KR101480982B1 - 골형성 유도 화합물 및 이의 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는 스피로스테놀 유도체와, 이 스피로스테놀 유도체를 유효 성분으로 함유하는 골형성 유도 및/또는 조골세포 분화 촉진용 조성물, 이 조성물을 포함하는 골 분화 유도성 생체 재료, 골 대사 이상 질환을 치료 및/또는 예방하는 약학적 조성물 및 조골세포의 기능을 개선하기 위한 식품공학적 조성물 및/또는 건강기능식품을 제안한다. 본 발명의 유도체는 세포 독성이 거의 없으며, UV 등에 대해서도 활성이 저하되지 않으면서 조골세포의 형성을 유도하여, 생체 내에 투여될 수 있으며, 골-전도 성능이 있는 물질과 복합체를 형성하여 의료 기기 등에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

골형성 유도 화합물 및 이의 응용{OSTEO-INDUCTION COMPOUND AND APPLICATION THEREOF}
본 발명은 골형성을 유도하는 화합물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 인체에 대한 독성이 없으며 외부 자극에 의해서도 활성을 잃지 않으면서 골형성을 유도하는 화합물 및 이 화합물을 유효 성분으로 함유하는 약학적 및/또는 식품공학적 조성물에 관한 것이다.
인간을 포함한 포유류에서 골조직(Osseous tissue)의 표면에 석회염이 침착하여 골조직을 형성하면서 골형성(Bone formation, Ossification)이 일어난다. 대부분의 뼈는 먼저 연골조직이 생성되고 이것이 골조직으로 전환되거나(연골성 골형성), 연골을 형성하지 않고 결합조직 중에서 직접 골조직이 형성되거나(결합조직성 골형성), 연골 기질이 바로 골 기질로 전환(전조성 골형성)되어 형성된다.
골조직은 특수화한 섬유성 결합조직으로서, 골세포와 그 사이를 차지하는 풍부한 세포간질로 이루어져 있으며, 세포간질에는 교원섬유와 무정형 기질로 이루어져 있다. 골조직을 구성하는 세포간질은 뼈의 외피에 해당하는 치밀질과 해면질로 구성될 수 있는데, 치밀질은 신체의 지지를 담당하며, 해면질은 골수강의 빈 공간을 보유하여 조혈 기능을 담당하는 많은 세포들이 포함되어 있다. 또한 세포간질 사이에는 섬유아세포에서 분화하여 골세포와 골 성분을 만드는 조골세포(골아세포, Osteoblast), 조골세포가 기질을 만들면서 형성되는 골세포, 골 성분을 파괴하는 파골세포(Osteoclast)로 구성된다.
골형성이나 골 재생(Bone Remodeling) 과정에서 한쪽에서는 혈관생성(Angiogenesis)을 수반한 골조직의 신생이 진행되며, 반대쪽에서는 골조직의 파괴, 흡수가 진행된다. 예를 들어, 골이 손상을 받으면 혈소판이 파괴되며 치유와 연관된 효소를 분비하고, 혈관증식이 일어나는 동시에, 대식세포가 활성화되어 치유에 필요한 성자 인자를 생성하면서 치유과정을 통제하게 된다. 이처럼, 뼈는 살아 있는 조직이기 때문에 오래되거나 불필요하게 된 뼈는 파골세포에 의하여 파괴되며, 조골세포는 파괴된 뼈를 다시 재생시키는 역할을 수행하므로, 조골세포와 파골세포 사이의 균형은 매우 중요하다.
특히, 조골세포의 분화로 생성된 칼슘은 뼈의 강도를 유지시켜줄 뿐만 아니라 호르몬 대사의 항상성에서 중요한 기능을 수행하며 골형성에 관여하는 다양한 단백질이나 효소, 예를 들어 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP) 등에 관여한다. 골형성 및 골 재생 과정에서 조골세포의 초기 분화에 관여하는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP) 및 타입 Ⅰ 콜라겐이 합성되며, 동시에 혈관생성이 수반된다.
이처럼, 뼈의 생성과 재생에서 조골세포와 파골세포의 활성은 적절한 수준으로 제어되어 균형을 이루어야 하는데, 골 대사 이상 질환은 생체 내에서 조골세포와 파골세포 사이의 균형이 깨져서 파골세포의 활성이 이상 증가하기 때문에 일어난다. 하지만, 현재까지 골 대사 이상 질환을 완벽하게 치료하는 방법은 개발되지 알려져 있지 않다. 따라서 골 대사 이상 질환이나 골의 손상이 있는 경우에는 적절한 골 이식 소재(Bone Graft Substitute)를 손상 부위에 이식하는 방법이 널리 사용되고 있다.
이처럼 골 이식 소재는 새로운 Gold Standard로 불리고 있으며, 현재 전 세계 의료기기 업계의 가장 큰 관심과 이슈가 되고 있다. 골 재생과 관련한 전략적 방법으로는 골의 재생을 촉진하고 유지하는 일종의 연결 통로로 사용되는 스캐폴드(scaffolds) 방식을 채택하거나, 골을 생성하는 역할을 담당하는 조골세포와 유사한 세포 개체인 골 조직세포와 같은 골 생성세포를 이용하거나, 골 재생이 요구되는 부위로 골 재생에 관여하는 세포들을 유도하는 신호 분자를 사용하는 골-유도 인자를 채택한다.
여기서 골 이식 소재는 작용기전과 골형성 방식에 따라 ⅰ) 환자 자신의 구강 내 또는 구강 외 공여부에서 채집한 자가이식(Autograft), ⅱ) 타인(주로 시체)의 뼈를 기증받아 채취하는 동종이식(Allograft), ⅲ) 소나 개와 같은 다른 종의 개체에서 채취한 골을 사용하는 이종이식(Xenograft), ⅳ) 인간의 뼈와 주성분이 동일하며 생체적합성이 양호하여 골조직과의 일체화 가능한 하이드록시아파타이트(Hydorxyapatite, HA) 또는 삼칼슘인산(Tri-calcium phosphate, TCP, 예를 들어, α-TCP 또는 β-TCP), 사칼슘인산(Tetra-calcium Phosphate) 등과 같은 바이오세라믹, 바이오글라스 또는 합성 고분자와 같은 합성 골 이식 소재를 사용하는 합성 이식(Alloplastic)으로 구분할 수 있다.
한편 골 재생이 이루어지는 방법은 ⅰ) 이식된 골 이식 소재의 세포 자체가 골을 증식시키는 골 생성(Osteo-Genesis, 자가 이식), ⅱ) 골 이식 소재가 골결손부를 채워 골의 형성을 위한 연결 구조 역할을 하는 스캐폴드 방식을 사용하는 골-전도(Osteo-conduction, 자가 이식, 동종 이식, 합성 이식), ⅲ) 골형성 단백질(BMP)이나 기타 성장 인자 등을 이용하여 골 전구세포가 조골세포로의 분화를 촉진하여 골의 재생을 유도하는 생체 내 신호 전달 메커니즘을 이용하는 골-유도(Osteo-Induction, 자가 이식, 동종 이식) 방식으로 구분될 수 있다.
자가 이식은 골-생성, 골-전도 및 골-유도가 가능하며, 골 재생과 관련한 스캐폴드, 골 생성 세포 및 신호전달체계의 요소를 모두 갖추고 있으므로 가장 이상적인 골 이식 소재이다. 하지만, 환자에게서 추출할 수 있는 골조직의 양이 충분하지 못하고 골조직의 채취로 인하여 환자에게 부작용이 발생할 수 있다. 특히 골다공증 등으로 인하여 골의 상태가 좋지 못할 경우 이를 대체할 수 있는 골 이식 소재를 선택하여야 한다.
자가 이식을 대신할 수 있는 골 이식 소재는 우수한 골형성 능력을 가지고 있어야 하고, 생체친화성이 있어야 하며, 비-항원성이 있어야 하는 등의 요건을 갖추어야 하지만, 가장 중요한 것은 골 치료 과정(Bone Healing Process)을 효율적으로 진행할 수 있어야 하며 인체에 대한 독성 없이 환자에게 안전하게 제공될 수 있어야 하며, 활성을 상실하지 않고 지속적인 골형성을 유도하여야 한다.
골 이식을 위해 개발된 HA, β-TCP, 바이오글라스 등의 합성 이식 소재는 골-전도성 소재이지만, 최근에는 골 재생을 유도하는 신호 메커니즘을 보유하는 소재를 이용한 골-유도성 소재에 대한 연구와 개발이 집중되고 있다. 골-유도성 소재의 예로는 골 내부의 용융 단백질인 BMP, 혈소판 풍부 혈장(Platelet-rich plasma, PRP), 탈회 골기질(Demineralized Bone Matrix, DBM), 골세포 내 성장 인자 등이 있으며, 임상적으로는 사체 유래 DBM과 인공 BMP-2 함유한 제품이 가장 우수한 것으로 알려져 있다.
하지만, 종래의 골-유도성 이식 소재는 사체에서 원재료를 추출하는 동종이식 소재로서, 사체 유래 제품은 교차 감염의 위험성이 높아 안전성에 있어서 문제점이 있을 뿐만 아니라, 제품의 원재료가 충분히 공급되지 못하는 한계가 있다. 아울러, 기존의 합성 골 이식재로 많이 사용되는 HA, β-TCP의 성능은 기존의 DBM와 비교해서 성능이 떨어진다고 알려져 있다. 따라서 안전성이 확보될 수 있으며, 골형성 유도 성능을 가지고 있을 뿐만 아니라 대량으로 제조가 가능할 골형성 이식 소재의 개발은 절실히 필요하다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 독성이 없어 안전성이 확보될 수 있고, 외부 자극에 의하여 활성을 상실하지 않아 안정적이며, 용해도가 향상되어 생체 내에서 효율적으로 골형성을 유도할 수 있는 화합물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 새로운 화합물 또는 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하여 골형성 유도 및/또는 조골세포 분화를 촉진하는 조성물 및 이 조성물에 생분해성 고분자로 이루어진 스캐폴드를 포함하는 골 분화 유도용 생체 재료를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 새로운 화합물 또는 이 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 골 대사 이상 질환을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 새로운 화합물 또는 이 화합물의 식품공학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 골 기능 개선용 식품공학적 조성물 및/또는 건강기능식품을 제공하고자 하는 것이다.
전술한 목적을 갖는 본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체를 제공한다.
Figure 112013024107259-pat00001
또한, 본 발명은 전술한 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
예시적으로, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체는 상기 조성물 중에 0.1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 함유될 수 있다.
상기 골형성 유도 조성물은, 골절의 치료 촉진, 골 이식의 치료 촉진, 골 이식물의 고형화 촉진, 치아 이식물의 골결합 촉진 또는 치주골 증식 촉진을 위한 용도로 사용되는 골형성 유도를 위해 사용될 수 있다.
예시적으로, 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase, ALP), 혈관 생성 또는 콜라겐의 발현(expression)이나 활성을 증가시켜, 골형성 유도, 조골세포 분화 촉진 또는 골 분화를 유도한다.
또한 본 발명은 전술한 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물(골 분화 유도 조성물, 조골세포 분화 촉진용 조성물)과; 생분해성 고분자로 구성되는 스캐폴드를 포함하는 골 분화 유도용 생체 재료를 제공한다.
예시적으로, 상기 생분해성 고분자는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알기산염, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리락틱코글리코산(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid, PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 및 이들의 유도체 또는 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
예를 들면, 상기 골 이식 소재는, 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HA), 인산칼슘(calcium phosphate), 삼칼슘인산(Tri-calcium phosphate, TCP), 사칼슘인산(Tetra-calcium phosphate), 황산칼슘(calcium phosphate), 탈회골기질(Demineralized Bone matrix, DBM), 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 혈소판 풍부 혈장(Platelet-rich plasma, PRP), 골세포 내 성장 인자 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 소재이거나 임플란트 소재일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 골 대사 이상 질환을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체는 상기 조성물 중에 0.1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 함유될 수 있으며, 골 대사 이상 질환은 골다공증, 전이성 골종양(metastatic bone tumor), 원발성 골종양(primary bone tumor), 류마티스성 관절염, 퇴행성관절염, 치주질환, 치주골염, 염증성 치조골 흡수 질환, 골염 및 염증성 골흡수 질환으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
골 대사 이상 질환을 치료 및/또는 예방하는 약학적 조성물 중에 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase, ALP), 혈관생성 또는 콜라겐의 발현(expression)이나 활성을 증가시킨다.
또한, 본 발명은 전술한 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 골세포의 기능을 개선하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 합성된 유도체는 천연물로부터 유래하여 인체에 대한 독성이 없으며, 자외선(UV)과 같은 외부 자극에 대해서도 활성을 거의 잃지 않을 뿐만 아니라 용해도가 향상되어 제약 산업이나 식품공학 산업에 응용될 수 있다.
즉, 이 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 골형성 유도(조골세포 분화)를 촉진하는 조성물 및/또는 골다공증과 같은 골 대사 이상 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로 응용될 수 있다. 아울러, 이 유도체 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 골 기능 개선을 위한 식품공학적 조성물 및/또는 건강기능식품으로 활용될 수 있다.
따라서 본 발명에 따라 골형성 유도 성능이 양호한 유도체를 골-전도성과 생체적합성(biocompatibility)이 우수한 하이드록시아파타이트(Hydroxy apetite, HA), 삼칼슘인산(tri-calcium phosphate)나 기타 임플란트 소재와 복합화(complex)하거나, 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 폴리락트산 등과 같은 생분해성 고분자로 스캐폴드를 형성하여 천연물 유래 골형성 유도체 물질 또는 골 분화 유도용 생체재료로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따라 아르기닌으로 치환된 (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol 유도체(스피로스테놀 유도체)를 합성하기 위한 반응 메커니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체를 사용한 세포 독성 실험에 따른 cell viability를 측정한 그래프이다. 세포 독성 비교를 위하여 치환되지 않은 (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol(스피로스테놀)을 사용하였다.
도 3은 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체를 사용하여 골형성과 관련이 있는 혈관생성(Angiogenesis) 정도를 위상차현미경을 이용하여 촬영한 사진이다. 포지티브 컨트롤로서 치환되지 않은 스피로스테놀 및 VEGF-A를 사용하였다.
도 4는 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체를 사용하여 혈관 내피 세포에서 골형성에 관여하는 단백질인 BMP-2의 발현 정도를 측정한 그래프이다. 포지티브 컨트롤로서 VEGF-A를 사용하였다.
도 5는 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체를 사용하여 골형성의 초기 과정에 관여하는 ALP 효소의 활성 정도를 측정한 그래프이다. 포지티브 컨트롤로서 아스코르브산과 β-글리세로포스페이트의 혼합물을 사용하였다.
도 6은 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체의 안정성을 평가하기 위하여, UV의 조사에 의하여 활성이 저해되는 정도를 측정한 그래프이다. 포지티브 컨트롤로서 아스코르브산과 β-글리세로포스페이트의 혼합물을 사용하였으며, 비교를 위하여 BMP-2를 사용하였다. 도면에서 ***은 네거티브 컨트롤(NC)에 비하여 통계적으로 의미 있다는 것을 의미하며(P< 0.005), ###은 UV 조사 전에 비하여 통계적으로 의미 있게 감소하였다는 것을 의미하고(P< 0.05), ns는 UV 조사 전후에 통계적으로 의미 없이 변화가 일어났다는 것을 의미한다(no significance).
도 7은 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체의 생체 내(in vivo) 활성을 평가하기 위하여 rat의 두개골에 골결손부를 인위적으로 만든 뒤에 스피로스테놀 유도체의 투여에 따라 두개골의 생성 정도를 측정한 컴퓨터단층촬영(Computed Tomography, CT) 사진(도 7의 (a) 부분)과, 컴퓨터단층촬영에 따라 생성된 두개골의 면적을 측정한 그래프이다(도 7의 (b) 부분).
도 8은 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체의 생체 내(in vivo) 활성을 평가하기 위하여 래트(rat)의 두개골에 골결손부를 인위적으로 만든 뒤에 스피로스테놀 유도체의 투여에 따라 해당 조직을 염색한 후 위상차 현미경으로 촬영한 사진으로서, 좌측은 H&E 염색 후 위상차 현미경으로 촬영한 사진이고, 우측은 Manson's Trichrome 염색 후 위상차 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 9a는 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체에, 생분해성 고분자인 히알루론산과, 골 이식 소재로 사용되는 하이드록시아파타이트(HA)와 삼칼슘인산(TCP)을 배합하여 스캐폴드 형태로 제조한 뒤, 골결손부가 생성된 토끼 두개골에 투여한 뒤, 해당 골조직을 염색하여 위상차 현미경으로 촬영한 사진으로, 위쪽이 골형성 관련 인자를 포함하지 않은 스캐폴드를 투여한 토끼 두개골의 염색 사진(컨트롤)이고, 아래쪽이 스피로스테놀 유도체와 골 이식 소재를 포함한 스캐폴드를 투여한 토끼 두개골의 염색 사진이다. 도 9b는 조직계측학적 분석에 따라 새로 생성된 골을 측정한 그래프이다.
본 발명은 인체에 무해하고 생체 내 환경에서 용이하게 흡수되어 신속하게 표적 부위로 이동할 수 있으며, 외부 자극에 의해서도 활성을 잃지 않으면서 골형성을 유도할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol 유도체(스피로스테놀 유도체)이다.
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출발 물질로서의 (3β,25R)-spirost-5-en-3-ol(스피로스테놀)은 디오스게닌(diosgenin)으로도 불리는데, 이 출발 물질은 야생마(wild yam)의 사포닌을 강산, 염기 또는 효소를 이용한 가수분해에 의하여 얻어지는 스테로이드 사포게닌(steroid sapogenin)이다. 스피로스테놀은 조골세포에서 에스트로겐 수용체 관련 포스파티딜이노시톨 3-키나아제, p38 미토겐-활성 단백질 키나아제 경로를 통하여 혈관생성을 유도한다(Men Luh Yen et al. Mol. Pharmacol. 68(4): 1061-73, 2005). 하지만, 스피로스테놀은 물에 대한 용해도가 낮아(0.02 ㎎/L) 생체 내의 흡수가 어렵기 때문에 실제 이용에는 한계가 있다. 이에 본 발명에서는 물에 대한 용해도를 증가시킬 수 있도록 스피로스테놀의 일단에 형성된 하이드록시기에 염기성 아미노산인 아르기닌의 카르복시기와 에스테르 결합을 형성하여, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 새로운 유도체(스피로스테놀 유도체, 아르기닐스피로스테놀(Arginylsprostenol)을 합성한다.
화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체는 출발물질인 스피로스테놀의 히드록시기에 아르기닌의 카르복시기를 에스테르 결합하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 도 1에 도시한 것과 같이, 스피로스테놀(1)에 3개의 아민기를 적절한 보호기에 의하여 보호된 아르기닌(2)을 반응시켜 스피로스테놀의 히드록시기에 보호기로 보호된 아르기닌이 에스테르 결합된 중간체(3)를 얻을 수 있다. 이때, 아르기닌의 아민기(아미노기)를 보호하기 위한 보호기로서 예를 들어 Boc(t-butyloxycarbonyl) 또는 Fmoc(9-fluorenyl methoxyarbonyl)를 사용할 수 있지만, 본 발명이 이들 예시한 보호기로만 한정되는 것은 아니다. 이때, 스피로스테놀(1)은 물에 대한 용해도가 낮으므로, 적절한 유기용매, 예를 들어 p-톨루오일클로라이드, 트리에틸아민(TEA), 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 유기용매를 사용할 수 있다. 중간체(2)의 합성이 완료되면, 트리플루오로아세트산 및 메틸렌클로라이드(TFA/MC) 등을 사용하여 아르기닌의 아민기에 부착된 보호기를 제거하는 탈보호 반응을 통하여 최종적으로 아르기닌으로 치환된 스피로스테놀 유도체(4)를 얻을 수 있다.
화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체는 염기성 아미노산이 치환되어 있어서 생체 내에서의 용해도가 증가할 수 있다. 특히, 본 발명의 실시예에서 확인한 바에 따르면, 치환되지 않은 스피로스테놀에 비하여 훨씬 세포 독성이 덜하여 안전성이 향상되는 예상치 못한 결과를 얻을 수 있다(도 2).
본 발명자들이 확인한 바에 따르면, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체는 골형성의 유도와 밀접한 관련이 있는 혈관생성(Angiogensis)에서 중요한 역할을 수행하는 혈관내피성장인자-A(Vascular endothelial growth factor A, VEGF-A) 및 치환되지 않은 스피로스테놀에 비하여 혈관생성 능력이 양호하였으며(도 3), 골형성단백질 2(Bone Morphogenic Protein 2, BMP-2)의 발현을 특히 초기에 활성화한다(도 4).
아울러, 본 발명의 실시예에 따르면 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체는 골형성 유도 인자로 알려진 알칼라인포스파타아제(Alkaline Phosphatase, ALP)의 활성을 크게 향상시키며(도 5), 외부 자극으로서 UV의 조사에 의해서도 활성을 유지한다(도 6). 뿐만 아니라 생체 내 실험에서도 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체를 투여하면, 래트(rat)의 두개골 결손부에서 골형성이 촉진되며 골형성 과정에서 생성되는 콜라겐의 합성 역시 촉진시킨다(도 7 내지 도 8). 아울러, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체를 포함한 스캐폴드를 투여한 결과 토끼의 두개골 결선부에서 골형성이 유도되고, 골 재생과 관련한 콜라겐의 합성 역시 증가한다(도 9a 및 도 9b).
이처럼, 본 발명에 따라 합성된 스피로스테놀 유도체는 천연 유래 물질로서 천연 물질에 비해서도 세포 독성이 없어 인체로 투여하더라도 안전하고, UV에 의해서도 활성을 상실하지 않아 매우 안정적인 활성을 유지하면서 골형성을 유도한다.
따라서 본 발명은 또한 전술한 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 골형성 유도 조성물에 관한 것이다. 골형성을 유도하기 위해서는 골형성에 직접적으로 관여하는 조골세포가 분화되어야 한다는 점에서 본 발명은 또한 조골세포의 분화를 촉진하는 조성물 또는 골 분화 유도용 조성물에 관한 것이다. 이때, 본 발명에 따른 골형성 유도 조성물의 유효성분으로 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염은 물론이고, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체 또는 입체이성질체를 포함할 수 있다는 점에 유의하여야 한다.
여기서, 약학적으로 허용되는 염이란, 통상적인 방법으로 제조된 염으로서, 예시적으로 약학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염 또는 염기성 염을 들 수 있으며, 이들 염은 약학적 용도로 호환될 수 있다.
산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다. 본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 유도체를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
약학적으로 허용되는 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨과 같은 알칼리금속이나 마그네슘과 같은 알칼리토금속, 또는 암모늄을 포함할 수 있는데, 예시적으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민 및 tert-부틸아민이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 염기를 사용하여 약학적으로 허용되는 금속염을 만들 수 있는데, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
골형성 유도 조성물 중에 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 0.1 ~ 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 1 ~ 10 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 따라서 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 골형성 유도 조성물은 예를 들어 골절의 치료 촉진, 골 이식의 치료 촉진, 골이식물의 고형화 촉진, 치아 이식물의 골결합 촉진, 치주골 증식 촉진을 위한 약학적 조성물로 활용될 수 있다.
또한 본 발명은 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염(또는 이들을 유효 성분으로 포함하는 골형성 유도 조성물)과; 생분해성 고분자 또는 골 이식 소재로 구성되는 생체 활성 물질로 이루어진 스캐폴드(scaffold)를 포함하는 조직공학적 생체재료인 골 분화 유도성 생체 재료에 관한 것이다. 즉, 전술한 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체, 또는 이 유도체(또는 약학적으로 허용되는 염)를 유효 성분으로 포함하는 골형성 유도 조성물에, 생체조직과 유사한 생분해성 고분자 기질 또는 골 이식 소재와 같은 생체 활성 물질 또는 담체로 구성되는 고분자 스캐폴드를 골형성을 요구하는 생체 부위에 이식함으로써 새로운 골조직의 형성을 유도할 수 있다.
예시적으로, 본 발명에 따라 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 골 분화 유도성 생체 재료를 구성하는 스캐폴드는 유도된 골세포의 증식과 분화를 위한 지지체 역할을 수행할 필요가 있으며, 성형 가공의 편의성과 면역 반응을 최소화하여야 한다.
바람직하게는 골 분화 유도성 생체 재료를 구성하는 스캐폴드는 이 스캐폴드가 이식되는 골조직 내의 골세포에 대한 부착 능력이 양호하고, 골세포의 증식 및 분화를 유도하는 동시에 특히 독성 및 염증 반응이 없어야 하며, 우수한 생체친화성(biocompatibility)과 생분해성(biodegration)을 갖는 소재를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위하여, 골 분화 유도성 생체 재료를 구성하는 스캐폴드에는 예시적으로 스캐폴드의 물성을 강화시킬 수 있는 생분해성 고분자 및/또는 필요에 따라 골세포의 형성을 유도할 수 있는 골 이식 소재를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 '생분해성 고분자'(biodegradable polymer)'란, 체내에서 분해 또는 흡수될 수 있는 임의의 고분자 재료를 모두 포함하며, 예시적으로 생체 내 골조직이 손상되었을 때 이를 고정, 치유할 수 있는 소재를 포함할 수 있다. 이와 같은 생분해성 고분자의 종류는 특정 종류로 제한되지 않지만, 예를 들어 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 키틴, 알기산염, 히알루론산, 덱스트란과 같이 생체적합성이 양호한 천연 고분자는 물론이고, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리락틱코글리코산(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid, PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 및 이들의 유도체 또는 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 합성 고분자 재료를 들 수 있다. 합성 고분자 재료는 천연 고분자에 비하여 값이 싸고 분자 구조와 분자량을 조절하여 기계적 특성 및 생분해성을 조절할 수 있는 이점을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 골 분화 유도성 생체 재료를 구성하는 스캐폴드는 전술한 생분해성 고분자와 독립적으로 골형성 또는 골분화 등을 유도할 수 있는 골 이식 소재와 같은 생체 활성 물질을 더욱 포함할 수 있다. 스캐폴드에 포함될 수 있는 골 이식 소재는 골-생성(Osteo-Genesis), 골-전도(Osteo-Conductivity) 또는 골-유도(Osteo-Inductivity) 활성을 갖는 생체 물질 또는 합성 물질이다. 예시적으로 사용될 수 있는 골 이식 소재는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HA), 인산칼슘(calcium phosphate), 삼칼슘인산(Tri-calcium phosphate, TCP), 사칼슘인산(Tetra-calcium phosphate), 황산칼슘(calcium phosphate), 탈회골기질(Demineralized Bone matrix, DBM), 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 혈소판 풍부 혈장(Platelet-rich plasma, PRP), 골세포 내 성장 인자 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 소재일 수 있지만, 본 발명이 이들 소재로 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 골 분화 유도성 생체 재료를 구성하는 스캐폴드 중에 전술한 생분해성 고분자는 40 ~ 50 w/v%이며, 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 10 ~ 45 w/v%로 첨가될 수 있다. 필요한 경우, 하이드록시아파타이트 및/또는 TCP와 같은 골 이식 소재가 10 ~ 30 w/v% 포함될 수 있다.
예시적으로, 본 발명에 따른 골 분화 유도성 생체 재료를 구성하는 스캐폴드는 염 침출법이나 상 분리법과 같은 종래에 사용되는 방법을 사용하여 제작될 수 있으나, 보다 균일한 공극 형성 및 공극간의 양호한 연결성을 고려할 때, 조형가공기술(solid free-from fabrication, SFF)과 같은 쾌속조형기법(rapid prototyping technique)을 사용하여 제작할 수 있다.
조형가공기술의 예로는 액체 상태의 광경화성 수지에 레이저광을 선택적으로 조사하여 광이 조사되는 부분만 경화되는 원리를 이용하여 한 층씩 스캐폴드를 적층하는 광조형법, 균일한 크기의 고형상 분말을 한 층으로 도포하여 레이저 광선을 조사함으로써 고체 분말을 용융 결합시켜 스캐폴드 형상을 제작하는 선택적 레이저 소결 방법, 필라멘트 선 형태의 열가소성 소재가 압출 금형 노즐의 내부를 통과하는 과정에서 노즐 안에서 용융되고 노즐을 통하여 분사시켜 얇은 필름 형태로 고화시키고, 한 층이 고화되면 그 위로 노즐을 이동하여 같은 공정을 반복하여 다음 층을 생성하여 3차원 형상의 스캐폴드를 제작하는 용착 조형 방법, 롤러를 이용하여 얇은 분말을 균일하게 펼친 뒤 프린터 헤드를 일정 방향으로 이동시키고 결합제를 뿌려 분말 입자를 결합시키는 공정을 반복하여 3차원 구조의 스캐폴드를 형성하는 3차원 프린팅 방식, 일정한 간격을 X방향, Y방향으로 이동시켜 플로팅하는 방식으로, 생체 조직에 적합한 고분자를 가진 노즐을 이동시키면서 고분자 라인을 적층하는 형식으로 고온을 유지할 수 있는 압출 챔버에 적절한 생체 재료를 채운 뒤 용융시켜 선을 그리면서 여러 층을 적층하여 3차원 형상의 스캐폴드를 제작하는 3D 플로팅 방식을 들 수 있다.
예시적으로, 3차원 쾌속조형기술을 이용하여 골조직의 이식에 필요한 스캐폴드에 쓰이는 장비인 바이오 플로팅 시스템을 사용할 수 있는데, 컴퓨터를 이용하여 설계된 3차원 모델을 실제 3차원 형상의 제품으로 만들 수 있도록 마이크로 CT로부터 얻어낸 생체 정보 이미지를 CAD/CAM을 이용하여 적합한 형상의 3차원 스캐폴드를 제작할 수 있다.
예를 들어, 마이크로 광조형 기술을 이용하여 스캐폴드를 제작하고자 하는 경우, 스캐폴드의 물성을 향상시킬 수 있도록 40 ~ 50 w/v% 가량의 생분해성 고분자인 히알루론산 용액을 클로로포름과 함께 준비하고, 대략 10 ~ 45 w/v%, 바람직하게는 10 ~ 30 w/v% 가량의 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 용액과 혼합하여 가용성 광 감음 고분자로 구성되는 몰드에 소량(예를 들어 1 mL씩) 주입한다. 이때, 필요에 따라 10 ~ 30 w/v% 가량의 TCP나 하이드록시아파타이트(HA)와 같은 골 이식 소재가 함께 혼합, 주입될 수 있다. 이어서, 이소프로판올과 같은 용매에 침지시켜 클로로포름을 제거하고, 적절한 농도의 수산화나트륨 용액에 담가 몰드를 용해시키고, 세척 및 감압 하의 동결건조 등의 방법을 통하여 화학식 (Ⅰ)의 유도체(또는 이의 약학적으로 허용되는 염)-생분해성 고분자, 및 선택적으로 골 이식 소재가 혼합된 스캐폴드를 포함하는 골 분화 유도성 생체 재료를 제작할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 스피로스테놀 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 골 대사 이상 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 골형성 유도 조성물과 마찬가지로, 골 대사 이상 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약학적 조성물의 유효성분으로 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염은 물론이고, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체 또는 입체이성질체를 포함할 수 있다. 아울러, 약학적으로 허용되는 염이란, 통상적인 방법으로 제조된 염으로서, 예시적으로 약학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염 또는 염기성 염을 들 수 있다.
본 명세서에서 '골 대사 이상 질환'이란 조골세포의 부족, 조골세포의 기능 저하 및/또는 파골세포의 과도한 활성 등으로 인하여 골형성에 문제가 있는 임의의 질환을 의미한다. 아울러, 스피로스테놀 화합물은 조골세포에서 에스트로겐 수용체와 관련한 포스파티딜이노시톨 3-카이나아제의 활성을 증가시켜 혈관생성을 유도한다는 점에 비추어 볼 때, 본 발명에 따른 골형성 이상 질환에는 에스트로겐의 부족으로 인한 인터류킨-1(IL-1)에 의한 골 파괴와 염증성 질환을 포함할 수 있다. 예시적으로 전술한 화학식 (Ⅰ)의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 의하여 치료 및/또는 예방 가능한 골 대사 이상 질환의 예로는 유전적 체질적 요인으로 인하여 골질의 형성보다 골질의 감소가 더 커져 뼈의 양이 감소하는 골다공증(Osteoporosis), 다른 장기의 악성종양으로부터의 전이에 의한 전이성골종양(metastatic bone tumor), 골조직 자체에서 유래하는 원발성 골종양(primary bone tumor), 자가 면역 현상이 원인으로 알려져 있으며 다발성 관절염을 초래하는 류마티스성 관절염, 관절을 보호하는 연골의 손상이나 퇴행성 변화로 인하여 야기되는 퇴행성관절염, 치아를 지지하는 치주 인대 및 골조직의 염증인 치주질환, 치주골염, 치조골 흡수 부전이나 염증성 치조골 흡수 질환, 골염(Osteitis), 골조직에서 칼슘이 빠져나가 뼈에 구멍이 나고 부서지기 쉽게 되는 염증성 골흡수 질환을 포함하나, 골 대사 이상 질환이 전술한 질환이나 질병으로만 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 골 대사 이상 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물 중에 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 0.1 ~ 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 1 ~ 10 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 결코 아니다.
본 발명의 골 대사 이상 질환을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물은 전술한 화학식 (Ⅰ)의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 단독으로 사용되거나, 또는 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 골형성 유도 조성물 및/또는 골 대사 이상 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제와 같은 희석제 또는 부형제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 및 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.
비경구 투여를 위한 형태로는 치약, 구강세정제, 국소 투여제(크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제 등) 등을 들 수 있다. 상기 국소 투여제의 제형의 일예로는, 유효성분인 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학적 조성물을 천연 섬유 또는 합성 섬유로 만든 거즈 등의 담체에 함침시킨 것일 수 있다. 상기 크림 또는 연고의 경우, 치주병 또는 치은병 환부나 그 주위에 직접 도포하는데 적합할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
아울러, 골형성 유도 조성물 및/또는 골 대사 이상 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 화학식 (Ⅰ)의 유도체 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 포함하는 골세포의 기능 개선을 위한 식품조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다. 여기서 식품공학적으로 허용되는 염이란, 전술한 약학적으로 허용되는 염과 동일한 것일 수 있다. 본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다. 이때, 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품학적으로 허용되는 식품보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 이때, 유효성분인 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 식품공학적으로 허용되는 염은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제 성분을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당은 물론이고, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제 또는 감미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진)과 같은 천연 향미제/감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제/감미제 등을 사용할 수 있다.
그 외에 식품 조성물 또는 건강기능식품에는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 식품공학적 조성물 중에는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술 사상으로만 한정되는 것은 결코 아니다.
합성예 : 스피로스테놀 유도체의 합성
(1) Boc-보호된 아르기닌과 에스테르 결합한 중간체의 합성
(3β,25R)-spirost-5-en-3-ol(스피로스테놀, 도 1의 (1), 7.92g, 19.01 mmol)과 3개의 아민기가 Boc로 보호된 아르기닌(Boc-Arg(Boc)2-OH, 도 1의 (2), 9.02g, 19.01 mmol)을 triethylamine(TEA) (5.3 ㎖, 38.04 mmol), p-Toluoyl chloride(2.53 ㎖, 19.01 mmol), tetrahydrofuran(THF)에 녹이고, 약 2분간 저어준 후 4-dimethylaminopyridine (DMAF, 2.3g, 19.01 mmol)를 넣고 실온에서 약 12시간 동안 저어주었다. 출발 물질인 스피로스테놀이 TLC 상에서 완전히 사라진 것을 확인 한 후 용매를 제거하고 포화 KHSO3(aq) 용액과 methylene chloride를 이용하여 추출하였다. 용매는 MgSO4로 건조한 후 제거하였다. 조-생성물은 실리카겔크로마토그래피를 이용하여(hexane:ethylacetate = 5:1) 분리하여 흰색 고체인 중간체(도 1의 (3))를 얻었다(수율 87%).
(2) 아르기닐-O-스피로스테놀의 합성
정제된 중간화합물(도 1의 (3))은 30% TFA/MC(trifluoroacetic acid/methylene chloride) 하에서 약 1시간 동안 교반하여 보호된 Boc 그룹을 제거하였다. 용매를 rotary evaporator로 제거하고 흰색의 고체를 얻었으며 이 화합물을 아세톤에 녹인 후 2M-HCl / Ether로 처리하여 TFA salt를 HCl salt로 치환하였다. 이때 흰색의 침전물이 생겨나며, 이 침전물을 glass filter로 거른 후 아세톤과 에테르로 몇 차례 씻어주고 건조시켜 순도 95%이상의 깨끗한 화합물(도 1의 (4))을 얻었다. NMR 분석결과가 아래에 표시되어 있다.
1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ): δ 5.34 (s, 1H), 4.59 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 3.98 (m, 1H), 3.15 (m, 3H), 2.32 (m, 2H), 1.89 (m, 7H), 1.65 (m, 12H), 1.25 (m, 7H), 1.01 (s, 3H), 1.96 (m, 4H), 0.74 (s, 3H), 0.73 (s, 3H). LRMS (ESI): m/z = 571.5[M + 1] +
실시예 1 : 세포 독성
위 합성예에서 제조된 스피로스테놀 유도체에 대한 생체 내 안전성을 알아보기 위하여 세포 독성 시험을 수행하였다. 마우스 조골세포인 MC3T3-E1 세포를 1×104 cell/well의 농도로 96-well plate에 접종하고, 10% 우태아 혈청(FBS, Gibco #16000, USA) 및 1 X antibiotics (Gibco #15240062, USA)가 첨가된 알파-최소배지(alpha-MEM, JBI #008-53)를 포함하는 성장 배지에서 밤새 배양하였다. 0 ~ 1 ㎎/㎖ 농도로 치환되지 않은 스피로스테놀과 위 합성예에서 합성된 아르기닐스피로스테놀을 각각 처리하였다(n=3). 24 시간 경과 후 WST-1 assay((주)이츠바이오 #EZ-Cytox cell viability assay kit)에서 배지를 제거한 뒤 1X PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕ 배지와 10 ㎕ WST-1을 처리하였다. 30분에서 4시간 이후 450 ㎚에서 살아 있는 세포수를 판독하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과가 도 2에 도시되어 있다. 치환되지 않은 스피로스테놀의 경우 30 ㎍/㎖의 농도에서 50% cell viability를 보였으나, 아르기닐스피로스테놀의 경우 같은 농도에서 90% 이상의 cell viability를 보여, 세포 독성이 현저히 개선되었다는 점을 확인하였다.
실시예 2 : 혈관생성 능력 측정
본 실시예에서는 골형성 및 골 재생과 밀접한 관련이 있는 혈관생성(Angiogenesis) 정도를 알아보기 위하여 Tube-like structure 형성 정도를 Matrigel assay를 이용하여 측정하였다. 세포로는 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC)를 사용하였으며, 배양 배지로 EEGM-2 BulletKit (Lonza #cc3162)를 사용하였고, Matrigel은 BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (BD Biosciences #356231)를 사용하였다. 먼저 4℃에서 밤새 Matrigel을 녹인 뒤, matrigel 200 unit/well을 24-well plate에 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 한 뒤, matrigel 상에 5×104 cell의 농도로 세포를 접종하였다. 이어서, 4 ㎍/㎖의 아르기닐스피로스테놀로 처리하였다. 네거티브 컨트롤로서 Culture medium을 사용하였으며, 포지티브 컨트롤로서 조골세포와 관련한 혈관생성에서 중요한 역할을 하는 VEGF-A 100 ng/㎖을 배양 배지에 첨가하였으며, 비교를 위하여 치환되지 않은 스피로스테놀 4 ㎍/㎖을 처리하였다. 24시간 동안 배양하고, PBS를 사용하여 2회 세척한 뒤, 4% 파라-포름알데하이드를 사용하여 세포를 고정하였다. 다시 PBS로 2회 세척하고, 0.1% crystal violet/50% 메탄올을 사용하여 10분 동안 염색한 뒤, 세척, 건조하고 위상차 현미경으로 관찰하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과가 도 3에 도시되어 있다. 본 발명에 따라 합성된 아르기닐스피로스테놀은 VEGF-A 또는 치환되지 않은 스피로스테놀에 비하여 내피세포에서 더욱 많은 tube-like structure의 형성을 촉진하여, 이들 내피세포의 형태학적 분화를 촉진함으로써 골형성 또는 골 재생과 관련된 혈관생성을 촉진하는 효과가 우수하다는 점을 확인하였다. 혈관생성 효과는 골형성 촉진에 중요한 요소 중 하나이므로, 본 발명에 따라 합성된 아르기닐스피로스테놀 유도체는 혈관생성을 촉진하여 골형성 신호전달에 관여할 것으로 예측되었다.
실시예 3 : 골형성 단백질(BMP-2)의 발현 유도 측정
위 실시예 2에서 확인된 아르기닐스피로스테놀 유도체의 혈관생성 유도 능력이 실제로 골형성을 유도하는지를 확인하기 위하여 혈관내피세포의 골형성 단백질인 BMP-2의 발현 효과를 측정하였다. 실시예 2와 동일하게 HUVEC 세포를 사용하였으며, 배양 배지로 EGM-2 BulletKit (Lonza #cc3162)을 사용하였으며, 24-well plate에 5×104 cell/well의 농도로 세포를 접종한 뒤, 밤새 배양하였다. 4 ㎍/㎖의 아르기닐스피로스테놀 유도체로 처리하였으며, 비교를 위하여 100 ng/㎖의 VEGF-A로 처리하였다. 0, 3, 6, 12, 16, 24 시간 경과 후 각 샘플의 배지를 수거하고, BMP-2 ELISA assay (Peprotech #900-K255)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 BMP-2 발현 정도를 측정하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과는 도 4의 그래프에 도시되어 있다. 본 발명에 다라 합성된 아르기닐스피로스테놀 유도체는 특히 초기에 혈관내피세포의 BMP-2 발현 및 분비를 촉진하여, 골형성을 유도한다는 점을 확인하였다.
실시예 4 : ALP 활성 측정
본 실시예에서는 아르기닐스피로스테놀 유도체가 조골세포의 분화의 대표적인 마커의 하나인 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성에 미치는 영향을 측정하였다. 마우스 조골세포인 MC3T3-E1 세포를 1×104 cell/well의 농도로 96-well plate에 접종하고, 10% 우태아 혈청(FBS, Gibco #16000, USA) 및 1 X antibiotics (Gibco #15240062, USA)가 첨가된 알파-최소배지(alpha-MEM, JBI #008-53)를 포함하는 성장 배지에서 밤새 배양하였다. 네거티브 컨트롤러서 10% FBS를 함유하는 알파최소배지를 사용하였으며, 포지티브컨트롤로서 ALP를 활성화시키는 아스코르브산(ascorbic acid) 100 ㎍/㎖와 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 200 ㎍/㎖를 혼합하였고, 포지티브 컨트롤에 4 ㎍/㎖의 아르기닐스피로스테놀 유도체를 첨가하여 ALP 활성 정도를 측정하였다. 3일째 배지를 교환하면서 10일까지 배양하였으며, 4일째, 7일째, 10일째 ALP 활성 정도를 측정하였다. ALP 분석은 다음과 같은 순서로 진행하였다. 먼저 300 ㎕의 PBS로 2회 각각의 세포를 세척하고, 2-amino-2-methyl-1-orpanol(AMP) buffer(pH 10.5) 140 ㎕와, 기질(225 mM disodium paranitrophenyl phosphate in 1.5 mM MgCl2) 10 ㎕를 첨가한 뒤, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 종결 용액(Stop solution)으로 250 mM NaCl을 사용한 뒤 405 nm에서 판독하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과는 도 5에 그래프로 도시되어 있다. 아르기닐스피로스테놀 유도체는 골형성 유도 인자로 알려진 아스코르브산 및 베타-글리세로포스페이트와 유사하거나 더 크게 ALP의 활성을 증가시킨다는 점을 확인할 수 있다.
실시예 5 : UV 조사에 의한 활성 유지(안정성)
본 실시예에서는 안정성 시험을 위하여 UV 조사 후에 ALP 활성을 측정하였다. 비교군으로 BMP-2를 사용하였다. 마우스 조골세포인 MC3T3-E1 세포를 1×104 cell/well의 농도로 96-well plate에 접종하고, 10% 우태아 혈청(FBS, Gibco #16000, USA) 및 1 X antibiotics (Gibco #15240062, USA)가 첨가된 알파-최소배지(alpha-MEM, JBI #008-53)를 포함하는 성장 배지에서 밤새 배양하였다. 네거티브 컨트롤러서 10% FBS를 함유하는 알파최소배지를 사용하였으며, 포지티브컨트롤로서 ALP를 활성화시키는 아스코르브산(ascorbic acid) 100 ㎍/㎖와 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 200 ㎍/㎖를 혼합하였고, 대조군으로 50 ng/㎖의 BMP-2를 사용하였으며, 포지티브 컨트롤에 4 ㎍/㎖의 아르기닐스피로스테놀 유도체를 첨가하여 ALP 활성 정도를 측정하였다. 3일째 배지를 교환하면서 10일까지 배양하였으며, 4일째, 7일째, 10일째 ALP 활성 정도를 측정하였다. ALP 분석은 다음과 같은 순서로 진행하였다. 먼저 300 ㎕의 PBS로 2회 각각의 세포를 세척하고, 2-amino-2-methyl-1-orpanol(AMP) buffer(pH 10.5) 140 ㎕와, 기질(225 mM disodium paranitrophenyl phosphate in 1.5 mM MgCl2) 10 ㎕를 첨가한 뒤, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 종결 용액(Stop solution)으로 250 mM NaCl을 사용한 뒤 405 nm에서 판독하였다. 본 실시예에 따라 측정한 결과가 도 6에 도시되어 있다. 도시된 것과 같이, UV의 조사에 의하여 단백질인 BMP-2는 그 활성을 상실하여 활성이 크게 감소하였으나, 아르기닐스피로스테놀은 UV 조사 전후에 활성이 거의 유지되어 안정적으로 활성을 유지한다는 점을 확인하였다.
실시예 6 : In vivo assay: Rat calvarial defect model
본 실시예에서는 전술한 실시예에서 확인된 아르기닐스피로스테놀 유도체가 생체 내에서 골형성을 어느 정도 유도하는지를 시험하였다. 아울러, 골형성의 초기 단계에 관여하는 콜라겐의 형성 정도를 측정하였다.
실험동물로 Sprague Dawley Rat(8주령, 실험군 3마리)를 사용하였으며, Rat 두개골에 골결손부를 만들어 아르기닐스피로스테놀 유도체가 load된 젤라틴 필름을 이식한 후 6주차에 희생하여 골 생성 정도를 관찰하였다. 컴퓨터단층촬영(CT)과 관련해서 micro-CT 장치인 SKYSCAN 1076 in-vivo micro-CT(Belgium)를 사용하였으며, 촬영 조건은 X-ray(50kV, 200 uA, Al 0.5 mm filter 사용)이었으며, 영상 픽셀 크기는 18 ㎛이었다. 본 실시예에 따른 실험 결과가 도 7에 도시되어 있는데, 도 7의 (a)는 본 실시예에 따라 스피로스테놀 유도체의 투여에 따라 두개골의 생성 정도를 측정한 컴퓨터단층촬영(Computed Tomography, CT) 사진이고, 도 7의 (b)는 컴퓨터단층촬영에 따라 생성된 두개골의 면적을 측정한 그래프이다. 먼저 도 7의 (a)인 마이크로 CT 촬영 사진에서 알 수 있는 것과 같이, 아르기닐스피로스테놀 유도체를 투여한 결과 새로운 두개골의 생성이 촉진되었으며, 도 7의 (b)의 두개골 형성 측정 그래프에서 알 수 있는 것과 같이, 네거티브 컨트롤에서 골형성이 거의 진행되고 있지 않은 것과 비교하여, 아르기닐스피로스테놀 유도체를 투여하면 네거티브 컨트롤에 비해서 2배 정도 골형성이 유도되어 골결손부의 경계부로부터 섬유성 결합조직으로 회복되었음을 알 수 있다.
한편, 콜라겐 형성 정도를 측정하기 위해서 H&E 염색과 Masson's Trichrome 염색 과정을 진행하였다. 콜라겐 형성 정도를 측정한 사진이 도 8에 도시되어 있다. H&E 염색 사진(도 8의 좌측 부분)에서 알 수 있듯이, 아르기닐스피로스테놀 유도체로 처리한 실험군에서 골결손부는 모세혈관을 다수 함유한 섬유성 결합조직으로 회복되었으며, 네거티브 컨트롤에 비하여 골결손부 중심에서 골형성 과정이 넓은 영역에 걸쳐서 진행되고 있으며, 염증 소견은 거의 관찰되지 않았다. 또한, Masson's Trichrome 염색(도 8의 우측)에서도 알 수 있는 것처럼, 아르기닐스피로스테놀 유도체로 처리한 실험군은 콜라겐(푸른색 영역)이 많이 생성되어 골형성을 촉진하고 있음을 알 수 있다.
실시예 7 : In vivo assay: Rabbit calvarial defect model
본 실시예에서는 전술한 실시예에서 확인된 아르기닐스피로스테놀 유도체에 합성 골 이식 소재를 사용하여 스캐폴드를 형성하고, 이 스캐폴드가 생체 내에서 골형성을 어느 정도 유도하는지를 시험하였다.
스캐폴드 시편을 제작하기 위하여 대조군(control)에는 스캐폴드의 형태를 만들기 위한 생분해성 고분자인 히알루론산과, 골-전도성 합성 골 이식 소재인 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HA)/TCP 100 ㎎을 혼합하여 직경 7.9 ㎜, 두께 1 ㎜의 스캐폴드 시편을 제작하였다. 실험군으로서 위 조성에 아르기닐스피로스테놀 유도체를 첨가하여 스캐폴드 시편을 제작하였다. 뉴질랜드 산 화이트 웅성 토기(3 ~ 3.5 ㎏) 2 마리를 1주일의 순화기간을 거쳐 사용하였다. 토끼의 두개골에 8 ㎜ 직경의 골결손부 4개를 만들고 위에서 제작된 스캐폴드 시편을 이식한 뒤, 4주차에 희생하여 관찰하였다. 조직을 고정하여 탈회하고 조직 슬라이드를 제작하여 Masson's Trichrome으로 염색하여 위상차 현미경으로 관찰하였다. 아울러, 골형성 정도를 계측하기 위하여, Analysis TS Auto(Olympus, Japan)를 이용하여 조직계측학적 분석을 수행하였다. 본 실시예에 따른 실험 결과가 도 9a 및 도 9b에 각각 도시되어 있다. 아르기닐스피로스테놀 유도체를 포함시킨 실험군에서 훨씬 광범위하게 골형성이 일어났음을 확인하였다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체.
    Figure 112013024107259-pat00003

  2. 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물.
    Figure 112013024107259-pat00004
  3. 제 2항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 상기 약학적 조성물 중에 0.1 ~ 100 ㎍/㎖의 농도로 함유되어 있는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 골형성 유도를 위한 약학적 조성물은, 골절의 치료 촉진, 골 이식의 치료 촉진, 골 이식물의 고형화 촉진, 치아 이식물의 골결합 촉진 또는 치주골 증식 촉진을 위한 용도로 사용되는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase, ALP), 혈관생성 또는 콜라겐의 발현(expression)이나 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물.
  6. 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물과; 생분해성 고분자 또는 골 이식 소재로 구성되는 생체 활성 물질로 이루어진 스캐폴드를 포함하는 골 분화 유도용 생체 재료.
    Figure 112013024107259-pat00005

  7. 제 6항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알기산염, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리락틱코글리코산(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid, PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 및 이들의 유도체 또는 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 골 분화 유도용 생체 재료.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 골 이식 소재는, 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HA), 인산칼슘(calcium phosphate), 삼칼슘인산(Tri-calcium phosphate, TCP), 사칼슘인산(Tetra-calcium phosphate), 황산칼슘(calcium phosphate), 탈회골 기질(Demineralized Bone matrix, DBM), 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 혈소판 풍부 혈장(Platelet-rich plasma, PRP), 골세포 내 성장 인자 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 소재인 것을 특징으로 하는 골 분화 유도용 생체 재료.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 조골세포의 분화를 촉진하는 골형성 유도를 위한 약학적 조성물.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 골형성 유도를 위한 약학적 조성물은, 골절의 치료 촉진, 골 이식의 치료 촉진, 골 이식물의 고형화 촉진, 치아 이식물의 골결합 촉진 또는 치주골 증식 촉진을 위한 용도로 사용되는 골 분화 유도용 생체 재료.
  11. 제 6항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 골형성 단백질 (Bone Morphogenic Protein, BMP), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase, ALP), 혈관생성 또는 콜라겐의 발현(expression)이나 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골 분화 유도용 생체 재료.
  12. 제 6항에 있어서, 상기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 조골세포의 분화를 촉진하는 골 분화 유도용 생체 재료.
  13. 하기 화학식 (Ⅰ)로 표시되는 유도체 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 골형성을 개선하기 위한 식품 조성물.
    Figure 112014095619762-pat00007
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