KR101452033B1 - 소형 리포솜의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 실질적으로 연속적으로 흐르는 물 흐름과 유기 용매 흐름(이 유기 용매는 리포솜을 형성할 수 있는 1종 이상의 지질을 포함함)을 실질적으로 연속적으로 혼합하고, 이 혼합물을 냉각시켜 리포솜을 형성함으로써 한정된 입자 크기의 리포솜을 제조하는 방법을 개시하며, 이때 물 흐름의 유량 대 유기 용매 흐름의 유량의 비와 상기 혼합물의 냉각 속도는 리포솜의 약 90% 이상이 약 200 nm 미만의 입자 크기를 갖는 리포솜 제제를 얻을 수 있도록 제어한다.
Description
본 출원은 35 USC 119(e) 및 파리 조약 하에 2008년 12월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/138,353호를 기초로 우선권의 이익을 주장하며, 상기 가출원은 그 전체를 본원에서 참고로 포함한다.
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 리포솜 백신 제조 분야에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 크기가 약 200 nm 미만인 리포솜을 제공하는 것이다.
본 발명은 놀랍게도, 유기 액체(여기에 지질이 용해되어 있음)와 물을 혼합하는 것을 포함하는 리포솜 형성 방법을 이용할 때, 유기 용매의 농도뿐만 아니라 형성된 혼합물의 신속한 냉각이 일관된 리포솜 크기의 형성과 유지에 중요하다는 것을 발견하였다. 본 발명의 방법 및 장치는, 백신 품질의 리포솜의 연속 제조를 촉진하기 위한 새로운 조건 하에, 수혼화성 유기 용매에 용해된 지질을 포함하는 지질 용액을 흐르는 물에 혼입함으로써, 균질한 리포솜 봉입 약물 백신 제제의 상업적 및 확장 가능한 합성을 촉진한다. 이 방법은 연속 혼합 시스템을 이용하며, 이것에 의해 유량의 비, 즉, 지질 용액 유량 대 물 유량의 비가 일정하게 유지됨으로써 시스템 내에 일정한 비율의 유기 용매가 유지된다. 이 방법은 추가로, 리포솜 형성에 이어 수행되고 평균 리포솜 크기 증가를 방지하는 신속하고 규모 독립적인 냉각 단계를 이용한다. 이 방법은 추가로, 원하는 크기의 리포솜 형성을 촉진하는 파이프 구조물을 제공한다.
크기가 약 200 nm 미만인 리포솜을 제조하기 위해, 본 발명에 따르면, 유기 용매/물 혼합물 중의 유기 용매의 농도를 5%∼30%, 더 바람직하게는 10%∼25%, 가장 바람직하게는 10%∼25%로 유지하고, 유량의 비(물/유기 용매)를 19:1∼3 1/3:1, 더 바람직하게는 9:1∼5:1 또는 9:1∼4:1로 유지하며, 리포솜 혼합물의 냉각을 (약 55℃에서 약 30℃로) 5시간 미만 내에, 더 바람직하게는 2시간 미만 내에, 가장 바람직하게는 30분 미만 내에, 가장 바람직하게는 사실상 즉시 완료한다.
본 발명은 당해 분야의 장애요인, 즉 뱃치 간의 불균일성, 냉각 시의 리포솜 크기의 원치않는 증가 및 초음파 처리 또는 가압 시스템 등의 복잡한 방법에 대한 필요성을 회피한다. 본 발명에 따라 제조된 리포솜은 인체 또는 수의학적 용도를 위한 백신의 제조에 적합하다.
도 1은, 장치 구조물의 개략도이며, 삽도가 "T"형 분기 구조를 도시하고, 경우에 따라 파이프는 난류를 증가시켜 혼합을 촉진하기 위한 임의의 내부 돌출부 또는 배플을 포함한다.
도 2는 전체 임상적 제조 공정의 다양한 파라미터를 도시하는 흐름도이다.
도 3은, 상이한 직경의 파이프를 이용하는, 염료(지질/용매를 모방하기 위함)와 물의 합류를 보여주는 사진이다: (A) 양쪽 파이프의 직경이 9 mm; (B) 5 mm(물) 및 3 mm(지질/용매) 파이프.
도 4는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 20% t-부탄올을 사용하여 MUC-1 펩티드를 담지하는 리포솜의 형성을 보여주는 투과 전자 현미경 사진(18배 확대)이다.
도 2는 전체 임상적 제조 공정의 다양한 파라미터를 도시하는 흐름도이다.
도 3은, 상이한 직경의 파이프를 이용하는, 염료(지질/용매를 모방하기 위함)와 물의 합류를 보여주는 사진이다: (A) 양쪽 파이프의 직경이 9 mm; (B) 5 mm(물) 및 3 mm(지질/용매) 파이프.
도 4는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 20% t-부탄올을 사용하여 MUC-1 펩티드를 담지하는 리포솜의 형성을 보여주는 투과 전자 현미경 사진(18배 확대)이다.
본 발명의 방법은 나노크기 리포솜 제제, 특히 직경이 약 200 nm보다 크지 않은 실질적으로 균일한 리포솜 입자 크기를 포함하는 리포솜 제제의 대규모 상업적 제조에 적용 가능하다. 바람직하게는, 리포솜의 90% 초과(동적 광 산란으로 측정된 부피 가중)가 직경 약 200 nm 미만이고, 가장 바람직하게는, 99% 초과가 약 200 nm 미만이다. 이러한 크기의 입자는 산업 승인 임상 제조 표준에 따라 용이하게 멸균 여과될 수 있다.
이러한 균일한 크기의 리포솜의 제제는, 본 발명에 따라 유기 용매의 농도를 제어하여 리포솜 형성 시와 형성 후 이를 실질적으로 일정하게 유지함으로써 제조할 수 있다. 용매 농도를 제어함으로써 지질 용액 및 물(또는 리포솜 형성에 사용하기에 적합한 다른 수성 용매)이 합류하여 섞일 때 형성되는 리포솜 입자 크기를 제어할 수 있다.
여기서, 지질 용액과 물의 합류는 용액과 물이 처음 펌핑되는 파이프 배관 구조물의 분기점(접합부) 바로 아래의 "중간 흐름"에서 이루어진다. 상기 지질 용액 흐름은 한 파이프를 통해 연속적으로 흘러 연속적으로 흐르는 물 흐름으로 유입된다. 2개의 흐름은 임의의 각도로 만나며, 따라서 물과 지질 용액이 각각 통류하는 파이프는 약 90 ° 또는 90 ° 미만의 각도로 만날 수 있다. 지질 용액과 물의 혼탁한 혼합물, 즉 "용매 클라우드(solvent cloud)"는 파이프의 분기점 바로 아래에 형성되며 리포솜이 형성되는 것으로 생각되는 위치를 획정한다.
또한, 지질/용매와 수액 혼합의 난류 정도가 리포솜 형성을 촉진할 수도 있다. 따라서, 포함될 수는 있지만 리포솜 형성에 필수적인 것은 아닌 분기 구조와 장치의 특징은 임의의 파이프의 중공 내에 배플, 내부 돌출부 또는 만입부를 포함시키는 것이며, 이는 난류 증가를 촉진하여 리포솜 형성을 촉진할 수 있다. 따라서, 액체가 합류되는 위치에서의 고전단 환경의 형성은 본 발명에 따라 리포솜을 제조하는 데 유용하다.
리포솜의 형성과 저장 용기로의 혼합물의 도입 사이의 시간 동안 혼합물을 냉각시키는 인라인 냉각 장치는 리포솜 혼합물의 급속 냉각을 가능하게 한다. 이것은, 예를 들어, 냉각 재킷, 냉각 코일, 또는 리포솜 혼합물이 통과하여 흐르는 파이프 또는 다른 커넥터를 침지하는 얼음조를 사용하여 수행할 수 있다. 저속 냉각 조건에서는 리포솜 크기가 소정의 유기 용매 농도에서 시간이 경과함에 따라 증가하는 반면, 급속 냉각은 리포솜 크기를 유지한다.
물 유량 대 유기 용매 유량의 비(1) 및 혼합물 중의 유기 용매의 농도(2)를 제어하고, 리포솜 형성 직후 혼합물을 냉각시키고(3), 경우에 따라 난류 강화 구조를 이용함으로써, 특정 크기 범위 내에 일관되게 속하는 리포솜을 연속적으로 제조하는 것이 가능하다.
따라서, 이러한 구조물과 디자인은, 미리 정한 다량의 물과 지질/용매를 함께 혼합하는(즉, 한 용기로부터 다른 용기로) 선행 기술의 폐쇄된 비효율적 시스템을 회피한다(예를 들어, 미국 특허 출원 제11/185,448호). 그 대신, 본 발명의 장치는 어떠한 치료용 물질이라도 지질 용액에 봉입하여 포함하는 균질한 리포솜 제제를 제조할 수 있는 연속적이고 반복 가능한 공정을 가능하게 하는 연속 흐름의 개방형 시스템이다.
이러한 구조물은 또한, 이것이 가압 지질/용매 용액을 별개의 오리피스 또는 마이크론 크기의 구멍을 통해 가압 지질/용매 분사물 형태로 물 흐름으로 강제로 밀어 넣지 않는다는 점에서 선행 기술 장치(예를 들어, 미국 특허 제6,843,942호, Wagner et al, 2002, Journal of Liposome Research, 12(3), p. 259-270, 미국 특허 제6,855,277호)와 추가로 구별된다. 본 발명의 장치는, 예를 들어, 언급된 마이크론 크기의 오리피스가 형성되기는 하지만, 그 밖에는 다량의 물과 지질 액체가 파이프 사이에서 서로 혼합되는 것을 막는, "직교류 주입 모듈(cross-flow injection module)"을 필요로 하지 않는다. 즉, 본 발명은, 액체 보유 파이프의 서로 연결된 벽의 작은 구멍(이것이 없으면 두 액체는 분리됨)을 통해 물로 지질/용매를 강제로 주입하지 않는다. 이와는 달리, 본 발명의 장치 및 방법은 실제로 임의의 그러한 장애물이나 가압 분사없이도 한 액체(물) 흐름과 다른 자유 유동 액체(지질 용액)의 흐름의 직교류를 포함한다. 본 발명은 또한 정해진 균일한 크기 범위 내에 속하는 리포솜 제조를 위한 선행 기술에 기재된(예를 들어, 미국 특허 제6,855,277호) 어떠한 균질화 또는 음파 처리도 필요로 하지 않는다.
약물, 펩티드 또는 리포펩티드 등의 원하는 치료용 화합물뿐만 아니라 보조제 또는 부형제 등의 임의의 다른 바람직한 성분들을 본 발명의 지질 용액에 첨가하는 것은, 지질 용액이 흐르는 물과 합류될 때 형성되는 리포솜 내에 그러한 성분들이 봉입되는 것을 촉진한다.
용매의 농도 및 물 유량 대 지질 용액 유량의 비를 제어하는 것 이외에도, 언급된 배관 시스템을 통해 각각의 액체의 흐름을 개시하기 전에 지질 용액 및 물 중 하나 또는 둘 다를 가열하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명의 액체의 각각의 온도는 균일한 크기의 여과 가능한 리포솜의 일관되고 재현 가능한 수율을 담보하기 위한 중요한 기준이 될 수 있다. 바람직한 온도는 이용되는 지질(들)의 전이 온도에 따라 달라진다.
본 발명의 방법에 의하면, 실제적인 유량 범위에서의 조작이 가능하다. 유량의 비(즉, 지질 용액 유량 대 물 유량의 비)를 일정하게 유지하는 한, - 실제적 범위에서는 - 액체가 서로 합류되는 속도가 중요하지 않다는 것은 놀라운 발견이다. 결과적으로, 이 방법은 극소량의 용액뿐만 아니라 극대량의 전체 부피 용액에도 적용될 수 있다.
따라서, 약물이 봉입된 여과 가능한 리포솜의 연속적 형성을 보조하는 본 발명의 요인으로는 (1) 용매 및 용매 농도; (2) 지질; (3) 지질 용액과 물 사이의 유량의 비; (4) 혼합 전 또는 혼합 시의 액체의 온도; (5) 액체가 혼합되고 리포솜이 형성된 후의 냉각; (6) 각각의 액체가 연속적으로 방해받지 않고 흘러 서로 합류되는 것; 및 (7) 난류 유발 수단을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이하 단락들에서는 이들 고려사항 각각을 상세히 설명한다.
(1)
용매 및 용매 농도
본 발명의 용매 중 특정한 한 유형은 수혼화성 유기 용매이며, 그 비한정적인 예로 저급 알칸올, 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소아밀 알코올, 이소프로판올, 2-메톡시 에탄올 및 아세톤을 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 용매는 부탄올 또는 tert-부탄올(t-부탄올)이다. 유기 용매는 지질 및 약물 또는 생물활성 물질을 용해시키는 데 유용하며, 이것은 그 후 본 발명에 따라 흐르는 물 또는 수성 매질로 흘러 들어가 약물 또는 활성 물질을 봉입한 본원에 개시된 리포솜을 형성한다.
특정 크기 범위 내에 속하는 리포솜의 제조와 관련된 한 가지 고려사항은 수혼화성 유기 용매의 농도이다. 본 발명에 따르면, 용매 제거(예를 들어, 동결건조) 전 최종 농도이기도 한, 혼합 시점에서의 유기 용매의 농도는 5%∼30%이며, 더 바람직하게는 10%∼25%이고, 가장 바람직하게는 10%∼25%이다. 일반적으로, 용매의 농도가 낮을수록, 형성되는 지질 소낭 리포솜 입자가 더 작아진다. 따라서, 본 발명의 장치 및 방법에 의하면, 20% t-부탄올이 리포솜의 99%가 크기가 200 nm 미만인 리포솜 제제를 생성하는 것에 비해, 10% 농도의 t-부탄올은 리포솜의 약 99%가 크기가 100 nm 미만인 리포솜 제제를 생성한다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 24% 농도의 t-부탄올은 크기가 400 nm 미만인 리포솜을 생성하였다. 따라서, 리포솜 집단의 평균 입자 크기는 용매 혼합물 중의 용매의 농도를 조정하고 이 농도를 일정하게 유지함으로써 조절할 수 있다.
크기가 약 200 nm보다 작은 리포솜을 제조하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 이들은 임상적으로 승인된 0.22 ㎛ 세공 크기의 필터를 이용하여 용이하게 멸균 여과할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 이러한 필터와 함께 사용될 수 있는 200 nm 미만의 리포솜을 제조하기 위해, 바람직한 용매 농도, 특히 t-부탄올에 대한 바람직한 용매 농도는 약 20% 이하이다.
수중에 지질/용매 혼합물을 신속하게 분산시키는 것은 일정한 용매 농도를 유지하는 데, 즉, 용매 농도를 약 20%로 유지하는 데 도움이 될 수 있다.
(2)
지질
리포솜을 형성할 수 있는 바람직한 인지질로는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 포스파티딜콜린(PC; 레시틴), 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 다른 적절한 인지질로는 추가로 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티드산(DPPA), 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)을 포함한다. 가장 바람직한 지질은 DPPC이다.
리포솜 형성을 촉진 또는 조절하는 데 도움이 되도록 지질 용액 중에 스테롤을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여 특히 유용한 스테롤 중 하나는 콜레스테롤이다. 콜레스테롤은 리포솜 형성을 촉진하는 데 필요한 것은 아니지만, 리포솜 특성(예를 들어, 안정성)을 조절한다.
(3)
지질 용액과 물 사이의 유량의 비
물 및 지질 용액 흐름의 개시 및 중단은 동시에 이루어지며, 물 유량 대 지질 용액 유량의 비는 용매 농도를 결정하고, 따라서 리포솜 크기를 결정한다. 용매 농도가 높을수록, 형성되는 리포솜이 커진다. 물 유량 대 지질 용액 유량의 비는 바람직하게는 2:1 이상(약 33 1/3% 이하의 유기 용매 농도를 형성함), 더 바람직하게는 3:1 이상(약 25% 이하의 유기 용매 농도를 형성함)이다. 이것은 바람직하게는 19:1 이하이다. 이것은 약 19:1(약 5%의 유기 용매 농도를 형성함)∼3 1/3:1(약 30%의 유기 용매 농도를 형성함), 더 바람직하게는 9:1(약 10%의 유기 용매 농도를 형성함)∼5:1(약 20%의 유기 용매 농도를 형성함), 또는 9:1∼4:1(약 25%의 유기 용매 농도를 형성함)일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 물의 유량은 분당 약 1.7 L일 수 있다. 본 발명에 따른 지질/용매의 용매의 유량은 분당 약 0.43 L일 수 있다. 유량은, 비가 일정하게 유지되는 한, 특정한 원하는 리포솜 크기에 대해 실제에 맞게 조정할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 리포솜의 약 99% 초과가 약 200 nm 미만의 크기를 갖는 리포솜 제제를 제조하길 원하고 유기 용액 농도가 약 20%일 경우, 이용되는 실제 혼합 시간 및 용액 부피 등의 실제적 고려사항에 따라, 물 유량 대 지질 용액 유량의 비를 약 4:1로 유지하면서 유량을 조정할 수 있다.
(4)
액체의 온도
바람직한 최소 온도는 전이 온도와 관련이 있다. 본 발명의 물 및 지질 용액 액체를 둘 다 바람직하게는 성분들의 전이 온도보다 10℃ 이상 더 높은 온도로 가열하는 것이 바람직하다. 따라서, 이 온도는 전이 온도보다 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃ 또는 그 이상 더 높은 온도일 수 있다. 액체는 그 각각의 저장 탱크에 놓인 채로 가열될 수 있으며, 상기 탱크는 열 손실을 줄이기 위해 재킷으로 단열 처리될 수 있다. 각각의 액체의 온도는 약 40℃∼45℃, 약 45℃∼50℃, 약 50℃∼55℃, 또는 약 55℃∼60℃일 수 있다. DPPC의 경우, 온도는 바람직하게는 42℃ 이상, 더 바람직하게는 45℃ 이상, 가장 바람직하게는 50℃ 이상이다. 최고 온도는 중요하지 않지만, 물론, 온도가 높을수록 에너지 투입량이 커진다. DPPC의 경우, 선택된 온도는 바람직하게는 약 42℃∼65℃, 더 바람직하게는 45℃∼60℃, 가장 바람직하게는 50℃∼55℃이다.
(5)
냉각
많은 공정이 저장, 여과 또는 다른 가공을 행하기 전에 벌크의 냉각을 필요로 한다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 공정의 리포솜 형성 단계에 필요한 온도 및 용매 농도에서 리포솜 크기가 리포솜 형성 후에 시간이 경과함에 따라 증가한다는 것을 관찰하였다. 그 결과, 수집 용기 내에서 냉각이 일어날 경우, 뱃치 크기는 리포솜의 최종 크기에 영향을 미치고, 뱃치가 클수록 냉각 시간이 길어진다. 리포솜 형성 직후 열 교환기를 사용하는 것에 의해 가능하게 되는 순간 냉각은 리포솜 크기의 제어를 가능하게 하고 뱃치 크기 독립성에 대한 이러한 장애요인을 제거한다. 리포솜 크기를 유지하기 위해서는, 20℃ 냉각 시간이 5시간을 초과해서는 안 되며, 예를 들어, 5시간 미만 동안 약 55℃에서 약 35℃로, 더 바람직하게는 2시간 미만 동안 약 55℃에서 약 30℃로, 가장 바람직하게는 30분 미만 동안 약 55℃에서 약 30℃로 냉각시킨다. 필요에 따라 혼합물을 더 낮은 온도로 냉각시킬 수 있다.
(6)
각각의 액체의 상호 간으로의 연속적 흐름
본 발명의 액체, 즉, 물 및 지질 용액은, 상기에 기재된 것과 같은 바람직한 유량에 따라 설정 또는 조정되는 별개의 모터 하에 펌핑될 수 있고 수 리터의 각각의 액체를 수용할 수 있는 대형 용기 내에 저장될 수 있다. 따라서, 주입을 위한 물을 50 L 이상(바람직하게는 200 L)까지 수용하는 탱크가 저장소로서 사용될 수 있으며, 이로부터 상기에 언급된 파이프 및 T형 분기 구조를 통해 물이 펌핑될 수 있고, 그 유량은 통수로 내에 유량계를 설치함으로써 모니터링할 수 있다. 마찬가지로, 수 리터(예를 들어, 50 L 이상까지)의 지질/용매 용액을 수용한 별개의 탱크가 상기 장치를 통해 펌핑될 수 있고, 또한 동일한 방식으로 그 유량이 모니터링될 수 있다.
상기 장치를 통해 펌핑되는 물의 유량에 따라, 더 많거나 더 적은 물이 일정 시간 동안 저장 탱크로부터 방출될 것이다.
상기한 것은 지질 용액 저장소에도 명백히 적용된다. 때때로 물 흐름의 유량이 지질 용액의 유량의 적어도 약 4배여야 하기 때문에, 지질 용액 용량보다 4배 이상 많은 용량의 물을 수용할 수 있는 저장 탱크를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 분명히, 단위 시간당 제조될 수 있는 적절한 크기의 리포솜의 양을 최대화하기 위해 물과 지질 용액의 연속적 흐름을 생성할 수 있도록 양 저장 탱크 내에 충분한 액체가 존재해야 하는 시간의 길이는 있다. "탱크"는, 유리, 스테인레스 스틸 및 플라스틱으로 제조된 용기를 포함하나 이들에 한정되지 않는, 본원에 기재된 액체량을 저장 및/또는 가열할 수 있는 임의의 용기일 수 있다.
(7)
방해받지 않는 액체의 흐름 및 난류 유발 수단
상기에 언급된 바와 같이, 지질 용액을 물 흐름으로 도입하기 위한 유용한 구조는, 각각의 파이프의 내부가 이들이 접하는 위치에서, 즉 접합부에서 서로에 개방되도록 배향된 2개의 파이프를 통해 이루어지며, 이때 2개의 개구 사이에는 다량의 지질 용액이 개구를 통해 자유롭게 흐르는 것을 막는 임의의 내부 장애물이 없다. 이 두 흐름은 임의의 각도로 만날 수 있기 때문에, 물과 지질 용액이 각각 유통하는 파이프는 약 90° 또는 90° 미만으로 만날 수 있다. 도 1 참조.
본 발명의 방법은 상업적 제조 목적에 잘 적용될 수 있고 규모 확장이 용이하기 때문에, 본 발명에 따라, 임의의 직경의 파이프를 유량 및 용매 농도 등의 다른 파라미터의 적절한 변경에 따라 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 파이프는 임의의 직경을 가질 수 있으며, 예컨대 약 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 또는 20 mm, 또는 20 mm 초과의 직경을 가질 수 있다. 직경은 유량 및 혼합 효율을 고려한 후 선택할 수 있다.
이러한 직경의 파이프는 그 전체 길이 또는 그 길이의 일부에 걸쳐 균일할 수 있다. 즉, 유리 배관의 상호 간의 연결 또는 탭 또는 펌프로의 연결을 자유자재로 할 수 있도록 실험실에서 널리 사용되는 전형적인 "배관" 커넥터를 설치하기 위해, 본 발명의 파이프는 그러한 관으로의 삽입이 용이하도록 한쪽 말단이 좁아져도 좋다.
분기 구조를 구성하는 2개의 파이프는 이들의 개구가 만나는 접합점에서 동일한 직경을 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 물을 보유한 파이프는 지질 용액 파이프보다 더 좁거나 더 넓을 수 있으며, 그 반대일 수도 있다. 본 발명의 파이프는 유리, 플라스틱 또는 금속일 수 있다.
내부 표면이, 내부 중공을 통한 액체의 흐름을 조절하기 위한 융기부, 배플, 만입부 또는 돌출부를 포함하는 파이프를 사용할 수 있다. 물이 지질 용액과 만나는 지점에서 주위의 난류를 증가시키는 것이 필요할 경우, 이러한 파이프 중 하나가, 물 흐름을 자극하여 분기점에서 난류를 생성함으로써 정상 전단력보다 더 큰 전단력을 유발시켜 리포솜 형성을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 돌출부 또는 배플은 통수 파이프의 분기점 "상류"에 배치되는 것이 최적이지만, 또한, 그 대신에, 액체 혼합을 촉진하기 위해 분기점 아래에 배치될 수도 있다.
(8)
다른 고려사항, 성분 및 파라미터
(i) 리포솜
임상적으로 승인된 0.22 ㎛ 세공 크기의 필터를 이용하여 용이하게 멸균 여과될 수 있다는 점에서, 크기가 200 nm보다 작은 리포솜을 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 장치를 사용하여 본 발명의 방법에 따라 제조되는 제제는 특정한 최대 크기를 갖는 리포솜 집단을 포함한다.
일반적으로, 물 유량 대 지질 용액 유량의 비가 감소됨에 따라, 즉, 유기 용매 농도가 증가함에 따라 리포솜 크기가 증가한다. 리포솜 크기는 온도 또는 사용된 유기 용매 등의 다른 요인에 의해서도 영향을 받을 수 있다.
지질/용매가 물과 합류하여 혼합된 후 제조된 리포솜은, 경우에 따라 냉각 재킷을 통과하고 별개의 탱크에 수집될 수 있다. 그 후, 리포솜 제제를 동결건조시킨 후 공지된 방법에 따라 나중에 재구성할 수 있다.
(ii) 생물활성 물질
MUC-1은 20개 아미노산 서열의 30∼100 반복부로 이루어진 폴리펩티드 코어를 포함하는 대형 뮤신이다. MUC-1 펩티드, 당펩티드, 리포펩티드 및 글리코리포펩티드는 본 발명의 리포솜으로 봉입하기 위한 특히 바람직한 펩티드이나, 임의의 다른 펩티드, 생물활성 물질, 약물 또는 치료용 화합물도 본 발명의 리포솜에 봉입될 수 있기 때문에, 본 발명이 상기 물질들에만 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 활성 물질은 상기에 언급된 20개 아미노산 반복 서열의 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 또는 9개 이상의 연속된 잔기를 포함하는 (임의로 글리코실화 및/또는 지질화된) 펩티드이다. 이것은 직렬 반복부이기 때문에, 어느 아미노산을 첫번째 아미노산으로 선택할지는 실질적으로 임의적인 것임이 이해되어야 한다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 적어도 반복 서열의 DTR 트리펩티드를 포함한다. 이것은, 예를 들어 PDTRP(서열 번호 1의 아미노산 13∼17), SAPDTRP(서열 번호 1의 아미노산 11∼17), TSAPDTRP(서열 번호 1의 아미노산 10∼17), PDTRPAP(서열 번호 1의 아미노산 13∼19) 또는 TSAPDTRPAP(서열 번호 1의 아미노산 10∼19) 서열을 포함할 수 있다. 상기 활성 물질은 하나보다 많은 반복부를 포함할 수 있으며, 이것은 정수가 아닌 수의, 예를 들어 1 1/4의 반복부를 포함할 수 있다.
지질화는 리포솜으로의 펩티드의 봉입을 촉진한다. 바람직하게는, 지질화될 경우, 펩티드는 직렬 반복 영역의 단편(이 단편은 단일 반복부보다 더 짧거나 같거나 더 길 수 있음)인 제1 서열 및 지질화된 제2 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 상기 제1 서열은 바람직하게는 상기에 기재된 것과 같은 BLP25 또는 BLP40의 MUC-1 유래 서열이다.
상기 제2 서열은 바람직하게는 제1 서열의 C-말단에 부착되며, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산이며, 가장 바람직하게는 2개 또는 3개 아미노산이다. 바람직하게는, 1∼3개 아미노산이 지질화되며, 바람직하게는 이들이 연속적이다. 바람직하게는, 지질화된 아미노산은 독립적으로 Ser*, Thr, Asp, Glu, Cys, Tyr, Lys*, Arg, Asn, 또는 Gln(*가 최적임)이다. 바람직하게는, 제2 서열의 마지막 아미노산은 지질화되지 않으며, 바람직하게는 이것은 Gly*, Ala, Val, Leu*, 또는 Ile이다. 바람직하게는, 지질 기는 C12(라우르산), C14(미리스트산), C16(팔미트산)*, C18(스테아르산) 또는 C20(아라키드산) 지질이다.
MUC-1에 대해서는, 특히 중요한 물질이 27개 아미노산 리포펩티드, 즉 "BLP25"이다. 이것은 MUC-1 단백질의 직렬 반복 영역의 25개 아미노산 잔기 부분(즉, 1 1/4 반복부) 및 2개 아미노산 C-말단 연장부(KG)로 이루어지며, 여기서, K(리신)는 이하에 기재된 바와 같이 지질화된다:
STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP-K(팔미토일)-G-OH (서열 번호 1)
특히 중요한 또 다른 물질인 "BGLP40"은 MUC-1 단백질의 직렬 반복 영역의 40개 아미노산 잔기 단편 및 C-말단 연장부(SSL)를 포함하며, 상기 연장부는 이하에 나타낸 바와 같이 지질화된다(표시된 글리코실화는 일례이며, 다른 글리코실화 패턴도 포함되고 글리코실화되지 않은 것도 포함된다):
TSAPDTRPAPGS(Tn)T(Tn)APPAHGVTSAPDT(Tn)RPAPGSTAPPAHGVS(리포)S(리포)L (서열 번호 2)
(iii) 기타 성분들
지질 성분의 추가적인 적절한 성분은 당지질 및 다른 지질 보조제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A(MPLA) 또는 지질 A, 또는 천연 보조제의 유사체일 수도 있고 아닐 수도 있는 합성 보조제이다.
(iv) 물
임상 등급수.
(9)
확장성
용량은 용기 크기에 의해서만 한정된다. 상업적 공정은 컴퓨터로 제어될 수 있다.
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<120> METHOD OF MAKING SMALL LIPOSOMES
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<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 1
Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg
1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Lys Gly
20 25
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 2
Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro
1 5 10 15
Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser
20 25 30
Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Ser Ser Leu
35 40
Claims (25)
- 한정된 입자 크기를 갖는 리포솜을 포함하는 조성물로서, 상기 리포솜의 90% 이상이 200 nm 미만의 입자 크기를 가지고, 상기 리포좀에 MUC-1(Mucin-1) 펩티드, 또는 MUC-1(Mucin-1) 펩티드의 글리코실화, 지질화, 또는 글리코실화 및 지질화된 유도체가 봉입되는 것이며,
상기 조성물은 연속적으로 흐르는 물 흐름을 제공하는 단계,
연속적으로 흐르는 유기 용매 흐름을 제공하는 단계로서, 상기 유기 용매는 그 안에 용해된 1종 이상의 지질 및 1종 이상의 MUC-1(Mucin-1) 펩티드를 포함하며, 상기 1종 이상의 지질은 리포솜을 형성할 수 있는 것인 단계,
상기 물 흐름과 상기 유기 용매 흐름을 연속적으로 혼합하여 혼합물을 얻는 단계,
상기 혼합물을 냉각시키는 단계, 및
상기 혼합물 내에서 리포솜이 형성되도록 하는 단계
를 포함하며 물 흐름의 유량 대 유기 용매 흐름의 유량의 비와 상기 혼합물의 냉각 속도를, 리포솜의 90% 이상이 200 nm 미만의 입자 크기를 갖는 리포솜 제제가 얻어지도록 제어하는 것인 방법에 의해 얻어지는 것인 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 리포솜이 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 포스파티딜콜린(PC; 레시틴), 포스파티드산(PA), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디팔미토일포스파티드산(DPPA), 디미리스토일포스파티드산(DMPA), 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 디미리스토일포스파디딜세린(DMPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE) 및 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)으로 구성된 군에서 선택되는 인지질을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 리포솜이 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 리포솜이 스테롤을 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 리신에서 지질화되는 것인 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 팔미토일화되는 것인 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 팔미토일화되는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 서열 번호 2의 2개의 마지막 세린에서 지질화되는 것인 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 글리코실화되는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 MUC-1 펩티드가 글리코실화되는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조되는 것인 조성물.
- 동결건조된 제13항에 기재된 조성물로부터 재구성되는 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 물 흐름의 유량 대 유기 용매 흐름의 유량의 비가 2:1 이상인 조성물.
- 제1항에 있어서, 냉각 속도가 평균 4℃/hr 이상인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유기 용매 흐름은 상기 혼합 전에 상기 지질의 전이 온도보다 10℃ 이상 더 높은 온도에 있는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 방법이 상기 물 흐름 또는 상기 유기 용매 흐름 내에 또는 상기 혼합으로부터 형성된 혼합물 흐름 내에 난류를 유발하는 수단을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 멸균 여과된 제1항에 기재된 조성물을 포함하는 백신 제제.
- 동결건조된 제1항에 기재된 조성물 또는 제20항에 기재된 조성물을 포함하는 백신 제제.
- 재구성된 제21항에 기재된 조성물을 포함하는 백신 제제.
- 연속적으로 흐르는 물 흐름을 제공하는 단계,
연속적으로 흐르는 유기 용매 흐름을 제공하는 단계로서, 상기 유기 용매는 그 안에 용해된 1종 이상의 지질을 포함하며, 상기 1종 이상의 지질은 리포솜을 형성할 수 있는 것인 단계,
상기 물 흐름과 상기 유기 용매 흐름을 연속적으로 혼합하여 혼합물을 얻는 단계,
상기 혼합물을 냉각시키는 단계, 및
상기 혼합물 내에서 리포솜이 형성되도록 하는 단계
를 포함하는, 한정된 입자 크기를 갖는 리포솜의 제제를 제조하는 방법으로서, 물 흐름의 유량 대 유기 용매 흐름의 유량의 비와 상기 혼합물의 냉각 속도를, 리포솜의 90% 이상이 200 nm 미만의 입자 크기를 갖는 리포솜 제제가 얻어지도록 제어하는 것인 제조 방법. - 삭제
- 삭제
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