±5℃培养96小时。通过离心收获细胞，并将所得细胞沉淀烘干以得细胞干重0.38g。然后用次氯酸盐(4-6％氯)溶液处理细胞沉淀15分钟以消化细胞。通过离心回收固体聚合物。然后用水和甲醇相继洗涤以去除附着的杂质，并获得0.27gPHA，共计细胞干重的71.05％。
这些结果可与现有技术中Ashby等的结果相比较，其在使用大豆基生物柴油过程的共产物流时发现PHA积累量为细胞干重的42％。
用制备培养基中2％(w/w)纯甘油替换2％(w/w)GL8，重复上述实验。如可由以下表4中所见的，使用纯甘油的相对于细胞干重的PHA产率仅为52.6％，相比之下，使用GL8的产率为71.1％。PHA制备的碳利用率就甘油和GL8而言分别为11.45％和20.8％。
表4
用别的方法难以处理掉的实施例11的釜脚残留物甚至比纯甘油更有效地产生PHA，据推测是由于杂质起到了PHA制备促进剂的作用。GL7和GL8中金属杂质的细节提供于下表5中。
表5.GL7和GL8的ICP结果
  分析物(mg/L)   GL7   GL8
  钙   3.263   8.189
  镉   0.002   0.002
  钴   0.000   0.002
  铬   0.005   0.023
  铜   0.075   0.046
  铁   0.360   0.554
  钾   48.90   21.63
  镁   2.183   3.552
  锰   0.022   0.040
  钼   0.004   0.004
  钠   17.21   38.24
  镍   0.006   0.022
  铅   0.015   0.152
  锌   0.814   0.131
由GL8获得的聚羟基链烷酸酯的表征：
发现使用GL8获得的PHA的多分散指数(Mw/Mn)为1.4640，其中Mw和Mn值分别为35990和24583。质子和13C NMR与标准PHA(来自Sigma)匹配。然而，与标准PHA的熔点值146.9℃(宽)相比，DSC测定的熔点为166.2℃(窄)(图6)。(聚合物物理性质的所有以上数据由Solvay Specialties India Private Limited提供。)测定由本发明聚合物制造的薄膜的承载能力。发现承载能力对于40.5mm直径、0.05mm厚度的薄膜而言为7-8psi。随之薄膜可转化成胶囊、小袋并适于热封。当埋入潮湿的花园土壤50天之后，这些薄膜显示生物降解迹象。更坚韧的薄膜可通过增加膜厚度或通过向本发明PHA中掺混聚甲基丙烯酸酯来制造。
实施例12.2
以相同的方式重复实施例12.1的实验，除了制备培养基中的以下改变：(i)用2％GL7替代2％GL8，并在接种培养物前用85％H3PO4将培养基的pH调节成中性，加入GL7后喷射该培养基以消除GL7中残留的甲醇(注意，除非另有说明，任何使用GL7时采取这种喷射)，和(ii)不含有实施例12.1的制备培养基中加入的Na2HPO4·12H2O和KH2PO4。与GL8的71.1％相比，发现PHA含量为细胞干重的49.3％(w/w)。因此，当粗甘油级分的组成有变化时，MTCC-5343培养物的反应可能不同。
实施例12.3
由于King’s B培养基昂贵，并也因为该培养基含有蛋白胨和甘油，以相同的方式重复实施例12.1的实验，除了用10％(v/v)麻疯树油渣饼水解物(JOCH)和2％(w/v)GL7替代King’s B生长培养基，前者以氨基酸提供氮、后者提供甘油。然而，当将生长在上述生长培养基中的培养物接种在实施例12.2的制备培养基中时，发现PHA产率进一步降至细胞干重的28.2％(w/w)。
即使King’s B培养基原则上可用源于生物柴油方法本身的副产物的更加经济的培养基替代，但在MTCC-5343的情况中，这种替代不利地影响相对于细胞干重的PHA产率。
实施例13
实施例13.1
使用分离自Aadri(纬度20°57.584’，经度70°16.759’)，Gujarat India的Veraval海岸的海洋细菌(MTCC 5345)重复实施例12.2的实验，所述细菌与热水管盐单胞菌(Halomonas hydrothermalis)具有99.63％的序列同一性。该细菌从60种海洋细菌中筛选出来，并发现产生更大量的PHA。用Zobell’s海洋培养基替代King’s B生长培养基，一升Zobell’s海洋培养基包含：蛋白胨5.0g、酵母提取物1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁8.8g、硫酸钠3.24g、氯化钙1.8g、氯化钾0.55g、碳酸氢钠0.16g、溴化钾0.08g、氯化锶34.0mg、硼酸22.0mg、硅酸钠4.0mg、氟化钠2.4mg、硝酸铵1.6mg和磷酸二钠8.0mg，pH维持为7.6±0.2。在该培养基中接种该海洋细菌以获得O.D.为1.7-1.9的种子培养物。将离心的生物质接种于与实施例12.2相同的制备培养基中。相对于细胞干重的PHA产率为71.2％(w/w)。
已经发现与分离自土壤的MTCC 5343相比，在本发明过程中分离的海洋细菌MTCC5345使用GL7制备PHA更加有效。
实施例13.2
使用海洋细菌(MTCC5345)重复实施例13.1的实验，除了用10％(v/v)JOCH和2％(w/v)GL7替代Zobell’s海洋生长培养基。相对于细胞干重的PHA产率为69.8％(w/w)，也就是几乎与上述实施例13.1相同。培养基中终结于PHA中的碳百分数为11.30％(w/w)。实验数据的细节提供于下表6中。
表6
Figure BPA00001547216700251
Figure BPA00001547216700261
实施例13.3
使用海洋细菌(MTCC5345)重复实施例13.2的实验，进行以下简化：(i)将生长和制备阶段合并成单个阶段，(ii)除了GL7和JOCH，不提供其它营养物/微量营养物，(iii)通过GL7和JOCH之间的内部中和，使得pH自调节(成为7.7)，如此，不有意对pH进行调节，(iv)不进行喷射以去除GL7中的甲醇，并且培养在环境温度条件下进行，所述环境温度条件从夜间/清晨的28℃至午间的37℃之间变化。直接将1-10％(v/v)种子培养物接种于100mL生长兼制备培养基中，所述培养基含2-10％(w/v)的步骤(xiii)的粗甘油和5-20％(v/v)的实施例3制备的麻疯树油渣饼水解产物。如可由下表7所见的，相对于细胞干重的PHA产量为75.1％(w/w)。PHA的绝对重量较实施例13.2高89％，同时培养96小时之后终结于PHA中的培养基中的碳百分数也高出18.8％。纯化PHA的DSC熔点为172℃(图7)。因此，本实施例证实了方法的简化(完全避免GL7的处理；单阶段发酵；节省时间；环境条件处理)以及更高的经济性(仅由麻疯树油甲酯过程的GL7和JOCH共产物流提供营养物；节省能量)，同时提高PHA制备效率。
表7
Figure BPA00001547216700271
实施例13.4
在5L烧瓶中，用4L发酵液进行实施例13.3的实验，所述烧瓶置于环境温度下的摇床中。96小时后收获的湿生物质重39g，干燥生物质的产量为5.57g，PHA的产量为4.3g(相对于细胞干重的77％的PHA)。
实施例13.5
重复实施例13.3的实验，除了用2g 9∶1的GL7和GL8的混合物替代2g GL7，培养时间为一周。所收获干燥生物质的产量为0.615g，而PHA的产量为0.425g，也就是，相对于细胞干重的PHA产率为69％(w/w)和相对于培养基中的碳含量的PHA产率为30.2％。
实施例13.6
将部分由实施例11-13.5获得的PHA样品溶于氯仿中，并通过浇铸于清洁、干燥的玻璃板上而制成膜，缓慢蒸发氯仿。通过将0.5-5％的PHA溶解于氯仿(w/v)中而制备PHA薄膜。空气干燥该膜；彻底蒸发导致膜的形成。通过千分尺测定的该膜厚度为0.016-0.28mm。发现埋入潮湿的花园土壤中的膜在50天后生物降解。
本发明的优点
1.利用共流、以高效和经济的方式制备高密度能量砖和可生物降解聚羟基链烷酸酯聚合物。
2.纯化甲酯的甘油洗涤过程在甲酯中遗留非常少的甲醇，而是在甘油层中限定90-95％的量。
可用小床体积的树脂处理甲酯而无需再生。

Claims (12)

1.由含有06％游离脂肪酸的麻疯树包壳种子制备麻疯树油甲酯和副产物的综合方法，所述方法包括如下步骤：
(i)在去壳机中将麻疯树包壳种子机械去壳以获得麻疯树种壳和麻疯种子；
(ii)使用榨油机，压榨步骤(i)中获得的麻疯种子以获得麻疯树油、麻疯树油渣饼和废油泥，所述麻疯树油渣饼具有4-6％氮；
(iii)用碱中和步骤(ii)中获得的麻疯树油；
(iv)在搅拌下使一部分步骤(iii)中获得的中和麻疯树油与醇和碱进行酯交换反应10-20分钟，并分离粗甘油层GLl和粗麻疯树油甲酯；
(v)用纯甘油层洗涤步骤(iv)中获得的粗麻疯树油甲酯三次以分离三个含甲醇和KOH的不纯甘油层GL2、GL3和GL4，从而获得甘油洗涤的JME-G3W；
(vi)纯化步骤(v)中获得的JME-G3W以移除碱金属杂质；
(vii)用步骤(iv)和(v)中获得的由GLl、GL2和GL3组成的甘油层GL5处理剩余的步骤(iii)中获得的中和油的部分以获得麻疯树油甲酯和甘油层GL6；
(viii)分离步骤(vii)中获得的麻疯树油甲酯和甘油层GL6；
(ix)用中和油的剩余部分处理步骤(viii)中获得的甘油层GL6从而去除甲醇以获得麻疯树油甲酯和甘油层GL7；
(x)分离步骤(ix)中获得的麻疯树油甲酯和甘油层GL7；
(xi)直接将步骤(x)中获得的甘油层GL7用于制备聚羟基链烷酸酯或用于用硫酸中和碱以获得纯甘油和釜脚GL8；
(xii)将步骤(vi)中获得的JME-G3W与步骤(viii)和(x)中获得的麻疯树油甲酯混合以获得混合甲酯；和
(xiii)用KOH甲醇溶液对步骤(xii)中获得的混合甲酯进行酯交换以获得具有0.088％总甘油和0.005％游离甘油的纯麻疯树油甲酯作为生物柴油。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括如下步骤：
a.通过加入权利要求1的步骤(ii)中获得的废油泥，在压块机中将权利要求1的步骤(i)中获得的麻疯树种壳压块以获得作为副产物的麻疯砖，其密度为1.05-1.10g／cm3；
b.用H3PO4、H2SO4水解权利要求1步骤(ii)中获得的具有4-6％氮的麻疯树油渣饼以获得作为副产物的麻疯树油渣饼水解产物。
3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)中，去壳在特别设计的去壳机中进行，所述去壳机包括(i)由转鼓构成的破荚器，其通过固定表面的磨擦开壳而不损坏种子，(ii)倾斜振荡筛，用于将种子与壳分离和指引种子向与壳相反的方向移动，和(iii)使用吹风机以吹去壳，壳单独收集而壳中种子无损失。
4.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(iv)中，所用的碱选自由氢氧化钾和氢氧化钠组成的组。
5.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(iv)中，醇选自由甲醇和乙醇组成的组。
6.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(vi)中，通过使用大孔阳离子交换树脂移除碱金属杂质而纯化JME-G3W层。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述大孔阳离子交换树脂通过使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物和硫酸制备。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述苯乙烯-二乙烯基苯共聚物使用十六烷醇作为成孔剂通过苯乙烯的悬浮聚合制备。
9.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(v)中，进行树脂处理的JME-G3W层具有15-30ppm的[Na+]和[K+]杂质水平、0.4-0.6％(w／w)的甲醇杂质水平、500-1500ppm的含水量、0.2-0.3％(w／w)的甘油总含量和0.15-0.25％(w／w)的游离脂肪酸含量。
10.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(xi)中，釜脚定义为成功循环之后遗留的残余物，主要由在进一步可蒸馏溶剂／产物方面不具价值的固体和自由液体组成。
11.如权利要求2所述的方法，其中在步骤a中，压块在压块机中进行，所述压块机包括(i)倾斜螺旋给料机，(ii)配备有搅拌器和进料添加剂的开口的混合装置，(iii)由模制所述砖的模具和产生高压以压实的水压系统组成的压制系统，和(iv)用于冷却所形成的砖的砖传输系统。
12.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)中，所得的壳具有0.08g／cm3的容积密度和3700kcal／kg的热值。
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