KR101450838B1

KR101450838B1 - 표적화 화학요법을 위한 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101450838B1
Application number: KR1020120012940A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 오남묵
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2012-02-08
Publication date: 2014-10-15
Also published as: KR20130091560A

Abstract

본 발명은 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 폴리펩티드의 주쇄에 광감작제 및 pH 민감 물질이 접합된 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 암 인식 지능형 폴리펩티드는 표적화 화학요법을 위한 전구약물로 적용이 가능하고, 산성 환경을 가진 질병 부위에 선택적인 표적화가 이루어지며, 약물 축적능력을 증가시켜 기존의 전구 약물들에 비해 높은 약물 효율성과 치료 효과를 제공할 수 있다.

Description

표적화 화학요법을 위한 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이의 제조방법{Intelligent tumor-identifying polypeptides for targeted chemotherapy and preparation method thereof}

본 발명은 표적화 화학요법을 위한 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

다양한 기술을 이용하여 암의 치료와 진단이 이루어지고 있지만 현대 사회에서 암은 사망원인 중 매우 큰 비중을 차지하고 있다. 또한 고령화 시대로 진행되면서 관절염과 같은 노인성 질환도 증가하고 있는 추세이다. 이러한 질병의 치료와 예방을 위해 사용되는 약물들은 질병부위에서 직접적으로 작용하여 질병 유발 세포를 제거할 수 있지만, 정상 부위에도 작용할 수 있는 부작용을 가지고 있으며 약물 내성을 가지는 세포에는 약물의 효과가 크게 줄어들어 효과적인 치료에 어려움이 있다.

최근, 암의 치료를 위해서 폴리펩티드 기반 전구약물을 특정 세포 수용체에 적용하는 전략에 대한 관심이 높아지고 있다. 하지만, 이러한 전구약물의 제조 방법이 상대적으로 복잡하고, 특정 부위로의 표적화 능력이 비교적 낮아 정상 부위에도 작용하는 문제점이 있다.

특히, 대부분의 고형암에서 암세포는 빠른 증식과 분화 때문에 저산소 상태를 유지하게 되어 혐기성 대사와 해당과정을 통해 락틱산 등과 같은 산성 물질을 생산하여 정상 조직의 pH(pH ~ 7.4)와는 다르게 암세포의 외부환경은 약산성(pH ~ 6.8)을 나타낸다 [K. Engin, D. B. Leeper, J. R. Cater, A. J. Thistlethwaite, L. Tupchong, J. D. McFarlane, Int . J. Hyperthermia, 1995, 11, 211-216.]. 이러한 pH 환경을 가지는 질병부위의 치료시 약물의 비특이적인 작용이 정상조직에도 영향을 미치는 부작용이 발생하거나 약물의 표적화 능력 등이 저하되는 문제점이 발생한다.

이에 본 발명은 이러한 암세포의 특성을 고려하여, 암세포의 pH 변화에 반응하여 특정 부위로의 표적화 능력 등을 향상시킬 뿐 아니라 정상 조직에 대한 부작용을 줄이면서 암 치료 효과를 높일 수 있는 폴리펩티드 기반 전구약물을 제공하는 것이다.

상기 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은, 약산성 환경을 가지는 질병부위를 효과적으로 표적화하고 약물 축적능력을 증가시켜 기존의 전구 약물들에 비해 높은 약물 효율성과 치료 효과를 나타낼 수 있는 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 암 인식 지능형 폴리펩티드를 포함하는 암 치료를 위한 표적화 화학요법용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양상은, 폴리펩티드의 주쇄에 광감작제 및 pH 민감 물질이 접합된 암 인식 지능형 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 양상은, 상기 암 인식 지능형 폴리펩티드를 전구약물로 포함하는 암 치료를 위한 표적화 화학요법용 조성물 및 암 치료를 위한 표적화 화학요법용 키트에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양상은, 폴리펩티드의 주쇄에 pH 민감 물질을 접합하는 pH 민감 물질 접합 단계 및 상기 pH 민감 물질 접합 단계 이후에 광감작제를 접합하는 광감작제 접합 단계를 포함하는 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 암 인식 지능형 폴리펩티드는 폴리펩티드에 pH 변화에 응답할 수 있는 pH 민감성 물질과 치료 약물인 광감작제를 화학적으로 접합시켜 고형 암과 같은 약산성 환경의 질병 부위에서 선택적으로 작용하고, 약물의 효과를 극대화시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 암 인식 지능형 폴리펩티드는 생체적합성이 뛰어나 생체 내 여러 면역 기작을 회피할 수 있고, 다양한 질병부위에 효과적으로 작용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 암 인식 지능형 폴리펩티드는 고형암뿐만 아니라 폐쇄성 질환, 근신경계질환, 류마티스 관절염 등과 같이 산성을 띠는 질병부위에 대한 선택적 치료에 적용이 가능하다.

도 1은 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6의 pH에 따른 전하의 전환 및 광활성을 간략하게 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6의 NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3a은 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6의 제타 포텐셜을 나타낸 것이다.
도 3b는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6의 pH에 따라 노출된 1차 아민의 변화를 나타낸 것이다.
도 4a는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4b는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6에 대한 9,10-디메틸안트라신의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 처리된 종양 세포(B16F10, KB, MCF-7, A549, HeLa)의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 5b는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 처리된 종양 세포(KB)의 유세포분석을 통한 흡수율을 정량화하여 나타낸 것이다.
도 5c는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 처리된 종양 세포(KB)의 빛 조사 이후 광독성을 나타낸 것이다.
도 5d는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 처리된 종양 세포(KB)에 빛을 조사하지 않았을 때의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 6은 종양 세포 (KB)에 Ce6만 처리하고 4시간 배양한 후의 pH에 따른 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6을 다양한 종양 세포(HeLa, MCF-7, A549, B16F10)에 빛 조사 없이 24 시간 동안 처리한 후 측정한 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 8a는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 처리된 누드 마우스의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 8b는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 처리된 누드 마우스에서 적출한 장기의 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 8c는 본 발명에 의한 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 처리된 누드 마우스에 빛 조사 이후 종양의 부피 퇴행을 나타낸 것이다.

이하 본 발명에 관하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 암 인식 지능형 폴리펩티드를 제공한다. 상기 암 인식 지능형 폴리펩티드는 고형암 등과 같은 약산성의 pH 환경을 가진 질병부위에 선택적으로 작용하는 물질이며, 산성 환경을 가진 질병부위로의 우수한 선택성, 효과적인 약물 전달 및 축적성이 이루어져 약물 작용의 효율을 증대시킬 수 있다.

상기 암 인식 지능형 폴리펩티드는 폴리펩티드의 주쇄에 광감작제 및 pH 민감 물질이 유기합성으로 접합된 화합물이다. 상기 암 인식 지능형 폴리펩티드는 생체 내 pH(약 pH 7.4)에서는 구조적 안정성이 뛰어나고, 암 세포 외부의 약산성 환경에서는 pH 민감 물질의 분리에 따른 전하의 전환이 이루어져 암 세포에 대한 선택적 약물 전달이 가능하다.

예를 들어, 도 1을 참조하면, 폴리펩티드의 주쇄에 pH 민감 물질로서 2,3-디메틸말레익 엑시드의 접합시 2,3-디메틸말레익 엑시드에 존재하는 카르복실기의 영향으로 (-)전하를 나타내고, 고형 암 등과 같은 약산성 환경의 질병부위에서는 2,3-디메틸말레익 엑시드가 분리되면서 (+)전하로 전환된다. (+)전하를 띠는 암 인식 지능형 폴리펩티드는 (-)전하를 띠고 있는 세포막과의 반응이 용이하므로, 종양 세포로의 표적화가 이루어지고, 종양 세포로의 약물 축적이 보다 증대될 수 있다. 또한, 이러한 높은 약물 축적에 의해서 정상 세포로의 약물 작용에 따른 부작용을 낮추면서 종양 세포에 대한 약물 효과를 증대시킬 수 있다.

상기 폴리펩티드는 세포 독성이 낮은 수용성 중합체이고, 생체 친화성이 높아 생체 내 여러 면역 기작을 회피하면서 다양한 질병부위에 약물 효과를 제공할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 암 치료를 위한 화학요법에 적용가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 아스파르트산, 라이신, 히스티딘, 글루타민산 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 단량체를 포함할 수 있다. 더 바람직하게는 폴리아스파르트산, 폴리라이신, 폴리히스티딘, 폴리글루타민산 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 광감작제는 표적화 화학요법에 따라 생체에 투여시 암세포에 선택적으로 축적되고, 가시광선의(~ 670 nm) 조사시 광감작 활성에 의해서 종양세포에 대한 독성을 가진 단일항 산소(¹O₂) 등을 발생시켜 암 세포의 성장을 억제하고 괴사시키는 약물이다. 상기 광감작제는 암 치료를 위한 화학요법에 적용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phorphyrins), 포피센류(porphycenes) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 하기의 화학식 1의 클로린 e6이다.

[화학식 1]

상기 pH 민감 물질은 생체 pH(약 pH 7.4)에서는 암 인식 지능형 폴리펩티드와 안정적으로 결합하고, 약산성의 pH 환경(pH 7 이하)에서는 상기 폴리펩티드와 분리되는 물질이다. 이러한 pH 환경에 따른 pH 민감 물질의 분리는 폴리펩티드의 전하 전환을 유도하고, 종양 세포로의 표적화를 가능하게 한다. 바람직하게는 상기 pH 민감 물질은 2,3-디메틸말레익 엑시드이다.

바람직하게는 본 발명에 의한 암 인식 지능형 폴리펩티드는 하기의 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

(화학식 1에서, n은 10 이상이고, 바람직하게는 20 내지 70이며, 더 바람직하게는 20 내지 30이고, Ce6은 클로린 e6이다.)

본 발명은 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 폴리펩티드의 주쇄에 pH 민감 물질을 접합하는 pH 민감 물질 접합 단계 및 상기 pH 민감 물질 접합 단계 이후에 광감작제를 접합하는 광감작제 접합 단계를 포함한다. 상기 폴리펩티드, pH 민감 물질 및 광감작제는 상기 언급한 바와 같다.

또한, 상기 폴리펩티드가 폴리아스파르트산인 경우에는 pH 민감 물질 접합 단계 이전에 폴리아스파르트산과 에틸렌디아민을 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법은 하기의 반응식 1 및 반응식 2와 같다. 아스파르트산 단량체로부터 개환중합을 이용하여 폴리아스파르트산을 합성한 후 디메틸포름아미드에 녹이고 에틸렌디아민과 반응시킨다(반응식 1). 다음으로, 2,3-다이메틸말레익 엑시드, 트리에틸아민 그리고 피리딘(1)을 첨가하여 반응시킨 후 석신이미드로 치환된 클로린 e6과 디메틸설폭시드(2)에서 반응시켜 암 인식 지능형 폴리펩티드를 제조한다(반응식 2).

[반응식 1]

[반응식 2]

본 발명에 의한 암 인식 지능형 폴리펩티드는 암 치료를 위한 표적화 화학요법에 전구 물질로서 단독으로 이용되거나 또는 생체 투여 방법 등에 따라 적절한 조성물로 제조되어 이용될 수 있다.

상기 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이를 포함하는 조성물은 580 nm 내지 700 nm 파장, 바람직하게는 670 nm 파장의 가시광선에 의해서 광감작 활성을 일으킬 수 있다.

상기 암 인식 지능형 폴리펩티드 및 이를 포함하는 조성물은 정맥 주사, 복강 내 주사, 근육 내 주사, 두개 내 주사, 종양 내 주사, 상피 내 주사, 피부관통전달, 식도 투여, 복부 투여, 동맥 주사, 관절 내 주사, 및 구강 내 투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여될 수 있다.

상기 암은 포유류 동물, 특히 인간에게 발생되는 모든 암일 수 있으며, 보다 구체적으로, 피부, 소화기, 비뇨생식기, 호흡기, 조혈계, 뇌, 신경계 등의 고형 암일 수 있다. 예를 들어, 피부암, 흑색종, 위암, 식도암, 결장암, 직장결장암, 췌장암, 대장암, 직장암, 담관암, 간암, 뇌종양, 백혈병, 육종, 골암, 유방암, 갑상선암, 폐선암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암, 두경부암, 방광암, 내분비선암, 요도암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 전립선암, 림프종 등일 수 있으며, 바람직하게는 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 흑색종, 유방암 등이다.

본 발명은 상기 암 인식 지능형 폴리펩티드 단독 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는 암 치료를 위한 표적화 화학요법용 키트를 제공한다. 상기 키트는 암 인식 지능형 폴리펩티드를 광활성시키는 580 nm 내지 700 nm 파장 범위의 광원을 더 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 하기의 실시예 및 비교예에 의하여 보다 구체적으로 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 예에 지나지 않으며, 본 발명의 보호범위를 제한하는 것은 아니다.

제조예 1: 폴리아스파르트산 - DMA - Ce6 의 제조

L-아스파르트산 β-벤질에스터 (L-aspartic acid β-benzyl ester), 트리포스진 (triphosgene) 및 무수 1,4-디옥세인(anhydrous 1,4-dioxane)을 50 ℃에서 반응시켜 L-아스파르트산 N-카복시안하이드리드 (L-Asp N-carboxyanhydride, NCA)를 제조하였다. 상기 L-아스파르트산 N-카복시안하이드리드 (600 mM), 이소프로필아민 (isopropylamine, 개시제, 10, 15, 30 mM) 및 무수 디메틸포름아미드 (anhydrous dimethylformamide, DMF, 20 ml)를 혼합하고 3일 동안 상온에서 개환 중합시켜 고분자를 합성하였다. 다음으로, 합성된 고분자에 존재하는 β-벤질 에스터 그룹을 제거하기 위해 0.5 M 수산화나트륨 용액을 10분간 처리해주고 아세트산으로 중화하여 60, 42, 25의 반복체를 가진 폴리(L-아스파트산)을 합성하였다(반복체의 숫자는 ¹H-NMR으로 분석하였다).

상기 폴리(L-아스파트산)에 2,3-다이메틸말레익 엑시드 (2,3-dimethylmaleic acid, DMA)를 접합시키기 위해서, 상기 폴리(L-아스파트산) (10 mM)을 N, N′-디사이클로헥실카보디이미드 (N,N′-dicyclohexylcarbodiimide, DCC, 600 mM), N-하이드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS, 600 mM), 과량의 에틸렌디아민 (ethylene diamine, 2 M, EDA)과 함께 20 ml의 DMF에서 전 활성화시켰다. DMA (600, 420, 250 mM)를 트리에틸아민(triethylamine, TEA 60 mM)과 피리딘(10 mM)을 이용하여 DMF(20 ml)에서 7일 동안 상온 반응시켰다. 그 후, 합성된 폴리펩티드에 광감작제를 접합시키기 위해서 폴리(L-아스파트산) (10 mM)와 Ce6 (Chlorin e6, Frontier Scientific Inc, 40 mM)을 DCC(50 mM), NHS(50 mM)와 함께 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO, 20 ml)에서 반응시켰다(반응식 3). 생성물은 DMSO상에서 3일 동안 투석한 후, 5mM 소디움테트라보레이트 용액상에서 1일간 투석시킨 뒤 동결 건조하였다. 합성된 폴리펩티드는 반복체에 따라 poly(L-Asp₆₀)-DMA-Ce6 [화합물 (1)], poly(L-Asp₄₂)-DMA-Ce6 [화합물 (2)] 및 poly(L-Asp₂₅)-DMA-Ce6 [화합물 (3)]이다.

[반응식 3]

비교예 1

2,3-다이메틸말레익 엑시드의 접합 공정을 거치지 않는 것 외에는 제조예 1과 동일한 방법으로 poly(L-Asp₂₅)-Ce6[화합물 (4)]을 제조하였다.

[ 실험예 1] 물성 분석

(1) ¹ H- NMR 분석

폴리아스파르트산-DMA-Ce6을 DMSO-d₆에 녹여 ¹H-NMR을 측정하였다.

(2) 제타 포텐셜

폴리아스파르트산-DMA-Ce6(0.1 mg/ml)와 PBS (150 mM)를 혼합한 이후 pH 변화(pH 7.4-5.0)에 따라 Zetasizer 3000 (Malvern Instruments)을 이용하여 제타 포텐셜 변화를 측정하였다.

(3) 1차 아민 농도

폴리아스파르트산-DMA-Ce6에서 DMA의 탈락은 플루오르스아민(fluorescamine)을 이용한 일차 아민의 농도측정을 통해 확인하였다. 서로 다른 pH의 폴리아스파르트산-DMA-Ce6(1 mg/ml)에 상온의 DMF에 녹아있는 플루오르스아민 (2.5 mg/ml, 20 μl)을 혼합하여 샘플을 제조하였다. 각 샘플의 형광 세기(F_s)는 형광광도계(Shimadzu RF-5301PC, 여기 파장 365 nm, 방출 파장 465 nm)를 통해 측정하였다.

1차 아민 농도 =( F _s - F _d _.w )/(F ₀ - F _d _.w )×100(%)

F_s : 샘플의 형광 세기

F₀: 양성 대조군, 0.1 M HCl에서 샘플을 24 시간 동안 처리한 이후의 형광 세기

F_d _.w: 음성 대조군, 탈이온수의 형광 세기

(4) UV - vis 흡광도 스펙트럼

폴리아스파르트산-DMA-Ce6 또는 Ce6 (0.1 mg/ml)을 PBS (150 mM)와 혼합한 이후 pH 7.4 및 6.8에서 자외선가시광선분광광도계(Cary 1E UV/Visible spectrophotometer)를 이용하여 측정하였다.

(5) 9,10- 디메틸안트라신의 형광 세기 변화

단일항 산소의 발생은 단일항 산소에 대해 매우 빠른 화학적 트랩 능력을 가지는 9,10-디메틸안트라신 (9,10-dimethylanthracene)의 형광 세기 변화로 측정하였다. 9,10-디메틸안트라신 (20 μl)을 서로 다른 pH (pH 7.4 또는 6.8)의 PBS 150mM 상에서 폴리아스파르트산-DMA-Ce6과 혼합하고, 상기 혼합용액에 670nm 레이저를 5.2 mW/cm² 세기로 10 분간 조사하였다. 다음으로, 형광광도계 (여기 파장 360 nm, 방출파장 380-550 nm)를 이용하여 측정하였다.

9,10- 디메틸안트라신 형광 세기 변화= F _f - F _s

F_f : 전체 9,10-디메틸안트라신 형광 세기

F_s: 각 샘플의 형광 세기

도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 폴리아스파르트산-DMA-Ce6에서 폴리아스파르트산의 치환도[degree of substation: DS, poly(L-Asp) 하나의 반복체당 치환된 DMA 블록의 수]는 ¹H-NMR 분석 결과로부터 얻어진 δ 1.9(-CH₃, DMA 블록) 피크와 δ 4.45[-CH-, poly(L-Asp)의 반복체] 피크의 적분 비를 이용하여 분석하였다(도 2). 그 결과, 치환도는 0.84±0.3 [poly(L-Asp₆₀)], 0.82±0.1 [poly(L-Asp₄₂)], 및 0.85±0.1 [poly(L-Asp₂₅)이다. ¹H-NMR 분석 결과로부터 얻어진 δ 6.5(-CH, Ce6 블록) 피크와 δ 4.45[-CH-, poly(L-Asp)의 반복체] 피크의 적분 비를 이용하여 분석한 결과, 3 개의 Ce6(광감작 약물) 분자가 하나의 폴리펩티드 분자에 결합된 것을 확인할 수 있다.

도 3a 내지 도 3b에 나타낸 바와 같이, pH 7.4 내지 5.0의 용액에서 제타 포텐셜을 측정하였으며, 화합물 (1)의 제타 포텐셜은 -6.3 mV에서 +6.4 mV로 증가된 것을 확인할 수 있다(도 3a). 특히, 화합물 (1)의 제타 포텐셜은 pH 7.4와 6.4 사이에서 급격하게 변화되었지만, DMA가 존재하지 않는 화합물 (4)는 변화가 없었다. 이는 약산성 pH에서 DMA의 분리가 화합물 (1), (2) 및 (3)의 제타 전위 변화를 일으킨 것으로 예측할 수 있다. 화합물 (1)의 경우, pH 6.8(종양 세포외 pH)에서 24 시간이 지난 후에는 거의 87 %의 DMA가 분리되었지만, pH 7.4(생리학적 pH)에서는 13 %의 DMA가 분리된 것을 확인할 수 있다(도 3b).

도 4a 내지 도 4b에 나타낸 바와 같이, 화합물 (1)은 pH의 영향 없이 파장 670 nm에서 강한 흡수 피크(Ce6에 의한 피크)를 보여준다. 또한, 서로 다른 pH에서 각 화합물에 빛을 조사하였을 때 (5.2 mW/cm², 670 nm, 10 분), 단일항 산소의 발생에 큰 변화가 없음을 보여준다. 그러나 폴리아스파르트산에서 아스파르트산의 단량체수가 증가할수록 폴리아스파르트산에 결합된 Ce6 분자 간의 거리 차가 증가하게 되고 Ce6 분자 간의 자가 퀀칭 효과는 제한될 수 있다. 특히, 아스파르트산 단량체 60개를 가지는 화합물 (1)에서 (F_f-F_s)(F_f는 전체 9,10-디메틸안트라신 형광 세기, F_s는 각 샘플의 형광 세기)의 형광 세기가 가장 크게 증가하였고, 이는 단일항 산소의 발생을 증명한다(도 4b).

[ 실험예 2] In vitro 에서 종양 세포의 표적화 능력 및 항종양 활성도 평가

제조예 1의 폴리아스파르트산-DMA-Ce6(Ce6 2 ㎍/ml)으로 처리된 종양 세포는 상이한 pH 환경(pH 7.4 및 6.8)에서 형광 현미경 (Ce6 형광 검출) 및 FACSCalibur™Flow Cytometer (Becton Dickinson)을 이용하여 측정하였다. 보다 구체적으로, 상기 종양 세포(B16F10, KB, MCF-7, A549, HeLa) (1×10⁵ cells/ml)는 각각의 폴리아스파르트산-DMA-Ce6을 처리하고 37℃에서 DMEM 또는 RPMI-1640 배지 [pH 7.4 또는 6.8, 1% penicillin-streptomycin 및 10% FBS(소태아혈청)]에서 4 시간 동안 배양된 이후 분석되었다. 현미경 분석 과정에서, 형광퇴색 현상을 개선하기 위해서 세포에 안티-페이드 마운팅 용액(anti-fade mounting solution, 5% N-propyl galate, 47.5% glycerol 및 47.5% Tris-HCl, pH 8.4)을 한방울 첨가하였다.

Ce6의 종양 세포에 대한 세포독성 실험은 빛 조사를 통해 측정하였다. 종양 세포는 4 시간 동안 상기 화합물로 처리되고, 10 분 동안 파장 670 nm 및 광세기 5.2 mW/cm²의 레이저로 조사한 이후 세포 계산 키트[Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc)]를 이용하여 세포 생존율 실험을 하기 전까지 12 시간 동안 배양하였다. 또한, 폴리펩티드에 대한 세포독성을 확인하기 위해서 빛 조사를 행하지 않고 24 시간 동안 배양한 이후 세포독성을 확인하였다.

도 5a 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 도 5a는 pH 7.4와 6.8에서 5종류의 종양 세포(B16F10, KB, MCF-7, A549, HeLa)에 화합물 (1)을 처리한 형광 이미지를 나타낸 것이다. 화합물 (1)은 pH 7.4 보다 pH 6.8에서 더 높은 세포 흡수를 나타내고 있다. 이러한 흡수 경향은 유세포분석기를 통해 얻은 정량 분석 결과와 일치한다; [pH 6.8(평균형광: 63.2), pH 7.4(평균형광: 10.1), 비처리 세포(대조군, 평균형광: 9.08)] (도 5b). 하지만, Ce6만 처리한 종양 세포(KB)는 pH 7.4와 6.8에서 차이가 없는 것을 알 수 있다(도 6). 도 5c는 KB 종양 세포에 대한 화합물 (1)의 광독성을 나타낸 것이다. 빛을 조사할 경우(670 nm 레이저를 5.2 mW/cm²의 세기로 10 분간), 화합물 (1)은 pH 7.4 보다 pH 6.8에서 비교적 높은 종양 세포의 사멸을 유도하였고, 화합물 (1)은 pH 6.8에서 0.76 μg/ml의 IC 50 (50 % 저지농도) 값을 갖는 반면, pH 7.4에서는 10 μg/ml 이상의 값을 가진다(표 1). pH 6.8에서 화합물 (1)의 KB 종양세포 내 흡수 증가는 단일항 산소의 발생을 유도하여 광독성을 일으키지만 pH 7.4에서는 종양 세포에 대하여 낮은 광독성을 보여준다(도 5c). 빛 조사에 앞서, 화합물 (1)을 500 μg/ml로 24 시간 동안 처리하였을 때, 세포독성은 보이지 않았으며 이는 화합물 (1) 자체는 비독성임을 보여주는 것이다(도 5d). 이러한 결과는 다른 종류의 종양 세포로 실험을 한 경우와 일치한다(도 7).

[ 실험예 3] In vivo 종양 세포의 표적화 능력 및 항종양 활성도 평가

In vivo 실험은 4-6 주령의 암컷 누드마우스를 통해 이루어지고, 실험은 가톨릭대학교 동물실험윤리위원으로부터 입증된 실험 가이드라인에 따라 실시하였다. 종양 세포로 KB 또는 SKOV3 세포를 PBS 7.4 (이온강도: 0.15)에 1×10⁴개의 농도로 부유시켜 4-6 주령의 암컷 누드마우스(BALB/c nu/nu mice)에 피하 주사로 주입하였다. 상기 종양 세포가 150 mm³까지 커지면 제조예 1의 폴리아스파르트산-DMA-Ce6 (0.12 mg/kg body), Ce6 (2.5 mg/kg)을 상기 암컷 누드 마우스의 꼬리에 정맥 주사하였다.

생체 내에서 종양 세포의 외부 환경 pH를 측정하기 위해서, 졸레틸/럼푼 (6.25/8.75 mg/kg)으로 누드마우스를 마취시키고, 16-gauge beveled tip (1.6 mm OD)을 장착한 Orion 98-63 micro-pH electrode (Thermo Electron Corp.)를 이용하였다. C마운트 렌즈 및 장파장 방출 필터가 장착된 12-비트 CCD 카메라 (Image Station 4000 MM; Kodak, New Haven, CT)를 이용하여 상기 누드 마우스의 형광 이미지를 측정하였다. 샘플 주입 후 24 시간이 지나면 누드 마우스의 장기들(종양, 간, 비장, 폐, 신장, 심장)을 적출하여 분석하였다.

광역학 치료(photodynamic therapy)를 통한 in vivo 종양 저해 효과를 확인하기 위해 제조예 1의 폴리아스파르트산-DMA-Ce6이 주입된 누드 마우스의 병소 부위에 국부적으로 670 nm 레이저를 5.2 mW/cm²의 세기로 40 분간 조사하였다. 종양 부피는 하기의 식으로 계산하였고, "MINITAB^®release 14 statistical software" 및 "ANOVA"(significance level *: p < 0.05 또는 **: p < 0.01)을 이용하여 분석하였다.

종량 부피=길이×(폭)²/2

도 8a 내지 도 8c에 나타낸 바와 같이, 폴리펩티드가 접합된 약물의 전기적 변화가 in vivo에서 종양 세포로의 흡수를 촉진할 수 있는지 확인하기 전에, KB 종양 세포를 가지고 있는(담암체) 누드 마우스의 in vivo 종양 세포 외 pH가 6.70 근처인 것을 확인하였다. 화합물 (1), (3) 및 (4) 또는 Ce6을 KB 종양 세포를 가지고 있는 누드 마우스의 꼬리에 정맥주사 하고 형광 in vivo 사진을 얻었다(도 8a). 소량의 화합물 (1) (Ce6 기준 0.12 mg/kg)이 주사된 누드 마우스의 in vivo 종양 부위에서 높은 형광이 나타났으며 이것은 화합물 (3), 화합물 (4)와 뚜렷한 차이를 보인다. Ce6만 주입한 경우에는 비교적 높은 농도(2.5 mg/kg)를 주입했음에도 불구하고 종양 부위에서 낮은 형광 세기가 나타나고, 주입 후 24 시간이 경과되었을 때 누드 마우스의 장기들(종양, 간, 비장, 폐, 신장, 심장)을 적출하여 분석한 결과(도 8b), 화합물 (3), 화합물 (4), Ce6과 비교하여 화합물 (1)이 종양에 많이 축적된 것을 확인할 수 있다. 비록 간에서 강한 형광 세기를 보였지만 화합물 (1)의 간에 대한 광독성은 무시할 수 있으며, 국부적인 빛의 조사는 종양 부위에 제한될 것이다. 도 8c는 화합물 (1) 또는 Ce6을 처리한 KB 종양 세포를 가지고 있는 누드 마우스의 종양 부피 퇴행을 나타낸 것이다. 주사 후 24 시간이 지난 뒤 종양 부위에 670 nm 레이저를 5.2 mW/cm²의 세기로 40분간 조사하였고, 이러한 치료에서 KB 종양에 대한 뛰어난 퇴행 결과를 확인할 수 있다. Ce6을 높은 농도(2.5 mg/kg)로 주입한 경우와 비교하여 화합물 (1) (Ce6 기준 0.12 mg/kg)은 종양의 퇴행에 더욱 효과적인 것을 확인할 수 있다. 특히, 주사 후 8 일째일 때, 화합물 (1)을 처리한 모든 누드 마우스는 치료되었다.

이에 본 발명에 의한 암 인식 지능형 폴리펩티드는 질병부위를 효과적으로 표적화하고 약물 축적능력이 우수하여 종양 치료 효과를 개선할 수 있다.

Claims

폴리펩티드에 광감작제 및 pH 민감 물질이 접합된 것을 특징으로 하며,
상기 광감작제는 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phorphyrins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며,
상기 pH 민감 물질은 2,3-다이메틸말레익 엑시드인 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 아스파르트산, 라이신, 히스티딘 및 글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 폴리아스파르트산, 폴리라이신, 폴리히스티딘 및 폴리글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드.
삭제
제1항에 있어서,
상기 광감작제는 클로린 e6인 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드.
삭제
제1항에 있어서,
상기 암 인식 지능형 폴리펩티드는 하기의 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드.

(화학식 1에서, n은 10 이상이고, Ce6은 클로린 e6이다.)
제1항에 있어서,
상기 암 인식 지능형 폴리펩티드는 580 nm 내지 700 nm 파장의 가시광선에서 광활성화되는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드.
제1항에 있어서,
상기 암 인식 지능형 폴리펩티드는 암 치료를 위한 표적화 화학요법에 적용되는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 암 인식 지능형 폴리펩티드를 전구약물로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 표적화 화학요법용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 조성물은 정맥 주사, 복강 내 주사, 근육 내 주사, 두개 내 주사, 종양 내 주사, 상피 내 주사, 피부관통전달, 식도 투여, 복부 투여, 동맥 주사, 관절 내 주사, 및 구강 내 투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 표적화 화학요법용 조성물.
제10항의 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 표적화 화학요법용 키트.
제12항에 있어서,
상기 표적화 화학요법용 키트는 암 인식 지능형 폴리펩티드를 광활성화시키는 580 nm 내지 700 nm 파장의 광원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적화 화학요법용 키트.
폴리펩티드에 pH 민감 물질을 접합하는 pH 민감 물질 접합 단계 및 상기 pH 민감 물질 접합 단계 이후에 광감작제를 접합하는 광감작제 접합 단계를 포함하며,
상기 광감작제는 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phorphyrins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며,
상기 pH 민감 물질이 2,3-디메틸말레익 엑시드인 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 아스파르트산, 라이신, 히스티딘 및 글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 단량체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 폴리아스파르트산, 폴리라이신, 폴리히스티딘 및 폴리글루타민산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법.
삭제
삭제
제14항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 폴리아스파르트산인 경우에 pH 민감 물질 접합 단계 이전에 폴리펩티드 및 에틸렌디아민을 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법.
제19항에 있어서,
상기 폴리펩티드 및 에틸렌디아민을 반응하는 단계는 하기의 반응식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법.

[반응식 1]
제14항에 있어서,
상기 폴리펩티드가 폴리아스파르트산인 경우에 pH 민감 물질 접합 단계(1) 및 광감작제 접합 단계(2)는 하기의 반응식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 암 인식 지능형 폴리펩티드의 제조방법.
[반응식 2]