KR20130128286A

KR20130128286A - 압출공정 없이 핵산 함유 나노 리포솜을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20130128286A
Application number: KR1020120052218A
Authority: KR
Inventors: 이명규; 아미르 아바스 목타리에; 정봉현; 정신영; 최종민
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-11-26
Also published as: KR101493961B1; WO2013172669A1

Abstract

본 발명은 압출과정 없이 디에틸에테르(diethyl ether) 및 에탄올(ethanol)의 혼합 용매에 지질이 용해된 지질 용액과, 핵산이 용해된 수용액을 섞는 단계를 포함하는, 핵산 함유 나노 리포솜의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 직경 100 내지 150 nm의 핵산 함유 나노 리포솜, 및 핵산 함유 나노 리포솜 제조용 키트에 관한 것이다.

Description

압출공정 없이 핵산 함유 나노 리포솜을 제조하는 방법{A extrusion-free method for producing nucleic acid-containing nano liposome}

본 발명은 압출공정 없이 디에틸에테르(diethyl ether) 및 에탄올(ethanol)의 혼합 용매에 지질이 용해된 지질 용액과, 핵산이 용해된 수용액을 섞는 단계를 포함하는, 핵산 함유 나노 리포솜의 제조방법 및 핵산 함유 나노 리포솜 제조용 키트에 관한 것이다.

약물전달시스템(Drug Delivery System; DDS)은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있으면서 성공 가능성이 높은 고부가가치 핵심기술로서, 약물투여를 효율적으로 하여 환자 치료의 질을 높이는 데 그 목적이 있다.

약물전달시스템의 핵심기술 중 하나인 약물 흡수 촉진 기술에 속하는 난용성 약물의 가용화 기술은 신약 물질의 개발비용을 줄일 수 있는 동시에 현재 출시되어 있는 의약품의 부가가치를 높일 수 있는 가장 합리적인 방법으로 여겨지고 있다. 특히, 우리나라와 같이 신약개발 여건이 열악한 상황에서 약물의 가용화 기술의 개발을 통한 개량 신약의 개발은 적은 비용으로 막대한 부가가치를 창출할 수 있는 분야이다.

오늘날 유전자의 전달이나 약물전달의 수단으로 가장 각광받고 있는 물질 가운데 하나가 리포솜이라 할 수 있다.

리포솜은 양친매성 지질의 생체세포막의 구성성분인 인지질(phospholipid)을 주성분으로 하여 형성된 지질-이중막(lipid-bilayer) 구조의 소포체(vesicle)로서 내부의 수상(aqueous compartment)에 수용성 약물을 봉입시키거나 지질-이중막에 소수성 약물을 담지시킬 수 있는 약물전달체이다. 이러한 리포솜의 막구조는 세포막의 구조와 비숫하여 독성이 적고 세포와의 융합이나 세포 내 이입을 통해 약물전달이 가능하며 또한, 조합에 따라 크기, 표면전하 및 화학적 개질 등 특성 조절이 가능하다. 특히, 우수한 생체적합성 때문에 약물전달체로서 연구가 활발히 진행되고 있다(Bangham, A. D.; Torchilin, V. P., 2005, Nat . Rev . Drug Discov., 4: 145).

전신순환을 목적으로 하는 다른 입자형 약물전달체의 경우와 마찬가지로 리포솜은 혈중 단백질의 흡착으로 인해 간이나 비장에 다량 존재하는 대식세포의 식작용(phagocytosis)에 의해 순환계에서 소실되거나, 혈중 순환과정 중 리포솜으로부터 약물이 유출되는 단점이 있었다. 특히, 대식세포의 식작용은 리포솜 표면에 옵소닌 단백질(opsonic protein)의 흡착을 통해 발생하기 때문에 이러한 문제점을 해결하기 위해 인지질의 말단에 PEG(poly(ethylene glycol))을 결합시킨 인지질-PEG 유도체를 구성성분으로 사용하여 리포솜을 제조하거나, 제조된 리포솜의 표면을 PEG 또는 다당류 등으로 코팅함으로써 옵소닌 단백질의 흡착이 억제된 리포솜을 개발하였다. 상기 PEG로 개질된 리포솜은 대식세포의 식작용에 의한 약물소실을 감소시킴으로 약물의 혈중순환시간을 연장하고, 나아가 표적장기로의 약물도달율을 높이는 효과를 나타내었다. 리포솜의 크기 또한 전신순환 및 암조직 등의 표적지향적 전달을 위해 중요하다. 일반적으로 핵산 포획 효율을 향상시키기 위하여 양이온 리포솜을 사용하는데, 대부분의 경우 크기를 줄이기 위하여 중합탄산 필터(polycarbonate filter)로 압출(extrusion)하는 과정을 병행한다.

현재 임상시험 단계에 진입한 siRNA/나노리포솜 제제의 약 80% 가량은 캐나다 Tekmira(구 Provita) 사의 LNP(liposome nucleic acid particle) 제조기술을 사용하고 있다(Pharmaceutical Research, 2005, 22: 362). 이 방법은 별도로 제조한 지질을 90% 에탄올에 녹인 지질 용액과 핵산이 녹아있는 pH 5의 산성용액을 반응 전 37℃로 가열하고 T-커넥터를 구비한 펌프를 이용하여 1:1의 부피비로 일정하게 주입하는 연속혼합법(continuous mixing)으로 혼합시킴으로 1차적으로 준안정한(metastable) 형태의 리포솜을 제조한 후 다시 동일한 장치를 이용하여 산성용액으로 2차 희석시켜 DNA 포획률이 증가된 보다 안정한(stable) 리포솜을 제조한 후, 추가적으로 농축 및 투석과정을 거쳐 정맥주사용 나노 리포솜으로 제조하는 기술이다. 상기 방법으로도 압출과정 없이 핵산이 고효율로 포획된 나노리포솜을 제조할 수 있었다. 상기 압출과정이란 나노 스케일의 균일한 리포솜을 얻기 위하여 이전에 다공성 막을 통과시키거나 필터로 여과하는 등의 방법으로 수행되었던 과정으로, 상기 방법은 이러한 압출과정을 배제하고도 균일한 리포솜을 제조할 수 있는 방법을 제시하기는 하였으나, 여전히 복잡한 과정을 거쳐야 하며 특수한 장치를 필요로 한다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 압출과정이 없는 간단한 방법으로 고효율로 핵산을 포획할 수 있는 균일한 크기의 정맥주사용 리포솜을 제조하는 방법을 찾기 위해 예의 연구노력하였다. 구체적으로 지질 용액을 제조하기 위한 용매로서 다양한 유기 용매를 조합하여 테스트하고 바람직하게는 각 조합에 있어서 성분들의 부피비를 조절하여 리포솜 형성 능력을 확인하였다. 그 결과, 지질을 디에틸에테르(diethyl ether; DE)와 에탄올을 1:3의 부피비로 혼합한 용액에 녹인 지질 용액을 이용하였을 때, 특수장비 없이 단순혼합(simple mixing)으로 간편하게 평균 크기 120 nm의 정맥주사용 리포솜을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 디에틸에테르(diethyl ether) 및 에탄올(ethanol)의 혼합 용매에 지질이 용해된 지질 용액과, 핵산이 용해된 수용액을 섞는 단계를 포함하는, 핵산 함유 나노 리포솜의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지질이 용해된, 혼합 용액 중 디에틸에테르를 15 부피% 내지 35 부피%로 포함하는 디에틸에테르와 에탄올이 혼합된 용액 또는 이에 추가적으로 물이 혼합된 용액; 및 핵산이 용해된 수용액을 포함하는 핵산 함유 나노 리포솜 제조용 키트를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 디에틸에테르(diethyl ether) 및 에탄올(ethanol)의 혼합 용매에 지질이 용해된 지질 용액과, 핵산이 용해된 수용액을 섞는 단계를 포함하는, 핵산 함유 나노 리포솜의 제조방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 지질이 용해된, 혼합 용액 중 디에틸에테르를 15 부피% 내지 35 부피%로 포함하는 디에틸에테르와 에탄올이 혼합된 용액 또는 이에 추가적으로 물이 혼합된 용액; 및 핵산이 용해된 수용액을 포함하는 핵산 함유 나노 리포솜 제조용 키트를 제공한다.

본 발명에서 용어, "나노 리포솜"은 지질 이중층 또는 다중층으로 구성된 수십 내지 수백 나노미터 크기의 친수성 캡슐형 나노물질을 의미한다. 상기 나노 리포솜은 나노 캡슐 내부의 빈 공간에 핵산을 포획하여 핵산 의약제제로 활용될 수 있다. 상기 핵산 포획 나노 리포솜은 항암 요법제, 항생제, 백신 등에 적용하여 기존의 제형보다 뛰어난 약효와 낮은 부작용을 나타내고 있다. 바람직하게 상기 핵산을 포획한 나노 리포솜은 정맥주사의 형태로 투여될 수 있다.

상기 본 발명의 제조방법은 기존에 사용되는 지질이 용해된 유기용매(예를 들어, 에탄올)와 핵산(예를 들어, siRNA)이 용해된 수용액을 1:1로 연속적으로 혼합(continuous mixing)하고 희석하여 핵산이 포획된 나노 리포솜을 제조하는 방법과 달리, 지질 용액을 제조하기 위한 용매로서 적절한 조합의 유기용매를 사용하면, 즉 디에틸에테르와 에탄올을 사용하면 압출과정 없이(extrusion-free) 지질 용액과 핵산을 함유한 수용액을 단순혼합(simple mixing)하여도, 예컨대 교반에 의해서도 100 내지 150 nm 크기의 균일한 나노 리포솜을 형성하는 것을 특징으로 하는 제조방법이다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 압출과정 및 1:1 연속 혼합 과정을 생략하고도 특별한 장치없이 간편하게 고효율 고수율로 나노 리포솜을 제조할 수 있다.

본 발명에서 "디에틸에테르(diethyl ether)"는 에틸에테르, 단순히 에테르 또는 에톡시에탄이라고도 하며 일반적으로 널리 사용되는 유기용매로, (C₂H₅)₂O의 화학식을 갖는다. 밀도가 0.7134 g/cm³으로 물보다 낮고 끊는 점이 34.6℃로 낮은 휘발성이어서 반응 후 쉽게 증발시켜 제거할 수 있는 장점이 있다. 친전자성 산소원자의 양측면에 2개의 소수성 에틸기가 결합되어 있어 구조적으로 안정하여 용이하게 지질 사이에 삽입될 수 있고 휘발성을 이용하여 쉽게 제거할 수 있다.

상기 디에틸에테르 및 에탄올의 혼합 비율은 바람직하게 혼합 용액 중 디에틸에테르를 15 부피% 내지 35 부피%로 포함할 수 있다. 즉, 디에틸에테르와 에탄올을 1:1.9 내지 1:5.7의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 1:3의 부피비로 즉, 디에틸에테르를 25 부피%로 사용할 수 있다. 또한 상기 디에틸에테르 및 에탄올의 혼합 용매는 물을 추가로 포함할 수 있다. 이때 사용되는 물의 양은 이후 논의될 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 디에틸에테르를 전혀 포함하지 않은 100% 에탄올 용액을 사용하였을 때, 125 nm의 크기와 85.4%의 핵산포획률(캡슐화)을 갖는 나노 리포솜이 제조되었으나, 높은 다분산성(polydispersity)을 가지며 입자의 균질성이 낮은 것이 확인되었다. 또한 디에틸에테르와 에탄올을 동일부피로 사용하였을 때, 91.7%의 높은 핵산포획률(캡슐화)을 갖는 나노 리포솜이 제조되었으나, 상기 나노 리포솜은 191.0 nm의 다소 큰 크기와 높은 다분산성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 디에틸에테르와 에탄올을 혼합한 용매, 특히 1:3으로 혼합하여 사용한 경우, 120.4 nm의 크기, 낮은 다분산성 즉, 우수한 입자 균질성, 및 86.5%의 높은 핵산포획률을 갖는 나노 리포솜을 제조할 수 있음을 확인하였다(표 1). 즉, 디에틸에테르를 15% 미만으로 포함하는 용매를 지질 용액에 사용한 경우 높은 핵산포획률과 나노 스케일의 리포솜을 제작할 수는 있으나, 높은 다분산성의 균질성이 떨어지는 것을 확인하였고, 35% 초과하여 포함하는 용매를 사용한 경우 리포솜의 크기가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 리포솜의 크기, 다분산성, 및 입자의 균질성을 고려할 때, 에탄올과의 혼합 용매 중 디에틸에테르를 15 내지 35 부피%로 포함하는 용매를 지질 용액 제조를 위한 용매로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 지질 용액과 섞는 핵산 수용액의 양은 지질 용액과 혼합 후 최종 용액에서의 수용액층의 비율을 고려하여 결정될 수 있다.

바람직하게, 지질 용액과 핵산 수용액을 혼합한 최종 용액에서, 디에틸에테르 및 에탄올이 혼합된 유기 용매의 부피와 수용액의 부피가 45:55 내지 30:70이 되도록, 핵산 수용액의 양을 결정할 수 있다.

지질 용액의 용매로서 물이 추가로 포함되는 경우, 지질 용액과 핵산 수용액을 혼합한 최종 용액에서, 디에틸에테르 및 에탄올이 혼합된 유기 용매의 부피와, 지질 용액에 추가로 포함되는 물 및 핵산이 용해된 수용액이 혼합된 수용액층의 부피비가 45:55 내지 30:70이 되도록, 핵산 수용액의 양을 결정할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 디에틸에테르 및 에탄올이 1:3의 부피비로 혼합된 지질 용액과 핵산 수용액을 2:3의 부피로 혼합하여 리포솜을 제조하였다. 또한, 디에틸에테르, 에탄올 및 물이 1:3:1의 부피비로 혼합된 지질 용액과 핵산 수용액을 동일한 부피로 혼합하여 리포솜을 제조하여, 유기 용매 혼합물과 핵산을 용해시킨 수용액을 섞은 총 용액에서 디에틸에테르, 에탄올 및 수용액층의 부피비는 1:3:6, 즉, 디에틸에테르 및 에탄올의 부피와 수용액층의 부피비가 2:3이 되도록 조절하였다.

상기 핵산은 적어도 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리머를 의미한다. DNA, RNA 등을 포함한다. 상기 DNA는 안티센스(anti sense), 플라스미드 DNA, 플라스미드 DNA 단편, 전농축 DNA, PCR 생성물, 벡터, 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA 또는 이들의 유도체를 포함한다. 또한 상기 RNA는 올리고 뉴클레오티드 RNA, 전이 RNA(tRNA), 핵내 저분자 RNA(snRNA), 리포솜 RNA(rRNA), 메신저 RNA(mRNA), 안티센스 RNA, 간섭 RNA(siRNA), 리보자임(ribozyme), 키메라 서열 또는 이들의 유도체를 포함한다.

상기 본 발명에 사용되는 지질 혼합물은 이온화 가능한(ionizable) 양이온 지질, 비-이온화(non-ionizable) 지질 및 PEG-지질을 포함할 수 있다.

상기 이온화 가능한 지질은 DODAP(dioleoyldimethylammonium-propane), DC-CHOL(dimethylethancarbanoyl cholesterol), DODAC(dioleyl-dimethylammonium chloride), DDAB(didodecyldimethylammonium bromide), DMRIE(dimyristyloxypropyl-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide), DODMA(dioleyloxydimethylaminopropane), DMDMA(dimethyldimyristylammonium) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 이온화 가능한 지질은 pH에 따라 중성 또는 양이온의 형태로 존재할 수 있다. 즉, 산성 조건 하에서 양이온의 형태로 존재함으로 전체적인 리포솜 구조체의 음의 전하 분위기를 일부 상쇄시켜 반발력을 감소시킴으로 형성되는 나노 리포솜의 크기를 감소시킬 수 있다.

상기 비-이온화 지질은 DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPE(dioleolphosphatidyl ethanolamine), 및 DPPE(bis(diphenylphosphino)ethane), CHOL(cholesterol), 디아실포스파티딜콜린(diacyl phosphatidylcholine), 디아실포스파티딜에탄올아민(diacylphosphatidylethanolamine), 디아실포스파티딜세린(diacylphosphatidylserine) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPE(dioleolphosphatidyl ethanolamine), 및 DPPE(bis(diphenylphosphino)ethane), CHOL(cholesterol), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

리포솜이 대식세포의 식작용에 의해 손실되는 것을 예방하기 위해 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)-지질을 이용할 수 있다. 상기 PEG가 표지된 지질을 도입함으로 형성되는 리포솜 표면에 대식세포의 식작용을 유발하는 옵소닌 단백질(opsonic protein)의 흡착을 억제함으로 식작용에 의해 혈류를 통해 이동하는 도중에 손실되는 것을 예방할 수 있다. 상기 PEG-지질은 mPEG-PE(methoxy-PEG2000 distearoylphosphatidylethanolamine), miPEG-PE(maleimidyl-PEG2000 distearoylphosphatidylethanolamine), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법으로 제조된 나노 리포솜의 표면에 추가적으로 세포투과성 리간드를 결합시킴으로 세포 내로 약물전달능이 향상된 나노 리포솜을 제조할 수 있다. 또한 표적 장기 또는 조직 특이적 리간드를 결합시켜 장기 또는 조직 특이적 이동성이 향상된 나노 리포솜을 제조할 수 있다. 상기 리간드를 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한없이 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게 상기 리간드가 결합할 수 있는 반응성이 높은 말레이미드기를 갖는 miPEG-PE를 도입할 수 있다.

바람직하게 상기 핵산이 용해된 수용액은 산성용액일 수 있다. 산성 조건에서 상기 이온화 가능한 지질은 양의 전하를 띠게 되어 음전하를 띠는 핵산과 안정적으로 결합할 수 있다. 바람직하게 상기 산성용액은 pH 4.0 내지 5.0의 시트르산 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 지질 용액과 핵산 수용액을 섞는 단계는 지질 용액에 핵산이 용해된 수용액을 섞거나, 또는 핵산이 용해된 수용액에 지질 용액을 섞는 방법 모두에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 함유 나노 리포솜 제조방법은 상기 혼합 용매 중 유기용매를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 지질 용액과 핵산 수용액을 균일하게 혼합하여 반응시키고 유기용매를 증발시킴으로 농축시키고 투석단계를 통하여 유기용매를 제거하였다. 그러나, 상기 유기용매 증발 단계는 생략될 수 있고, 또한 본 발명의 제조방법은 투석단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 방법으로 제조된 나노 리포솜은 100 내지 150 nm의 크기를 가질 수 있다. 보다 바람직하게, 평균 120 nm 직경의 크기를 가질 수 있다. 상기 범위로 크기가 조절된 나노 리포솜은 정맥주사용 핵산 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 디에틸에테르와 에탄올이 특정비율로 혼합된 유기용매를 지질 용액의 용매로 사용하여, 기존의 방법에 비해 복잡한 과정 없이 지질 용액과 핵산 용액을 간편하게 섞는 것으로 균일한 크기의 정맥주사용 리포솜의 제조할 수 있고, 리포솜의 대량 생산에도 적용 가능하고, 생산비용 및 시간을 줄일 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 방법으로 생산된 리포솜은 저장 안정성이 뛰어나며 종류에 무관하게 모든 종류의 핵산(siRNA)을 85% 이상의 고효율로 포획할 수 있어서 핵산 리포솜 전달체 개발에 범용적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 나노 리포솜 제조 방법은 모든 종류의 핵산(siRNA)이 포획된 리포솜 전달체 개발에 범용적으로 사용될 수 있고, 간편한 방법으로 빠른 시간에 제조될 수 있으며, 생산비용을 절감할 수 있고 대량생산에도 적용될 수 있고 상기 방법으로 생산된 리포솜은 저장 안정성 또한 우수하므로 정맥주사용 핵산 전달용 리포솜 제조 산업에 응용가치가 높다.

도 1은 지질 용매인 디에틸에테르:에탄올:물의 혼합비에 따른 제조된 리포솜 용액의 투명도를 나타낸 도이다. 각각에 대한 디에틸에테르:에탄올:물의 혼합비율은 A=0:4:1, B=1:3:1 및 C=2:2:1이며, B 조건에서 투명도가 가장 높은 것으로 나타났다.
도 2는 지질 용매인 디에틸에테르:에탄올:물의 혼합비에 따른 제조된 리포솜의 siRNA 포획률(캡슐화)을 나타낸 도이다. 포획률은 1% NonidetP-40(NP-40)의 존재 유무에 따라 측정하였다. 각각의 포획률은 각 조건에서 밀도계(densitometer)로 siRNA의 세기를 측정한 후 NP-40(-)/NP-40(+)×100%의 식으로 분석하였으며, 측정값은 표 1에 나타내었다. 용매의 혼합비율은 도 1에서와 동일하다.
도 3은 디에틸에테르:에탄올:물=1:3:1 부피비의 혼합용액에 지질을 녹인 지질용액과 핵산 수용액을 동일한 부피로 섞어 제조한 리포솜(A)과 디에틸에테르:에탄올=1:3 부피비의 혼합용액에 지질을 녹인 지질용액을 핵산 수용액과 4:6의 부피비로 섞어 제조한 리포솜(B)의 포획률을 비교분석한 도이다. 각각의 크기(size), 다분산성(PD) 및 포획률(EN)은 아래에 표시하였다.
도 4는 siRNA의 포획률 및 입자크기에 대한 지질 및 siRNA 농도의 영향을 나타낸 도이다. 도 2와 동일한 조건(1X)에서 지질 및 siRNA의 농도를 2배(2X) 및 3배(3X)로 증가시켰을 때, A는 크기 및 다분산성을 나타낸 도이며, B는 siRNA의 포획률을 나타낸 도이다.
도 5는 제조된 리포솜의 FITC-siRNA 포획률을 나타낸 도이다. 지질 용매로는 디에틸에테르:에탄올:물=1:3:1의 혼합 용매를 사용하였으며, 제조된 리포솜의 평균크기는 129.5 nm, siRNA 포획률은 95%이다.
도 6은 Tat 펩타이드로 리간드 표지한 리포솜의 다양한 세포주에 대한 세포투과성 분석 결과를 나타낸 도이다. 표지되지 않은 리포솜(Con)은 낮은 세포투과성을 보이는 반면, Tat 펩타이드로 표지한 리포솜(Tat)의 경우 세포투과성이 급격히 증가하였다.
도 7은 Fab'과 리포솜 표면의 miPEG-PE의 maleimide 기와의 결합분석 결과를 나타낸 도이다. 결합분석은 비환원(NR) 및 환원(R) 조건에서 SDS-PAGE로 진행하였다. F/L은 Fab'-리포솜 복합체를 나타낸다.
도 8은 Fab'이 결합된 Cy5-siRNA 포획 리포솜의 폐암세포 특이적 세포투과성을 나타낸 도이다.
도 9는 Tat 펩타이드 표지 유무에 따른 siGFP(서열번호 1 및 2)의 GFP 발현 억제효과를 나타낸 도이다. NT는 리포솜을 처리하지 않은 대조실험군(non-treated)을, NC는 Tat 펩타이드를 결합시키지 않은 리포솜을 처리한 실험군(non-conjugated)을, Tat는 Tat 펩타이드(서열번호 13)가 표지된 리포솜을 처리한 실험군을 나타낸다.
도 10은 Fab' 표지 유무에 따른 siTMPRSS4의 TMPRSS4 발현 억제효과 및 TMPRSS4에 의한 NCI-H322 세포의 전이능 즉, 세포이동(migration) 및 침윤(invasion) 억제능을 측정한 것으로, 음성 대조실험군으로는 siTMPRSS4(서열번호 3 및 4) 포획 리포솜에 Fab'을 표지하지 않은 군(TM/NA)과 siβGalactosidase(서열번호 5 및 6) 포획 리포솜에 Fab'을 결합시킨 군(Gal/Fab)을 사용하였다. 음성 대조군들과 비교하여 siTMPRSS4 포획 리포솜에 Fab'을 표지한 군(TM/Fab)은 TMPRSS4 유전자 발현을 억제하였으며, 세포이동 및 침윤을 억제하였다. 유전자 발명은 RT-PCR로 측정하였으며, TMPRSS4 유전자 발현을 확인하기 위하여 서열번호 7/8(237 bp) 및 9/10(365 bp)의 PCR 프라이머쌍을 사용하였고, 대조군 유전자인 β-액틴 유전자 발현은 서열번호 11 및 12의 PCR 프라이머를 사용하여 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 핵산포획 리포솜의 제조

디올레오일디메틸암모늄-프로판(dioleoyldimethylammonium-propane; DODAP), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine; DSPC), 디올레올포스파티딜에탄올아민(dioleolphosphatidyl ethanolamine; DOPE), 콜레스테롤(cholesterol; CHOL), 디메틸아미노에탄카바모일 콜레스테롤(dimethylethancarbanoyl cholesterol; DC-CHOL) 및 페길화 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(pegylated distearoylphosphatidylethanolamine; PEG-PE)을 5:4:4:4:4:1의 몰비(총 2.3 mg)로 섞어 지질혼합물을 제조하여 지질 박막(lipid film)을 만들어 건조시킨 후, 디에틸에테르(diethylether; DE):에탄올:물을 1:3:1의 부피비로 섞은 혼합 용액 400 μl에 완전히 용해시켰다. 100 μg의 핵산(siRNA)은 150 mM 농도의 시트르산 용액(pH 4.0) 400 μl에 용해시켰다. 상기 별도로 제조한 지질혼합물 용액과 핵산 용액을 잘 섞어주고 질소가스를 이용하여 유기용매를 증발시킨 후 분자량 12,000의 투석막을 이용하여 HBS(20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl)로 투석하였다. 투석한 리포솜의 siRNA 포획률(캡슐화)은 아가로스젤 전기영동으로 확인하였으며, 리포솜의 크기를 분석하였다.

비교예 1: 혼합용매의 성분비에 따른 핵산포획 리포솜의 제조

상기 실시예 1의 방법으로 제조된 나노 리포솜과 비교실험을 위하여 지질용액을 제조하기 위한 혼합 용매의 성분 비를 달리하여 나노 리포솜을 제조하였다. 구체적으로, 디에틸에테르, 에탄올 및 물을 0:4:1 또는 2:2:1의 부피비로 혼합시킨 용매를 이용하여 지질 용액을 제조하고 실시예 1과 동일한 방법으로 나노 리포솜을 제조하였다.

실시예 2: 핵산포획 리포솜의 최적화

최적화된 핵산포획 나노 리포솜의 제조방법을 확인하기 위하여, 실시예 1의 방법으로 제조된 나노 리포솜과 비교예 1의 방법으로 제조된 나노 리포솜의 특성을 분석하여 그 결과를 도 1, 도 2 및 표 1에 나타내었다.

우선, 도 1에는 상기 방법으로 제조된 리포솜의 투명도를 확인한 결과를 나타내었다. 즉, 투명도가 높은 것이 생성된 리포솜 입자의 크기가 작다는 것을 보여준다. 상기한 바와 같이 디에틸에테르, 에탄올 및 물을 각각 0:4:1, 1:3:1 및 2:2:1로 혼합한 용액에 지질을 용해시킨 지질 용액을 이용하여 리포솜을 제조하고 이의 투명도를 비교하였다. 이 중 1:3:1의 비율로 혼합한 용액을 사용한 경우 투명도가 가장 높았으며, 이 때 리포솜의 평균 크기는 120.4 nm로 역시 가장 작게 나타났다(표 1). 0:4:1 비율의 혼합 용액을 사용한 경우에도 125.4 nm의 작은 크기의 리포솜을 제조할 수 있었으나, 입자균질성을 나타내는 다분산성(polydispersity)이 1:3:1 혼합 용액을 사용하여 제조한 리포솜은 0.174인 반면 0:4:1의 경우 0.280으로 높게 나타나, 0:4:1의 지질 용액을 사용한 경우 입자의 균질성이 떨어지는 것을 확인하였다. 도 2에는 상기 다양한 비율의 혼합 용액으로 제조한 지질 용액을 사용하여 제조한 리포솜의 siRNA 포획정도를 도시하였다. 그 결과를 수치화하였을 때, 디에틸에테르:에탄올:물의 비율을 2:2:1로 사용한 경우가 97.1%로 가장 높게 나타났고, 1:3:1 및 0:4:1로 사용한 경우는 각각 86.9% 및 85.4%를 나타내었다(표 1). 또한 전체적으로 표면전하는 -1 내지 6 mV 사이의 값을 나타내었다.

상기 결과로부터, 디에틸에테르:에탄올:물을 1:3:1의 부피비로 혼합한 용매에 지질을 녹인 지질 용액과 핵산 수용액을 섞는 단계만을 거쳐 입자가 균질하고 핵산 포획률이 높은 나노 크기의 리포솜을 제조할 수 있음을 확인하였다.

또한 실험 결과로는 나타내지 않았으나, 디에틸에테르와 에탄올을 1:3의 부피비로 혼합한 용매에 지질을 용해시킨 지질 용액을 siRNA를 녹인 핵산 수용액과 4:6의 부피비로 섞었을 때에도, 도 3에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 리포솜과 동일한 효과를 나타냄을 확인하였다. 즉, 디에틸에테르와 에탄올이 일정한 부피비를 유지하는 한 지질 용액 중 물의 존재 여부나 비율과 상관없이 동일한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

또한 본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 리포솜이 높은 저장안정성을 가지는 것을 확인하였다. 상기 제조된 리포솜은 2개월 동안 냉장보관 후에도 크기와 효과를 유지하는 것을 확인하였다.

실시예 3: 리포솜 크기 및 핵산포획률에 대한 지질 및 핵산 농도의 영향

고농도의 핵산(siRNA)을 포획할 수 있는 리포솜은 정맥 주사시 주사량을 줄일 수 있고, 제조 과정 중 유기용매의 양을 줄일 수 있다는 장점이 있다. 상기 실시예 2에서 나타난 바와 같이 가장 효율이 높았던 즉, 실시예 1의 방법과 동일하게 디에틸에테르:에탄올:물=1:3:1 부피비의 혼합 용액을 사용하였다. 이에 형성되는 리포솜에 대한 지질 및 siRNA의 농도의 영향을 확인하기 위하여 지질과 siRNA의 양을 2배 및 3 배로 높여 리포솜을 제조하였다.

그 결과, 2배 및 3배 농도의 지질과 siRNA 사용시 리포솜의 크기는 각각 121.2 nm 및 119.1 nm, 다분산성은 0.108 및 0.092로 원래의 농도로 사용시 얻어진 124.2 nm 및 0.121에 비해 유사하거나 일부 더 좋은 결과를 나타내었다(도 4). 또한 siRNA 포획률은 86 내지 89%로 유사하게 나타났다. 따라서, 본 발명의 리포솜 제조방법은 고농도의 리포솜 제조에도 유용함을 확인하였다.

실시예 4: 리포솜의 세포투과능 분석

제조된 리포솜의 세포투과능을 확인하기 위하여 FITC를 표지한 siRNA(FITC-siRNA)를 이용하였다. 리포솜 제조시 지질 혼합물 중 지질 조성은 DODAP:DSPC:DOPE:CHOL:DC-CHOL:PEG-PE:miPEG-PE=5:4:4:4:4:0.5:0.5의 몰비(총 2.3 mg)로 혼합하여 사용하였으며, 100 μg의 FITC-siRNA를 사용하였다. 이때, miPEG-PE는 말레이미드(maleimide) 기를 포함하는 PEG-PE를 의미하며, 그 용도는 후술할 것이다. 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 리포솜의 FITC-siRNA 포획률은 도 5에 나타난 바와 같이 90% 이상이었다.

제조한 리포솜의 세포투과도를 확인하였다. 대상 세포주로는 인간 폐암세포주인 A549, NDI-H322, NCI-H460 및 마우스 NIH-3T3 세포를 이용하였다. 그러나 도 6의 상단(Con)에 나타난 바와 같이 리포솜 자체로는 상기 모든 세포주에 대해 낮은 세포투과능을 나타내었다. 즉, 비록 표면에 이온화 양이온 지질(DODAP 및 DC-CHOL)이 존재하지만 이들 지질은 약염기 상태에서 약한 양전하를 가지고, 다른 지질들은 약한 음전하를 가져 전체적으로 0 mV에 가까운 전하를 나타내기 때문인 것으로 판단된다.

따라서, 리포솜의 세포투과성을 향상시키기 위하여 높은 세포투과성을 갖는 Tat 펩타이드를 리간드로 도입하여 리포솜을 제조하였다. Tat 펩타이드(GRKKRQRRRPPQGGC; 서열번호 13)는 C-말단의 시스테인 잔기의 술프하이드릴(sulfhydryl) 기를 통해 리포솜 표면의 miPEG-PE의 말레이미드 기와 결합하였다. 상기한 방법으로 제조된 Tat 펩타이드 리간드를 표지한 리포솜은 리간드를 표지하지 않은 리포솜에 비해 세포투과도가 크게 향상되었다. 그 결과를 도 6에 도시하였다. 따라서, 리포솜에 세포투과성이 높은 리간드를 도입함으로 리간드 특이적 세포투과를 유도할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 항- EGFR 인간항체 표지 리포솜의 폐암세포 특이적 세포투과능

EGFR은 많은 종류의 암세포에서 과량 발현되는 단백질이다. 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 리포솜의 표면에 항-EGFR 항체(Erbitux, Merck 사)를 표지하여 항체 특이적 세포투과를 유도할 수 있는지 확인하였다. 항체 표지를 위하여 항-EGFR 항체를 펩신으로 절단하여 F(ab')2를 제조하고, DTT를 처리하여 이황화결합(disulfide bond)을 환원시키고 실온에서 PBS로 3회 세척하여, 하나의 자유 술프하이드릴(-SH) 기를 포함하는 Fab'을 획득하였다. 상기 획득한 Fab'을 앞서 제조한 리포솜에 처리하여 리포솜 표면의 miPEG-PE의 말레이미드 기에 결합시키고, 300K 투석막을 이용하여 HBS 또는 PBS로 3회 투석하여 얻은 Fab'이 결합된 리포솜을 SDS-PAGE로 분석하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, Fab'과 miPEG-PE의 결합에 의한 분자량 증가로부터 Fab'이 리포솜 표면에 성공적으로 결합된 것을 확인하였다. 상기 항체가 표지된 리포솜을 폐암세포주 및 NIH-3T3 세포에 처리하였다. 그 결과, NIH-3T3 세포에 대해서는 세포투과를 일으키지 못하였으나, 인간 폐암세포주인 NCI-H460, NCI-H322 및 A549에 대해서는 세포투과성을 갖는 것을 확인하여 이를 도 8에 나타내었다.

실시예 6: siRNA 포획 리포솜의 유전자 침묵( gene silencing ) 효과 분석

GFP를 안정적으로 발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB-458세포를 이용하여 세포에 투과된 리포솜 내에 포획된 siRNA의 유전자 침묵 효과를 확인하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 GFP의 발현을 억제하는 GFP siRNA(siGFP)를 포획한 리포솜을 제조하였고, 상기 리포솜이 약 90%의 siRNA 포획률을 나타내는 것을 확인하였다. 이때, 리포솜의 크기는 129 nm, 다분산성은 0.120으로 정맥주사용 리포솜으로 사용되기에 적합한 조건을 갖추었다. 표면전하는 -0.95 mV로 약 음성을 나타내었다. 상기 제조된 리포솜의 표면에 Tat 펩타이드 리간드 도입 유무에 따른 siGFP의 유전자 침묵 효과를 분석하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 리포솜을 처리하지 않거나(non-treated; NT), Tat 펩타이드 리간드를 결합시키지 않은 리포솜을 처리한 경우(non-conjugated; NC)에 비해, Tat 펩타이드를 결합시킨 리포솜을 처리한 경우 GFP 발현 억제효과가 현저하게 나타나는 것을 확인하였다. 이는 Tat 펩타이드 리간드에 의해 리포솜의 세포투과능이 향상되고 이에 따라 세포 내로 도입된 리포솜 내의 siGFP가 세포질로 유리되어 GFP의 발현을 억제하였음을 제시한다.

TMPRSS4 siRNA(siRMPRSS4)는 NCI-H322 세포 내의 TMPRSS4에 대한 침묵효과를 유도할 뿐만 아니라, TMPRSS4에 의한 세포이동 및 침윤을 억제한다고 알려져 있다. 본 발명에 의해 siTMPRSS4를 리포솜에 포획하고, 항-EGFR Fab'을 결합시켰을 때, TMPRSS4 포획 리포솜에 Fab'을 결합시킨 TM/Fab' 군은 음성대조군은 TM/NC 및 Gal/Fab 군에 비해 TMPRSS4 발현을 보다 억제하고, 세포이동 및 침윤을 현저히 억제하였다(도 10). 상기 결과는 본 발명에 의해 제조된 기포솜 표면에 항체(Fab')를 결합시켜, 표적세포 특이적 침묵효과를 유도할 수 있음을 제시한다.

<110> Korea Research Institute of Biocience and Biotechnology <120> A extrusion-free method for producing nucleic acid-containing nano liposome <130> PA120298/KR <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siGFP sense <220> <221> variation <222> (20)..(21) <223> dideoxy <400> 1 gcaagcugac ccugaaguut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siGFP antisense <220> <221> variation <222> (20)..(21) <223> dideoxy <400> 2 aacuucaggg ucagcuugct t 21 <210> 3 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTMPRSS4 sense <400> 3 gguucucugc cuguuucgac aacuu 25 <210> 4 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siTMPRSS4 antisense <400> 4 aaguugucga aacaggcaga gaacc 25 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sibetaGal sense <220> <221> variation <222> (20)..(21) <223> dideoxy <400> 5 cuacacaaau cagcgauuut t 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sibetaGal antisense <220> <221> variation <222> (20)..(21) <223> dideoxy <400> 6 aaaucgcuga uuuguguagt t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TMPRSS4 237 bp forward <400> 7 ccgatgtgtt caactggaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TMPRSS4 237 bp reverse <400> 8 cccatccaat gatccagagt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TMPRSS4 364 bp forward <400> 9 gatccacact gcaggtgctg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer TMPRSS4 364 bp reverse <400> 10 ccacagacgt gctgtttgtc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer beta-actin 365 bp forward <400> 11 gctcgtcgtc gacaacggct c 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer beta-actin 365 bp reverse <400> 12 caaacatgat ctgggtcatc ttctc 25 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 13 Gly Arg Lys Lys Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Gly Cys 1 5 10 15

Claims

디에틸에테르(diethyl ether) 및 에탄올(ethanol)의 혼합 용매에 지질이 용해된 지질 용액과, 핵산이 용해된 수용액을 섞는 단계를 포함하는, 핵산 함유 나노 리포솜의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 디에틸에테르 및 에탄올의 혼합 비율은 혼합 용액 중 디에틸에테르를 15 부피% 내지 35 부피%로 포함하는 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 디에틸에테르 및 에탄올의 혼합 용매는 물을 추가로 포함하는 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 디에틸에테르 및 에탄올의 혼합 용매에 지질이 용해된 지질 용액의 부피와 수용액의 부피가 45:55 내지 30:70 인 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 지질은 이온화 가능한(ionizable) 양이온 지질, 비-이온화(non-ionizable) 지질 및 PEG(polyethylene glycol)-지질을 포함하는 것인 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 이온화 가능한 양이온 지질은 DODAP(dioleoyldimethylammonium-propane), DC-CHOL(dimethylethancarbanoyl cholesterol), DODAC(dioleyl-dimethylammonium chloride), DDAB(didodecyldimethylammonium bromide), DMRIE(dimyristyloxypropyl-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide), DODMA(dioleyloxydimethylaminopropane), DMDMA(dimethyldimyristylammonium) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 비-이온화 지질은 DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPE(dioleolphosphatidyl ethanolamine), DPPE(bis(diphenylphosphino)ethane), CHOL(cholesterol), 디아실포스파티딜콜린(diacyl phosphatidylcholine), 디아실포스파티딜에탄올아민(diacylphosphatidylethanolamine), 디아실포스파티딜세린(diacylphosphatidylserine) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 PEG(polyethylene glycol)-지질은 mPEG-PE(methoxy-PEG2000 distearoylphosphatidylethanolamine), miPEG-PE(maleimidyl-PEG2000 distearoylphosphatidylethanolamine), 및 이들의 조합, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 나노 리포솜의 크기는 100 내지 150 nm인 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 핵산은 siRNA인 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 나노 리포솜은 추가로 표면에 세포투과성 리간드 또는 표적 장기 또는 조직 특이적 리간드를 표지한 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 나노 리포솜의 제조방법은 단순혼합(simple mixing)에 의해 압출과정 없이(extrusion-free) 진행되는 것인 제조방법.
지질이 용해된, 혼합 용액 중 디에틸에테르를 15 부피% 내지 35 부피%로 포함하는 디에틸에테르와 에탄올이 혼합된 용액 또는 이에 추가적으로 물이 혼합된 용액; 및 핵산이 용해된 수용액을 포함하는 핵산 함유 나노 리포솜 제조용 키트.